Système nerveux

390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau pour une infection virale, avec ou sans implantation de fibres optiques, puis un isolement de quatre à cinq semaines et un test de peur conditionnée. Le porteur décrit un stress lié à l'isolement social et à la contention, et prévoit l'euthanasie pour des analyses d'électrophysiologie et d'histologie. Il affirme qu'aucune approche in silico ou en culture cellulaire ne peut se substituer à l'animal entier pour étudier la mémoire chez les mammifères.

Objectifs

La mémorisation des évènements passés nous permet de mieux réagir aux situations présentes. Elle permet notamment d’éviter les dangers et d’assurer la survie des individus, mais est également au cœur des phénomènes d’apprentissages. Sans surprise, les mécanismes fondamentaux de la mémoire sont théorisés et étudiés depuis plusieurs décennies par les neuroscientifiques, mais c’est seulement récemment que la démonstration expérimentale des conséquences physiologiques de l’expérience vécue et de sa rétention - la mémoire - sur le cerveau a été rendue possible par des approches optogénétiques. Il a notamment été montré que des groupes de neurones – les cellules constituant le cerveau et briques élémentaires de la cognition – dispersés dans diverses régions cérébrales étaient nécessaires et suffisants pour permettre l’encodage et le rappel de la mémoire. Ces groupes de neurones constituent l’engramme. L’objectif global de notre projet et de comprendre les processus d'encodage et de stockage de la mémoire, chez les mammifères en utilisant des outils de dernière génération permettant d’identifier et de manipuler les cellules de l’engramme. Nous voulons étudier les mécanismes cellulaires et synaptiques de la formation des cellules de l'engramme dans le cortex préfrontal du cerveau, une structure corticale impliquée dans les fonctions cognitives supérieures. Dans ce projet, Nous souhaitons valider les conditions d’utilisation de deux nouveaux outils moléculaires CaMPARI2 et Cal-light, afin de les utiliser pour cibler et manipuler les cellules de l'engramme dans le cortex préfrontal afin de pouvoir déchiffrer les mécanismes de la mémoire.

Bénéfices attendus

Notre objectif est la compréhension des mécanismes fondamentaux de la mémoire. Néanmoins, leur bonne connaissance nous permettra à terme de mieux comprendre les pathologies qui sont associées à des troubles de la mémoire, comme les maladies neurodégénératives - Alzheimer, Parkinson – ainsi que les pathologies génétiques liées aux déficits cognitifs.

Procédures

L’ensemble des animaux subiront une chirurgie pour infection virale (30min) avec ou sans implantation de fibres optiques (1h30). La pose d’implant et le test comportemental nécessite que les animaux soient placés en hébergement individuel pour une durée de 4-5 semaines suite à la chirurgie pour éviter le risque de perte d’implant dû à l’interaction avec ses congénères.

Impact sur les animaux

Les étapes de la chirurgie entrainant des effets indésirables sur les animaux :stress,douleurs post-opératoires. L’animal subit également un stress lié a la restriction de comportement social suite à l'isolement des animaux après la chirugie et le stress physique lié à des contentions et à la tache comportementale de peur conditionnée.

Devenir

L'ensemble des animaux est euthanasié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des expériences d'électrophysiologie in vitro ou des études histologiques.

Remplacement

En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. L’utilisation de tests statistiques pour ces expériences nous permet d’estimer un nombre minimal de souris nécessaires pour satisfaire les conditions statistiques de significativité.

Raffinement

Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée (2/jours) dans les jours qui suivent la chirurgie jusqu’à récupération complète des animaux.Des critères de bien être seront évalués : allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraine la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures de chirurgie sera décrit dans les procédures. La chirurgie est réalisée sous anesthésie .Un contrôle de la respiration et de l’absence de reflexe est vérifié faite par pression de pâte arrière afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal. sera effectué tout le long de la chirurgie. La douleur induite par l’incision sera couverte par l’injection préalable en sous cutané d’un anesthésique local. L’injection en sous cutané des analgésiques en début de chirurgie va permettre une couverture analgésique jusqu’au réveil de l’animal. Une seconde injection d'analgésique est réalisée en fin de chirurgie pour assurer une couverture analgésique pendant les 4-6 heures post-opératoire. Les jours suivants si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous cutanée une injection quotidienne d’un anti inflammatoire non stéroïdien, jusqu’à disparition des signes de mal être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 16 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque semaine pendant huit semaines une injection intrathécale de protéines pathologiques prélevées sur des patients atteints de la maladie de Charcot, pour tenter de reproduire la maladie, et subissent des tests de motricité, de force musculaire et de curiosité. Le porteur indique que les souris pourraient développer une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive, un point limite portant sur la fonction motrice déclenchant alors la mise à mort. Il affirme qu'il est "indispensable" de générer un modèle de la forme sporadique, inexistant à ce jour, aucune alternative cellulaire ne permettant selon lui d'étudier la propagation de la protéine.

Objectifs

La maladie de Charcot, est une maladie neurodégénérative qui touche les neurones du cerveau et de la moelle épinière responsables du mouvement. La maladie débute en moyenne à l’âge de 60 ans et est responsable d’une paralysie progressive, de troubles de la parole et de la déglutition, et de difficultés respiratoires aboutissant au décès en 2 à 5 ans. Il n’existe à ce jour aucun traitement de la maladie, et la recherche sur la maladie de Charcot a été marquée ces 20 dernières années par une multitude d’essais thérapeutiques négatifs. Ces résultats sont en grande partie liés à la faible connaissance des mécanismes à l’origine de la maladie, et à l’absence de modèles animaux fiables. Deux formes de la maladie existent, les formes héréditaires causées par des mutations génétiques représentent moins de 10% des patients, et les formes dites sporadiques qui représentent plus de 90% des patients et pour lesquelles l’origine de la maladie est inconnue. Un acteur semble toutefois jouer un rôle central dans la maladie : une protéine appelée TDP-43, qui s’accumule de manière anormale dans les neurones des patients atteints de la maladie. Parallèlement, cette protéine semble jouer un rôle dans la propagation de la maladie au sein du système nerveux en se propageant de neurone en neurone. Malgré les avancées réalisées dans la compréhension des mécanismes impliqués dans la maladie ces dernières années, l’absence de modèle animal reproduisant la maladie est une limite majeure. Des modèles animaux portant les mutations génétiques responsables de formes familiales existent mais ne représentent que moins de 10% des patients. Il est donc indispensable de générer de nouveaux modèles représentatifs des 90% des patients atteints de la forme sporadique pour avancer dans la compréhension de la maladie et faire émerger de nouvelles pistes thérapeutiques. L’objectif du projet est de répondre à l’absence de modèles animaux fiables dans la recherche sur la maladie de Charcot en générant un modèle animal de la forme sporadique (inexistant à ce jour limitant les progrès de la recherche) pour permettre la compréhension des mécanismes impliqués et appliquer des stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Si les souris développent une pathologie similaire à la maladie de Charcot chez l’Homme, alors elle pourra être étudiée sur un modèle fiable de la maladie pour identifier les mécanismes impliqués afin de mieux comprendre l'origine et la propagation de la maladie, et enfin permettre d’identifier de nouvelle cible thérapeutique.

Procédures

Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. Au total, 36 souris subiront une injection intrathécale par semaine pendant 8 semaines (équivalence de la ponction lombaire chez l’Homme) sous anesthésie générale courte avec anesthésie locale. L’anesthésie générale et l’injection durent en moyenne 10 minutes. La procédure démarre par deux semaines d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement, ainsi que l’habituation aux tests comportementaux qui seront réalisés. Une semaine après chaque injection, et avant l’injection suivante, les animaux subiront des tests comportementaux et cognitifs. Ces tests sont au nombre de 3 et visent respectivement à évaluer la motricité, la force musculaire et la curiosité. La durée de ces tests est d’environ 30 minutes par souris (3 tests différents de 10 min chacuns avec des temps de récupération entre chaque). Un mois après la dernière injection, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem et études biochimiques et d’imagerie.

Impact sur les animaux

Une procédure modérée telle que l’injection intrathécale entraine peu de douleur car cette procédure est réalisée sous anesthésie générale avec anesthésie locale sur la zone de l’injection, et que les animaux recevront une injection d’analgésique pour couvrir une éventuelle douleur post-injection. Les animaux sont surveillés au réveil, et dans les premières heures suivant l’injection puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée et des antalgiques setont administrés si toutefois une douleur est décelée. L’injection de protéines pathologiques ayant pour but de créer un modèle de la maladie, les animaux seront également surveillés quotidiennement. D’après notre expérience, pas ou peu de signes de mal être sont attendus car la maladie de Charcot chez l’Homme n’entraîne pas de troubles cognitifs ni de dépression, mais ces symptômes seront tout de même surveillés. En revanche, si notre modèle permet d’induire des symptômes semblables à la maladie chez l'Homme, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive (entrainant une perte de poids). Pour ces raisons, nous suivrons l’apparition de symptômes éventuels à travers la surveillance quotidienne des animaux, la pesée bihebdomadaire à partir des premiers symptômes, ainsi que par l’utilisation de tests hebdomadaires d’évaluation de la fonction motrice des animaux. La grille de score des points limite s’attarde notamment sur la fonction motrice des animaux de façon à ce qu’ils soient euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement et donc de s’alimenter et de boire correctement. Enfin, les tests comportementaux réalisés pouvant engendrer un stress lié à l’isolement et à la contention des souris, une habituation 15 jours avant le début de la procédure sera réalisée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des 2 procédures pour exploration de la propagation de la maladie par des études biochimiques et histologiques.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de la protéine TDP-43 dans l’induction et la propagation de la maladie de Charcot. En effet la maladie met en jeu l’organisme entier et plus particulièrement le système nerveux central (cerveau et moelle épinière). Les modèles cellulaires ne permettent d’évaluer le mode d’action qu’au niveau moléculaire et cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe ou à l’organisme entier. Aussi, il n’existe pas de modélisation mathématique ou d’alternatives non animales dans ce domaine.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi, 36 animaux au maximum seront nécessaires à ce projet : 3 groupes de 12 animaux (groupe expérimental, contrôle sain, contrôle négatif), dans chaque groupe se distinguent 2 sous-groupes en fonction de la destinée des animaux (6 animaux pour analyses biochimiques et 6 animaux pour analyses histologiques), et chaque sous-groupe est constitué de 50% de souris mâles et 50% de souris femelles. Ainsi 36 animaux sont nécessaires pour avoir minimum 3 réplicas par sous-groupe et par sexe. De plus, un groupe de souris sera utilisé pour mettre au point le protocole de mise à mort et de dissection permettant ainsi d’améliorer le protocole et de diminuer le nombre d’animaux utilisés par lots car moins de perte étant donné que le personnel sera formé. Ce groupe de souris utilisera des animaux de l’animalerie n’ayant pas les caractéristiques qui sont voués à être sacrifiés dans tous les cas.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animaux (4 souris par cage car ce sont des animaux sociaux), et les animaux évolueront dans un environnement enrichi (cabane, coton, rouleau de sopalin, etc…). Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalerie. La douleur susceptible d’être induite par les injections sera limitée car elles seront réalisées sous anesthésie générale courte et accompagnée d’une anesthésie locale par précaution. Les animaux seront surveillés au réveil, et dans les premières heures suivant l’injection puis quotidiennement. Une évaluation de la douleur sera réalisée grâce à une grille de score. L’injection a pour but de créer un modèle pathologique modéré. En revanche, si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive. Pour ces raisons, nous suivrons l’apparition de symptômes éventuels à travers la surveillance quotidienne des animaux, ainsi que par l’utilisation d’une grille de score et de points limites adaptés. La grille de score s’attarde notamment sur la fonction motrice des animaux de façon à ce qu’ils soient euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement. Par ailleurs, si moins de 8 injections sont nécessaires à l’induction de la pathologie elles seront réduites au strict minimum. Aussi, les tests comportementaux pouvant engendrer un stress lié à l’isolement, une habituation 15 jours avant le début des tests sera réalisée. Par ailleurs, un groupe de souris sera prévu pour mettre au point le protocole d'injections, de dissection/expérimentation. Ce groupe utiliseras des animaux de l’animalerie n’ayant pas les bons génotypes qui sont voués à être sacrifiés dans tous les cas. Ceci contribue à réduire le nombre d’animaux dans les autres groupes et permet une meilleure utilisation des animaux dans un soucis de réduction et de raffinement.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour l’étude des maladies humaines car l’organisation de son ADN et l’expression de ses gènes sont similaires à celles de l’Homme. La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacent à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle facile à entretenir, bien décrit et documenté. C’est un modèle utilisé dans le monde entier permettant ainsi de comparer les résultats entre les laboratoires de recherches. Les souris seront âgées d’environ 4 mois, l’âge moyen pour avoir des animaux adultes et mature car la maladie de Charcot est une maladie qui touche des adultes.

2288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des mutations sont introduites par électroporation dans le cerveau de souris nouveau-nées pour y induire un glioblastome, avant une euthanasie par perfusion intracardiaque précédée d'une thoracotomie sous anesthésie. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'effet dommageable jusqu'à six semaines, tout en décrivant au-delà une prostration et un poil hérissé qui le conduisent à ne pas garder les animaux plus longtemps. Il conclut qu'aucun modèle cellulaire ne récapitule les niches où se développent ces tumeurs et justifie l'étude sur l'animal entier.

Objectifs

Les glioblastomes (GBM) représentent la forme la plus fréquente et la plus agressive des tumeurs primaires du cerveau avec un pronostic de survie très bas. Lors d’experiences pilotes décrites dans une DAP précédente, nous avons établi un modèle de GBM chez la souris, qui permet d’étudier les étapes précoces de l’apparition des tumeurs. Ces tumeurs se déclanchent à cause de mutations qui surviennent dans des cellules souches du cerveau. Notre équipe travaille depuis longtemps sur ces cellules souches et nous sommes capables d’introduire des mutations en utilisant la méthode d’électroporation in vivo du cerveau de nouveaux-nés décrite dans les procédures et que nous utilisons régulièrement depuis plus de 10 ans. L’analyse de ces cellules ainsi modifiées sera effectuée à différents temps après l’induction des mutations et permettra de caractériser les évènements cellulaires et moléculaires qui interviennent pendant la période d’induction et de développement précoce des GBM.

Bénéfices attendus

Grâce à notre méthode qui permet d’introduire des mutations dans les cellules souches du cerveau, nous avons le moyen unique de pouvoir étudier les étapes précoces du développement des glioblastomes chez l’animal entier, possibilité qui n’existe pas à l’heure actuelle. Notre modèle pourra être utilisé pour tester l’effet de molécules particulières dans le développement précoce de ces cancers ou dans leur régression. Enfin, nous pourrons générer un modèle adulte des glioblastomes reflètant plus fidèlement ce qui se passe chez les patients atteints de ce type de cancer, dans le but ultime d’identifier des pistes thérapeutiques.

Procédures

Interventions: 1) electroporation du cerveau: geste réalisé sous anesthésie générale. Durée de l'acte: 1 minute maximum, effectué sur 2288 animaux nouveau-nés, 1 seule fois par animal. 2) Injection intrapéritonéale, durée moins de 1minute, effectuée 1 fois sur 336 animaux vigiles âgés de 2 à 30 jours, ou 2 fois sur 108 animaux âgés de 21 à 35 jours. 3) Thoracotomie dans le cadre d'une euthanasie par perfusion intracardiaque. Geste réalisé sous anesthésie générale sub-létale (surdosée) après une pré-médication avec un analgésique morphinique. Durée: 5 minutes, 1 seule fois car conduit à la mort de l'animal, sur 2288 animaux.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 77 jours après. Nous pratiquons en routine depuis une douzaine d’année les procédures décrites dans ce projet et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à ces actes sur la santé et le bien être des animaux. L’animal peut ressentir un stress au moment de sa contention et lorsqu’on introduit une aiguille fine dans son abdomen mais au regard de la durée extremement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits sont très limités dans le temps. Les produits injectés n’entrainent pas d’effet indésirable sur les animaux. Nous n’avons jamais observé d’effet toxique du tamoxifène (molécule qui permet de réguler le récepteur à l’hormone oestrogène) injecté à des animaux dans d’autres projets. Les lignées transgéniques que nous utilisons dans ce projet sont non dommageables. Les autres effets indésirables attendus sont les effets du développement des tumeurs cérébrales. Dans un précédent projet, nous avons réalisé des expériences pilotes sur plusieurs animaux pour évaluer la taille des tumeurs et leurs conséquences sur leur santé et nous n’avons jamais observé d’effet dommageable selon la grille de score sur des animaux jusqu’à 6 semaines après l’induction des glioblastome malgré que la tumeur occupe une partie importante du cerveau. Il est possible que la tumeur engendre une augmentation de la pression intracranienne mais sans impact visible sur la santé de l'animal. Toutefois, nous avons observé sur quelques animaux l’effet de la tumeur après 6 semaines, qui apparait de façon soudaine et se caractérise par le comportement prostré de l’animal ayant un poil hérissé. Cependant nous ne gardons pas les animaux au-delà de ces 6 semaines car notre projet ne nécessite pas de garder des animaux présentant des tumeurs délétères pour leur santé.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever leur cerveau en vue de leur analyse

Remplacement

Le but de notre projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans les phases précoces de développement des GBM dans le contexte écologique de l’avènement des tumeurs en ciblant les cellules souches neurales de la ZSV des ventricules latéraux qui sont à l’origine de ces GBM. La prolifération et la différenciation de ces cellules souches sont contrôlées par des facteurs extrinsèques ou environnementaux présents au niveau de niches cellulaires qui entourent ces cellules. Ces facteurs sont sécrétés par exemple par les cellules gliales ou celles du système vasculaire. Malheureusement il n’existe pas de modèles cellulaires capables de récapituler ces niches cellulaires.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des cellules souches directement dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette méthode par électroporation des cerveaux in vivo est utilisée en routine depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et nous pouvons estimer au plus juste le nombre d’animaux suffisants à utiliser pour avoir des résultats reproductibles et tenant compte du taux d’échec des expériences réalisées par la suite sur les échantillons biologiques. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir de mêmes portées, sans distinction de sexe, afin d’optimiser le nombre de nouveaux-nés utilisés par portée et donc de réduire le nombre de portée par expérience. Pour les analyses histochimiques, le nombre d’animaux nécessaires à l’étude a été réduit grâce au fait que chaque cerveau prélevé servira à l’analyse de plusieurs marqueurs. Le nombre d’animaux a été estimé en s’appuyant sur des tests statistiques appropriés pour ce type de procédure (test non paramétrique adapté aux petits échantillons, qui ne sont pas distribués selon une loi normale). De plus grâce à notre expérience concernant l’analyse statistique de résultats obtenus en utilisant ces méthodes dans d’autres projets, le nombre d’animaux pour ce projet a pu être réduit au strict nécessaire.

Raffinement

Selon les recommandations règlementaires, les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. 5 personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation post-expérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises. -Lors de la perfusion intracardiaque, pour éviter toute souffrance, une prémédication de buprénorphine est administrée avant la perfusion, puis les animaux sont anesthésiés par un surdosage d’anesthésique. L’acte n’est réalisé qu’après s’être assuré que l’animal est sans réaction.

Choix des espèces

De façon générale, la souris est le modèle mammifère le plus utilisé par la communauté scientifique pour établir des modèles de cancers in vivo permettant l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires des phases précoces de développement de cancer. Le modèle d'induction de glioblastome par mutation de 3 gènes critiques a déjà été décrit chez la souris par d'autres équipes scientifiques et mime différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires de la genèse et du développement des glioblastomes. Ce modèle est donc réalisable et pertinent. De plus, grâce à notre adaptation basée uniquement sur l’électroporation, nous pouvons étudier les étapes d’induction et de développement précoce des glioblastomes dans des contextes génétiques mutants existant uniquement chez la souris. Tous les animaux seront électroporés au stade nouveau-né car c’est le stade où les cellules souches neurales qui bordent les ventricules latéraux sont extrêmement nombreuses et peuvent être modifiées génétiquement en introduisant facilement des molécules d'ADN. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l’électroporation, de 2 jours jusqu’à un maximum de 11 semaines, pour suivre l’évolution des cellules génétiquement modifiées. Toutefois la plupart des animaux sera euthanasiée avant 4 semaines.

1392 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire le syndrome de Leigh, une maladie mitochondriale mortelle, elles développent une perte de poids, un retard de croissance puis une faiblesse musculaire et des difficultés respiratoires avant d'être tuées à des âges définis pour prélever leurs organes. Le porteur présente cette première étude comparative de deux modèles murins comme une source de connaissances sur une maladie sans traitement. Il affirme que les lignées cellulaires ne peuvent pas reproduire les mécanismes d'adaptation de l'organisme entier.

Objectifs

Les maladies mitochondriales sont des maladies causées par des mutations du génome des mitochondries, les centrales énergétiques des cellules, ou du génome nucléaire, et à l’issue souvent fatale. Elles peuvent se manifester à tout âge et se présentent comme des maladies qui affectent généralement les muscles et le cerveau. Il n’existe pas de thérapies efficaces contre ces maladies à ce jour, en raison d'une compréhension insuffisante des mécanismes sous-jacents. Des mécanismes complexes impliquant une réponse au stress lié aux déficits des mitochondries sont de plus en plus suspectés d’être impliqués dans ces pathologies. Le syndrome de Leigh représente la maladie mitochondriale pédiatrique la plus courante. C'est une maladie mortelle affectant à la fois le cerveau et les nerfs. Elle est causée par des mutations de plus de 75 gènes impliqués dans le métabolisme mitochondrial. Ce projet, financé par l’Association Française contre les Myopathies, vise à caractériser de manière exhaustive les mécanismes de réponse précoce au stress induits dans les organes par un dysfonctionnement des mitochondries, en comparant différents modèles de souris du syndrome de Leigh. Ceci devrait permettre d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes physiopathologiques du syndrome de Leigh, afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Il s'agit de la première étude comparative métabolomique de 2 modèles murins du syndrome de Leigh, et qui, de ce fait, devrait apporter des connaissances importantes sur cette pathologie qui ne dispose d'aucun traitement à l'heure actuelle. Elle pourrait nous aider à identifier des cibles thérapeutiques concrêtes et jusqu'à aujourd'hui non suspectées.

Procédures

Les animaux ne vont pas subir d'intervention puisqu'ils seront euthanasiés dès qu'ils atteignent l'âge requis pour un prélèvement d'organes post-mortem (7 jours, 14 jours, 21 jours, 28 jours, 35 jours et 42 jours).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (à respectivement 4 et 3 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir qui vont à terme résulter en phénotype de faiblesse musculaire, avec difficultés respiratoires peu avant le décès (vers 8 et 7 semaines respectivement).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, car nous réalisons uniquement des prélèvements d'organes post-mortem à différents âges d'analyse.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les échantillons tissulaires destinés à la protéomique et la transcriptomique. Pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, nos expériences solides de ces méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental pour la métabolomique.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son génome est très similaire à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, l'utilisation de deux modèles du syndrome de Leigh, qui présentent des atteintes mitochondriales différentes , permettra de mieux comprendre la pathogenèse de cette maladie. Les souris seront utilisés à divers stades post-naissance, de 7 jours à 42 jours, afin de déceler les changements rapides qui s'opèrent lorsque le syndrome de Leigh se développe chez ces animaux.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de la moelle épinière par stéréotaxie créant une lésion de la myéline, ainsi qu'une castration ou une ovariectomie, pour étudier le rôle du récepteur des androgènes des astrocytes dans la réparation de la myéline. Le porteur indique que la lésion n'a pas entraîné de handicap dans ses études antérieures et prévoit la dissection du cerveau et de la moelle après mise à mort. Il affirme que les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer l'analyse chez l'animal pour ce processus de remyélinisation.

Objectifs

Bien que nous ayons identifié le récepteur des androgènes (AR) comme une cible thérapeutique clé pour promouvoir la réparation de la myéline, le mécanisme responsable de cet effet remyélinisant de la testostérone via ce récepteur n'est pas encore bien élucidé. L'objectif de notre projet d’étude consiste à déterminer quel type de cellule neurale est nécessaire pour exprimer AR (astrocytes, neurones...) afin de permettre l’activation des chimiokines et par conséquent le recrutement, au sein de la lésion démyélinisante, des oligodendrocytes matures et myélinisants, capables de promouvoir la réparation de la myéline. Au cours de nos travaux de recherche nous avons montré que la présence des cellules astrocytes au sein de la lésion démyélinisante est indispensable au recrutement d’oligodendrocytes et par conséquent à la remyélinisation. Au niveau fondamental, il est très important de caractériser la cellule cible, astrocytes, qui permet à la testostérone et son AR de promouvoir cet effet remyélinisant. Pour cela, nous utiliserons des souris transgéniques dont les astrocytes sont dépourvus du AR. Sur le plan clinique, les deux sexes, mâles et femelles, seront utilisés vu que cette maladie touche 3 fois plus de femmes que d’hommes. De même, Le statut hormonal des patients atteints de sclérose en plaques, souvent négligé, mérite une attention particulière pour des stratégies de remyélinisation efficace. Chez les hommes atteints de sclérose en plaques, de faibles niveaux de testostérone résultant de dysfonctionnements de l'hypothalamus et de l'hypophyse ont en effet été associés à une incapacité neurologique et à des résultats cliniques défavorables. En outre, le risque d'admission à l'hôpital pour une sclérose en plaques est significativement plus élevé chez les hommes diagnostiqués pour un hypofonctionnement testiculaire (baisse du niveau de testostérone et de son récepteur).

Bénéfices attendus

A terme, ce travail permettra de confirmer ou infirmer l’implication du récepteur astrocytaire des androgènes dans l’effet remyélinisant de la testostérone. Ce travail permettra de valider l’efficacité des protocoles proposés dans la réparation de la myéline des souris malades et il apportera des informations importantes sur les moyens d’optimiser le traitement de ces pathologies démyélinisantes chez les patients. En effet, et comme indiqué plus haut, les taux d’androgènes sont réduits chez les malades de sclérose en plaques, à travers nos travaux, nous suggérons un rétablissement de taux normaux de testostérone lors des traitements de ces malades en fonction du sexe. Il conviendrait donc de proposer des traitements personnalisés de remyélinisation et de la médecine de précision dans la sclérose en plaques. Il serait également possible et intéressant d'utiliser des androgènes synthétiques actifs par voie orale pour favoriser la réparation de la myéline

Procédures

Chacun des animaux inclus de ce projet subira une opération chirurgicale au niveau de la maoelle épinière par stéreotaxie. La durée de l'opération ne dépassera pas 10 min. L'animal sera sous anésthésie avant, pendant et après l'opération et durera entre 30 à 50 min. Le génotypage se fait sur des prélevements de queues de souriceaux de 11 jours, en quelques secondes.

Impact sur les animaux

Nos études précédentes, concernant la lésion in situ de la myéline par la LPC, au niveau d’une seule région de la moelle épinière, n’ont pas montré d’handicape chez les souris. Une fois l’effet de l’anesthésie est terminé, les animaux reprennent doucement leur activité et mobilité et quelques heures après l’opération, ils se comportent normalement. Néanmoins, le suivi sera effectué quotidiennement afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress et des fiches d’évaluations individuelles nous permettront de suivre la bonne récupération des animaux après les chirurgies. En Tous les autres animaux inclus de ce projet et ayant répondu à tous les critères du bienêtre animal seront euthanasiés à terme (4 semaines après l’opération chirurgicale). Leurs moelles épinières seront disséquées et utilisées pour les analyses nécessaires à ce projet.

Devenir

A la fin de l'expérience qui aura duré 4 semaines, le sang des animaux sera recueilli pour des analyses d’hormones stéroïdes (testostérone, estradiol…). Les restes des corps seront disséqués pour isoler les cerveaux et moelles épinières. Ces derniers seront maintenus dans le fixateur jusqu’au moment de les couper. Ces coupes serviront entre autres aux analyses immunohistologiques afin d’analyser l’état de la myéline chez ces différents types de souris, traitées ou non avec la testostérone.

Remplacement

Malgré une analyse de l’effet faisant l’objet de cette demande dans des cultures cellulaires, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’analyse de l’effet chez l’animal. Les cultures mixtes (neurones, astrocytes et oligodendrocytes) sont compliquées à réaliser et en plus la myélinisation des axones in vitro ne donne pas de bons résultats. Le processus de remyélinisation met en jeu des interactions complexes entre tous les types cellulaires présents dans la moelle épinière, et que toutes ces interactions ne peuvent être reflétées dans des cultures cellulaires. Cependant, les cultures organotypiques de cervelet ou de moelles épinières peuvent les remplacer car la myélinisation se fait convenablement, mais seulement chez des souriceaux (entre jours postnataux 0 et 10). Cette étape du projet (effet du AR astrocytaire sur le développement de la myéline) est d’ailleurs réalisée sur des cultures organotypiques, réduisant le nombre d’animaux utilisé dans notre projet. Ainsi, nous ne pouvons utiliser des animaux adultes pour étudier les processus de myélinisation et remyélinisation en culture organotypique. Le recours à l’animal est donc nécessaire à notre projet d’étude.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit à 8 par point expérimental, le minimum requis lors de nos travaux précédents de façon à mettre en évidence des différences statistiques. Nous utiliserons 192 souris en 5 ans. Pour utiliser le strict nécessaire de souris, nous n’utiliserons pas de souris pour des contrôles absolus (exemple de souris non traitées ou traitées que par la testostérone) car nous utiliserons les souris des groupes expérimentaux pour servir d’autocontrôles (régions éloignées des zones lésées) et des souris dont le génotypage est de type sauvage. De même, si les résultats sont statiquement significatifs dès les premières expériences, nous tacherons à réduire sensiblement le nombre total de souris. Nous pourrions par exemple nous affranchir des souris prévues pour la 3ème année ; ce qui réduirait le nombre à 128 seulement !

Raffinement

Nos animaux seront hébergés par groupe de 5 animaux par cage dans des conditions optimales d’hébergement (nourriture et eau disponible à volonté, présence de lambeaux fins de papier pour faire un nid, petits cubes de bois à ronger). Avant la procédure chirurgicale, les animaux seront manipulés avec soin pour qu’ils soient habitués aux procédures expérimentales. Pendant la procédure chirurgicale, des mesures thérapeutiques seront mises en place telles qu’un traitement analgésique et un tapis chauffant sera utilisé pour l’animal, sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Nous utilisons l'animal le plus utilisé par les chercheurs, la souris C57BL/6, pour leur facilité d’hébergement et d’élevage. Leur génome est très bien connu, ce qui permet de les "modifier génétiquement". Cet avantage nous permet d’utiliser des souris transgéniques et des souris sauvages du même fond génétique dans nos études expérimentales. Nous utiliserons des souris transgéniques, dépourvues du récepteur AR dans les astrocytes. Pour les études in vivo, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines pour la castration et l’ovariectomie et des souris de 10 à 12 semaines pour la lésion LPC. Puisque nous traitons nos animaux par les stéroïdes tels que la testostérone, la castration et l’ovariectomie des animaux est indispensable pour éliminer tout effet des stéroïdes endogènes, synthétisés par les testicules et les ovaires (voir§ 4.2.1.). Notre projet d’étude de démyélinisation et remyélinisation chez ces souris adultes nous permettront de mieux comprendre les processus pathologiques de la gaine de myéline, rencontrés chez l’homme, atteint de sclérose en plaques.

3720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation est déclenchée pendant la gestation par injection, avec un risque de fausse-couche pouvant atteindre 40 %, puis la descendance subit une série de tests comportementaux dont un conditionnement de peur, pour étudier le rôle des microglies dans les troubles neurodéveloppementaux. Le porteur indique que ces tests provoquent un stress léger à modéré et prélève ensuite les structures cérébrales après mise à mort. Il conclut que les modèles in vitro ne reproduisent pas ces étapes du développement et qu'un recours à des animaux non-humains vivants est nécessaire.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux ont des causes multiples y compris environnementales. Un lien entre des épisodes inflammatoires pendant la gestation et une augmentation du risque de développer des troubles neurodeveloppementaux chez le descendant ont été démontrés. Récemment, le rôle des microglies (cellules immunitaires du cerveau) dans ces troubles a été mis en évidence chez la descendance mâle. Cependant, aucune donnée sur la descendance femelle, ni sur les troubles cognitifs de la descendance n'ont été générées. Ce projet se base sur un modèle d'inflammation gestationnelle couramment utilisé et maîtrisé par les porteurs du projet. L'objectif est d'étudier le rôle des microglies dans les troubles cognitifs neurodéveloppementaux chez le mâle et la femelle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir le rôle des microglies dans la mise en place des troubles cognitifs à l'âge adulte des descendants mâles et femelles après inflammation gestationnelle. Cette étude permettra d'obtenir des données concrètes sur les deux sexes, ce qui n'est actuellement pas disponible mais également sur la sphère cognitive, très peu documentée à ce jour. L'approche par renouvellement des microglies permettra par ailleurs d'établir une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement des troubles neurodéveloppementaux.

Procédures

Prélèvement de sang unique de quelques secondes sur animal vigile pour la présélection des femelles. Injection unique de quelques secondes durant la gestation pour la mère gestante. Tests comportementaux à la période juvénile quotidien durant en tout moins de 15 minutes afin d'évaluer les comportements émotionnels et le développement général (6 tests en juvénile), pouvant engender un léger stress chez l'animal. Tests comportementaux à l'âge adulte afin d'évaluer les capacités de mémoire et les comportements émotionnels ( 5 tests, un test par jour, espacés d'au moins un jour entre les tests, sur une période de 2 semaines– quelques minutes par test), pouvant engender un léger stress, voir modéré lors de l'apprentissage de peur conditionné chez l'animal.

Impact sur les animaux

Le modèle d'inflammation gestationnelle présente un risque de fausse-couche pouvant atteindre 40% sans impacter la survie des mères. Les mères gestantes injectées peuvent présenter une baisse de leur prise de poids sans signe majeurs de comportement de maladie. Les bébés mâles présentent généralement un poids inférieur par rapport aux contrôles. Aucune différence de poids n'est trouvée chez les femelles. Aucune mortalité après mise bas n'est documentée sur ce modèle. Les autres tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entraîner un léger stress notamment durant les deux tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules et/ou vésicules extracellulaires nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.

Remplacement

L’étude des phénotypes microgliaux au cours du développement nécessite des modèles non humains. L'étude des effets de l’inflammation maternelle ne peut se faire de manière fine chez l'homme et nécessite de fait l'utilisation d'animaux vivants. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser ces étapes du développement cérébral et la recherche bibliographique indique que la réponse inflammatoire correspondant à nos modèles n'est pas développée in vitro à ce jour. La proximité des signatures microgliales entre l'homme et l'animal permettra un transfert à l'homme à la suite de ce projet, ce qui reste notre priorité et notre objectif scientifique premier : comprendre chez l'homme le développement des microglies durant les phases développementales.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons utilisé le site Idele.fr permettant de calculer la taille des effectifs en prenant en compte le nombre de groupes, une significativité à 5%, une puissance statistique à 80% et des moyennes et écarts types fictifs basés sur nos expériences passées. Nous avons alors choisi un nombre permettant un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre de destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer sur une population cellulaire triée à partir de structures cérébrales. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques (buprénorphine à 0.1 mg/kg) les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Une anesthésie par injection intrapéritonéale de pentobarbital (Exagon 300 mg/kg, 100ul/10g de poids corporel) avec une prise en charge de la douleur préalable par utilisation de buprénorphine (0.1 mg/kg) 30 min avant sera utilisée pour réduire la douleur des animaux. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris et l'accrétion de données nouvelles sur modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. De plus, les microglies de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun et permettent de conduire à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Les analyses seront conduites au cours de la période post-natale pour le comportement juvénile et à l'âge adulte pour l'évaluation comportementale et les études biologiques subséquentes.