Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Nouvelles approches pour l’évaluation et le traitement des douleurs arthritiques chez les ovins. Partie 01
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
68 brebis vont être utilisées, 34 tuées à l'issue et 34 renvoyées dans leur élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du léger au sévère. Une arthrite est déclenchée par une injection dans l'articulation sous anesthésie, suivie d'une IRM, de prélèvements sanguins, d'injections et de quinze administrations intranasales d'ocytocine, avec quatre tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur décrit une boiterie et un œdème articulaire pendant quatorze jours et prévoit une mise à mort si le score de douleur reste élevé plusieurs jours. Il affirme que le remplacement du mouton est impossible car l'espèce est "l'objet de l'étude", ce projet étant la partie 01 d'un travail mené dans deux établissements.
Objectifs
Chez les animaux d’élevage, la douleur reste un concept délicat à aborder. En effet, l'évaluation de la douleur chez ces animaux repose sur l'évaluation subjective de quelques critères zootechniques, cliniques et comportementaux (productivité, postures, etc.) dont les conclusions vont significativement varier en fonction de l'expérience et de la sensibilité des professionnels et qui ne permettent pas d’évaluer la douleur dans toutes ces dimensions (cognitive/émotionnelle/sensorielle). L'absence de biomarqueurs spécifiques permettant de réaliser un diagnostic précis de l'état douloureux d'un animal et/ou de quantifier l'intensité douloureuse conduit à un déficit d'évaluation. Ce déficit d'évaluation limite la prise en charge précoce des douleurs favorisant le développement de douleurs chroniques avec pour conséquence une augmentation de l'anxiété et du stress de l'animal douloureux mais également de ses congénères via des mécanismes de contagion émotionnelle, encore largement incompris. Par ailleurs, ce déficit d'évaluation ne permet pas de valider de manière précise l'efficacité des traitements antalgiques conventionnels chez les animaux d'élevages or, l'utilisation de ces traitements est limitée 1/ par leurs effets secondaires notamment sur la reproduction (ex : AINS), 2/ par la réglementation qui limite la présence de résidus médicamenteux dans les produits animaux de consommation et 3/ par le coût de ses traitements qui restent à la charge des professionnels. Ensemble, ces contraintes font que la prise en charge de la douleur des animaux élevages est limitée. Il existe donc un besoin impérieux d'innovation pour améliorer d'une part, l'évaluation de la douleur avec pour objectif de tester l'efficacité réelle des antalgiques sur ces animaux et d'autre part, pour stimuler le développement de nouvelles molécules plus efficaces, dépourvues d'effets secondaires et qui satisfassent les contraintes spécifiques de l’élevage. Dans ce contexte, ce projet propose de combiner des approches d’imagerie médicale, d’éthologie et de pharmacologie afin de 1/ mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs spécifiques de l’état douloureux dans un modèle d’arthrite inflammatoire chez le mouton et 2/ démontrer l’efficacité antalgique de l’ocytocine, un composé déjà présenté comme antalgique sur les douleurs inflammatoires chez les rongeurs et dont l’utilisation pourrait satisfaire aux contraintes de l’élevage. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet auront plusieurs bénéfices aussi bien d'un point de vue scientifique que du point de vue de la médecine vétérinaire. D'un point de vue scientifique ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes de contagion émotionnelle de la douleur et de son impact sur l’expression des comportements sociaux chez les animaux. D’un point de vue de la médecine vétérinaire, si les résultats de ce projet démontrent l’efficacité antalgique d’un traitement intranasal d’ocytocine, alors nous aurons alors fourni les premiers arguments pour un repositionnement de l’ocytocine comme analgésique pour le traitement des douleurs inflammatoires chez les ovins.
Procédures
Au sein de l'EU1 les interventions suivantes seront réalisées: Huit prélévements sanguins (veine jugulaire) durant quelques secondes / Deux injections sous cutanées durant quelques secondes / Quinze administrations intra nasales durant quelques secondes / Quatre tests comportementaux qui seront réalisés 8 fois. Un test ne sera effectué qu’une seule fois et durera 5min ; les 3 autres seront effectués 8 fois et ils dureront 3min, 10min et 30min. Au sein de l'EU2 les interventions suivantes seront réalisées: Une injection intraarticulaire réalisée au sein de l'EU2 sous anesthésie générale et sous analgèsie (45 min) pour l'induction d'un modèle d'arthrite / Une procédure d'imagerie médicale IRM réalisée sous anesthésie générale (1h45) dans lEU2
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'arthrite induit l'apparition d'une boiterie, un œdème articulaire et des signes de douleur à la flexion modérée pendant 14 jours. Les différents actes expérimentaux peuvent engendrer du stress pour l’animal. L'administration intra nasale peut être un acte désagréable pour l’animal mais l’ocytocine ne présente pas d'effet secondaire. Les prises de sang réalisées à la veine jugulaire peuvent entrainer une légère douleur ainsi que l’apparition d’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement. Les injections sous cutanées réalisées de part et d’autre des flancs de l’animal ainsi que l’injection intra-articulaire (tibiotarsiennes) pour induire le modèle d'arthrite peuvent également engendrer une douleur légère au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger. Le transport des brebis d’un établissement utilisateur à l’autre peut générer du stress pour l’animal.
Devenir
34 brebis seront replacées dans leur élevage et 34 autres brebis seront euthanasiées afin de récolter les tissus d’intérêt (articulation, moelle épinière, cerveau) pour des études ultérieures.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du mouton est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage et la médecine vétérinaire de cette espèce. De plus, nous souhaitons étudier l'impact d'une douleur modérée sur l'expression des comportements sociaux dans cette espèce et cette question ne peut pas être abordée par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour une étude basée sur un approche IRM, notre effectif est plutôt important (N=4x8 animaux). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les groupes expérimentaux. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce (i.e. herbivore social). Les conditions de vie du groupe « arthrite-serum physiologique » (i.e. traitement avec l’impact le plus négatif) correspondent à la réalité observée naturellement, voire moins douloureux puisque nos animaux ne développeront pas d'atteinte sur d'autres articulations ou encore des atteintes pulmonaires comme observées lors des infections à agalacticae sur les exploitations. La taille de nos effectifs (8 individus par groupe) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques. Si ces conditions ne sont pas remplies, nous utiliserons des tests non-paramétriques tels que les tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, si la variabilité intra-groupe le permet.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. Ils seront hébergés dans le bâtiment conditionnés de l'EU1 et auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. L'enclos des animaux sera enrichi avec un promontoire permettant à l'animal de monter et descendre afin qu'il puisse changer son point d'observation et faire de l'exercice. Lors du transport des animaux entre les deux unités expérimentales, les animaux recevront une injectionde neuroleptique afin de limiter le stress. Lors de l'induction du modèle les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de limiter l'induction de douleurs inutiles liés à l'injection intrarticulaire de BCII. Tous les animaux seront visités quotidiennement et une surveillance accrue sera réalisée post induction du modèle. Deux expérimentateurs indépendants utiliseront deux échelles d'évaluation publiées et validées pour évaluer la douleur chez les animaux Expérimentateurs. Ainsi, si un animal Expérimentateurs présente pendant plus de trois jours un score supérieur à 5 sur l'une de ces deux grilles l'animal recevra une injection d'antalgique et sera euthanasié par un employé qualifié de l'EU1. L'animal Observateur sera replacé au sein du cheptel de l'EU1 et sortira de l'expérimentation. Lors des prélèvements, des tests comportementaux, et des injections intranasales, les animaux recevront une récompense sous forme d'aliments juste après les procédures afin de réduire le stress engendré par la procédure.
Choix des espèces
Le mouton est utilisé dans cette étude à cause de la forte incidence (jusqu'à 40% des jeunes animaux dans certaines fermes) des pathologies l'arthritiques observées dans cette espèce. Ces arthrites sont causées par plusieurs bactéries et cette situtation sanitaire présente une sérieuse atteinte au bien-être des animaux. Ainsi l'utilisation du mouton est nécessaire car cette espèce est l'objet de l'étude. Les animaux utilisés seront des femelles de race Ile de France agées entre 9-10 mois. Ce projet sera réalisé chez des jeunes animaux car la prévalence des arthrites infectieuses est plus importante chez les jeunes ovins.
Nouvelles approches pour l’évaluation et le traitement des douleurs arthritiques chez les ovins. Partie 02
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
68 brebis vont être utilisées, 34 tuées à l'issue et 34 renvoyées dans leur élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du léger au sévère. Une arthrite est déclenchée par une injection dans l'articulation sous anesthésie, suivie d'une IRM, de prélèvements sanguins, d'injections et de quinze administrations intranasales d'ocytocine, avec quatre tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé. Le porteur décrit une boiterie et un œdème articulaire pendant quatorze jours et prévoit une mise à mort si le score de douleur reste élevé plusieurs jours. Il affirme que le remplacement du mouton est impossible car l'espèce est "l'objet de l'étude", ce projet étant la partie 02 d'un travail mené dans deux établissements.
Objectifs
Chez les animaux d’élevage, la douleur reste un concept délicat à aborder. En effet, l'évaluation de la douleur chez ces animaux repose sur l'évaluation subjective de quelques critères zootechniques, cliniques et comportementaux (productivité, postures, etc.) dont les conclusions vont significativement varier en fonction de l'expérience et de la sensibilité des professionnels et qui ne permettent pas d’évaluer la douleur dans toutes ces dimensions (cognitive/émotionnelle/sensorielle). L'absence de biomarqueurs spécifiques permettant de réaliser un diagnostic précis de l'état douloureux d'un animal et/ou de quantifier l'intensité douloureuse conduit à un déficit d'évaluation. Ce déficit d'évaluation limite la prise en charge précoce des douleurs favorisant le développement de douleurs chroniques avec pour conséquence une augmentation de l'anxiété et du stress de l'animal douloureux mais également de ses congénères via des mécanismes de contagion émotionnelle, encore largement incompris. Par ailleurs, ce déficit d'évaluation ne permet pas de valider de manière précise l'efficacité des traitements antalgiques conventionnels chez les animaux d'élevages or, l'utilisation de ces traitements est limitée 1/ par leurs effets secondaires notamment sur la reproduction (ex : AINS), 2/ par la réglementation qui limite la présence de résidus médicamenteux dans les produits animaux de consommation et 3/ par le coût de ses traitements qui restent à la charge des professionnels. Ensemble, ces contraintes font que la prise en charge de la douleur des animaux élevages est limitée. Il existe donc un besoin impérieux d'innovation pour améliorer d'une part, l'évaluation de la douleur avec pour objectif de tester l'efficacité réelle des antalgiques sur ces animaux et d'autre part, pour stimuler le développement de nouvelles molécules plus efficaces, dépourvues d'effets secondaires et qui satisfassent les contraintes spécifiques de l’élevage. Dans ce contexte, ce projet propose de combiner des approches d’imagerie médicale, d’éthologie et de pharmacologie afin de 1/ mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs spécifiques de l’état douloureux dans un modèle d’arthrite inflammatoire chez le mouton et 2/ démontrer l’efficacité antalgique de l’ocytocine, un composé déjà présenté comme antalgique sur les douleurs inflammatoires chez les rongeurs et dont l’utilisation pourrait satisfaire aux contraintes de l’élevage. Ce projet sera réalisé dans deux unités expérimentales.
Bénéfices attendus
Les résultats issus de ce projet auront plusieurs bénéfices aussi bien d'un point de vue scientifique que du point de vue de la médecine vétérinaire. D'un point de vue scientifique ce projet apportera de nouvelles connaissances sur les mécanismes de contagion émotionnelle de la douleur et de son impact sur l’expression des comportements sociaux chez les animaux. D’un point de vue de la médecine vétérinaire, si les résultats de ce projet démontrent l’efficacité antalgique d’un traitement intranasal d’ocytocine, alors nous aurons alors fourni les premiers arguments pour un repositionnement de l’ocytocine comme analgésique pour le traitement des douleurs inflammatoires chez les ovins.
Procédures
Au sein de l'EU1 les interventions suivantes seront réalisées: Huit prélévements sanguins (veine jugulaire) durant quelques secondes / Deux injections sous cutanées durant quelques secondes / Quinze administrations intra nasales durant quelques secondes / Quatre tests comportementaux qui seront réalisés 8 fois. Un test ne sera effectué qu’une seule fois et durera 5min ; les 3 autres seront effectués 8 fois et ils dureront 3min, 10min et 30min. Au sein de l'EU2 les interventions suivantes seront réalisées: Une injection intraarticulaire réalisée au sein de l'EU2 sous anesthésie générale et sous analgèsie (45 min) pour l'induction d'un modèle d'arthrite / Une procédure d'imagerie médicale IRM réalisée sous anesthésie générale (1h45) dans lEU2
Impact sur les animaux
L’induction du modèle d'arthrite induit l'apparition d'une boiterie, un œdème articulaire et des signes de douleur à la flexion modérée pendant 14 jours. Les différents actes expérimentaux peuvent engendrer du stress pour l’animal. L'administration intra nasale peut être un acte désagréable pour l’animal mais l’ocytocine ne présente pas d'effet secondaire. Les prises de sang réalisées à la veine jugulaire peuvent entrainer une légère douleur ainsi que l’apparition d’un éventuel hématome au niveau du site de prélèvement. Les injections sous cutanées réalisées de part et d’autre des flancs de l’animal ainsi que l’injection intra-articulaire (tibiotarsiennes) pour induire le modèle d'arthrite peuvent également engendrer une douleur légère au niveau du site d’injection. Les tests comportementaux peuvent induire un stress léger. Le transport des brebis d’un établissement utilisateur à l’autre peut générer du stress pour l’animal.
Devenir
34 brebis seront replacées dans leur élevage et 34 autres brebis seront euthanasiées afin de récolter les tissus d’intérêt (articulation, moelle épinière, cerveau) pour des études ultérieures.
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer nos animaux avec une autre espèce ou un substitut non-vivant. L’utilisation du mouton est nécessaire car notre projet répond à des questions précises concernant l’élevage et la médecine vétérinaire de cette espèce. De plus, nous souhaitons étudier l'impact d'une douleur modérée sur l'expression des comportements sociaux dans cette espèce et cette question ne peut pas être abordée par des méthodes alternatives.
Réduction
Pour une étude basée sur un approche IRM, notre effectif est plutôt important (N=4x8 animaux). Ainsi, nous optimisons nos chances d’obtenir un contraste suffisant entre les groupes expérimentaux. Les conditions de vie sont en adéquation avec les besoins de l’espèce (i.e. herbivore social). Les conditions de vie du groupe « arthrite-serum physiologique » (i.e. traitement avec l’impact le plus négatif) correspondent à la réalité observée naturellement, voire moins douloureux puisque nos animaux ne développeront pas d'atteinte sur d'autres articulations ou encore des atteintes pulmonaires comme observées lors des infections à agalacticae sur les exploitations. La taille de nos effectifs (8 individus par groupe) nous permettra de réaliser des analyses statistiques. Le choix des tests dépendra de la distribution des données et de l’homogénéité des variances. Si les conditions de normalité de la distribution et d’homogénéité des variances sont remplies, nous utiliserons des tests paramétriques. Si ces conditions ne sont pas remplies, nous utiliserons des tests non-paramétriques tels que les tests de permutation pour comparer les lots expérimentaux. Des matrices de corrélation pourront être utilisées pour tester les éventuels liens entre paramètres comportementaux et neurobiologiques, si la variabilité intra-groupe le permet.
Raffinement
Les conditions de vie des animaux seront en adéquation avec les besoins de l’espèce. Ils seront hébergés dans le bâtiment conditionnés de l'EU1 et auront accès à l'eau et à la nourriture ad libitum. L'enclos des animaux sera enrichi avec un promontoire permettant à l'animal de monter et descendre afin qu'il puisse changer son point d'observation et faire de l'exercice. Lors du transport des animaux entre les deux unités expérimentales, les animaux recevront une injectionde neuroleptique afin de limiter le stress. Lors de l'induction du modèle les animaux seront anesthésiés et analgésiés afin de limiter l'induction de douleurs inutiles liés à l'injection intrarticulaire de BCII. Tous les animaux seront visités quotidiennement et une surveillance accrue sera réalisée post induction du modèle. Deux expérimentateurs indépendants utiliseront deux échelles d'évaluation publiées et validées pour évaluer la douleur chez les animaux Expérimentateurs. Ainsi, si un animal Expérimentateurs présente pendant plus de trois jours un score supérieur à 5 sur l'une de ces deux grilles l'animal recevra une injection d'antalgique et sera euthanasié par un employé qualifié de l'EU1. L'animal Observateur sera replacé au sein du cheptel de l'EU1 et sortira de l'expérimentation. Lors des prélèvements, des tests comportementaux, et des injections intranasales, les animaux recevront une récompense sous forme d'aliments juste après les procédures afin de réduire le stress engendré par la procédure.
Choix des espèces
Le mouton est utilisé dans cette étude à cause de la forte incidence (jusqu'à 40% des jeunes animaux dans certaines fermes) des pathologies l'arthritiques observées dans cette espèce. Ces arthrites sont causées par plusieurs bactéries et cette situtation sanitaire présente une sérieuse atteinte au bien-être des animaux. Ainsi l'utilisation du mouton est nécessaire car cette espèce est l'objet de l'étude. Les animaux utilisés seront des femelles de race Ile de France agées entre 9-10 mois. Ce projet sera réalisé chez des jeunes animaux car la prévalence des arthrites infectieuses est plus importante chez les jeunes ovins.
Evaluation des modifications vasculaires cérébrales par microscopie de localisation ultrasonore (ULM) sur un modèle de la dépression chez le rat.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
99 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 67 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et 32 en souffrance modérée. Issus d'une lignée sélectionnée pour un caractère "dépressif", ils reçoivent des injections d'antidépresseur, une neurostimulation par ultrasons cinq jours de suite, une craniotomie sous anesthésie, puis une imagerie cérébrale avant d'être tués par décapitation sans réveil. Le projet cherche à mesurer la vascularisation du cerveau dans ce modèle de dépression. Le porteur affirme n'avoir "pas d'autre alternative" pour la microvascularisation cérébrale ni pour modéliser la dépression.
Objectifs
L’objectif de notre projet est d’évaluer, par microscopie de localisation ultrasonore (ULM), la vascularisation cérébrale dans un modèle animal de dépression. Les animaux dépressifs proviennent d’une lignée consanguine de rat exprimant spontanément un caractère dépressif à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est d’améliorer la compréhension des mécanismes neurovasculaires liés à la dépression et de proposer des paramètres quantifiables (volume sanguin, vitesse des flux, nombre de vaisseaux, etc.) pour discriminer les animaux atteints et sains, ainsi qu’évaluer l’efficacité des traitements de la dépression.
Procédures
Interventions sur les animaux : - 3 injections intra-péritonéale d'un antidépresseur en 24h - Neurostimulation par ultrason (US) : 1 fois par jour pendant 5 jours ; durée journalière : 10 minutes. - Anesthésie gazeuse pendant l’imagerie par microscopie de localisation ulrasonore (ULM) et le neurostimulation (5x10 minutes neurostimulation + 1x15minutes ULM) - Craniotomie (1 fois, 15 minutes) - Euthanasie par décapitation sans réveil.
Impact sur les animaux
La contention nécessaire à l'induction de l'anesthésie rajoute un stress supplémentaire. Une douleur au point d'injection en intraveineuse de l'agent de contraste et au point d'injection en intra-péritonéale peut être ressentie et peut générer un hématome. Lors de la neurostimulation, il peut être observer un inconfort lié à l'utilisation d'un cadre stéréotaxique.
Devenir
Nous prélèverons les cerveaux pour des analyses histologiques. De ce fait, tous les animaux seront mis à mort à l’issu des manipulations d’imagerie cérébrale.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la vascularisation cérébrale. Au préalable de ce projet, des tests ont été pratiqués sur des dispositifs tubulaires mimants les petits vaisseaux. A ce stade de notre projet, nous n’avons pas d’autre alternative pour tester la microvascularisation cérébrale. De même, il n’existe pas d’alternative pour modéliser la dépression.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, lors de phase de mise au point, chaque animal pourra subir plusieurs fois l’étape d’imagerie de contraste. Ceci permettra de tester plusieurs concentrations (du moins concentré au plus concentré) d’agent de contraste et paramètres d’imagerie sans avoir recours à d’autres animaux et sans reprise de conscience de l’animal. Pour cette phase du projet, nous pensons que l’utilisation de 35 animaux est jugée suffisante pour atteindre l’objectif de cette procédure. De plus, nous ne jugeons pas utile de faire ces mises au point sur les deux sexes. Nous utiliserons donc que des rats mâles. Pour la 2ème étape du projet, nous souhaitons appréhender les différences de vascularisation entre des rats sains et des rats dépressifs. Nous pensons que l’utilisation de 64 animaux est suffisante pour atteindre cet objectif. Des tests stastitiques appropriés seront utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les rats seront hébergés par groupe social, de 2 à 4 par cage, en présence d'enrichissements comprenant un tunnel et/ou une cabane en carton ainsi qu'un bâton à ronger, papier absorbant. Toutes les stratégies d'analgésie et d'anesthésie et de soins seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être observés lors de leur hébergement avant la procèdure d’imagerie.
Choix des espèces
Le rat semble l’espèce la plus adaptée pour cette étude. La taille de la boite cranienne est suffisante pour procéder à l’amincissement de crâne. De plus, il existe un modèle de rats dépressif utilisable pour ce projet . La dépression est souvent une pathologie de l’adulte. Nous aurons donc recours à des rats adultes de 8 semaines.
Etude de la transmission nociceptive dans un modèle de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies, l'une cérébrale l'autre sur la moelle épinière, une stimulation par lumière, un entraînement comportemental dont la nature n'est pas précisée et une mesure du retrait de la patte par un faisceau infrarouge pouvant provoquer une rougeur. Le projet étudie la transmission de la douleur dans un modèle de la maladie de Parkinson. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces réseaux nerveux et que les études in vivo sont "indispensables".
Objectifs
En plus du système dopaminergique, les autres systèmes monoaminergiques notamment sérotonergiques sont aussi affectés dans la maladie de parkinson. La sérotonine (5HT) exerce une action analgésique au niveau de la corne dorsale de la moelle épinière. Dans cette étude, nous proposons d'étudier la transmission nociceptive spinale sur un modèle expérimental de la maladie de Parkinson chez la souris. Nous utiliserons des souris transgéniques qui permettront de cibler les neurones à sérotonine par des approches d'optogénétique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mettre en évidence le rôle des neurones à sérotonine dans le contrôle de la transmission nociceptive et son altération dans un modèle de douleur induit par la maladie de parkinson. L’identification des réseaux impliquant les neurones à sérotonine permettra de mettre au jour de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourront ensuite amener de nouveaux traitements pour améliorer le bien-être des patients parkinsoniens. Associés aux traitements des symptômes moteurs, ils apporteront un réel bénéfice aux patients dont la qualité de vie tendra à s’approcher de celle des sujets sains.
Procédures
Dans cette étude, 312 animaux recevront : -Une chirurgie stéréotaxique cérébrale (environ 1h30) et une spinale (environ 45min), -Une stimulation optogénétique d'une durée de 3 min également de l'entrainement comportemental de 10 min. -Electrophysiologie : 2h
Impact sur les animaux
Les animaux subiront deux interventions chirurgicales par stéréotaxie au niveau cérébral et spinal qui présentent des risques potentiels d'infection, d'hypothermie et de douleur. La stimulation thermique à l'aide d'un faisceau infrarouge utilisée pour mesurer le seuil du retrait de la patte arrière peut provoquer une rougeur cutanée.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour l'analyse histologique
Remplacement
Il n'existe aucun modèle in vitro sur culture cellulaire pouvant reproduire la physiopathologie étudiée dans ce projet. En effet, nous travaillons sur les relations entre réseaux nerveux matures et interconnectés dans le système nerveux. Ces connexions sont impossibles à reproduire in vitro. Les études in vivo sont donc indispensables.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum en tenant compte des contraintes expérimentales pour obtenir des résultats statistiquement cohérents et significatifs. La taille des cohortes par groupe a été ajustée aussi pour tenir compte de la variabilité inter-individuelle comportementale et du taux de succès des différentes procédures réalisées chez l’animal.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe au sein de l’animalerie dans un environnement enrichi comprenant des tubes en carton et matériel de nidification. Leur entretien sera pris en charge par le personnel zootechnique. Les chirurgies seront réalisées par des experts et optimisés pour soulager le stress et la douleur post-op et des analgésiques seront adaptés. Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long de l’étude. Après la chirurgie, les animaux seront surveillés avec une attention renforcée pour limiter la perte du poids (cage de stabulation 24h sur 24 sur un tapis chauffant, réhydratation, injection bi quotidienne sous-cutanée de saline 0,9% et saline-glucose 5%, nourriture humidifiée sera déposée dans la cage). En cas de problème, une intervention immédiate et selon les points limites spécifiques une conduite à tenir en fonction des points limites généraux et spécifiques. En cas de blessure, les plaies seront nettoyées et désinfectées. En cas de non amélioration de l'état général de l'animal, le responsable du projet prendra la décision de la nécessité de mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée car ce modèle d'espèce génétiquement modifiée permet de cibler des populations de neurones identifiées. D'autre part, le modèle inflammatoire a été largement utilisé chez la souris. Il s'agit d'un modèle animal très reproductible, permettant d'inclure le plus faible nombre d'animaux possible dans les protocoles. L’étude doit être réalisée à l’âge adulte lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le système nerveux est mature. D’où le choix de souris adultes âgées de 8 à 12 semaines.
Etude de l’impact d’un facteur de risque génétique sur une maladie du cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
56 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection de fibrilles dans une structure cérébrale liée à la mémoire, puis sont gardées deux mois avant d'être tuées pour analyse. Le projet compare des souris porteuses de la forme APOE3 ou APOE4 pour comprendre comment ce facteur de risque aggrave une maladie du cerveau. Le porteur affirme qu'aucune alternative cellulaire ne convient et que la souris reste un outil "unique" pour étudier ces mécanismes.
Objectifs
L’apolipoprotéine de forme APOE4 est un facteur de risque génétique dans plusieurs maladies du cerveau, contrairement à son homologue neutre APOE3. L’objectif de cette étude est de comprendre comment la présence de ce facteur de risque aggrave ces maladies du cerveau. Nous testerons par exemple si la présence de APOE4 accélère la progression de la pathologie par rapport à la présence de APOE3. Nos premiers travaux montrent que des voies de signalisations spécifiques sont altérées par la présence de APOE4 et l’objectif de ce projet est de valider ces données à l’aide de différentes techniques et sur un plus grand nombre d’individus. Cette étude permettra de mieux comprendre le mode d’action du facteur de risque pour pouvoir ensuite mieux diagnostiquer et/ou prévenir ces maladies.
Bénéfices attendus
En utilisant des modèles animaux exprimant un facteur de risque (tel que APOE4), nous pouvons étudier la manière dont il aggrave une pathologie. La mise en évidence d’un lien de cause à effet entre APOE4 et un marqueur de la maladie pourrait permettre de comprendre certains aspects cliniques chez l’Homme car le facteur APOE4 est un facteur de risque associés à certaines maladies du cerveau seulement. En élucidant des bases mécanistiques à leur mode d’action, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine en permettant par exemple d’adapter de nouvelles thérapeutiques. Une validation de nouvelles cibles altérées par le facteur de risque dans la maladie ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques, et pourraient également aider à un meilleur diagnostic de cette maladie. En effet, avec le vieillissement, il est parfois difficile de diagnostiquer certaines maladies du cerveau qui présentent des symptômes similaires, malgré la présence de marques pathologiques différentes. La validation de nos cibles est importante à ce niveau car elles pourraient servir de biomarqueurs pour mieux diagnostiquer les patients.
Procédures
Procédure chirurgicale : chirurgie stéréotaxique pour injections de fibrilles aSyn dans une structure cérébrale liée à la formation de la mémoire sur 56 animaux. Le délai post-chirurgical avant la mise à mort de l’animal est de 2 mois. Les souris transgéniques exprimant le facteur neutre humain APOE3 (28 animaux) ou APOE4 (28 animaux) sous la forme KI (en lieu et place du gène murin) seront élevées pendant 5 mois. Elles ne présentent à cet âge aucun signe de dysfonctionnement connu (Jackson laboratories).
Impact sur les animaux
Douleurs sur la zone d’incision chirurgicale prévenue par l’application d’un analgésique local. Douleurs post-opératoires minorés par des antalgiques. Potentielle inflammation évitée par une injection d’anti-inflammatoire non stéroidien. Stress ou un comportement anormal peuvant survenir suite aux chirurgies surveillés quotidiennement pendant une semaine complète de récupération.
Devenir
Tous les animaux (56) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
La propagation de protéines mal conformée dans différentes structures du cerveau est une caractéristique majeure des maladies du cerveau. Nous utilisons un modèle animal, la souris, pour mimer cette propagation (dans ce projet des fibrilles de synucléine) afin d’étudier les mécanismes moléculaire et cellulaires que cela provoque. Une fois injectées, ces fibrilles de synucléine induisent des altérations mesurables dans différentes structures cérébrales grâce aux connections qu’elles ont entre elles. Il n’est donc pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur les groupes expérimentaux selon les techniques utilisées (approches moléculaires et analyses immunohistologiques). Les calculs faits tiennent compte de la variabilité inter-individuelle qui sera réduite compte tenu que nous utiliserons seulement des animaux mâles dans nos expériences, mais augmentée selon l’efficacité des injections de fibrilles aSyn. Ces dernières seront évaluées à l’aide de tests statistiques adaptés après analyse par immunohistologie.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ceux-ci bénéficieront de soins appropriés pour optimiser le bien-être des souris, tels que des éléments d’enrichissement (matériel de construction du nid, barre à ronger) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux avant et après la chirurgie. Des mesures de raffinement sont prises lors de la chirurgie : anesthésie gazeuse supplémentée par une couverture analgésique locale, pommade d’anesthésique au niveau des oreilles (barres d’oreille du cadre stéréotaxique), injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien, pommade à base de vitamine A contre le dessèchement occulaire, tapis chauffant thermostaté préservant la température de l’animal et cage placée en zone réchauffée apr ès l’opération. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir après la chirurgie : la surveillance des souris se fait 1X par semaine de façon détaillée (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture, pesées) permettant de s’assurer du bien-être des souris. Un personnel autorisé et expérimenté pratiquera la chirurgie (formation à la pratique des actes chirurgicaux sur les animaux utilisés à des fins scientifiques) et la mise à mort si un point limite est atteint.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est la souris. Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau car il possède des structures neuro-anatomiques comparables à celle du cerveau humain. En particulier l’hippocampe, le cortex frontal, et les connections nerveuses qui leur sont associées, sont des structures affectées de façon primaire dans ces maladies qui touchent la mémoire. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (3-5 mois) pour avoir des informations sur les interactions entre le facteur de risque génétique étudié dans un cerveau mature et non en formation/développement. Cet âge nous permet également de nous affranchir des effets du vieillissement, pour éviter les facteurs confondants, le vieillissement étant également un facteur de risque des maladies du cerveau en général.
Évaluation de l’exposition paternelle chronique à de faibles doses de polluants environnementaux persistants sur le développement embryonnaire chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mâles reçoivent par voie orale de faibles doses de polluants pendant trente-cinq jours, passent un test comportemental, puis sont croisés avec des femelles dont les embryons sont analysés, tous les animaux étant tués pour prélever testicules, cerveau et foie. Le porteur annonce un stress minimal lié à l'administration et surveille le risque de fausse route, avec un point limite de perte de poids de 10 %. Il cherche à évaluer des effets épigénétiques de l'exposition paternelle et affirme que la spermatogenèse et le développement embryonnaire ne sont possibles qu'in vivo.
Objectifs
L'objectif de l'étude est de révéler les effets de l'exposition chronique à faible dose sur le système reproducteur mâle en mettant l'accent sur les mécanismes épigénétiques. 1) Analyser les effets des polluants sur le nombre de spermatozoïdes et la méthylation de l'ADN. 2) Révéler les effets sur la méthylation de l'ADN dans le cerveau, le foie et les testicules embryonnaires. 3) Analyser les modifications du comportement de la descendance des animaux traités.
Bénéfices attendus
Nous répondrons à plusieurs questions. Nous chercherons à savoir si l'exposition à de faibles doses de polluants environnementaux persistants modifie la santé reproductive des souris mâles, le nombre de spermatozoïdes et si elle induit des altérations épigénétiques. Nous nous demanderons si les éventuels effets induits chez les mâles influencent le développement embryonnaire des futurs embryons tels que le cerveau, le foie et les testicules et, enfin, si le comportement des animaux adultes est altéré.
Procédures
Les animaux recoivent, par administration orale (0.1ml), des polluants à faible dose, 1 fois par jour, tous les 2 jours, pendant 35 jours. Cette intervention dure 30 secondes en moyenne. Le test de comportement durera 5 minutes et ne sera pas répété.
Impact sur les animaux
Les concentrations des polluants utilisés sont faibles et les composés seront dissous dans l'eau. Le stress lié à l'administration sera minimal. La fausse-route lors de l'administration est un risque qui sera surveillé. Le test de comportement peut générer une anxiété, un stress qui seront observés mais non répétés.
Devenir
Tous les animuax sont mis à mort à la fin de la procédure: nous analyserons les organes cibles de l'étude (testicules, cerveau et foie).
Remplacement
Le modèle de souris est couramment utilisé dans les études toxicologiques. Nous ne pouvons pas reproduire les effets sur le système reproducteur dans un système in vitro en raison de la complexité de la spermatogenèse et du développement embryonnaire très complexe et qui n’est possible qu’in vivo.
Réduction
Nous réduirons le nombre d'animaux en utilisant, pour les trois groupes de composés téstés, un seul groupe d'animaux contrôles. Cependant, l’utilisation de souches non consanguines nécessite 12 animaux par lot en raison de la forte variation entre les animaux, pour obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les composés seront administrés par voie orale, par des personnes formées et compétentes pour ce geste technique. Les souris seront traitées seulement tous les deux jours, ce qui aidera à réduire le stress. Les polluants testés sont dissous dans de l'eau. Application de points limites : perte de poids de 10% maximum, les animaux seront pesés 3 fois par semaine. Pour minimiser les effets indésirables, les animaux seront hébergés par lot de 4.
Choix des espèces
La souche Swiss RjOrl, souche non consanguine, est un modèle de choix pour les études. Les souches non consanguines sont utilisées dans de nombreuses études toxicologiques. Pour comprendre comment des facteurs toxiques influencent la gamétogenèse au cours du développement, le modèle de la souris est judicieux car très utilisé dans l’étude du développement chez les mammifères. Nous utiliserons des souris mâles adultes de 5 semaines car les jeunes animaux sont plus sensibles aux effets de la pollution. Nous utiliserons des animaux adultes lorsque la première vague de spermatogenèse sera accomplie et que les animaux seront capables de produire des spermatozoïdes. Lorsque le traitement sera terminé, les animaux auront atteint l'âge de deux mois, de sorte que les mâles seront capables de féconder les femelles. Pour l'étude embryonnaire, nous croiserons ces animaux mâles avec des femelles âgées de 8 semaines (à cet âge les femelles sont fertiles) et les embryons de 15 jours seront analysés.
Effet de la crise de migraine induite par des donneurs de monoxyde d’azote sur la dépression corticale envahissante chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Ils reçoivent des injections de donneurs de monoxyde d'azote censés reproduire la migraine, subissent un test comportemental de sensibilité faciale au filament de von Frey, puis des enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie profonde sans réveil après application de chlorure de potassium. Le porteur indique comme seul effet attendu une allodynie faciale et reconnaît que le modèle ne reproduit pas tous les aspects de la migraine. Il affirme qu'un "animal entier avec un système nerveux intégré" est un préalable et juge les méthodes in silico "trop primaires".
Objectifs
L’isosorbide dinitrate (ISDN) et la nitroglycérine (NTG), sont des donneurs de monoxyde d’azote (NO). Ils sont utilisés comme modèles de migraine chez les rongeurs en raison de leur capacité à induire des céphalées chez les humains. Cependant, il est important de noter que ces modèles ne reproduisent pas tous les aspects de la migraine, notamment la manifestation d'aura ? De plus, leur utilisation doit être combinée à d'autres modèles pour obtenir une compréhension complète de la pathologie de la migraine. Le chlorure de potassium (KCl) est utilisé comme modèle pré-clinique de dépression corticale envahissante (CSD) dans la migraine avec aura car il est capable de déclencher une décharge électrique similaire à celle qui se produit dans le cerveau lors d'une crise de migraine. En utilisant ce modèle, en combinaison avec l’ISDN ou le NTG, nous pourrons étudier les mécanismes sous-jacents de la CSD et de la migraine, ainsi que tester de nouveaux traitements potentiels. L'objectif est d'évaluer la faculté de deux donneurs de NO à altérer le seuil de déclenchement et le nombre des épisodes de CSD provoqués par application de concentrations croissantes de KCl au niveau cortical chez le rat anesthésié. La CSD est caractéristique des évènements survenant lors du déclenchement des crises de migraine et constitue dans la littérature un outil pour étudier la migraine avec aura.
Bénéfices attendus
A moyen terme, en combinant deux modèles de migraine chez les rongeurs (Isosorbide dinitrate+chlorure de potassium et Nitroglycérine+chlorure de potassium), ce projet a pour but d’améliorer les outils existants dans la recherche pré-clinique pour étudier la physiopathologie de la migraine avec aura. Si nous arrivons à identifier de nouveaux acteurs ainsi que leurs rôles, cela nous permettra de mieux comprendre cette pathologie. A plus long terme, ces études peuvent aider à développer de nouveaux traitements pour soulager les patients souffrant de migraine avec aura.
Procédures
Les interventions dans ce projet sont prévues sur une durée maximale de 2 semaines. 1/ Injections (intra péritonéales i.p.) sur des animaux vigiles (Maximum 4). Chaque animal reçoit au maximum 1 injection i.p. par jour (durée d’intervention : 1min). 2/ Réalisation des enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie générale profonde au 5ième jour (protocole ISDN), ou 8ième jour (protocole NTG). 3/ La sensibilité mécanique est mesurée par un test de von Frey qui consiste à appliquer sur la face du rat (zone périorbitaire) une gamme de filaments de von Frey, calibrés pour exercer une force (exprimée en grammes) constante. Les rats sont habitués à ce test durant les 5 jours. Ces mesures sont peu douloureuses (durée de stimulation 3 sec) puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement. Tous les jours, les rats seront soumis au test comportemental de von Frey et la force exercée qui entraine le retrait de la tête sera mesurée sur chaque rat, avant et après l’administration de saline, ISDN ou NTG.
Impact sur les animaux
Selon la littérature et notre expérience avec le modèle Isosorbide dinitrate et Nitroglycérine ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux autre que le développement d'une allodynie, surtout à niveau facial. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels comme manger et boire. Aucune nuisance ou effet indésirable est attendu après l’administration de chlorure de potassium car elle aura lieu chez l’animal anesthésié (procédure sans réveil).
Devenir
Impossibilité de récupérer les animaux du fait de la procédure effectuée et des risques irreversibles (infectieux traumatiques) en cas de réveil.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Il n'existe pas dans la littérature aucune méthode alternative (in vitro ou in silico) pouvant répondre à l'efficacité d'un produit à potentiel thérapeutique antimigraineux. Un animal entier avec un système nerveux intégré, même sous anesthésie, est un préalable à une étude pertinente dans le domaine de la douleur. Une méthode in vitro ne pourrait rendre compte de la douleur car elle supprimerait de nombreux paramètres (régulations...) et rendrait le résultat réducteur voir inadapté. Des études électrophysiologiques chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence le déclenchement d'évènements de dépression corticale envahissante après l'application de chlorure de potassium. Les études in silico constituent dans le domaine de la migraine encore une étape encore trop primaire aujourd'hui.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum (n=10/groupe/sexe). Un seul groupe témoin sera utilisé (5 injections de saline). Le nombre d'animaux par groupe est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets (http://www.quantativeskills.com/sisa). D’après les données du laboratoire nous prévoyons une perte maximum de 20 % de rats (qui pourront être écartés de l'étude), en raison de l'instabilité ou de la perte en cours de manipulation in vivo des enregistrements électrophysiologiques (baisse très importante de la pression artérielle témoin d'un problème homéostasique, ou perte du signal de courants corticaux).
Raffinement
L’expérience des travaux précédents (Dallel et al., 2017) montre que suite aux injections uniques ou répétées d'ISDN le rat ne présente aucun trouble moteur ou postural affectant ses capacités à se déplacer, à satisfaire ses besoins physiologiques (alimentation hydratation...). L'allodynie ne se traduit pas par une fuite ou une agressivité lors de la manipulation pendant et en dehors des sessions de test de sensibilité mécanique. La prise de poids reste normale. Néanmoins, si au cours de l’expérimentation, nous observons que les animaux ont de grosses difficultés à se mouvoir, se toiletter, se relever pour se nourrir, ou un mauvais état de leur pelage, ils seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital (150 mg/kg). Pour l'enregistrement électrophysiologique, les expériences peuvent être interrompues par une mise à mort par overdose de pentobarbital iv, si les conditions physiologiques d'enregistrement ne sont plus assurées, suite à une altération durable et irréversible des paramètres cardiorespiratoires.
Choix des espèces
La souche Sprague Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires . C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 8-12 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire. Les différents études sur la migraine sont réalisées sur des animaux adultes. Cette pathologie est majoritaire chez les personnes adultes. Chez l'enfant, ses caractéristiques sont un peu différentes de l'adulte.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
18 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans une procédure impliquant un niveau de souffrance léger. Chacune subit une biopsie du bout de la queue ou de l'oreille sous simple contention, geste que le porteur décrit comme une douleur légère avec un stress lié à l'immobilisation. Les souris sont gardées vivantes après le prélèvement, leur devenir dépendant ensuite du génotypage, sélection pour d'autres projets, maintien des colonies, ou mise à mort pour prélèvement de tissus ou faute d'usage. Il présente la biopsie comme la méthode la plus performante pour identifier les lignées modifiées et entretenir ces élevages.
Objectifs
Le laboratoire participe à plusieurs projets qui nécessitent le développement et l’utilisation de modèles murins génétiquement modifiés. Ce projet a pour objectif d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Chaque animal, identifié par tatouage aux doigts ou par injection de nanopuces, sera caractérisé par génotypage sur une biopsie de bout de la queue ou d’oreille. Cette demande d’autorisation de projet de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour différents projets de recherche (inclus dans d’autres demandes d’autorisation de projet) menés au laboratoire ; - sélectionner les animaux d'entretien des colonies ; - sélectionner les animaux pour les prélèvements d’organes ou de tissus post mortem pour des études ex vivo (hors champ de demande d’autorisation de projet).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt.
Procédures
Une biopsie de la queue ou un bout d’oreille (durée : quelques secondes) est réalisée sur animal vigile puis déposé dans un microtube. Dans la très grande majorité des cas, un seul prélèvement sera réalisé par animal. En cas de problème lié à l’analyse génétique de la biopsie, un deuxième prélèvement pourra être envisagé.
Impact sur les animaux
Les biopsies de queue ou d’oreille sont des gestes qui provoquent une douleur légère. L’animal est maintenu en contention pendant la biopsie ce qui représente une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet de recherche (inclus dans d'autres demandes d’autorisation de projet); b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies ; c/ ils sont euthanasiés pour des prélèvements de tissus post mortem ; d/ ils sont euthanasiés si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoins du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
Il n’existe à ce jour pas de méthodes aussi performantes que la biopsie de queue ou d’oreille pour réaliser le génotypage des souris, qui est nécessaire pour valider les études utilisant des lignées d’animaux génétiquement modifiés, et entretenir ces lignées.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces permettant de caractériser et sélectionner les animaux génétiquement modifiés. Les personnels de l’animalerie établissent, en concertation avec le responsable de la lignée, les plans d’élevage en amont, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux génotypés.
Raffinement
Les biopsies sont réalisées par un personnel expérimenté. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Elles sont réalisées avec du matériel adapté permettant un geste rapide et précis. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Un suivi des animaux est réalisé suite à cette procédure et des points limites adaptés ont été mis en place.
Choix des espèces
Les modèles murins génétiquement modifiés sont très utilisés pour comprendre des pathologies humaines car les outils pour générer ces modèles sont bien connus et très efficaces. Le temps de génération d’une lignée est court (3 mois) et son élevage en laboratoire simple. Les biopsies sont réalisées sur des animaux âgés d’au moins 8 jours. L'essentiel des lignées sont génotypées à cet âge pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte.
Etude des effets thérapeutiques lors du traitement par radiothérapie interne via l’utilisation de nanoparticules chargées au Rhénium-188 et d’un bio-implant dans le cas du glioblastome chez le rat (2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intracérébrale de cellules tumorales, la pose d'un implant biodégradable et selon les groupes une radiothérapie, avec un suivi IRM hebdomadaire et un transport de 95 kilomètres pour l'irradiation externe. Le porteur décrit fatigue, perte de poids et prostration possibles, et fait tuer tous les animaux pour éviter la souffrance liée à la croissance du glioblastome. Il juge le recours à deux modèles de rats "indispensable" pour obtenir des données transférables à la clinique.
Objectifs
Le développement de ce projet chez le rat permettra d'évaluer si l'attraction de cellules cancéreuses résiduelles dans un implant biodégradable en zone confinée (la cavité d'ablation de la tumeur dans le cerveau) apporte un bénéfice préclinique en synergie d'une radiothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements du fait de l'inclusion d'un acte de radiothérapie externe à distance du site principal.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavité d'éxérèse dans le glioblastome en synergie d'irradiation pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) - la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h) - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose en locorégional d'implants bio-polymère (durée d'environ 1h30) - l'association ou non à des radiothérapies (durée d'environ 30 minutes fractionnée en 2 ou 3 fois selon le type de radiothérapie). En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 3. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire. L'un des actes (radiothérapie externe) inclue un transport aller-retour d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.
Devenir
Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.
Remplacement
La thématique de recherche de notre équipe concerne le développement d’approches thérapeutiques pour le traitement du glioblastome et l’étude des modalités de mise en place posant à la fois des questions fondamentales et des questions de biotechnologies pour la santé. Le projet ici proposé a pour but l’étude du piégeage tumoral au travers de bio-implants polymères pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes de piégeage (au travers d’un leurre environnemental) et celle d’élimination (au travers de l’application d’une procédure de radiothérapie interne vectorisée). L’utilisation de deux modèles pour valider ces procédures et obtenir des données interprétables par la suite valorisables par la publication et transférables à la clinique est indispensable pour répondre aux questions et livrables scientifiques indiqués dans le résumé non technique.
Réduction
En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur des cellules dissociées ainsi que des sphéroïdes ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Un groupe référence incluant la radiothérapie externe est introduit, toutefois sans modifier le nombre initial d'animaux prévus pour l'étude, tout en devant générer des données statistiquement interprétables.
Raffinement
Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu.
Choix des espèces
Ce projet sera développé chez le rat, permettant des gradients d’infusion de chimio-attractant et des migrations cellulaires sur des volumes et distances plus importants que chez la souris. La possibilité d’utiliser deux types cellulaires dans deux types de rats est envisagée afin d’investiguer les réponses dans un cadre de xénogreffe d’une part et dans un cadre syngénique d’autre part (permettant d’étudier le rôle de l’immunité). En effet, nous avons validé des cellules humaines modifiées (de niveau sécuritaire 1) sur-exprimant le récepteur CXCR4, jouant un rôle dans les réponses aux radiations, et une protéine de fluorescence ; ce modèle sera utilisé chez le rat nude. Par ailleurs la lignée cellulaire F98 (modèle de GB de rat) sera utilisée chez le rat Fischer pour les études syngéniques. Les rats seront utilisés à 8 semaines car ils seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.
Conséquences neurobiologiques et comportementales d’un stress précoce en deux temps chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Séparées de leur mère trois heures par jour pendant quatorze jours puis soumises à une agression sociale et aspergées d'urine de mâle, elles passent six tests comportementaux, des prises de sang et deux chirurgies d'injection virale et d'implantation de fibre optique. Le porteur reconnaît une gêne durable, anhédonie, anxiété et apathie, "qui ne peut être soulagée", et n'euthanasie qu'au-delà de points limites. Il vise à distinguer souris vulnérables et résilientes et affirme que ces troubles ne peuvent être reproduits sans animaux vivants.
Objectifs
La dépression est une maladie psychiatrique extrêmement répandue et représente la première cause d’invalidité dans le monde. Elle est précipitée par des évènements de vie néfaste, notamment la maltraitance infantile, qui est le plus grand prédicteur pour le développement de dépression et de suicide à l’adolescence et à l’âge adulte. Cette adversité est par ailleurs associée à une forte résistance aux traitements utilisés en clinique. Par ailleurs, la dépression est majoritairement précipitée par l’expèrience de plusieurs évènements stressants qui arrivent à différents moments de la vie. Cependant, les conséquences à long terme de la maltraitance infantile varient d’un individu à l’autre et certains vont présenter la capacité de s’adapter en réponse au stress et éviter ses conséquences néfastes, c’est le concept de résilience au stress précoce. Comprendre les mécanismes neurobiologiques qui contribuent à la résilience est primordiale afin de mettre en évidence des facteurs de protection face au développement de psychopathologies qui serviront de nouvelles cibles thérapeutiques pour ces patients. Le système noradrénergique du locus-coeruleus joue un rôle majeur dans la résilience au stress chez l’adulte. Par ailleurs, si certaines études ont montré une dérégulation de ce système dans des modèles animaux de stress précoce, son rôle dans la résilience au stress précoce n’est pas connu. L’objectif de ce projet est de mettre en place un modèle murin de stress précoce en deux temps chez la souris. Nous associerons un modèle de séparation maternelle avant le sevrage avec un stress juvénile d’agression sociale à l’adolescence afin de dissocier des groupes d’animaux susceptibles vs résilients en fonction de leur phénotype comportemental à l’âge adulte et d’étudier si des altérations différentielles sur le système nerveux apparaissent. Pour cela nous utiliserons une approche comportementale dans le but d’étudier les conséquences du stress précoce sur le développement de comportement anxio-depressif à l’âge adulte ainsi que des techniques d’immunohistochimie, de biologie moléculaire et d’imagerie pour étudier les conséquences du stress précoce en deux temps sur le système noradrénergique en fonction de la susceptibilité au stress. Les résultats de ce projet serviront de base pour développer des modèles de manipulation génétique ou fonctionnelle de ce système dans le but d’enrayer les conséquences à long terme du stress précoce et de promouvoir la résilience.
Bénéfices attendus
L’adversité précoce est sans conteste le premier facteur de vulnérabilité pour les maladies psychiatriques telles que la dépression, les troubles anxieux, le syndrome de stress-posttraumatique, et pour le suicide. Outre la souffrance morale induite par ces pathologies, elles constituent un enjeu majeur de sante publique compte tenu du fardeau socio-économique engendré. Ces pathologies sont difficiles à prendre en charge, avec des traitements qui sont actuellement peu satisfaisants en termes de coût et d’efficacité. Ce projet a un intérêt majeur puisqu'il permettra d'améliorer la compréhension de la neurobiologie de dépression et de la résilience afin de concevoir de nouvelles approches thérapeutiques plus efficaces pour ces patients.
Procédures
- Stress précoce en deux temps : un stress de séparation maternelle de 3h par jour pendant 14 jours et un stress juvénile d’agressions sociale de 5 minutes pendant 2 jours. Au cours du stress d’agressions, les souris seront espergées d’urine de mâles. Les souris seront ensuite testées dans 6 paradigmes comportementaux anxio-depressif de 5 à 10 minutes sur une période de 3 semaines à l'âge adulte. Chaque souris n'est exposé qu'une seule fois à chaque test de comportement. Par la suite, les souris recevront 3 prélèvements de sang sur une période de 3 heures. - 2 procédures chirurgicales : une première procédure d'injection de virus sera réalisée suivie d’une deuxième procédure d'implantation de fibres optique, entre 2 à 3 semaines suite à l'injection de virus. Chaque procédure chirurgicale aura lieu sous anesthésie pour une durée de 1 ou 2 heures chacune.
Impact sur les animaux
La nature de cette expérience aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie). Lors de la procédure de stress juvénile de défaite sociale, les animaux sont mis en contact avec une souris agressives 5 minutes par jour pendant 2 jours. Des blessures ou lésions induites par les agressions physiques lors de cette procédure peuvent être observées. Toutes les attaques sont surveillées et stopées si elles perdurent afin d’éviter la formation de lésions. Les souris agressives seront isolées à leur arrivé à l’animalerie pour éviter les combats entre elles.
Devenir
A l'issue des 4 procédures, les animaux seront mis à mort et les cerveaux utilisés pour des analyses immunohistologiques ou de biologie moléculaire.
Remplacement
L’objectif de ce projet de recherche étant d’étudier l’émergence de troubles psychiatriques en réponse au stress, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Notre projet nécessite l’emploi de plusieurs techniques expérimentales. Compte tenu de la littérature et de notre expérience, nous utiliserons les tests statistiques pour analyser nos données. Ces tests nécessitent d’avoir un nombre minimum d’animaux pour atteindre les seuils statistiques de significativité en fonction des expériences réalisées . D’après notre expèrience, une grande variabilitée individuelle peut être observée lors des enregistrements en imagerie calcique en fonction de l'expression virale et du site d'implantation. Basé sur la littérature des effets comportementaux du stress et des changements neurobiologiques qui y sont associés, un dimorphisme sexuel est suspecté . C’est pourquoi nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles en considérant ici le sexe comme une variable d’analyse supplémentaire.
Raffinement
La nature de certaines de nos expériences, en particulier celles dont le but est de déterminer les effets du stress et de la dépression sur le cerveau, aboutira à une gêne (anhédonie, anxiété et apathie) qui ne peut être soulagée. Par contre, si un animal est en souffrance selon les critères définis, alors, il sera euthanasié. Les conditions d’élevage des animaux seront optimisées avec la mise à disposition de plusieurs supports pour la construction des nids (carton, coton). Pour limiter l’angoisse des animaux, ceux-ci seront habitués à l’expérimentateur, au dispositif et à la pièce d’expérimentation pour éviter un stress supplémentaire. Les jeunes seront manipulés avec douceur et par des personnes habituées à manipuler des jeunes souriceaux. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et des protocoles analgésiques seront mis en place pour limiter la douleur des animaux. Des points limites ont été établis pour chaque procédure. Nous incluons ici une procédure pilote sur un petit nombre d’animaux, pouvant donner lieu à un arrêt total des expériences. Cette phase du projet combinant le stress en deux temps et deux procédures de chirurgies sera uniquement lancée si nous n’observons aucune surmortalité des petits par rapport aux conditions sans les chirurgies.
Choix des espèces
La souris est le modèle standard pour l'étude de la fonction des circuits cérébraux dans le cerveau des mammifères : i) l’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine ; ii) L'anatomie, la morphologie cellulaire, la biochimie et l'électrophysiologie du cerveau de la souris sont bien caractérisées ; iii) Il existe une vaste littérature sur le comportement de la souris, l'apprentissage et la mémoire. Par ailleurs, il est possible d'utiliser des souris Génétiquement modifiées. L’objectif du projet étant d’étudier les conséquences comportementales et neurobiologiques à long terme du stress précoce tel que la maltraitance infantile, dans notre modèle de stress précoce en deux temps, la séparation maternelle sera réalisée sur des animaux non sevrés et le stress juvénile d’agression sociales 1 semaine après le sevrage . Les tests comportementaux et analyses neurobiologiques seront réalisés à l’âge adulte.
Enregistrement de neurones spinaux pour le criblage de candidats médicaments antalgiques contre la migraine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
380 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent cinq injections d'un produit déclencheur de migraine, puis leurs neurones spinaux sont enregistrés sous anesthésie profonde, ce qui ne permet pas de les garder en vie. Le porteur décrit ces injections comme "brèves et indolores" et l'allodynie comme modérée, tout en classant la procédure en sévère du fait de la répétition des injections. Il cherche à cribler des candidats médicaments antalgiques contre la migraine.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en place, valider, et utiliser un modèle de migraine expérimentale chez le rat pour tester des candidats médicaments anti-migraineux. Ce modèle est basé sur la mesure électrophysiologique de l’activité des neurones innervant la face et impliqués dans la génération de la sensation douloureuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester l’efficacité de candidats médicaments anti-migraineux sur des bases électrophysiologiques. Ainsi, il permettra de préciser le mode d’action des candidats médicaments, et d’avoir une meilleure évaluation de leur efficacité comparée à celle apportée par les tests comportementaux habituellement utilisés.
Procédures
Les animaux vigiles reçoivent 5 injections (1 jour sur 2) contenant un produit qui est connu pour pouvoir générer des migraines chez l’homme jusqu'au jour précédant la mesure électrophysiologiques. Les injections sont brèves et indolores.
Impact sur les animaux
L’injection i.p. du produit qui est connu pour pouvoir générer des migraines chez l’homme induit un stress très bref 1) due à la contention de l’animale et 2) une douleur très brève et modérée due à la pénétration de l’aiguille. En pratique, une injection correctement exécutée n’induit aucun reflexe défensif chez l’animal. L’état d’allodynie est modéré car d’après la littérature, les animaux traités ne présentent aucun signe comportemental de douleur spontanée. Cependant, la répétition des injections justifient une classification sévère.
Devenir
Les mesures électrophysiologiques sont invasives (elles se pratiquent sous anesthésie profonde) et ne permettent pas de garder les animaux en vie à la suite de l’expérience.
Remplacement
L’utilisation d’animaux pour les tests d'efficacité d’analgésiques/antalgiques est rendue nécessaire par le fait que les mécanismes physiopathologiques comme les mécanismes d'action des candidats-médicaments sont des processus complexe impliquant la totalité du système nerveux (de manière imagée, des communications réciproques entre le cerveau, la moelle épinière, et les tissus périphériques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit par 3 actions conjointes : 1) le soin apporté à chaque expérience, conjugué à plus de 10 ans de pratique dans le domaine (une spécialisation extrême est indispensable à l’obtention d’un taux de succès élevé); 2) le ciblage d’une population de neurone bien définie (neurones spinoparabrachiaux soit de la couche I, soit des couches III-V), qui permet de réduire les variations expérimentales liées aux caractéristiques individuelles des neurones enregistrés; 3) une approche par étape, avec des lectures intermédiaires des résultats, afin d’arrêter rapidement les plans d’expériences improductifs.
Raffinement
Les approches physiologiques chez l’animal anesthésié permettent un certain nombre de raffinements. Premièrement, la mesure de l'activité des neurones spinaux se fait chez l'animal anesthésié et permet de pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments sur la réponse à des stimuli très nociceptifs sans aucune souffrance pour l'animal (impossible chez un animal vigile). Deuxièmement, plusieurs doses de candidat médicaments peuvent être testées chez un même animal dans la même expérience, et il est possible de faire des prélèvements sanguins au cours de l’expérience (chez le rat) pour corréler l’exposition plasmatique aux effets observés. Troisièmement, le nombre d'animaux utilisés est réduit par le fait que chaque animal est son propre contrôle (principe des mesures répétées). Enfin, la mesure concomitante des paramètres cardiovasculaires apportent des renseignements connexes essentiels sur les caractéristiques du candidats médicaments.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce, ici le rat, dépend des données déjà acquises sur le candidat médicament à tester, et sur le développement de la recherche dans le domaine de la migraine. L’ensemble des mesures électrophysiologiques dans ce domaine s’est fait chez le rat.
Manipulation pharmacologique de canaux mis en jeu lors d’un challenge hypercapnique chez un modèle murin du syndrome d’Ondine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
698 souris vont être utilisées, une majorité tuée sans réveil, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance sans réveil et modéré. Des nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées puis tuées pour prélever une partie du système nerveux central, tandis que des adultes reçoivent des solutions par aérosol ou par voie intranasale sous anesthésie. Le porteur souligne que ces souris mutantes, modèles du syndrome d'Ondine, présentent une sensibilité accrue à l'anesthésie et un risque de défaillance respiratoire, l'arrêt cardiorespiratoire figurant parmi les points limites. Il teste des agents pharmacologiques sur des canaux respiratoires et affirme que cette fonction ne peut être étudiée que sur des souris vivantes.
Objectifs
Les syndromes d’hypoventilation alvéolaire centrale (SHAC) sont des pathologies associées à une dérégulation du fonctionnement du système nerveux autonome. Ces SHAC sont associées à une altération de la respiration, ils surviennent dès la naissance. Ces pathologies s’accompagnent d’une réduction voire d’une absence de réponse respiratoire à l’hypercapnie (trop de CO2 dans l’air inspiré), cette réponse est vitale et nécessaire pour éliminer le CO2 de l’organisme. L’endormissement et le sommeil s’accompagnent d’irrégularités respiratoires pouvant conduire à une situation d’hypercapnie, ainsi, les personnes atteintes de ce syndrome doivent tout au long de leur vie supporter une aide ventilatoire dès qu’elles s’endorment. Des cellules du système nerveux sont sensibles à l’hypercapnie, par le biais de canaux présents à la surface de leur membrane. Ces canaux sont sensibles aux variations d’acidité (trop de CO2). Les expérimentations seront réalisées chez des souris mutantes modèle d’un SHAC et leurs congénères sauvages. L’approche utilisée chez des souris nouveau-nées et juvéniles permettra d’identifier l’agent pharmacologique des canaux sensibles à l’acidité le plus efficace, elle nécessitera une chirurgie permettant d’isoler la partie du système nerveux central comportant la commande respiratoire. Chez les souris adultes, l’approche utilisée est non invasive, elle permettra de déterminer l’effet bénéfique d’un agent pharmacologique des canaux sensibles à l’acidité sur la respiration. In fine, les données obtenues devraient donc permettre de mieux comprendre comment ces canaux sensibles à l’acidité peuvent moduler la commande respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) permettront le développement de nouvelles pistes thérapeutiques dans le cadre des SHAC.
Bénéfices attendus
Les souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine que nous utilisons dans ce projet sont porteuses d’une mutation sur un gène dont la protéine est exprimée dans une population de neurones indispensables à la réponse respiratoire à l’hypercapnie (chémosensibilité au CO2/H+). A la naissance, ces souris ne présentent pas de réponse respiratoire à l’hypercapnie, cette dernière est partiellement restaurée chez les souris adultes. Le blocage des canaux sensibles aux protons pourrait potentiellement 1/améliorer la respiration des souris nouveau-nées, juvéniles ou adultes, 2/restaurer une réponse respiratoire à l’hypercapnie chez les souris nouveau-nées ou juvéniles et 3/restaurer ou potentialiser la réponse respiratoire à l’hypercapnie des souris adultes. De plus, nous souhaitons 1/identifier les cibles cellulaires et moléculaires des canaux sensibles aux protons au niveau de la commande centrale respiratoire et 2/déterminer si ces cibles évoluent selon l’âge des souris mutantes dont certaines récupèrent naturellement une faible réponse respiratoire à l’hypercapnie. In fine, les données obtenues devraient permettre de mieux comprendre comment les canaux sensibles aux protons peuvent moduler la commande centrale respiratoire. Ainsi, les éléments observés chez l’animal (dans des conditions non réalisables chez l’Homme) devraient permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques chez les patients.
Procédures
L’identification par tatouages et les prélèvements de bout de queue pour identification génétique des souris juvéniles mutantes et contrôles sont réalisés par un personnel formé et ne dure que quelques secondes. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité du modèle animal à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. Les souris mutantes et contrôles nouveau-nées et juvéniles sont anesthésiées (quelques minutes) puis euthanasiées par une méthode réglementaire afin d’isoler rapidement une partie du système nerveux central. Les souris adultes seront exposées via un système d’aérosol à une solution contrôle et une solution contenant un agent bloquant (10 minutes à chaque fois) avant la mesure non invasive des variables ventilatoires. 48h séparent l’administration de la solution contrôle par aérosol de celle de l’agent pharmacologique. Les autres souris adultes seront anesthésiées grâce à un gaz anesthésiant (pendant 10 minutes maximum) et dès l'anesthésie installée, l'administration par voie nasale de la solution contrôle et de l’agent bloquant (faible volume) sera réalisée. 48 heures séparent les 2 anesthésies. La mesure des variables ventilatoires chez les souris adultes sera réalisée de façon non invasive pendant 70min (1 fois par jour pendant 2 jours) dans une enceinte hermétiquement fermée et alimentée par un flux d’air en continu.
Impact sur les animaux
L’identification et le prélèvement caudal réalisé une unique fois chez l’animal pour la détermination de son génotype apparaît comme une source de douleur et de stress. Les données de la littérature mettent en évidence une sensibilité exacerbée à l’anesthésie chez ces souris mutantes modèles du syndrome d’Ondine ce qui conduit à un risque accru de défaillance respiratoire. L’administration intranasale du solvant ou de l’agent bloquant, peut entraîner une altération de la ventilation par obstruction des voies aériennes supérieures, sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des actes en vue des prélèvements et analyses nécessaires.
Remplacement
L’utilisation de neurones isolés en culture ne permet pas d’appréhender les relations entre les structures neuronales et de mettre en évidence le développement de réseaux substitutifs nécessaires à la correction de la pathologie. La fonction respiratoire nécessite l’utilisation de modèles murins ex vivo et in vivo. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues autrement que par un travail sur des souris vivantes. L’étude de l’influence des canaux sensibles aux protons sur la commande centrale respiratoire nécessite de conserver ex vivo un réseau vivant et fonctionnel de neurones et donc l’utilisation de souriceaux. L’étude des corrections des variables respiratoires par des agents bloquants des canaux sensibles aux protons ne peut être réalisée que sur des souris adultes vigiles, non contraintes et non anesthésiées.
Réduction
Nous utilisons aussi bien les souris mâles que les femelles dans nos travaux afin de limiter le nombre d’animaux. Le nombre total d’animaux impliqués sera de 698 (349 souris mutantes utilisés). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Ainsi, 23 souris nouveau-nées et 25 souris adultes mutantes par groupe sont nécessaires pour mettre en évidence des différences biologiquement significatives dans les variables respiratoires. Des tests statistiques seront réalisés a posteriori pour procéder à une interprétation fiable des résultats. Les mêmes animaux seront engagés dans l’analyse de la commande respiratoire et dans l’analyse des populations cellulaires impliquées.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. La température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’habituation aux enceintes de pléthysmographie (technique permettant de mesurer de manière non invasive la ventilation de la souris in vivo) se traduit par la disparition des épisodes d’augmentation anormale de la fréquence respiratoire et de toilettages des souris lorsqu’elles sont dans un nouvel environnement. Après 5 jours d’habituation, les souris sont calmes et leur respiration est régulière dès le placement dans l’enceinte. Les souris mutantes présentent une sensibilité exacerbée à l’anesthésie ce qui conduit à un risque accru de troubles respiratoires mortels lors des injections intranasales sous anesthésie. De ce fait, lors des injections intranasales de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris. En cas de défaillance cardiorespiratoire, l’anesthésie est stoppée, la souris est réanimée si nécessaire par l’expérimentateur. Les points suivants seront considérés comme des points limites : -tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire -modification du comportement caractéristique d’une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et ou terne, prostration, dos vouté) -anomalies pouvant entrainer une douleur intense ou une souffrance, par exemple une perte de la masse corporelle supérieure ou égale à 20 pour cent de la masse initiale de l’animal, plaies et ulcères, tumeurs, fractures… -Lors des injections intranasales de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons ou du solvant sous anesthésie, une surveillance accrue et en continue du rythme cardiorespiratoire est assurée par l’expérimentateur jusqu’au réveil complet de la souris du fait d’une sensibilité accrue des souris mutantes à l’anesthésie. L’arrêt cardiorespiratoire est considéré comme le point limite associés à ces injections.
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) sont depuis de nombreuses années les espèces animales de choix pour l’étude des mécanismes associés à la genèse et à la régulation de la respiration par la commande centrale respiratoire. Le modèle animal du syndrome d’Ondine n’existe, de nos jours, que sur modèle de souris mutées pour un gène sur des neurones impliquées dans la sensibilité au dioxyde de carbone. Ces souris mutantes ont été validées par des études antérieures. Le projet nécessite d’avoir accès à la commande centrale respiratoire dans des conditions qui ne peuvent être obtenues que par un travail sur les souris mutantes ; étude de l’influence par les canaux sensibles aux protons/dioxyde de carbone sur la commande centrale respiratoire ex vivo ; étude sur des tranches de tissu des propriétés électriques des neurones avec l’âge ; étude de la ventilation chez l’animal adulte vigil et de l’influence de l’agent bloquant des canaux sensibles aux protons/dioxyde de carbone appliqués par aérosol ou par administration intranasale.