Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Caractérisation de la lignée Pde2a2 +/-
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 48 dans des procédures classées sévères. Cette lignée modifiée pour réduire une protéine liée à l'autisme et à la déficience intellectuelle subit des tests sociaux et cognitifs, dont certains précédés de deux heures d'isolement, avant l'euthanasie et le prélèvement du cerveau, de la moelle épinière, des surrénales, des testicules et des ovaires, 120 animaux mourant au cours d'une perfusion intracardiaque. Le porteur qualifie les tests comportementaux de classiques et indolores et signale une anxiété possible liée au nouvel environnement et à l'isolement. Il indique avoir d'abord travaillé sur des lignées cellulaires et poursuivre directement chez la souris pour étudier les comportements.
Objectifs
Des mutations du gène PDE2A ont été découvertes chez des patients atteints d’autisme et de déficience intellectuelle, qui sont des maladies du développement du cerveau . La protéine PDE2A est très fortement présente dans le cerveau et a un rôle clé dans le développement des neurones, leur morphologie et fonctionnement. Ceci explique que des altérations de sa quantité puissent avoir un impact négatif sur le fonctionnement neuronal et induire des maladies du cerveau. La PDE2A regroupe trois protéines variantes qui se retrouvent à des emplacements distincts dans les neurones, dont la PDE2A2 que l’on retrouve spécifiquement dans la mitochondrie. Les mitochondries sont des petites unités présentes dans les cellules qui produisent de l'énergie sous forme d'ATP grâce au processus de respiration cellulaire. Des altérations de la mitochondrie sont d’ailleurs retrouvés chez les patients ayant des mutations sur le gène PDE2A ainsi que chez d'autres patients atteints de trouble du spectre de l'autisme. Nous avons récemment étudié la souris Pde2a+/- qui, comme les patients, a une quantité diminuée de tout les variants PDE2A. Nos récentes données montrent que cette souris est un bon modèle de maladie du cerveau, et qui présente des troubles socio-cognitifs similaires aux patients. Nous voulons à présent commencer l’étude de la souris Pde2a2+/- qui aura uniquement une quantité diminuée de PDE2A2, donc seulement au niveau de la mitochondrie. En effet, cela nous permettra de savoir si une atteinte unique au niveau de la mitochondrie est suffisante pour induire des troubles comportementaux.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle spécifique de la PDE2A2 au cours du développement du cerveau, et le lien entre la dérégulation de l'activité de cette enzyme au niveau de la mitochondrie et les troubles du neuro-développement comme la déficience intellectuelle, l'autisme et les troubles moteurs. Finalement, l'évaluation de la pertinence de ce modèle par rapport aux patients atteints d'une mutation permettra de mettre à disposition de la communauté scientifique un potentiel nouveau modèle de maladie du neurodeveloppement.
Procédures
Différents tests sociaux et cognitifs seront réalisés ponctuellement et qui dureront, selon les tests, de 3 minutes à 2 heures. Ces tests se feront chez les souriceaux, à l'adolescence (un mois) et à l'âge adulte (dès deux mois). Certains animaux seront soumis à une perfusion intra-cardiaque, et une injection d'anesthésique et une d'antalgique seront effectuées sur chaque animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une contention plusieurs fois au cours de leur vie, que ce soit pour des pesées ou pendant les différents tests. Les tests comportementaux réalisés sont classiques et indolores. De l'anxiété peut être attendue lors des différents tests liée à un nouvel environnement notamment pour les tests d'anxiété ou lors de l'isolement dans l'actimètre ou pendant le test d'interaction sociale avec 2h d'isolement auparavant.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales. Nous récupérerons différents organes (cerveau, moelle épinière, surrénales, testicules et ovaires) afin de réaliser des études moléculaires. 120 de ces animaux subiront une perfusion intra-cardiaque, sous anesthésie générale, au cours de laquelle ils décèderont afin de pouvoir réaliser une étude sur les coupes de cerveau.
Remplacement
Avant de réaliser cette étude, nous avons préalablement travaillé sur des lignées cellulaires, ce qui nous a permis de confirmer le rôle de PDE2A2. Notre étude portant globalement sur des maladies du neurodéveloppement et sur le déficit intellectuel et les troubles du spectre de l'autisme, nous devons poursuivre ce projet directement chez la souris pour étudier les différents comportements associés à ces maladies afin de valider le rôle de la forme mitochondriale de PDE2A.
Réduction
Dans un objectif de réduction, nous analyserons nos résultats après chaque groupe expérimental. Si les résultats des 2 premiers groupes expérimentaux sont significatifs et identiques, nous n'utiliserons pas le 3ème groupe. De plus, les organes de tous les animaux utilisés au cours de ce projet seront récupérés pour réaliser des études moléculaires, ce qui évitera l'emploi d'animaux supplémentaires. Pour garantir une puissance statistique (t test) suffisante à cette étude tout en minimisant le nombre d’animaux à utiliser, nous prévoyons un minimum de n=10 animaux par groupe, avec 3 expériences indépendantes. Chaque expérience sera réalisée 3 fois afin de garantir la reproductibilité des résultats, et pour chaque répétition, nous avons besoin d'un minimum de 10 animaux par groupe afin d'obtenir un résultat significatif.
Raffinement
Lors des procédures chirurgicales, les animaux seront au préalable anesthésiés, accompagné d'un analgésique et d'un antalgique afin de réduire la douleur de l'animal.
Choix des espèces
Travailler avec des souris permet de comparer un phénotype "sauvage" avec des modèles transgéniques disponibles, comme les souris Pde2a+/-. De plus, le modèle murin permet d'étudier à la fois les comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensorimoteurs que l'on peut retrouver chez les patients atteints de troubles du neuro-développement. Des tests seront réalisés au 7ème, 10ème et 14ème jour après la naissance, ce qui correspond à l'enfance chez l'humain. Puis nous réaliserons d'autres tests à 1 mois, ce qui correspond à l'adolescence. Enfin, nous réaliserons des tests à l'âge adulte d'une souris (à partir de 8 semaines). Cela permettra d'évaluer l'impact de l'extinction partielle du gène Pde2a2 au cours du développement, et d'identifier les moments clefs où la protéine PDE2A2 est impliquée dans la pathologie.
Etude d’un gène protecteur de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
58 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris Tau22, modifiées pour développer une pathologie de type Alzheimer, subissent une biopsie de la queue pour génotypage, une injection intracérébrale de vecteur de thérapie génique sous anesthésie, puis des tests de mémoire de reconnaissance d'objet et de labyrinthe en Y avant l'euthanasie et le prélèvement des tissus. Le porteur nomme les tests comportementaux et les qualifie de non invasifs, et indique que la chirurgie peut provoquer, rarement, infection ou convulsions. Il justifie l'euthanasie par le fait que ces animaux transgéniques ne peuvent être replacés ou relâchés.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une pathologie qui se caractérise par des troubles de la mémoire et par une perte progressive des facultés cognitives. Le processus de la maladie débute avec l’accumulation d’agrégats toxiques dans le cerveau. En particulier, la mort des cellules nerveuses est due à une accumulation de protéines toxiques. À ce jour, les traitements sont donnés aux patients à des stades trop avancés de la maladie. Il est donc important de développer des approches thérapeutiques qui peuvent agir plus tôt dans le processus de la pathogenèse et en particulier qui peuvent favoriser l’élimination de ces agrégats toxiques. En ce sens, le projet vise à étudier l'action de la protéine «protectrice» dans la maladie d'Alzheimer. Des résultats préliminaires indiquent qu’un variant naturel de cette protéine en question s'est avérée très efficace pour éliminer les agrégats toxiques dans les cellules neuronales. Avec ce projet nous envisageons de démontrer que ce variant présent dans une partie de la population ralentit l’avancée de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra démontrer pour le première fois, l'efficacité d’une protéine à dégrader des agrégats toxiques dans le cerveau de souris utilisé comme modèle de la maladie d’Alzheimer. Il pourra déboucher à terme sur des avancées thérapeutiques utiles pour l’homme.
Procédures
Les animaux Tau22 hétérozygotes auront été génotypés par PCR suite à une biopsie de la queue. Les animaux seront soumis à des anesthésies (1 fois pendant 30 min) puis à une procédure chirurgicale d’injection intracérébrale d’un vecteur de thérapie génique (1 fois, durée d’environ 25-30 minutes). A l’âge de 9 mois, ils seront soumis à des tests de comportements non invasifs afin de tester leur mémoire. Les différents tests seront réalisés une fois par animal et seront réalisés les uns à la suite des autres (test de reconnaissance de l’objet puis le Y-Maze), avec un temps de pause entre chaque d'au moins une semaine afin de limiter le stress éventuel des animaux. Aucun test comportemental réalisé ne peut être considéré comme invasif. Toutefois, une attention particulière sera accordée à chaque animal lors de chaque expérimentation. Les males seront testés en premier (ex en matinée) afin d’éviter toute attirance par le passage des femelles dans le support de test, ce qui pourrait biaiser l’interprétation. Les femelles du groupe seront ensuite testées dans l’après-midi qui suit le test des males. Il faudra compter 30 minutes / individu par test.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux développera selon leur génotype des lésions histologiques qui entraînent des perturbations de la mémoire à partir de 6 à 9 mois. Les animaux de génotype mutant auront une moins bonne performance d’apprentissage. Les animaux subiront une chirurgie qui peut dans de très rare cas et malgré les mesures d’asepsie entraîner une infection au site chirurgical, avec des complications telles que douleur et inflammation. Il n’est pas attendu de problèmes neurologiques liés au modèle, ni aux injections dans le cerveau, néanmoins des troubles neurologiques (ataxie et convulsion) pourraient survenir de façon accidentelle suite à l’injection dans le cerveau. La manipulation des animaux pour les tests de comportement peut engendrer un stress. Les biopsies pour le génotypage entraîneront une douleur.
Devenir
Mort (tous les animaux). Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. En effet, ces animaux Tau22 hétérozygotes souffrent de la pathologie d’Alzheimer, une maladie qui est accompagnée de déficits de mémoire qui pourraient s’aggraver davantage avec l’âge. Les animaux seront donc mis à mort en fin de procédure (âgés de 9 mois) pour prélèvement des tissus désirés.
Remplacement
A l’heure actuelle il n’est pas possible de reproduire les déficits d’apprentissage retrouvés chez les patients Alzheimer sans recourir à l’expérimentation in vivo. Des premières expériences sur cultures cellulaires de type neuronales ont permis de démontrer l'effet bénéfique de la protéine étudiée sur la réduction des agrégats toxiques. Les expériences chez la souris seront le complément nécessaire de ce travail. Cette évaluation garantira l'efficacité et la sécurité avant de passer aux essais sur l'homme.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au strict nécessaire par une gestion appropriée des plannings de reproduction et des accouplements réalisés afin de maximiser la production du génotype utile. Le nombre d'animaux qui sera utilisé pour évaluer le rôle de la protéine étudiée en tant que stimulateur de d’agrégats toxiques dans les neurones est un nombre utile pour cette tâche. Les procédures expérimentales ont été choisies pour obtenir des résultats statistiquement valides avec le plus petit nombre d'animaux, sans pour autant sacrifier la portée scientifique du projet. Pour atteindre cet objectif, nous travaillerons à augmenter la puissance statistique de nos expériences et en même temps à réduire au minimum les animaux utilisés au cours de l'étude en : 1) lorsque l'animal sera mis à mort, nous prélèverons le cerveau afin d'extrapoler toutes les informations et données possibles à partir du nombre minimum d'animaux. Bien que l'étude in vitro soit une stratégie valable pour réduire le nombre d'animaux, il est important de ne pas oublier les limites de cette approche. Si l'utilisation de cultures cellulaires peut donner des informations utiles d'un point de vue mécaniste, l'étude in vivo implique un animal dans son intégralité et peut donc fournir des informations imprévisibles (effets indésirables/inattendus) en ce qui concerne à une étude impliquant uniquement l'utilisation de cultures cellulaires. Toutes les procédures expérimentales seront menées par du personnel hautement qualifié dans un environnement contrôlé afin de minimiser les erreurs aléatoires. Le nombre d'animaux qui seront inclus dans chaque groupe a été défini sur la base de l'analyse statistique décrite dans la littérature et le nombre d'animaux nécessaires pour l'étude a été déterminé avec des outils statistiques. Enfin, notre collaborateur a procédé à la cryoconservation de cette lignée transgénique, ce qui permettra de ne pas maintenir les animaux qui n’entreront plus dans le cadre des expériences en cours pendant plus de 12 mois.
Raffinement
Les animaux seront mis à mort selon des méthodes conformes à la recommandation de la Commission européenne chaque fois que des souffrances sont visibles chez l'animal (déshydratation, impossibilité de mouvement). Afin d’éviter que l’animal se blesse, avant qu’il ne se réveille, nous couperons la pointe des griffes avec un petit ciseau ou coupe-griffe. À la fin de la chirurgie, les animaux seront réchauffés selon une méthode appropriée dans l’animalerie Ils seront surveillés périodiquement jusqu'à leur réveil. Dans les jours suivant l'intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés afin de vérifier la récupération complète des fonctions physiologiques de base (urine et nutrition). Au réveil complet et pendant les 12-20 heures suivantes (dans la mesure du possible dès leur réveil, dès que les animaux auront repris leur activitées physiologiques (urine, alimentation), afin d'éviter des dommages accidentels par les congénères, l'animal sera logé individuellement avec de la nourriture humide répartie uniformément dans la cage pour faciliter son accès. Apres cela, les souris seront remises dans leur cage pré-chirurgie.
Choix des espèces
La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie qui apparaît tardivement, insidieusement, mais progressivement et irréversiblement. Elle va détruire petit à petit les neurones de l’hippocampe qui gèrent la mémoire. La lignée de souris utilisée dans cette étude reproduit ces caractéristiques de la maladie humaine. En particulier ces animaux, à 9 mois, subissent une perte de mémoire qui est accompagnée de la mort neuronale dans une région ciblée du cerveau. L’injection du vecteur pour l’expression de notre protéine d’intérêt sera réalisée à 3 mois, avant le développement des symptômes liés à l’âge, pour tester un effet protecteur de cette protéine. Choix de l’espèce : l’introduction de la protéine Tau mutée chez la souris constitue une approche directe afin de mimer la maladie d’Alzheimer et notamment la parte de mémoire liée à cette pathologie. Les génomes murins et humains étant relativement proches dans leur structure, la souris est l’animal de choix pour ce type d’approche.
Etude comparative de la perception de la voix chez les primates — Volet Macaque EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
12 macaques rhésus vont être utilisé·es, gardés en vie et réintroduits dans leur groupe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une puce radiofréquence, est capturé la veille puis transporté et placé sous anesthésie environ trois heures pour un examen en IRM du cerveau. Le projet, de recherche fondamentale, compare la perception de la voix entre macaques, ouistitis et humains. Le porteur indique qu'aucun individu ne sera tué et affirme que cette comparaison entre espèces ne peut se faire sans recourir à des animaux.
Objectifs
Ce projet vise à étudier les mécanismes cérébraux et comportementaux de la perception de la voix chez les ouistitis (callithrix jacchus), le macaque (rhesus) et l’humain. La description du projet concerne les macaques. Les macaques sont hébergés dans des volières extérieures et intérieures en groupe sociaux dans l’EU2/2. Les performances comportementales à des tâches de cognition auditive sont mesurées via des modules de tests automatiques accessibles à volonté. Nous utilisons également l’IRMf pour mesurer l’activité cérébrale dans des conditions d’écoute passive et la comparer entre les groupes de sujets de taille comparable entre ouistitis, macaques et humains. Les macaques sont scannés en IRM 3T sous anesthésie. Deux expériences seront réalisées : la localisation d’un patch vocal (neurones sensibles et spécifiques au traitement des vocalisations des macaques) et comparaison inter-espèce.
Bénéfices attendus
Nous espérons que cette recherche fournira de nouvelles informations cruciales sur les bases cérébrales du traitement de l'information vocale chez les macaques. En particulier, nous mesurerons la localisation anatomique et la variabilité interindividuelle des patchs vocaux des macaques avec une taille d'échantillon et une puissance statistique comparables à celles des études humaines, pour une comparaison optimale entre espèces.
Procédures
Pose d’une puce RFID en position sous-cutanée dans chaque avant bras : celle-ci se réalise dans l’EU2/2 lors du contrôle sanitaire des animaux qui dure en moyenne 40 minutes, la pose de puces en elle-même ne dure pas plus de 10 minutes. La capture des animaux se réalise la veille de l’IRM et dure en moyenne une heure (avec ou sans anesthésie). Le transport des animaux jusqu’au centre IRM de l’EU1/2 se décompose en deux trajets (aller et retour) d’une heure et demie chacun. La session de scanning dure environ 3 heures incluant la sédation et l’anesthésie de l’animal, son positionnement dans le scanner, l’acquisition des séquences anatomiques et fonctionneles, puis sa sortie et son réveil.
Impact sur les animaux
Mise à jeun 12 heures avant les anesthésies (pose puce RFID, transport IRM). Anesthésie lors du transport au centre d'imagerie et pendant la session de scanning. Isolement du groupe pour les animaux participants à l'IRM anesthésié.
Devenir
Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu, ils seront tous réintroduits dans leur groupe sociaux.
Remplacement
Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes, afin d’inférer des mécanismes potentiellement présents chez un ancêtre commun, ici les mécanismes comportementaux et neuronaux de la perception de l’information vocale. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé sera minimal pour réduire autant que possible le nombre de singes impliqués, mais sera suffisant pour permettre une puissance statistique importante pouvant rendre les données interprétables. Le nombre d'animaux doit pouvoir permettre de comparer un groupe de macaques à un groupe humain.
Raffinement
Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par notre responsable du bien-être animal et validé par la la structure en charge du bien-être animal. Les animaux seront seulement anesthésié une fois pendant la durée de l'étude pour la pose des puces RFID. Pour certains animaux, comme les males adultes, une deuxième anesthésie par technique de téléanesthésie pourra etre réalisé pour le transpor des animaux au centre d'imagerie.
Choix des espèces
Cette étude comparera les données observées chez l’humain à celles mesurées chez deux espèces de primates nonhumains: macaques et marmousets. Les raisons justifiant le choix des macaques comme espèce de comparaison sont les suivantes : -Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylogénétique de sorte que les résultats nous renseigneront sur l'histoire de l'évolution relativement récente ; -Ils utilisent des vocalisations complexes et variées, bien caractérisées acoustiquement ; -Il s'agit d’un modèle neuroscientifique largement étudié, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les résultats obtenus seront interprétables en relation avec une grande quantité de données complémentaires ; -Enfin, ils peuvent être scannés en IRMf sur le même scanner que les humains, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la littérature électrophysiologique sur les singes. Nous constituerons un groupe formé de sub-adultes afin de faciliter la gestion et l’entraînement dans les premières phases du projet, et afin qu’ils soient à un âge de jeune adulte pendant le durée du projet, pour comparaison optimale avec les groupes d’humains aussi constitués de jeunes adultes.
Identification des réseaux neuronaux impliqués dans la douleur cornéenne grâce à l’imagerie fonctionnelle ultrasonore, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
260 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. On leur induit une douleur cornéenne chronique, soit par excision des glandes lacrymales sous anesthésie, soit par dépôt répété de chlorure de benzalkonium, avant imagerie fonctionnelle du cerveau et prélèvement. Le projet vise à identifier les réseaux neuronaux de la douleur cornéenne, que le porteur décrit lui-même comme provenant du "générateur de douleur le plus puissant" de l'organisme. Il affirme que cette douleur chronique ne peut être modélisée qu'au niveau de l'animal entier.
Objectifs
La cornée est le tissu le plus innervé de l’organisme et le générateur de douleur le plus puissant. La sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes. Elle engendre des douleurs, picotements, sensation de brûlure oculaire et sensibilité à la lumière (photophobie) avec des atteintes cornéennes. C’est une douleur chronique qui affecte de façon dramatique la qualité de vie des patients (anxiété, dépression) et qui en fait l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Les douleurs oculaires sub-aigües et chroniques sont les plus difficiles à traiter notamment car les circuits neuronaux impliqués sont encore très mal identifiés en raison des difficultés techniques en recherche préclinique où l’étude des réseaux neuronaux chez le petit animal reste complexe. Ce projet a pour but de mettre en évidence et mieux comprendre les réseaux de neurones et leurs dysfonctionnements en lien avec une douleur cornéenne chronique et sub-aigüe. A cette fin, nous enregistrerons les activités cérébrales suite à des stimulations cornéennes, dans des modèles murins d’une douleur oculaire sub-aigüe ou d’une douleur oculaire chronique.
Bénéfices attendus
La prise est charge de la douleur oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces notamment dans le cadre de douleurs sub-aigües ou chroniques. Le bénéfice attendu de ce projet est d’aboutir à une meilleure caractérisation des circuits neuronaux de la douleur cornéenne et de permettre d’améliorer notre compréhension de ses mécanismes d’initiation et de maintien, encore largement inconnus, afin de faire le lien entre manifestations cliniques et mécanismes neurologiques fin de développer des traitements réellement efficaces.
Procédures
Les animaux subiront soit une chirurgie pour le modèle de sécheresse oculaire par défaut de production de larmes soit le dépôt d’une goutte de chlorure de benzalkonium pour le modèle de douleur oculaire inflammatoire. Ils seront ensuite passés en imagerie fonctionnelle ultrasonore puis les cerveaux seront prélevés. Deux modèles animaux seront utilisés dans ce projet : 1) Modèle de sécheresse oculaire par défaut de production de larmes Les animaux développant une sécheresse oculaire sont des modèles d’une maladie humaine. Elle sera induite chez l’animal par excision des glandes lacrymales. Il s’agit d’une douleur cornéenne difficile à soigner. Les animaux sham subiront la chirurgie sans excision et donc ne développeront pas la maladie. Les animaux « naïfs » ne subiront aucune chirurgie. La chirurgie se fait sous anesthésie générale avec une analgésie appliquée en pré-, per- et post-opératoire. La chirurgie ne se fait que sur un des deux yeux. Elle dure 15 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Les animaux seront suivis régulièrement après la chirurgie pour vérifier leur état général (poids) et l’état de la plaie. 2) Modèle de douleur oculaire inflammatoire par instillation du chlorure de benzalkonium Les animaux contrôles de ce modèle recevront une goutte deux fois par jour de tampon phosphate salin (solution neutre) dans l’œil droit durant 7 jours. Les animaux modèles recevront une goutte de chlorure de benzalkonium deux fois par jour dans l’œil droit durant 7 jours. Le dépôt de la goutte se fait sur un animal vigile en contention manuelle et le temps pour réaliser le dépôt et la contention de l’animal est de 20 secondes. Ces animaux modèles développeront une douleur oculaire. - IMAGERIE fUS : L’ensemble des animaux auront une session d’imagerie fonctionnelle ultrasonore qui durera 2h par animal et qui se fera sous anesthésie générale. L’ensemble des tests réalisés durant l’imagerie seront donc fait sous anesthésie générale. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui sera réalisé selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie.
Impact sur les animaux
- Dans le modèle de sécheresse oculaire, Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. La chirurgie qui permet de mettre en place le modèle de sècheresse oculaire entrainera une douleur post-opératoire qui disparaitra en quelques jours. La douleur post-opératoire sera prise en charge par un traitement adapté. - L’instillation topique bi-quotidienne du chlorure de Benzalkonium durant 7 jours correspondent classiquement aux traitements (collyres) donnés aux patients en clinique humaine. C’est un conservateur. Son application topique sur le long terme est connue en clinique humaine pour être toxique pour la surface oculaire et engendrer des gènes ou des irritations : sensation de corps étranger, de picotement ou brûlure, d’œil sec voir une inflammation d’intensité variable. - Imagerie fUS : l’anesthésie prolongée des animaux pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal : température, fréquences cardiaques et respiratoires.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants se justifie par la nécessité de mettre en évidence des circuits neuronaux complexes impliqués dans la douleur cornéenne et qui impliquent l’ensemble de l’encéphale. Le modèle que nous utilisons ne peut pas être remplacé par une approche alternative in-vitro car la douleur cornéenne chronique est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier. Une approche intégrative sur l’animal entier reste incontournable. Notre projet de recherche porte sur les l’étude de réseaux neuronaux complexes présents dans un cerveau entier. Bien que ces questions soient posées pour aider à une meilleure compréhension des pathologies humaines et l’amélioration de leur traitement, une première étape nécessite l’utilisation de rongeurs.
Réduction
Nous utiliserons 260 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 22+/-2 degrésCelsius et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour et 12h nuit. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites (grille de suivi). Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin de mettre à mort l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié (chirurgie ou imagerie fonctionnelle ultrasonore fUS) présente une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement l’euthanasie de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’euthanasiant chimique.
Choix des espèces
Dans la littérature, les modèles de douleur oculaire ont majoritairement été développés chez des souris mâles et femelles adultes. Ce projet de recherche portant sur la douleur oculaire nécessite d’utiliser des animaux adultes, âgés de plus de 6 semaines dont les circuits neuronaux sont établis. Les animaux arriverons donc à l’âge de 7 semaines dans notre animalerie. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 7 jours. Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis.
Modélisation de comportements complexes de type autistique chez la souris et impact de l’obésité induite pendant la grossesse en utilisant la vision par ordinateur et des approches d’apprentissage en profondeur
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
676 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. Certaines subissent un tatouage, une amputation de la queue et l'implantation d'une puce radiofréquence, et un groupe de femelles reproductrices est soumis à un régime riche en graisses, avant enregistrement des comportements sociaux dans un dispositif de suivi vidéo. Le projet, de recherche fondamentale, modélise des comportements de type autistique et l'effet de l'obésité gestationnelle. Le porteur classe l'amputation de la queue parmi les gestes légers tout en reconnaissant qu'elle provoque stress et douleur, et affirme que le comportement ne peut s'étudier qu'in vivo.
Objectifs
Le trouble du spectre de l’autisme (TSA) désigne un ensemble de troubles neurodéveloppementaux caractérisés par : 1) des déficits de la communication sociale et 2) la présence de comportements répétitifs et des intérêts restreints. L'étiologie des TSA serait déterminée par la combinaison de plusieurs facteurs : génétiques et environnementaux. Parmi ces facteurs environnementaux, l’obésité maternelle représente un facteur de risque important. Le diagnostic des TSA repose essentiellement sur l’observation d’un comportement « anormal » durant les deux premières années de vie et notamment le comportement social. Ce dernier est un comportement très complexe dont l’étude requiert un niveau de détails élevé et l’accès à l’observation de plus de 2 animaux interagissant de manière libre pendant une longue période de temps. Pour étudier ce comportement et répondre à ces critères, nous proposons d’utiliser un système qui permet d’enregistrer de manière non-invasive des comportements sociaux complexes de 4 souris pendant plusieurs jours. Dans ce projet, nous souhaiterions modéliser des comportements complexes de type autistique sur 5 modèles de souris portant chacun l’inactivation d’un gène impliqué dans des pathologies avec TSA. Ce projet s’articule autour de 4 objectifs : Objectif 1 : Modélisation de comportements complexes de type autistique chez 2 modèles murins de TSA à différents stades du développement. Objectif 2 : Etudier l’effet de l’inactivation du gène associé au TSA dans certains types de neurones sur les interactions sociales et les comportements répétitifs respectivement. Objectif 3 : Etudier l’effet de la réexpression du gène cité précédemment sur les comportements complexes de type autistique. Objectif 4 : Etudier l’impact d’un surpoids gestationnel sur des comportements complexes de type autistique chez la descendance du modèle murin de TSA. En effet, la variabilité des symptômes autistiques pour une même mutation peut être expliquée par la contribution de facteurs environnementaux. Dans ce projet, nous proposons de tester l'hypothèse que le surpoids gestationnel pourrait être un facteur aggravant.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet seront, d'une part, l'identification de nouveaux comportements complexes associés aux troubles du spectre de l'autisme observés chez des souris en « semi-liberté » sur des modèles génétiques de l’autisme, sur un modèle avec obésité gestationnelle (connue pour être un facteur de risque), et sur des modèles combinant les facteurs génétiques et obésité gestationnelle. L'obésité représente un enjeu majeur de santé publique dont l'incidence est en nette augmentation en France depuis 1997 avec des conséquences graves sur la santé cardiovasculaire, métabolique et neurologique. Plus précisément, le taux de surpoids et d'obésité atteint 32% chez les femmes en âge de procréer ou enceintes. Par conséquent, la mesure de l'impact d'un surpoids/obésité gestationnel, est importante car elle peut démasquer ou aggraver l’effet des mutations génétiques. Il est nécessaire de mettre en évidence ces conséquences sur les symptômes de type autistique qui sont de plus en plus fréquents chez les enfants.
Procédures
Dans ce projet, certains animaux subiront différentes interventions légère unique pour les identifier (tatouage, caudectomie, implantation d'une puce radiofréquence en sous-cutanée) permettant de les identifier et un lot de femelles reproductrices sera soumis à un régime riche en graisses sur une période 6 semaines. Dans tous les cas, des mesures adaptées ont été prévues pour pallier aux nuisances éventuelles occasionnées par ces procédures.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, certaines expérimentations sont susceptibles d'induire du stress (tatouage, anesthésie, implantation de la puce radio fréquence) ou du stress et de la douleur (caudectomie). Les enregistrements vidéo dans le système Live Mouse Tracker (LMT) qui permet d’enregistrer de manière non-invasive des comportements sociaux complexes de plusieurs souris pourrait induire un stress lié au changement d’environnement. Le régime riche en graisses pourrait produire de l'anxiété mais ce n'est pas évident sur une période courte de 6 semaines.
Devenir
Les animaux enregistrés dans le système Live Mouse Tracker (LMT) et les animaux soumis au régime riche en graisses seront sacrifiés pour réaliser des prélèvements pour des analyses immunohistochimiques et histologiques.
Remplacement
Dans ce projet, nous nous intéresserons essentiellement à l'étude du comportement social. Le comportement est un ensemble d'actions réalisés par un être vivant, les modèles in vitro (culture cellulaire par exemple) ne permettant pas d'étudier le comportement, le modèle animal reste donc notre seule alternative. De plus, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques nécessite une validation sur des modèles précliniques (modèles animaux). Par conséquent, l'utilisation d'un modèle murin est indispensable pour répondre aux objectifs de notre étude. Il est à noter que l'utilisation de souches murines fixées génétiquement permet de réduire la variabilité et donc le nombre d'animaux utilisé.
Réduction
Ce projet sera réalisé sur plusieurs étapes successives. Le nombre de souris générées pour cette étude (20 souris par groupe, par sexe et par génotype) a été établi à partir d'études comportementales réalisées précédemment se basant sur des tests de puissance statistiques (http://powerandsamplesize.com/Calculators/) ainsi que sur les données de la littérature utilisant ce système. Etant donné que l’utilisation du Live Mouse Tracker (LMT) est une procédure non-invasive, les mêmes souris seront utilisées aux différents âges pour l’étude comportementale. Ces mêmes animaux seront utilisés pour les études immunohistochimiques. De plus, l'utilisation d'animaux dans certaines expérimentations sera conditionnée par les résultats obtenus dans d'autres expérimentations. En effet, si les résultats de cette dernière sont positifs (altérations comportementales), alors nous réaliserons les expérimentations suivantes et le nombre de souris utilisé sera alors établi grâce à l'utilisation de tests de puissance statistiques.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés dans des cages enrichies avec du matériel de nidification, un accès illimité à l'eau et la nourriture, la présence d'objets (tunnel) et un nombre limité de souris par cage (4 souris par cage). Pour notre étude, il est nécessaire de constituer des groupes de 4 souris de même sexe et de même âge par cage pour l'étude comportementale. Les animaux seront habitués à la manipulation par l'expérimentateur. Les expérimentations induisant une douleur seront toutes réalisées sous anesthésie (locale et générale). Les animaux seront surveillés quotidiennement (poils, posture, activité dans la cage ...) et le poids pris régulièrement. Une grille de score (jointe en annexe) sera mise en place pour la surveillance des animaux. Si un animal montre un score classé comme bénin à modéré, il sera surveillé plusieurs fois par jour et l'administration d’un AINS (anti-inflammatoire non stéroidien) en sous-cutanée et/ou d’un morphinique en sous-cutanée sera envisagée. L'arrêt de la nourriture riche en graisse sera également considéré pour les animaux avec surpoids gestationnel. Si aucune amélioration n'est observée et que l'état de l'animal se détériore, une mise à mort sera alors réalisée.
Choix des espèces
Les souris représentent des modèles robustes pour étudier différentes pathologies dont les TSA. Tout d'abord, les souris sont des animaux très prolifiques avec des temps de génération courts et des portées assez conséquentes facilitant l'étude de cohortes de plusieurs animaux. De plus, l'espérance de vie des souris est courte permettant d'étudier différents stades de développement en moins d'un an. Et enfin, les outils génétiques utilisés chez la souris permettent de générer les mêmes mutations génétiques retrouvées chez l'Homme mimant ainsi un certain nombre de symptômes et motivant la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, les animaux seront utilisés à 3 stades de développement différents : 1) Stade juvénile (entre le 35ème jour de vie postnatale (P35) et le 40ème jour de vie postnatale (P40)) : Pour identifier des altérations précoces du comportement (de type autistique). En effet, les TSA apparaissent durant les 2 premières années de vie chez l'Homme. 2) Stade adulte (3 à 4 mois) : Pour évaluer la progression des altérations comportementales présentes au stade juvénile et/ou l'apparition de nouvelles altérations comportementales. 3) Stade de vieillissement (>18 mois) : Pour identifier des altérations comportementales similaires à celles observées dans certaines maladies neurodégénératives telle que la maladie d'Alzheimer. En effet, les patients atteints de certains syndromes autistiques (syndrome de Down ou le syndrome de Prader-Willi) développent une démence ou un déclin cognitif après 40 ans.
Caractérisation multimodale des interneurones ventraux de la moelle épinière souris et humaine
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
360 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent un prélèvement de l'extrémité de la queue et un tatouage des phalanges pour génotypage, les animaux sans le bon phénotype étant euthanasiés après cette étape et les autres à l'âge adulte pour prélever leur moelle épinière. Le projet vise à caractériser des interneurones spinaux, avec l'objectif à long terme de développer des stratégies pour les patients traumatisés médullaires. Le porteur décrit ce modèle translationnel comme "crucial" et affirme que l'absence de données transcriptomiques publiées rend l'utilisation de nouveaux animaux "indispensable".
Objectifs
L'objectif principal du projet est la caractérisation moléculaire des neurones impliqués dans l'intégration sensorimotrice au sein de la moelle épinière chez l'homme. A plus long terme, l'objectif de cette caractérisation est de permettre la mise en œuvre de stratégies de neuromodulation ciblée afin d'améliorer le pronostic neurologique des patients traumatisés médullaires.
Bénéfices attendus
Chaque année et en France seulement, ce sont 1500 à 2000 nouveaux patients, d'un âge moyen est de 28 ans, qui viennent s'ajouter aux 40 000 para ou tétraplégiques recensés. Dans ce contexte, le développement d'un nouveau modèle translationnel est crucial afin de tester chez l'animal de nouvelles stratégies ciblées dont la transposition potentielle chez l'homme sera le préalable et non plus l'aléa.
Procédures
Prélèvement de l'extrêmité caudale de la queue de l'animal et tatouage de phalanges (prélèvement au niveau de l'oreille en cas de nécessité d'un nouveau prélèvement). Les animaux sont tatoués et prélevés entre le 7 et 10e jour. Cette procédure unique dure moins de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Seul le prélèvement de la queue (ou des phalanges en seconde intention) sera réalisé à des fins de génotypage.
Devenir
Les animaux n'ayant pas le bon phénotype seront euthanasiés à l'issue du génotypage. Les autres animaux seront euthanasiés une fois adulte (entre 2 et 4 mois) en vue du prélèvement post-mortem de la moelle épinière.
Remplacement
Afin de diminuer le nombre d'animaux utilisés, les données souris wild type seront issus de publications antérieures ayant mis en ligne les données de séquençage (snRNA-seq). Il n'y a toutefois aucune donnée transcriptomique publiée issues de souris En1-Cre permettant d'obtenir un profil spécifique pour les interneurones V1, ce qui rend indispensable l'utilisation de nouveaux animaux de la même espèce pour comparer les profils transcriptomiques.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au minimum nécessaire à l'obtention d'un nombre statistiquement suffisant pour l'analyse transcriptomique robuste, soit 40 000 neurones analysés. D'après nos résultats préliminaires, chaque moelle épinière souris extraite permet l'analyse d'environ 2000 neurones. Nous prévoyons donc d'analyser les moelles épinières issues d'environ 20 souris En1-Cre;Sun1-sfGFP ce qui est le nombre minimal d'animaux permettant un profiling transcriptomique statistiquement robuste.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans une animalerie agrée, en groupe sociaux, dans des conditions de températures et hygrométrie controlées. Elles ont accès ad libitum à la nourriture et l'eau: au sevrage, des croquettes humides sont placées au fond de la cage pendant le 1e semaine et leur consommation effective vérifiée. Les cages présentent un enrichissement du milieu donc la présence d'un "nid" sera le signe de souris calmes, regroupées et sociables. Les animaux sont quotidiennement surveillés, en tenant compte leur comportement (pas de prostration, de difficulté de déplacement, pas de stéréotypie) et de l'absence de lésions. Une surveillance quotidienne sera mise en place pour surveiller l'allaitement des souriceaux par la femelle ayant mise bas. Des points limites pour les souriceaux de moins de 10 jours et conduisant à une euthanasie immédiate du nouveau-né ont été établis. Pour les animaux adultes vivants (dont ceux utilisés en accouplement), la surveillance quotidienne permettra d'euthanasier tout animal présentant des lésions graves ou des signes de souffrance, ayant atteint un point limite ou présentant un comportement stéréotypique.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris du fait de l'existence de lignées transgéniques permettant de cibler l'expression de protéines fluorescentes spécifiquement dans les neurones spinaux V1. L'objectif du présent projet étant la caractérisation des neurones adultes, les souris utilisées seront euthanasiés à l'âge adulte, soit entre 2 et 4 mois.
Entretien d’une lignée de souris dont le gène de la chromogranine A est floxé (ChgA-loxP); Génération et entretien d’une lignée de souris dont le gène ChgA est éliminé sous le contrôle du promoteur du gène du 26Rfa (26RFa-iCre/+)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 440 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce projet se limite à produire et entretenir des lignées génétiquement modifiées, avec biopsie de la queue sous anesthésie pour génotypage et pose d'une puce sous-cutanée. Les souris de génotype "inadéquat" sont tuées après génotypage, et les couples reproducteurs le sont quand ils cessent de donner des portées. Le porteur relie cet élevage à l'étude d'une protéine liée à l'obésité et au diabète, présentés comme la pandémie de "diabesity".
Objectifs
L'obésité et le diabète de type II connaissent une progression significative et synchrone depuis 30 ans qui fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un réel enjeu de santé publique. Des études récentes ont révélé que des neuropeptides connus pour jouer un rôle crucial dans le contrôle hypothalamique du comportement alimentaire sont aussi exprimés dans les îlots pancréatiques, suggérant que les neuropeptides hypothalamiques pourraient servir de lien entre l’homéostasie énergétique et glucidique. C’est le cas du 26RFa, neuropeptide hypothalamique identifié au sein de l'Unité comme le ligand endogène d’un récepteur humain orphelin, le GPR103. Des études récentes menées au sein du laboratoire révèlent que le 26RFa est un nouvel acteur de la régulation de la glycémie. Au sein de notre équipe, nous avons rapporté le rôle essentiel d'une protéine de la famille des chromogranines, la chromogranine A (CgA), dans la formation des granules de sécrétion, organites permettant le stockage et la sécrétion des neuropeptides. De manière intéressante, les souris dont le gène exprimant la CgA a été invalidé de manière globale sont hypertendues et obèses. Or la CgA est exprimée par de nombreuses populations de cellules nerveuses, et de récentes études préliminaires nous ont permis d'observer que les neurones 26RFa expriment également la CgA. Ainsi, la compréhension du rôle de cette chromogranine dans les mécanismes moléculaires de la sécrétion des neuropeptides tels que le 26RFa pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement du diabète de type II. Dans ce contexte, nous souhaitons héberger et reproduire des souris CgA-loxP obtenues de "GemPharmatech". L'entretien de cette lignée nous permettra d'invalider de manière ciblée le gène exprimant la CgA en la croisant avec la lignée 26RFa-iCRE/+ pour invalider la CgA dans les cellules exprimant le 26RFa. Ce croisement devrait nous permettre de caractériser l'impact de l'altération de la sécrétion de neuropeptides sur la régulation de l'homéostasie du glucose dans l'organisme.
Bénéfices attendus
L'expression de la CgA étant ubiquiste, l'invalidation globale du gène exprimant la CgA ne nous permet pas de discriminer le rôle central des rôles périphériques de la CgA quant au contrôle de l'homéostasie glucidique. Par ailleurs, la caractérisation du phénotype des souris issues des croisements (prise alimentaire, poids, glycémie, morphologie et capacité sécrétoire des neurones hypothalamiques) concourra à la compréhension du rôle de la CgA dans la sécrétion du 26RFa et son rôle dans l’homéostasie glucidique.
Procédures
Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale (prélèvement d'un bout de queue de 3 mm destiné au génotypage des animaux) sous anesthésie : un seul prélèvement, 5 minutes d'anesthésie. L’induction de l'anesthésie profonde se fait par voie aérienne dans une cage dite "à induction". Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide de puces stériles dédiées. La puce est placée en sous-cutané entre les omoplates de façon tangentielle à la courbe du dos et à l'aide de l'injecteur stérile à usage unique fourni avec la puce.
Impact sur les animaux
Les modèles de souris dont le gène ChgA a été invalidé de manière globale sont viables, mais présentent une hypertension et une obésité. L'invalidation ciblée du gène ChgA ne devrait pas induire de nuisance ou d’effet indésirable accentués chez les animaux. Les animaux destinés à la reproduction subiront une biospsie caudale sous anesthésie par voie aérienne dans une cage dite "à induction" (isoflurane). Lors de cette anesthésie, les animaux seront identifiés à l'aide d'une puce placée en sous-cutané. L’élevage et la reproduction devraient induire peu de stress et de souffrance.
Devenir
Une partie des animaux générés dans ce projet sera destinée à la reproduction et à l'entretien de la lignée CgA-loxP, et une autre partie des animaux sera destinée à la génération et à l'entretien d'une lignée dont le gène ChgA est éliminé sous le contrôle du promoteur du gène du 26RFa. Les animaux de génotype adéquat seront placés en accouplement tant que les couples donneront naissance à des portées à un rythme régulier et dans des conditions assurant le bien-être des animaux. Les couples âgés ne produisant plus de portées seront mis à mort selon les procédures précedemment décrites. Les animaux de génotype inadéquat donc inutilisables, seront mis à mort après le génotypage. La stratégie de croisement a été réfléchie afin de réduire le nombre d'animaux ne pouvant être utilisés en expérimentation.
Remplacement
L’étude de l'impact de l'invalidation ciblée du gène ChgA sur l'homéostasie glucidique n’est possible que dans un système intégré et nécessite donc l’utilisation de modèles animaux.
Réduction
La stratégie de reproduction choisie dans le cadre de ce projet vise à réduire le nombre d'animaux générés en choisissant de travailler sur les animaux homozygotes pour la construction CgA-loxP, plutôt qu'hétérozygotes. En effet, les règles de la génétique mendélienne indiquent que la probabilité d'obtenir des animaux de génotype adéquat est de 1/4 dans le cas de croisements d'animaux double hétérozygotes CgA-loxP. Le nombre d'animaux de génotype non adéquat, générés dans la descendance des croisements est ainsi divisé par deux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux seront maintenus à cinq par cage (deux femelles et un mâle par cage pour les accouplements) pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de boules de coton pour construire un nid + dôme en plastique rouge sous lequel se réfugier). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est le cas lors du prélèvement de biopsies caudales nécessaires au génotypage des animaux. Dans le cadre de la reproduction de lignées de souris, la mise bas peut s’avérer être une étape critique nécessitant une surveillance particulière. Pour réduire une éventuelle souffrance liée à la mise bas, les femelles seront suivies quotidiennement, y compris week-ends et jours fériés, pour déceler tout signe de gestation puis, lorsque la gestation sera avérée et le terme estimé sera proche, le suivi sera renforcé afin de détecter les signes de mise bas. La mise-bas en elle-même sera étroitement surveillée afin de vérifier que la naissance des petits se produit dans un délai normal (le processus de mise-bas dure en moyenne 2 heures chez la souris) et l’aide nécessaire sera apportée aux femelles en cas de difficultés au cours de la mise bas (temps de mise bas allongé au-delà de 4h, mise-bas non évolutive, premiers petits mort-nés ou mère présentant des signes de détresse…).
Choix des espèces
La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coûts d’entretien réduits, fortes performances reproductives. De plus, la souris est un modèle animal largement utilisé pour les études de physiologie permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. La souris est également un modèle permettant des approches génétiques complexes, ce qui n'est pas le cas d’autres modèles mammifères. Ainsi, des souris de la lignée C57Bl/6J ont été utilisées afin de générer les animaux portant la construction transgénique CgA-floxP provenant de GemPharmatech (B6/JGpt-Chgaem1Cflox/Gpt). Cette dernière lignée (utilisation de souris à partir de 8 semaines de vie, âge de maturité sexuelle) sera alors croisée avec une lignée transgénique 26RFa-iCRE (même stade de développement et également obtenue à partir de souris de la lignée C57Bl/6J), détenue au sein de l'animalerie, soumise à un « Material Transfert Agreement » convenu entre le laboratoire d’origine et l’Inserm U1239.
SIGNAL: INFECTION AU SARS-COV-2 DES NEURONES A GNRH, NEUROINFLAMMATION,VEILLISSEMENT ET CONSEQUENCES A LONG-TERME
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
348 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur humain, elles sont infectées par le SARS-CoV-2 par voie nasale, avec implantation de mini-pompes et prélèvements sanguins répétés, certaines lignées n'ayant qu'une espérance de vie de sept à douze jours après infection. Le projet étudie l'infection des neurones à GnRH et ses effets à long terme sur la reproduction et la cognition, y compris chez des femelles gestantes et leur descendance. Le porteur affirme que cette étude requiert "l'organisme entier" et juge ces souris "indispensables".
Objectifs
Depuis le début de la pandémie de COVID-19, les efforts collaboratifs des 5 équipes de recherche ont montré que le SARS-CoV-2 infecte et tue les neurones produisant l'hormone de libération des gonadotrophines (GnRH) dans le cerveau des patients adultes atteints de COVID-19. Ce phénomène entraîne une réduction spectaculaire de l'expression de la GnRH dans l'hypothalamus chez une proportion significative de patients. Ces neurones, connus pour être les maîtres régulateurs de la fonction de reproduction, pourraient également jouer des rôles clés dans le développement des fonctions cognitives et sensorielles, du métabolisme et du vieillissement cérébral et systémique. En outre, les neurones à GnRH foetaux, qui proviennent du nez, expriment plusieurs protéines qui leur confèrent une sensibilité à l'infection par le SARS-CoV-2. Ceci suggère qu'ils pourraient être vulnérables en cas de transmission materno-foetale/néonatale, et fait planer le risque d'une double pandémie d'infertilité et de déclin cognitif prématuré. Nous émettons l'hypothèse que l'infection des neurones à GnRH et d'autres populations de cellules cérébrales par le SARS-CoV-2 module l'expression des gènes de l'hôte, perturbe le neurodéveloppement et aggrave les changements liés à l'âge par des altérations inflammatoires et épigénétiques persistantes dans les cellules survivantes. Le projet utilise des tissus humains de patients COVID-19 et de sujets non-infectés, ainsi que des modèles cellulaires, et nécessite également l’utilisation de modèles animaux transgéniques afin de déterminer si et comment l'infection et la perte des neurones à GnRH conduit à des altérations pathologiques à long terme. Nous poursuivrons trois objectifs: 1) Déterminer si et comment l'infection par le SARS-CoV-2 module de manière différentielle le paysage de l'expression génétique des neurones à GnRH et d'autres cellules cérébrales infectées pour accélérer l'inflammation hypothalamique, le dysfonctionnement cognitif ou métabolique et la sénescence cérébrale 2) Explorer si l'infection des neurones à GnRH ou la perte d'expression de la GnRH dans le cerveau adulte ou foetal/néonatal a des effets à long terme sur l'axe reproducteur dans des modèles animaux 3) Vérifier si le remplacement de la GnRH de façon physiologique ou l'inversion des voies pathologiques compensera l'expression génique à long terme et les altérations fonctionnelles induites par l'infection du cerveau par le SARS-CoV-2.
Bénéfices attendus
Le projet apportera une meilleure compréhension des répercussions à long terme, jusqu'ici sous-estimées, de la neuroinvasion par le SARS-CoV-2 en termes d'intégrité et de fonction des cellules cérébrales. Il pourrait permettre d’identifier les mécanismes cérébraux qui sous-tendent les symptômes neurologiques de la COVID longue, et proposer des stratégies thérapeutiques viables et fondées sur les preuves pour inverser ou compenser ces mécanismes pathologiques. Les résultats du projet devraient contribuer à réduire le fardeau social, financier et sanitaire imposé par la COVID-19.
Procédures
LES INTERVENTIONS SERONT EFFECTUEES SUR ANIMAL ANESTHESIE ET CHAQUE INTERVENTION EST REALISEE 1 FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL: - IMPLANTATION DE MINIPOMPE SOUS-CUTANEES AU NIVEAU DE LA PARTIE SUPERIEURE DU DOS, - INFECTION DES SOURIS PAR VOIE NASALE (SOURIS ADULTES GESTANTES OU NON). SEULS LES PRELEVEMENTS SANGUINS SERONT EFFECTUES SUR ANIMAL VIGILE. LES PRELEVEMENTS UNIQUES SERONT EFFECTUES AU NIVEAU DE LA VEINE MANDIBULAIRE 1 FOIS PAR MOIS PENDANT 6 MOIS (SUR L'ANIMAL ADULTE) OU A P12, P23 ET P30 (SUR SOURIS POST-NATALES); LES PRELEVEMENTS FREQUENTS SERONT EFFECTUES DANS LA VEINE LATERALE DE LA QUEUE 1 SEULE FOIS DANS LA VIE DE L'ANIMAL (3µL DE SANG TOUTES LES 6 MINUTES PENDANT 2H).
Impact sur les animaux
TOUTE MANIPULATION DES ANIMAUX PEUT PROVOQUER DU STRESS, DE LA FATIGUE ET DE L'INCONFORT ET DES MESURES DE RAFFINEMENT SERONT MISES EN PLACE POUR LES LIMITER AU MAXIMUM. EN PARTICULIER LES EXPERIENCES DE CHIRURGIE OU DE PRELEVEMENTS DE SANG PEUVENT PROVOQUER DES DOULEURS A COURT-TERME QUI SERONT LIMITEES PAR L'UTILISATION D'UN ANALGESIQUE (GEL DE CHLORHYDRATE DE PRAMOCAÏNE OU TRONOTHANE 1%). SEULS LES ANIMAUX INFECTES PAR LE VIRUS SARS-COV-2 DANS LA PROCEDURE 2 SUBIRONT UNE PERTE DE POIDS CONSEQUENTES ET SERONT SUIVIS DE TRES PRES; ILS SERONT SACRIFIES A 4 JOURS POST-INFECTION POUR LIMITER LA DUREE DE CET ETAT.
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés pour chaque procédure sera EUTHANASIE à terme même ceux qui servent de contrôles afin de récupérer le sang et les organes.
Remplacement
Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3 R. L’étude des effets physiopathologiques de l’infection par SARS-CoV-2 et de l’efficacité des médicaments nécessitent l’utilisation d’organisme entier, et ne laissent pas la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des systèmes cellulaires. En effet, suite à l’infection respiratoire, le système immunitaire s’active et conduit à une inflammation. Celle-ci se traduit par le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et par la production de facteurs solubles (cytokines, chimiokines etc). Cette réaction est sous la dépendance d'un réseau complexe de cellules et de facteurs solubles qui ne peut pas être reproduite in vitro. Par ailleurs, les effets potentiellement bénéfiques du donneur de NO au cours de l’infection ne peuvent être réellement évalués qu’in vivo. Le modèle souris est pertinent pour ce type d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et homogène d’animaux par groupe sera utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. LE NOMBRE D’ANIMAUX EST BASE SUR UN CALCUL STATISTIQUE QUI PREND EN COMPTE LE PARAMETRE ETUDIE ET DES EXPERIENCES PILOTES. POUR CELA, LA TAILLE MINIMALE DES GROUPES EXPERIMENTAUX A UTILISER A ETE DEFINI ; PUIS LA POSSIBILITE DE COLLECTER PLUSIEURS ECHANTILLONS/TISSUS CHEZ LES MEMES ANIMAUX CHAQUE FOIS QUE POSSIBLE A ETE PRISE EN COMPTE. CETTE UTILISATION MAXIMISE LES DONNEES OBTENUES A PARTIR DE CHAQUE ANIMAL, AFIN DE LIMITER OU D'EVITER L'UTILISATION SUBSEQUENTE D'ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES, ET CE, SANS POUR AUTANT COMPROMETTRE LE BIEN-ETRE ANIMAL.
Raffinement
Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Les personnes impliquées bénéficient d’une autorisation pour travailler sur des agents pathogènes de groupe 3. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. EN PARTICULIER, LES ANIMAUX SONT MANIPULES INDIVIDUELLEMENT, ET DANS LE CALME, AFIN DE LIMITER TOUT STRESS DES ANIMAUX NON MANIPULES. LES MANIPULATIONS S'EFFECTUENT A DISTANCE DES AUTRES ANIMAUX. UNE SURVEILLANCE QUOTIDIENNE EST EFFECTUEE AFIN DE S’ASSURER DE L’ETAT DES ANIMAUX.
Choix des espèces
La souris exprimant l’ACE2 humain génétiquement modifiée représente un modèle pertinent pour l’étude des réponses immunes et inflammatoires liées à l’infection par le SARS-CoV-2. AFIN D’ETUDIER LES CONSEQUENCES PATHOPHYSIOLOGIQUES DE LA PERTE DE CES NEURONES LORS DE LA COVID-19, NOUS UTILISERONS UN MODELE DE SOURIS TRANSGENIQUES DANS LESQUELLES L’ACE2 HUMAIN S’EXPRIMERA UNIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH. L’ETUDE DU ROLE SPECIFIQUE DU CO-RECEPTEUR A LA NEUROPILIN-1 (NRP1) SPECIFIQUEMENT DANS LES NEURONES A GNRH REQUIERT L’UTILISATION DE SOURIS TRANSGENIQUES INFECTEES DE MANIERE GLOBALE PAR LE SARS-COV-2 ET QUI N’ONT PAS LE RECEPTEUR NRP1 DANS LES NEURONES A GNRH. CES SOURIS ONT UNE ESPERANCE DE VIE COURTE (7 A 12 JOURS POST-INFECTION) MAIS SONT INDISPENSABLES POUR DETERMINER LE ROLE DU CO-RECEPTEUR NRP1 DANS LA PERTE DE L’EXPRESSION DE LA GNRH. NOTRE TROISIEME OBJECTIF ETANT D’ETABLIR L’IMPACT DE L’INFECTION IN UTERO OU NEONATALE SUR LA MINIPUBERTE ET A LONG TERME SUR L’AXE REPRODUCTEUR, IL NECESSITE L’UTILISATION DE SOURIS FEMELLES GESTANTES INFECTEES PAR LE SARS-COV-2 ET D’ETUDIER LES EFFETS SUR LA DESCENDANCE A PLUS OU MOINS LONG-TERME.
Physiopathologies des maladies neurodégénératives
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Macaques rhésus : 78
156 primates, 78 macaques à longue queue et 78 macaques rhésus, vont être utilisé·es, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une à deux chirurgies cérébrales, des IRM sous anesthésie tous les six mois, des prélèvements de liquide céphalorachidien mensuels et des prises de sang tous les quinze jours, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le projet crée des modèles de maladies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson, dont les retombées thérapeutiques restent une perspective. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico n'est valide et justifie le recours au primate par sa "proximité avec l'homme".
Objectifs
De nos jours dans le monde environ 36 millions de personnes sont atteintes de démences, dont 25 millions pour la maladie d’Alzheimer et 6 millions pour la maladie de Parkinson. En raison du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitement, le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives augmente considérablement et devrait croître de manière régulière dans les années à venir. Qu'elles soient génétiques ou acquises, leurs mécanismes d’initiation liés à des causes multifactorielles sont mal connus. Ainsi, il est nécessaire de créer et maîtriser des modèles le plus proche possible de la réalité pathologique. L’étude proposée ici permettra aux travers de différents modèles de primates non-humains de maladies neurodégénératives, d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de l’initiation et de l’installation des différentes pathologies afin de définir des nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les maladies neurodégénératives sont une cause majeure d’invalidité, de dépendance, d’institutionnalisation et d’hospitalisation. Elles ont un impact très important sur la qualité de vie des personnes atteintes ainsi que sur celle de leurs proches et de leurs aidants, et touchent ainsi une part importante de la population. Les traitements actuellement disponibles sont à visée symptomatique et d’efficacité relative. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces pathologies c’est trouver les traitements de demain.
Procédures
Une chirurgie (2 heures environ), ou deux maximum, espacées de 1 mois. Imagerie : IRM sur animal anesthésié, avant la chirurgie, 48 heures après et tous les 6 mois. La durée de l'IRM est de 1h30 à 2h. Prélèvements sanguins de quelques minutes tous les 15 jours sur animaux vigiles en contention légère. Prélèvements de liquide céphalorachidien de l'ordre de 5 minutes une fois par mois sous anesthésie légère.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible et infection au niveau des points de sutures. Pour l’imagerie : anesthésie. Pour les prélèvements liquide céphalorachidien (LCR) et sang : stress de l’anesthésie pour le LCR et de la contention (légère et rapide) pour le sang.
Devenir
Les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque aux temps expérimentaux définis. Le cerveau et éventuellement d’autres tissus seront alors prélevés puis mis à disposition pour réaliser les analyses post-mortem.
Remplacement
Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH car il n’existe pas de modèles mathématiques ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier les processus neurodégénératifs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à mimer la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus est une étape nécessaire à la découverte de nouvelles voies thérapeutiques
Réduction
Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité (cadre stéréotaxique, Imagerie, stabulation) nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études histologiques visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’état des animaux est observé et quantifié selon des critères objectifs permettant d’établir des scores de bien-être et de déterminer des points limites à partir desquels les actions adaptées sont menées (des massages, le maintien de l’animal au chaud à l’aide d’une couverture, la modification de la nature et le change plus régulier de la litière, l’augmentation de la fréquence des pesées, le gavage avec des complément alimentaire, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons en dehors de la sphère médicamenteuse pour améliorer l’état de santé de nos animaux).. . Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adapté au poids de l’animal, Les prélèvements de LCR sont faits sur animaux sédatés. Les prélèvements de sang sont réalisés sur animaux vigiles avec une légère contention. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. L’échelle de bien être est là aussi utilisée pour estimer la gêne occasionnée par ce geste. Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.).
Choix des espèces
Ces modèles ont déjà été réalisés et validés chez les rongeurs (rats, souris), comme base d’étude des maladies neurodégénératives, mais la proximité d’espèce avec l’homme en fera toujours un modèle de choix, surtout dans la détermination de marqueurs prédictifs. Les maladies neurodégénératives sont des maladies chroniques progressives qui touchent le système nerveux central. Leur fréquence augmente avec l'âge chez l’homme. Afin d’être au plus près de cet état, dans ce projet, les animaux utilisés seront donc adultes.
Modélisation du syndrome neurodéveloppemental Okur-Chung et de son phénotype analogue à celui de l’autisme chez la souris-AMENDEMENT 2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 408 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un groupe de 384 subit une chirurgie stéréotaxique du cerveau, les autres reçoivent jusqu'à cinq médicaments et enchaînent jusqu'à cinq batteries de tests comportementaux, avant une perfusion transcardiaque. L'objectif est de valider un nouveau modèle murin d'un trouble neurodéveloppemental rangé dans le spectre de l'autisme, les pistes thérapeutiques étant renvoyées à de futures études. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit "la complexité du cerveau", ce qui rendrait le modèle animal "indispensable".
Objectifs
Récemment, plusieurs cas de mutations dans un gène codant pour une kinase ont été liés de manière causale a des troubles neurodéveloppementaux. Ces maladies sont caractérisées par un retard de développement, une déficience intellectuelle et d’autres anomalies comportementales qui font la font entrer dans les troubles du spectre autistique. Notre objectif est de valider un nouveau modèle expérimental d'un trouble neurodéveloppemental chez la souris. Nous rechercherons d’éventuelles anomalies comportementales s’apparentant aux symptômes de la pathologie. Des études biochimiques seront ensuite réalisées sur les tissus cérébraux de souris issus de ces souris pour tenter d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués. Ces études devraient permettre d’améliorer les connaissances sur cette pathologie dans le but de développer des thérapies pour aider les patients du spectre de l'autisme. Ce projet mettra en jeu des procédures d’administration de substances pharmacologiques avant évaluation des conséquences biochimique et comportementales (fonctions motrices, cognitives, émotionnelles et sociales), suivi par perfusion transcardiaque pour analyse du tissue. Cette étude qui nécessite une approche comportementale n’est possible qu’à l’échelle de l’organisme entier et ne peut être reproduite in vitro ni ex vivo. Ce projet s’effectuera dans le respect de la règle des 3R, en veillant au bien-être des animaux et en limitant leur douleur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Les animaux seront observés quotidiennement et évalués à l’aide de points limites bien définis. En conclusion, notre travail vise à identifier les déficits neurobiologiques et comportementaux qui sont présents dans un modèle murin d'un trouble neurodéveloppemental, permettant de futures études thérapeutiques de ce syndrome. Ce projet apportera des données anatomiques, biochimiques et fonctionnelles cruciales pour appréhender les mécanismes mis en jeu dans le spectre de l'autisme et pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Bénéfices attendus
En conclusion, notre travail vise à identifier les déficits comportementaux dans un nouveau modèle expérimental d'un trouble neurodéveloppemental permettant de futures études thérapeutiques. Ce projet apportera des données anatomiques, biochimiques et fonctionnelles cruciales pour appréhender les mécanismes mis en jeu dans le spectre de l'autisme et pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
Procédures
Au total, 1408 animaux sur 3 ans seront utilisés et subiront une batterie de tests comportementaux. Parmi les 8 groupes expérimentaux différents, un groupe (384 animaux) subira une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie complète (durée de 20 minutes) et avec un traitement analgésique avant et jusqu'à 2 jours après la chirurgie. Aucun effet indésirable n'est attendu sur la base de notre expérience. Les autres animaux (1024) subiront des tests comportementaux jusqu'à 5 paradigmes différents, les tests étant espacés d'au moins une semaine entre chaque paradigme. Au total, 5 médicaments différents (dont 4 en aigue, par injection i.p, et un chroniquement pendant 3 semaines, administré dans l'eau à boire) seront administrés à des animaux éveillés. Aucun de ces médicaments n'ést préjudiciable au bien-être de l'animal. Une prise de sang sera effectuée au niveau de la veine caudal, à l'aide d'un tube capillaire, via une légère incision à l'extrémité de la queue, poirtant un faible risque d'hémorragie.
Impact sur les animaux
La chirurgie stéréotaxique de la souris est réalisée sous anesthésie générale et, normalement, tous les animaux survivent à cette procédure sans nécessiter de soins analgésiques prolongés. Neanmoins, des protocoles de soins pré et post opératoires sont mis en place pour éviter la sensation de douleur. Certains des tests comportementaux ont un impact modérément stressant sur les souris, mais nous surveillons régulièrement le bien-être des souris, leur poids, leur toilettage et leur comportement social, et nous n'avons pas constaté d'effets néfastes durables dans les expériences réalisées précédemment.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Nous utiliserons le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et d'imagerie
Remplacement
A l’heure actuelle, il n'existe pas de méthode de remplacement permettant de reproduire la complexité du cerveau, ce qui rend l’utilisation d’un modèle animal indispensable à la réalisation de ce projet.
Réduction
La taille de chaque groupe sera de 16 animaux par condition expérimentale. Nous avons précédemment utilisé cette taille de cohorte pour des expériences comparables et avons atteint de différences significatives dans nos expériences (p
Raffinement
Pour éviter toute souffrance, les procédures de chirurgie se feront sous analgésie et anesthesie générale. Les souris seront observées régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. Tout signe de douleur, souffrance, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques. Les souris seront logés à raison de 5 compagnons (frères, soeurs) par cage dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
L’espèce souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. De plus, les modèles transgéniques utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris. Animaux seront utilisés au stades infantiles (2 semaines), juvéniles (4 semaines) et adultes (12 semaines). Tous les animaux seront testés dans das tests comportementaux entre 3 et 6 mois, pour définir les phénotypes chez la souris adulte.
Rôle et mécanisme d’action de la chromogranine A dans la régulation de la sécrétion de neuropeptides hypothalamiques impliqués dans le contrôle de l’homéostasie glucidique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
306 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 234 sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections intrapéritonéales, des prélèvements sanguins caudaux répétés six à dix fois, des mises à jeun de seize heures et des tests de tolérance au glucose, à l'insuline et au pyruvate, avant une perfusion intracardiaque terminale. Le porteur étudie le rôle de la chromogranine A dans la sécrétion de neuropeptides hypothalamiques réglant la glycémie. Les retombées contre l'obésité et le diabète, présentés comme la pandémie de "diabesity", restent lointaines, et il affirme qu'une telle approche "très intégrée" n'est possible que sur "l'animal entier".
Objectifs
Les systèmes neuropeptidergiques hypothalamiques sont récemment apparus comme des liens couplant l’équilibre énergétique et l'homéostasie du glucose. Un dysfonctionnement de l'un de ces systèmes pourrait ainsi jouer un rôle majeur dans le développement de pathologies telles que l'obésité et le diabète. En effet, l'obésité est fréquemment associée au diabète de type II, et leur progression significative et synchrone depuis 30 ans fait de la pandémie mondiale de "diabesity" un véritable enjeu de santé publique. Au sein de notre Unité, le système peptidergique 26RFa/GPR103 a été identifié et démontré comme étant impliqué dans le contrôle du comportement alimentaire de par son important effet orexigène. De plus l’expression du 26RFa est augmentée chez les animaux obèses, suggérant qu’il pourrait jouer un rôle dans le développement et le maintien de l'obésité. Le 26RFa possède par ailleurs un robuste effet anti-hyperglycémiant central, conséquence de sa capacité à relayer l’action centrale de l’insuline. Au sein de notre équipe, nous avons rapporté le rôle essentiel de la protéine chromogranine A (CgA) dans la formation des granules de sécrétion, organites permettant le stockage et la sécrétion des neuropeptides. De manière intéressante, les souris dont le gène exprimant la CgA a été invalidé de manière globale sont hypertendues et obèses. Par ailleurs, nous avons observé récemment que les neurones 26RFa expriment d'autres neuropeptides ainsi que la CgA. Sur la base de ces données, nous proposons dans le présent projet d’étudier le rôle de la CgA dans les mécanismes moléculaires de la sécrétion des neurones 26RFa en analysant l’impact de la modulation de l'expression de la CgA dans les neurones 26RFa sur la sécrétion du système peptidergique 26RFa, la régulation centrale de l’homéostasie du glucose et le déclenchement de l’obésité et du diabète.
Bénéfices attendus
L’administration centrale de 26RFa a permis une première évaluation de l’effet du 26RFa central dans la régulation de l’homéostasie glucidique par le cerveau. Il a notamment été observé que le 26RFa exerce un puissant effet anti-hyperglycémiant lorsqu’il est administré en intra-cérébro-ventriculaire. Néanmoins, le rôle précis des différentes sous-population de neurones à 26RFa dans la régulation de la glycémie et les mécanismes d’action mis en jeu restent inconnus. De plus, l’interaction du système neuropeptidergique 26RFa/GPR103 avec d’autres systèmes neuropeptidergiques hypothalamiques reste également à l’étude. Nos données récentes montrant la colocalisation du 26RFa et des orexines dans les mêmes neurones de l’aire hypothalamique latérale suggèrent néanmoins que ces deux systèmes pourraient être impliqués ensemble et interagir au sein de l’hypothalamus latéral, pour réguler la glycémie. Ainsi, la caractérisation des différentes populations de granules de sécrétion, en terme de contenu en neuropeptides et granines, au sein des neurones 26RFa devrait permettre une meilleure compréhension de la capacité sécrétoire de ces neurones. Ces données, associées à l'invalidation de l'expression de la CgA au sein de cette population neuronale permettront de caractériser les rôles respectifs de ces neuropeptides dans la régulation centrale de l’homéostasie glucidique et des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-tendant leur action.
Procédures
Les animaux seront soumis à divers types d'expérimentations et de prélèvements soit en condition vigile, soit sous anesthésie. Les injections intra-péritonéales durent 3sec, avec procédure globale : contention+injection ip 15-20 sec. La perfusion intra-cardiaque dure moins de 7 min ; l'anesthésie induite : 5 min, renouvelée si nécessaire. Les animaux subiront des prélèvements sanguins caudaux d'un volume total de l'ordre de 40 μL par expérimentation. Les expérimentations sont répétées 6 à 10 fois avec une semaine de repos minimum entre chacune d'entre elles. - mesure de glycémie : mise à jeun de 16h, puis prélèvements sanguins caudaux (2 prélèvements de 1 sec chacun et de 2µl, toutes les 15 min, 9 fois entre T0 et T120 min). - test de tolérance au glucose : prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 200µl de glucose à T0 (2g/kg poids corporel) - tolérance à l’insuline : mise à jeun de 6h, puis prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 225µl d’insuline à T0 (0,75UI/kg poids corporel). - test de tolérance au pyruvate : mise à jeun pendant 16h, puis prélèvements sanguins idem + injection intra-péritonéale de 200µl de pyruvate à T0 (2g/kg poids corporel). - test de sécrétion d’insuline : mise à jeun pendant 16h, puis prélèvements sanguins caudaux de 10-15µl à T0, T15, T30 et T60 min après injection intra-péritonéale de 200µl de glucose à T0 (2g/kg poids corporel). L'hébergement en cage de calorimétrie indirecte permettra d'évaluer les paramètres métaboliques des animaux : 7 jours d’habituation en cage mimant la cage de calorimétrie indirecte, puis séjour de 7j en cage de calorimétrie indirecte avec 96h de mesures contrôles (prise alimentaire, hydrique, consommation d’O2, production de CO2, déplacements), puis 24h en condition de jeune puis 48h en condition de renutrition.
Impact sur les animaux
Les tests physiologiques auxquels seront soumis les animaux peuvent avoir un impact léger à modéré selon les procédures. Des signes de souffrance peuvent être observés : dégradation de l'état général de l’animal avec modifications de l’apparence physique externe (plaies, mauvais aspect du pelage, poil hérissé, dos voûté), et/ou changements du comportement (prostration, léthargie, agressivité inhabituelle lors des manipulations, vocalises), perte de poids importante.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux ne peuvent être réutilisés dans de nouvelles expérimentations sans compromettre les résultats et sont mis à mort.
Remplacement
Cette étude a l’avantage d’aborder, en parallèle, l’étude neuroanatomique de la chromogranine A (CgA) et de sa fonction régulatrice du système peptidergique 26RFa. Elle permettra la compréhension du rôle de la CgA dans la sécrétion de 26RFa, plus particulièrement par les neurones hypothalamiques, et ainsi la compréhension de la régulation centrale de l'homéostasie glucidique, en condition physiologique. Une telle approche, très intégrée, n’est rendue possible que par les études in vivo.
Réduction
Compte tenu de la variabilité inter-individuelle des processus physiologiques étudiés, nous utiliserons des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. De plus, une partie des tests physiologiques prévus pour évaluer l’homéostasie glucidique sera réalisée successivement sur une même souris et chaque souris sera son propre contrôle afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. Chaque nouveau test sera débuté lorsque les animaux auront bénéficié d’une période de rétablissement minimum d’une semaine qui permet aux animaux de reconstituer leur volume sanguin après les prélèvements effectués lors du test précédent et de stabiliser leur poids corporel. Pour les groupes dédiés au prélèvement des explants hypothalamiques ou cérébraux, les groupes de souris pourront être réduits à 10 animaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. Les animaux reproducteurs seront maintenus à trois par cage pour éviter tout isolement social et leur environnement sera enrichi (présence de matériel pour construire un nid + dôme en plastique rouge pour s'y réfugier). Pendant toute la durée du séjour, les animaux seront suivis quotidiennement pour déceler tout signe de souffrance. Parmi ces signes, seront notamment relevés : perte de poids importante (20% du poids initial), posture « dos voûté », prostration, plaies, poil terne, vocalisations anormales, agressivité. Si l’un de ces signes ou combinaison de signes apparaît, le suivi de l’animal sera renforcé. Si l’état de l’animal s’aggrave dans les heures qui suivent ou ne s’améliore pas dans les 24h, il sera considéré qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et une mise à mort sera réalisée. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par injection intra-péritonéale d'analgésiques, répétée après 4 heures si nécessaire.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre de façon globale, le rôle de la CgA dans la sécrétion des neuropeptides par les neurones 26RFa et la régulation hypothalamique de l’homéostasie glucidique. La souris présente de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : taille et coût d’entretien réduits, fortes performances reproductives. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris permet des approches génétiques et chémogénétiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude, la physiologie adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.
Elevage avec Identification et génotypage invasifs
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 3000
72 000 souris et 3 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, les animaux dont le génotype ne présente pas d'intérêt étant tués et les autres gardés en vie pour d'autres protocoles. Nouveau-nés ou adultes maintenus en contention, ils reçoivent un tatouage puis une biopsie de la queue ou de l'oreille pour identification et génotypage. Le porteur décrit une douleur légère et brève, avec dans de rares cas une hémorragie à la queue ou le rejet du nouveau-né par sa mère. Il affirme que les prélèvements non invasifs par écouvillon salivaire ou follicule pileux ne permettent pas un génotypage fiable avant sevrage, ce qui justifierait ces biopsies.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d'identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits dans l'Etablissement Utilisateur(EU) pour répondre aux besoins des chercheurs des deux instituts de Neurosciences. Les 23 équipes emploient une centaine de lignées qui sont couvertes en expérimentation par actuellement 88 autorisations de projets. Pour ce faire, sur les nouveau-nés, deux gestes techniques invasifs sont réalisés succéssivement: un tatouage digital selon un code de numérotion enregistré dans les procédures de l'EU suivi d'une biopsie de queue et sur les animaux adultes seul le prélèvement de la biopsie d'oreille est réalisé. Ces procédures sont réalisées sur animal vigile agé de 6 à 12 jours pour les nouveau-nés et sur animal adulte. Cette identification et génotypage se justifient par la nécessité de: -sélectionner les animaux d'intérêt pour l'expérimentation (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projets si des procédures le justifient -sélectionner et vérifier le génotype des géniteurs permettant l'amplification et l'entretien des colonies -sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences et les prélèvements d'organes ou des tissus pour des études ex-vivo hors champ d'application. Les animaux dont le génotype n'est pas d'intérêt pour les expérimentations déclarées, les activités d'élevage, la formation ou les prélèvements seront mis à mort selon une méthode réglementaire.
Bénéfices attendus
La procédure d'identification et de génotypage est nécessaire pour la sélection des animaux d'intéret dans les projets de recherche. L'identification par tatouage permet: -d'identifier individuelement ou par lot les animaux -de manière permanente sur le long terme -de ne pas mutilier les animaux sur leurs pattes pour garder une motricité fine -d'éviter un recours à l'anesthésie. Le génotypage par biopsie de l'extrémité de la queue ou d'oreille permet: -l'obtention de resultats fiables grâce à une quantité et une qualité du matériel génétique obtenu pour réaction d'amplication d'ADN -de minimiser les risques de contaminations entre échantillons grâce aux procédures de prélèvement compatible avec les contraintes sanitaires nécessaire au maintien du statut EOOPS (Exempt d'opportunistes et d'organismes pathogènes spécifiques) ciblé -d'éviter le recours à l'anesthésie
Procédures
Tatouage et prélèvement de biopsie de queues sur animal nouveau-né vigile ou d'oreille sur animal adulte vigile: un seul prelevement /animal et la procédure dure de 2 à 3min/animal
Impact sur les animaux
Les gestes réalisés provoquent une douleur légère et de court durée. L'animal est maintenu en contention pendant les actes ce qui est une source de stress qui sera minimisé par l'expérience des expérimentateurs. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir: -une légère hémorragie à la queue -le rejet du nouveau-né par la mère
Devenir
Une mise à mort des animaux est réalisée si leur génotype n'est pas d'intérêt ou gardé en vie pour une utilisation continue couverte par les autorisations de projets.
Remplacement
A ce jour, les prélèvements non invasifs à base d'écouvillons salivaires ou de follicules pileux ne permettent pas de procéder au génotypage de façon fiable en prenant en compte les techniques de génotypage robotisées, des procédures de prélèvements en condition stérile et la nécessité d'obtenir des résultats avant sevrage pour la gestion des élevages et la production des animaux expérimentaux. Un doute sur les résultats de génotypage conduirait à la nécessité de procéder à un nouveau prélèvement sur des animaux plus âgés et donc plus sensibles à la douleur. Chaque erreur qui conduirait à l'accouplement d'animaux n'ayant pas les caractéristiques attendues engendrerait: -une augmentation du nombre d'animaux produits inutilement -la naissance d'animaux avec des phénotypes potentiellement délétères -l'utilisation d'animaux génétiquement sans interet dans des projets expérimentaux induisant des résultats érronés et non exploitables
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d'autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Les plans d'élevage mis en place en concertation avec le porteur de projet visent à réduire autant que possible le nombre d'animaux générés et donc d'animaux à identifier et génotyper. Dans la mesure du possible, nous favorisons l'utilisation des animaux au génotype non d'intéret dans d'autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d'animaux produits par l'EU. Nous pouvons également utiliser ces animaux comme congénère de compagnie pour éviter les animaux isolés.
Raffinement
Les actes d'identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maitrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l'inconfort et le stress ressentis par l'animal. Ces identifications et prélèvements de biopsies sont réalisés avec du matériel et des instruments stériles et appropriés permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d'aseptie établies dans l'EU. La procédure est réalisée sous PSM et est limitée dans le temps (2-3min/animal) pour limiter le temps de séparation des nouveaux-nés de leur mère et la contention des animaux. Une mise à mort est décidée si la queue de l'animal présente un saignement non maitrisé dans l'heure suivant la réalisation de la biopsie sinon il est réalisé à reception des résultats de génotypage ou à P14 si les animaux nés ne seront pas utilisés.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l'homme ce qui permet une extrapolation des résultats à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire ou comportementale. Le rat est lui couramment utilisée dans des études de comportement et de neurogénèse adulte ce qui a permis de constituer des bases de données importantes pour guider la conception des protocoles expérimentaux et d'obtenir une bonne réplicabilité des expériences. Que soit la souris ou le rat, ces espèces de rongeurs sont des espèces qui permettent une obtention aisée de modèles génétiquement altérés par différentes méthodes et donc créer des modèles murins de pathologies neurologiques bien caractérisés. Pour la grande majorité, les animaux sont identifiés entre 6 et 12 jours post natal. A cet age les animaux sont aisément manipulable, le cartilage est souple et les groupes sociaux sont stables. Toutes fois, certaines procedures exigent un génotypage précoce entre la naissance et 5 jours : ces stades de développement sont ceux où les cellules expriment le mieux leur potentiel de différenciation et de survie en culture; cultures primaires de neurones hippocampiques et cultures organotypiques de tranches de cerveaux sur nouveaux nés. Pour les animaux adultes qui sont les géniteurs lors de l'introduction d'une lignée ou bien des vérifications sur animal adulte demandées par le chercheur, c'est un autre prélèvement qui est utilisé pour le génotypage: biopsie d'oreille.