Système nerveux

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Opérées au cerveau, elles reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant 20 jours, subissent un test comportemental, puis sont tuées pour l'électrophysiologie. Le projet étudie l'effet du cannabis sur la mémoire à l'adolescence, les souris étant utilisées à 28 jours pour mimer cette période. Le porteur affirme que ces circuits neuronaux ne peuvent être étudiés ni par simulation numérique ni chez des invertébrés.

Objectifs

Le noyau accumbens (NAc) est une région du cerveau impliquée dans la récompense et l'une des principales cibles des drogues illicites. L'hippocampe, une région du cerveau impliquée dans la formation de la mémoire, envoie des informations au NAc. Certaines drogues illicites, comme le cannabis, modifient les connexions neuronales entre l'hippocampe et le NAc, entraînant des troubles de l'apprentissage, mais on ne sait pas comment ces connexions sont régulées et modifiées après la consommation de cannabis. Il est important de noter que la consommation de cannabis commence généralement à l'adolescence, une période où le cerveau subit de nombreux changements. Il est donc important de comprendre comment la consommation de cannabis pendant l'adolescence influe sur la mémoire. Ce projet étudiera ces questions en se concentrant sur un candidat potentiel pour la régulation de ces connexions neuronales : les récepteurs CB1 astrogliaux. Le récepteur CB1 est le principal récepteur cérébral des effets du cannabis et on sait qu'il est exprimé dans les astrocytes, les principales cellules du cerveau. Notre nouvelle hypothèse est que l'activation des récepteurs CB1 dans les astrocytes pendant la consommation de cannabis entraîne des changements dans les connexions hippocampe-NAc et des déficits de la mémoire. En outre, nous étudierons ces effets sur des souris adolescentes, de sorte que notre étude fournira des informations sur les effets néfastes de la consommation de cannabis sur la mémoire des adolescents.

Bénéfices attendus

La consommation de cannabis à l'adolescence est en constante augmentation, mais ses effets nocifs à cet âge ne sont pas bien compris. Il est bien connu que la consommation de cannabis entraîne des déficits de la mémoire, mais les mécanismes neurobiologiques sous-jacents sont inconnus. Le récepteur CB1 étant la cible endogène des molécules psychoactives du cannabis, comprendre comment les récepteurs CB1 des astrocytes (les principales cellules du cerveau) régulent les connexions hippocampe-NAc (impliquées dans la mémoire) fera progresser nos connaissances sur ces processus. Par conséquent, ce projet nous aidera à mieux comprendre les mécanismes par lesquels le cannabis modifie ce circuit neuronal, altérant ainsi la mémoire et, de cette manière, visant à découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des effets nocifs de la consommation de cannabis.

Procédures

Tous les animaux seront opérés (durée de l'opération 90 min + 4 jours de suivi postopératoire). Une fois rétablis, les animaux recevront une injection intrapéritonéale (15 sec) par jour pendant une période de 20 jours consécutifs. Le test comportemental sera réalisé pendant 4 jours consécutifs (1h/jour maximum).

Impact sur les animaux

L'opération ne présente pas de risques majeurs et la douleur associée sera contrôlée par une anesthésie et des analgésiques adéquats. Si ces mesures sont prises correctement, il n'y a pas de signes de douleur après l'opération ou pendant la convalescence. Le taux d'apparition de signes d'infection de la plaie après ce type d'opération est très faible. Les traitements médicamenteux et les injections IP sont bien contrôlés en laboratoire et ne provoquent pas d'inconfort pour l'animal. De plus, les produits utilisés (et leurs doses) sont bien tolérés par les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour être utilisés en électrophysiologie.

Remplacement

A ce jour, notre connaissance de l'organisation des circuits neuronaux chez les mammifères, y compris l'homme, ainsi que leur plasticité, ne nous permet pas de concevoir et de réaliser des simulations numériques fiables pour étudier les changements qui se produisent. En outre, l'utilisation d'invertébrés, dont le système nerveux est complètement différent, serait inappropriée. Dans ce contexte, le recours à des expériences sur les mammifères reste nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux ne doit pas dépasser 15 animaux, c'estàdire le nombre minimum d'échantillons permettant l'application des tests statistiques classiques dans le domaine et également décrits dans la littérature scientifique sur le sujet. Les chiffres attendus garantissent une bonne interprétation des résultats. Toutefois, si l'expérience montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Les animaux sont logés dans des cages collectives avant et après la manipulation. Les souris sont hébergées avec du matériel de nidification en coton dans des conditions optimales de température, d'humidité et de lumière. Les souris sont observées quotidiennement par du personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs formés conformément à la réglementation en vigueur, afin que des mesures d'analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. L'établissement des points limites est basé sur une évaluation de l'état général et du comportement des animaux, comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, tant préopératoires que postopératoires, comprennent également l'utilisation d'analgésiques pour la gestion de la douleur et doivent être effectuées par des expérimentateurs formés à à la chirurgie des rongeurs, conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

À ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères, y compris l'homme, et surtout leur plasticité, ne permet pas de concevoir et de mettre en oeuvre des simulations numériques fiables permettant d'étudier les changements qui se produisent. De plus, l'utilisation d'invertébrés dont le système nerveux est complètement différent serait inappropriée. Dans ce contexte, l'expérimentation animale reste nécessaire. La souris est le modèle idéal pour ces trois raisons 1) Possibilité d'étudier des mutants pour une protéine donnée (dans ce cas le récepteur CB1), 2) Reproductibilité et comparabilité avec d'autres résultats obtenus dans le laboratoire et la communauté scientifique au sens large. 3) Les installations sont équipées pour les études sur les rongeurs. Les animaux seront utilisés à l’âge de 28 jours, car nous avons l'intention d'étudier les effets du cannabis pendant l'adolescence. En outre, une fois que toutes les procédures expérimentales in vivo (chirurgie, traitement pharmacologique et tests comportementaux) seront terminés, les animaux seront sacrifiés et utilisés pour l'électrophysiologie in vitro. En raison de la difficulté d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques sur des souris adultes, le protocole que nous avons établi permettra d'effectuer des enregistrements électrophysiologiques après que toutes les procédures auront été achevées sur des souris raisonnablement jeunes.

696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une chirurgie sous anesthésie pour modifier l'expression d'un gène dans le cerveau de leurs embryons, les mères étant tuées après le sevrage et les petits à l'âge adulte pour prélever le cerveau. Le projet cherche à comprendre la survie anormale de neurones transitoires dans certaines épilepsies, les retombées thérapeutiques restant hypothétiques. Le porteur affirme que la complexité du cerveau ne peut être reproduite dans aucun modèle in vitro.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux impliquent un dysfonctionnement cérébral résultant d'une altération de l'assemblage du cerveau au cours du développement embryonnaire. Ils comprennent l'autisme, le trouble déficitaire de l'attention/hyperactivité, la déficience intellectuelle, l'infirmité motrice cérébrale et diverses formes d'épilepsie. On estime que jusqu'à quinze pourcents des enfants des pays développés peuvent souffrir de troubles neurodéveloppementaux, dont certains symptômes durent toute la vie. Il est donc extrêmement important de comprendre les déficits impliqués dans ces troubles pour trouver des stratégies thérapeutiques permettant de guérir ces patients. Divers mécanismes peuvent être impliqués dans le développement anormal du cerveau, notamment la génération de neurones, leur migration vers leur destination finale et leurs connexions adéquates. En outre, une forme de mort cellulaire programmée apparaît comme un nouveau mécanisme, encore peu étudié, du bon développement du cerveau. Ainsi, certains n'apparaissent que de manière transitoire au cours du développement du cerveau, où ils participent à la construction des circuits neuronaux, et sont programmés pour mourir à la fin de la maturation cérébrale. Une survie aberrante de ces neurones a été constatée chez des patients atteints de troubles neurodéveloppementaux associés à l'épilepsie. De plus, nos travaux récents révèlent que le fait de forcer certains de ces neurones à survivre après la naissance perturbe le câblage du cerveau, ce qui entraîne une activité cérébrale aberrante et des crises d'épilepsie. Notre projet vise à étudier comment la survie aberrante des neurones transitoires chez la souris et l'homme conduit à une activité cérébrale altérée dans les troubles du développement neurologique. Au cours de ce projet, nous identifierons certains mécanismes clés de la "mort cellulaire programmée" au cours du développement du cerveau et évaluerons son rôle dans certains troubles du développement neurologique associés à l'épilepsie, ouvrant ainsi la voie à l'identification de nouvelles cibles ou stratégies d'intervention thérapeutique dans ces troubles.

Bénéfices attendus

La survie anormale des neurones transitoires est une caractéristique des troubles du développement cortical associés notamment à des formes d’épilepsies focales sévères. Comprendre les déterminants cellulaires qui contrôlent le destin de ces cellules permettra de mieux comprendre leur survie anormale dans la pathologie et de concevoir des stratégies visant à y remédier. Une meilleure connaissance de l’intégration de de ces cellules dans les réseaux corticaux et de leur impact sur l’activité corticale permettra à la fois de mieux comprendre comment leur survie anormale promeut l’émergence d’activités pathologiques, et ainsi révèlera de nouvelles cibles à visée thérapeutique dans les affections neurologiques impliquant une survie anormale des neurones transitoires.

Procédures

Un groupe de souris gestantes sera soumis à une courte chirurgie sous anesthésie et analgésie (45 min) pour induire l’expression d’un gène spécifique dans le cerveau de leurs embryons. Une fois les petits nés un antibiotique leur sera administré via la lactation (antibiotique placé en continu dans l’eau de boisson de la mère) afin de permettre l’expression de ce gène. Les mères seront euthanasiées après le sevrage des petits et les petits seront euthanasiés à l’âge adulte par une procédure adaptée. Un autre groupe de souris gestantes sera aussi soumis à une courte chirurgie (45 min) sous anesthésie et analgésie pour induire l’expression d’un virus non pathogène dans le cerveau de leurs embryons. Une fois ces embryons adultes, ils seront eux-mêmes soumis à une chirurgie d’une heure sous anesthésie et analgésie pour induire l’expression d’un second virus non pathogène dans leur cerveau. Les mères seront euthanasiées après le sevrage des petits et les petits seront euthanasiés à l’âge adulte par une procédure adaptée.

Impact sur les animaux

La contention peut provoquer un stress chez l’animal. Les étapes d’anesthésie peuvent provoquer une détresse respiratoire, et une perte de chaleur de l’animal. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer une souffrance et risque d'infection de la cicatrice. Les administrations d'antidouleur/anesthésiques peuvent entrainer une douleur et un stress de courte durée associée à la piqure de l’aiguille.

Devenir

Les animaux seront mis en oeuvre dans des expériences in vitro ou des marrquages histologiques, nécessitant un prélèvement du cerveau. Ils seront donc nécessairement euthanasiés en fin d'experimentation et ne pourront être réutilisés.

Remplacement

Les études menées dans ce projet portent sur le développement du cerveau et les connections entre neurones dans le cerveau adulte. Ainsi, les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées sur des cerveaux intacts, prélevés sur des souris au stade embryonnaire ou adulte, et ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement/adulte. En effet, nous disposons d’outils génétiques puissants chez la souris nous permettant de spécifiquement cibler les neurones d’intérêt ce qui en fait un modèle de choix. De plus, la complexité anatomique du cerveau et des réseaux neuronaux qui s’y établissent ne peuvent être mimés dans aucun modèle in vitro.

Réduction

Les expériences de chirurgie antérieures de nos collaborateurs sur ce type d’étude et de modèle animal indique qu’un échantillon de 6 animaux par condition pour une expérience donnée est suffisant pour mettre en évidence une différence mesurable et significative entre les conditions. A l’aide de ces calculs, nous estimons devoir utiliser 696 animaux dans le cadre de ce projet. Les effectifs ont été confirmés par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans un environnement avec enrichissement (sizzle, cabane en plastique) avec eau et nourriture à volonté. Les animaux seront regroupés en groupe sociaux avant la gestation (pour la mère) et après le sevrage (pour ses petits). Entre ces deux temps, la mère disposera d’une cage seule afin de minimiser le stress lors de la gestation et d’une cage seule avec ses petits avant le sevrage. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Après les chirurgies, les souris seront laissées seules pour une période de convalescence de 24 heures avant d’être remises en groupes sociaux. Après les chirurgies, une litière utilisée spécifique pour les animaux opérés permet de diminuer les risques d'infection de la cicatrice. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont placées sur une plaque chauffante, anesthésiée et un gel ophtalmique est également utilisé afin d’éviter le dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place, en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites, des mesures appropriées seront mises en place.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle de choix afin d’étudier le développement du cerveau ainsi que les connexions neuronales chez l’adulte, à la fois car c’est un modèle présentant un développement très bien caractérisé et stéréotypé mais surtout en raison des similarités du développement du système nerveux entre la souris et l’Homme. De plus, l’organisation de notre structure d’intérêt du cerveau est très similaire chez la souris et l’homme (organisation en couches, morphologie…). Les femelles gestantes sont des adultes. L'expérimentation est menée sur des souris du stade embryonnaire (E11.5-E12.5) jusqu’à l’âge adulte. En effet, les chirurgies concernant l’injection de gène/virus chez l’embryon doit se faire chez l’embryon lors de la neurogenèse de nos neurones d’intérêts et l’analyse de la survie neuronale et des circuits neuronaux doit se faire chez l’adulte car nous nous intéressons aux propriétés du cerveau de la souris adulte.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des périodes d'hypergravité en centrifugeuse, qui provoquent stress, baisse d'activité et perte de poids les premiers jours, puis soumises à une série de tests comportementaux, boîte noir et blanc, reconnaissance d'objet, labyrinthe en Y et piscine de nage. Elles sont ensuite mises à mort pour prélever le cerveau. Le porteur relie le projet aux troubles cognitifs des astronautes et affirme que l'effet de la gravité sur un organisme entier ne peut être modélisé in vitro ou in silico.

Objectifs

Lors des voyages spatiaux, les astronautes sont soumis à des modifications de gravité qui compromettent leurs performances cognitives, et qui représentent encore l’un des principaux écueils concernant les vols de longue durée. Ce projet consiste à comprendre les mécanismes cérébraux, en particulier hippocampiques, induisant ces perturbations provoquées par des changements de gravité. En effet, si le système vestibulaire est le système sensoriel initialement impliqué dans le mal de l’espace, l’hippocampe, structure centrale auquel il est étroitement connecté, représente une cible potentielle de choix. Notre hypothèse est qu’une partie des troubles cognitifs des astronautes seraient liés à des modifications de la plasticité fonctionnelle des réseaux neuronaux hippocampiques, propriété reconnue comme support biologique des processus mnésiques.

Bénéfices attendus

Les données qui seront recueillies grâce à ce projet apporteront des informations essentielles sur le rôle de la gravité dans le fonctionnement de l’hippocampe et des structures associées. En effet, on sait que le système vestibulaire, qui est l’organe sensoriel sensible à la gravité est indirectement connecté à l’hippocampe et participe ainsi non seulement à l’orientation dans l’espace mais aussi à la mémoire spatiale et aux autres fonctions contrôlées par l’hippocampe. Comprendre comment la gravité modifie le fonctionnement et la plasticité de l’hippocampe, et indirectement comment elle affecte les fonctions cognitives servira de base pour trouver des contre-mesures pour aider les astronautes à éviter la désorientation et l’altération des fonctions cognitives qu’ils subissent lors de changements de gravité au cours des vols spatiaux. En utilisant différentes durées d’exposition à l’hypergravité, nous cherchons à évaluer à la fois les adaptations qui s’opèrent dans les premiers jours mais aussi sur le plus long terme et comment s’effectue la réadaptation à 1G post-exposition à l’hypergravité.

Procédures

Les animaux seront exposés à une période d’hypergravité . Ensuite, 96 animaux seront mis à mort dès la sortie de la centrifugeuse pour permettre des prélèvements de tissus (expositions de 24h, 48h, 15j). Les autres seront soumis à des tests comportementaux. Les animaux effectuant des tests comportementaux seront divisés en 2 lots avec des protocoles de comportement différents (exposition à 24h, 15 j ou 30 j d’hypergravité). Pour le premier lot, le premier jour après la sortie de la centrifugeuse, les souris feront un test de la boite noire et blanche (10 min par souris). Ce test vise à évaluer l’anxiété des souris. Le deuxième jours le test de reconnaissance de place d’objet sera utilisé (test qui permet d’évaluer la mémoire spatiale et de reconnaissance à long terme) (2 sessions de 10 min à 4h d’intervalle par souris). Le 3ème jour la sociabilité et la reconnaissance sociale des souris sera évaluée grâce à un dispositif comportemental (2 sessions de 10 min par souris). Le 4ème jour les souris effectueront la première session d’un test d’évitement passif, la seconde partie du test sera effectuée une semaine plus tard (entre 1 et 5 min par souris)(mémoire émotionnelle). Après ces différents tests, soit 2 semaines après la sortie de la centrifugeuse les souris seront mises à mort pour permettre des prélèvements de structures et des enregistrements électrophysiologiques. Pour le lot 2, le jour de la sortie de la centrifugeuse les animaux effectueront le test d’enfouissement de billes (évaluation de l’anxiété,20 min par souris). Le jour 2, les souris effectueront un test d’alternance spontanée dans un labyrinthe en Y (mémoire de travail, 5min par souris). Le 3ème jour les souris commenceront un protocole en piscine de Morris. Ce test, réparti sur 5 jours donnera des indications sur la mémoire spatiale et l’apprentissage (4x4 essais de 1min max par jour). Une semaine après la sortie de la centrifugeuse les souris seront mises à mort pour permettre des prélèvements de structure et des enregistrements électrophysiologiques. Ces études vont nous permettre d’évaluer si les modifications sont concomitantes au niveau comportemental (mémoire) et au niveau cérébral (propriétés électrophysiologiques de l’hippocampe).

Impact sur les animaux

La mise en hypergravité des animaux induit une sensation d’alourdissement qui provoque une augmentation du niveau du stress chez le rongeur, lié à la perturbation de perception de la gravité, et à la difficulté initiale à se déplacer. Par conséquent, et comme cela a été montré dans la littérature, les animaux vont présenter une faible activité motrice pendant une période de quelques heures avant de s’habituer au nouveau référentiel gravitataire et reprendre une activité normale. Une baisse de la température corporelle due à l’inactivité des animaux se produira lors des 3 premiers jours d’exposition. De nombreuses études ont aussi montré une diminution de la masse corporelle les premiers jours de centrifugation. Cette perte de poids est due à une hypophagie médiée par une réaction au stress vestibulaire induit par la centrifugation, au bout de 3 à 4 jours les animaux recommenceront à s’alimenter normalement et reprendront du poids.

Devenir

Les animaux de l’étude seront mis à mort à la fin de la procédure (soit 300 souris) pour la réalisation d'analyses post-mortem.

Remplacement

Des études in vitro ou in silico ne permettent pas de mettre en évidence l’impact de l’hypergravité sur un organisme entier. En effet, la gravité exerce des effets sur l’intégralité de l’organisme (systèmes sensoriels, système musculosquelettique, viscères etc.), et les effets de ses modifications et de leurs interactions ne peuvent, à l’heure actuelle, pas être modélisés autrement que sur un organisme dans son intégralité. Par ailleurs, étant donné que nous effectuons des tests comportementaux, nous avons besoin des animaux vivants. Pour les enregistrements électrophysiologiques nous avons besoin de tranches de cerveaux d’organismes ayant été exposés à une hypergravité, qui ne sont pas encore modélisables in vitro ou in silico. Nous avons choisi le modèle souris afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur ce même modèle, car il est de petite taille et peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse. De plus, le modèle souris est un mammifère suffisamment proche de l’homme pour pouvoir transférer les données obtenues entre ces deux espèces.

Réduction

Tous les animaux utilisés pour les études comportementales seront utilisés pour les études post-mortem ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. Nous avons défini le nombre d’animaux dans chaque groupe à n=12 en nous basant sur la littérature disponible sur le sujet et sur les travaux du laboratoire utilisant les mêmes méthodes. En effet, un calcul d’effectif sur le site biostatgv.sentiweb.fr nous a permis d’aboutir à ce nombre sur la base de données précédentes acquises au laboratoire. Dans une optique de réduire le nombre d’animaux nous avons décidé de n’utiliser qu’un seul groupe d’animaux témoins et non pas un groupe témoins pour chaque temps d’exposition à l’hypergravité. Aussi, les animaux serviront en plus de la récupération de leur cerveau à des prélèvements sanguins afin d’en réduire leur nombre.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables tout au long de l’expérimentation. La stabilité des groupes permettra de réduire une éventuelle agressivité. Une semaine de manipulation des animaux sera réalisée avant les expérimentations afin de réduire le stress lié à la manipulation. Pendant cette semaine les animaux des groupes utilisés pour l’étude comportementale seront aussi habitués à être transportés dans un tunnel en polycarbonate rouge. Le tunnel sera placé à demeure dans la cage puis la souris sera encouragée à entrer dans le tunnel qui sera soulevé afin de faire ensuite délicatement glisser la souris dans la main. Cette méthode permet de ne pas soulever les souris par la queue et enlève par conséquent un facteur important d’anxiété. Lors des tests comportementaux les souris seront placées dans la pièce expérimentale 30 minutes avant le début des tests afin de leur permettre de s’habituer à ce nouvel environnement. De la nourriture humidifiée sur le sol ainsi que de la gélatine seront mis dans les cages pour permettre aux animaux de se nourrir et de s’hydrater facilement au début de l’exposition à l’hypergravité (il en sera de même pour les animaux témoins). Leur environnement est enrichi par des frisures de carton et un igloo en papier mâché. Les animaux seront surveillés par un système vidéo dans la centrifugeuse. De plus, à chaque arrêt de la centrifugeuse un responsable des animaux vérifiera quotidiennement leur état de santé et particulièrement d’éventuelles variations de poids, leur apparence physique externe (poils hérissés, blessures…) ou des changements de comportement (attitude de prostration, animal ne répondant plus à son environnement ou réagissant de manière inhabituelle à l’expérimentateur, réduction importante de l’activité motrice…). Un animal présentant un tel état de mal-être ou de souffrance sera immédiatement exclu de l’étude et une discussion sera entreprise avec des membres de la SBEA concernant son éventuelle euthanasie (cf grille de points limites).

Choix des espèces

Les données bibliographiques les plus récentes sur ce sujet ont portés sur le modèle souris, il parait donc judicieux de poursuivre avec cette espèce pour pouvoir confronter nos résultats et apporter de nouvelles données. Nous avons également choisi le modèle souris car il est de petite taille, peut être maintenu en groupes sociaux dans des cages standards placées dans les nacelles de la centrifugeuse et supporte bien une modification de la gravité jusqu’à 2G. Nous avons également choisi d’utiliser des souris C57BL6 car leur génome est connu et que des modifications de leur génome est possible et pourrait nous être utile par la suite (OGM sans otoconies par exemple). C’est aussi une souche qui est beaucoup étudiée au laboratoire et sur laquelle nous avons donc une importante base de données. Nous utilisons des souris adultes entre 3 et 5 mois car pour étudier la plasticité synaptique hippocampique, nous souhaitons que la croissance et le développement cérébral soient atteints. De plus, les astronautes sont toujours adultes, nos données seront donc plus facilement transposables à l’humain.

1 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une contention de 30 minutes en tube avec prélèvements sanguins pour tester la réponse au stress, une chirurgie d'injection d'un virus dans l'hippocampe sous anesthésie, puis un test de nage en labyrinthe aquatique, avant la mise à mort pour prélever le cerveau. Le projet cherche à comprendre pourquoi certains individus vieillissants gardent la mémoire et d'autres non, les retombées pour la maladie d'Alzheimer restant renvoyées au long terme. Le porteur conclut qu'une approche intégrée exige l'animal vivant et qu'aucune technique de remplacement n'est possible.

Objectifs

Au cours du vieillissement, certains individus voient leur mémoire décliner beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables, en comparaison aux individus résilients qui conservent de bonnes capacités mnésiques. La compréhension des processus qui sous-tendent ces différences inter-individuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles cognitifs liés à l'âge. L’hippocampe est une structure cérébrale jouant un rôle clé dans les mécanismes de mémoire, qui reposent en partie sur la génération de nouveaux neurones tout au long de la vie, processus appelé neurogenèse adulte. Un des mécanismes permettant d’expliquer les différences inter-individuelles de mémoire au cours du vieillissement serait la capacité de ces nouveaux neurones créés à l’âge adulte à s’intégrer (individus résilients) ou pas (individus vulnérables) dans le réseau de l’hippocampe. Il est important de noter que les astrocytes, aussi appelés cellules gliales, sont des partenaires actifs des neurones, notamment au cours des processus de mémoire. En effet, les astrocytes sont capables de détecter l’activité neuronale et d’y répondre en libérant des messagers chimiques. Nous proposons d’identifier si la libération de ces messagers est importante pour l’intégration des nouveaux neurones dans le réseau de l’hippocampe et donc le maintien des capacités mnésiques au cours du vieillissement. Enfin, le stress est connu pour avoir un fort impact sur le vieillissement des individus, et la réponse au stress est un facteur prédictif de vieillissement cognitif. De plus, la neurogenèse et l’état des astrocytes peuvent tous deux être affectés par un événement stressant (aigu ou chronique). Dès lors, il est important de connaître la réponse au stress des animaux pour pouvoir établir une corrélation avec l’état fonctionnel des astrocytes associés aux nouveaux neurones de l’hippocampe et le vieillissement cognitif des individus (résilients/vulnérables).

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l'UE. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes cognitives les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémorisation, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences inter-individuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d'Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 6 : • Test de réponse au stress : Les animaux seront placés 30min dans un tube de contention de façon à induire un stress et 3 prélèvements sanguins seront réalisés, à 3 temps différents (1600 animaux seront concernés). • Injections intra-cérébrales de virus : Les animaux seront sous anesthésie gaseuse durant toute la chirurgie (≈1h/animal) qui consiste en une injection de virus dans l’hippocampe, structure cérébrale impliquée dans la mémoire (1600 animaux). • Injections sous-cutanées d’un marqueur de prolifération cellulaire (400 animaux). • Labyrinthe aquatique : Au cours de ce test, les rats nagent dans une piscine et doivent apprendre à localiser une plateforme immergée en s’aidant des indices disposés dans la pièce. Ils passeront au maximum 6min dans l’eau par jour (4 essais consécutifs de 90s maximum), pendant 6 à 15 jours (1400 animaux). • Euthanasie par injection intra-péritonéale d’un mélange d’anesthésique/euthanasiant suivie d’une perfusion intra-cardiaque de fixateur sur cœur arrêté pour l’étude immunohistochimique (400 animaux). • Anesthésie profonde par injection intra-péritonéale d’un mélange d’analgésique/anesthésique suivie d’une perfusion intra-cardiaque de liquide cérébro-spinal artificiel pour l’étude électrophysiologique (1200 animaux).

Impact sur les animaux

Comme lors de tout projet incluant des contentions, des injections et des gestes chirurgicaux, il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adpatées. En effet, même si cela est relativement rare, il se peut que les sites d’injection (intra-péritonéale, sous-cutanée) ou les plaies chirurgicales s’infectent. De même dans les 2 jours suivant la chirurgie, il est possible que les animaux perdent du poids (~10/20g pour un rat de 400g au moment de la chirurgie) ou présentent des signes de douleur. C’est pourquoi les animaux seront suivis quotidiennement au cours des 3 jours suivant ces actes afin de s’assurer de leur bien être. Au cours de ce suivi, l’expérimentateur en charge du projet remplit une fiche de suivi du bien-être animal avec une grille de score. Enfin, au sujet de l’isolement, certes les animaux seront hébergés en cage individuelle mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.

Devenir

Toutes les parties du projet nécessitent le prélèvement du cerveau des animaux afin de réaliser des analyses à l’échelle cellulaire. Les animaux seront de ce fait mis à mort à l’issue de chaque expérience pour réaliser ce prélèvement.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact du vieillissement sur l’interaction entre astrocytes et nouveaux neurones de l'hippocampe, et ce en fonction du vieillissement des capacités de mémoire. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in sillico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents de l’équipe, en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales, des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus de l’étude), ainsi que du nombre minimum d’animaux nécessaires à l’observation de différences inter-individuelles au niveau comportemental (test d’apprentissage spatial) qui constituent l’objet de notre étude. Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents. De plus, notre schéma expérimental prévoit la possibilité de réduire le nombre de lots d’animaux générés en fonction des premiers résultats obtenus, les effectifs pourront ainsi être revus à la baisse si les objectifs sont atteints plus précocément que prévu

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en cages collectives enrichies (nids de fibres de peupliers compressées) afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique (motricité, réactivité, aspect du pelage) et manipulés hebdomadairement jusqu’à leur euthanasie. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière sera effectué chaque semaine. 10 à 30 min avant la chirurgie, un antalgique sera administré à l’animal afin de prévenir la douleur per-opératoire. Après chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement et quotidiennement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire (comportement, plaie, pesée). Si besoin, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée. Nous utilisons des grilles d’évaluation permettant de scorer (0 à 15) de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies mensuellement par l’expérimentateur jusqu’à l’euthanasie des animaux. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera mis à mort par inhalation de gaz carbonique.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la neurogenèse adulte est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’homme. Enfin, cette étude vient compléter les investigations déjà menées sur cette espèce par notre équipe, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante pour contrôler les résultats. Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des injections intra-cérébrales. Ensuite, les différentes études seront réalisées 1 à 15 mois après les chirurgies. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : un groupe début de vie adulte (rats de 4 mois), deux groupes milieu de vie (rats de 8 et 12 mois) et un groupe fin de vie (rats de 18 mois). Ces âges ont été choisis car ils permettent une étude longitudinale de l’interaction entre astrocytes et néo-neurones en comparant les animaux âgés à des animaux plus jeunes.

20 furets vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre moitié confiée pour adoption. Tous reçoivent un implant crânien lors d'une chirurgie de quatre à six heures, puis une cinquantaine de séances d'enregistrement cérébral sous contention, motivées par une privation d'eau. Dix furets sont tués pour analyse histologique du cerveau, les dix autres explantés lors d'une seconde chirurgie puis remis à des organismes d'adoption. Le porteur justifie l'usage du furet par son cortex plissé et une gamme auditive proche de celle de l'humain, et retient les femelles 'en raison de leur petite taille'.

Objectifs

Écouter dans des situations réalistes est un processus actif qui engage nos capacités de perception et de réflexion. Cela donne du sens à la parole, permet à la musique de nous émouvoir et aux sons de notre environnement d'avoir de l'importance. Grâce à notre écoute, nous, les humains et les autres animaux, sommes capables de naviguer à travers des paysages sonores complexes, de distinguer des sources sonores mélangées, de comprendre des messages et d'évaluer leur signification pour nos comportements. Ces compétences sont vraiment remarquables et nous dépassent souvent. Même les systèmes d'ingénierie audio les plus sophistiqués n'arrivent pas encore à égaler ces performances étonnantes. Le projet de recherche a pour objectif d'étudier une nouvelle approche de l'audition qui considère l'écoute comme un processus interactif entre nos facultés sensorielles et notre réflexion. Nous voulons intégrer la cognition (c'est-à-dire notre façon de penser et de prendre des décisions) comme une partie essentielle du traitement de l'information sonore, ce qui peut être étudié au niveau de notre activité cérébrale. En d'autres termes, nous cherchons à comprendre comment notre cerveau s'adapte rapidement lors de l'écoute, tant au niveau des neurones individuels que des groupes de neurones travaillant ensemble. Ce processus d'adaptation rapide est appelé "plasticité rapide". Il se manifeste à différents niveaux de notre système auditif, depuis l'oreille interne (cochlée) jusqu'au cortex auditif et préfrontal de notre cerveau. En résumé, ce projet de recherche explore comment notre cerveau traite les sons de manière active et flexible, en utilisant à la fois nos facultés sensorielles et cognitives. En comprenant mieux ces mécanismes, nous pourrons élargir nos connaissances sur l'écoute et développer de nouvelles avancées dans le domaine de l'audition.

Bénéfices attendus

Le projet s'appuie sur les travaux des chercheurs en charge du protocole réalisés lors de la dernière décennie sur la physiologie et la modélisation informatique de ces phénomènes. Ces efforts ont abouti à la découverte de plasticité rapide dans le cortex auditif, au niveau du neurone unique et de populations de neurones. Ils ont aussi conduit à l'élaboration d'un modèle neuromimétique de traitement auditif qui ont mené à des percées technologiques et à des applications concrètes. Ils ont enfin permis d’utiliser une technologie de neuroimagerie large-champ chez le furet. Ce projet étendra ces recherches et intégrera de nouveaux paradigmes psychophysiques puissants pour sonder l'écoute active chez l'homme. S'appuyant sur ces domaines très complémentaires et plusieurs innovations techniques (reconstruction de stimulus à partir d'enregistrements de neurones à grande échelle chez les animaux réalisant une tâche de comportement, nous espérons promouvoir une vision nouvelle de la perception auditive et de la cognition. Cela contribuera également de manière significative à des avancées significatives dans le domaine du traitement du signal pour les prothèses auditives cliniques, étant donné que de nombreuses limitations actuelles ne sont pas technologiques, mais plutôt conceptuelles.

Procédures

Tous les animaux (n=20) sont équipés d'un implant crânien lors d'une première chirurgie qui se fait sous anesthésie et analgésie (durée 4-6h). Cet implant permet ensuite de réaliser des enregistrements neuraux en électrophysiologie ou en neuroimagerie fonctionnelle par ultrasons (procédures répétées autour d'une cinquantaine de fois en moyenne par animal, entre 3 et 5 fois par semaine, durée moyenne d'enregistrement 3h). Une partie de la cohorte sera euthanasié (sous sédation et anesthésie ; n=10). L'implant crânien est retiré des animaux qui ne sont pas euthanasiés (n=10 - voir 5.8 + 5.9), lors d'une seconde chirurgie sous anesthésie et analgésie (durée 3h).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale se faisant sous anesthésie, un risque anesthésique est présent. Au long-terme, il existe aussi un risque infectieux. Par ailleurs, les enregistrements neuraux se font chez l'animal en situation de contention. La contention des animaux est nécessaire dans le cadre des enregistrements et pourra être génératrice de stress et d’inconfort pour l’animal. De plus, le comportement sera motivé par une privation hydrique qui pourra entraîner une sensation de soif de courte durée chez l’animal.

Devenir

L'euthanasie est nécessaire pour réaliser une analyse post-mortem des tissus cérébraux. Cette méthode n'est utilisée que pour les animaux dont la localisation des injections ou des enregistrements électrophysiologiques aigus par histologie post-mortem est nécessaire (n=10). Pour l'ensemble des autres animaux (n=10), nous retirons l'implant crânien à la fin de l'expérimentation quand cela est possible, afin de les confier à des organismes chargés de trouver des particuliers qui souhaitent adopter nos animaux.

Remplacement

Afin de pouvoir comprendre le traitement de l'information sensoriel dans les cortex auditifs, visuels et frontaux, il est nécessaire d'avoir recours à des animaux vivants pour pouvoir enregistrer l'activité neurale, que ce soit de neurones uniques en électrophysiologie ou les flux hémodynamiques en imagerie large-champ. Ce type d'enregistrement n'est pas réalisable chez des êtres humains. Par ailleurs, le furet constitue un animal modèle nécessaire à la compréhension de la perception auditive dans un contexte de prise de décision. En effet, il est capable d'apprendre des tâches complexes et de percevoir des sons dans une gamme auditive similaire à celle de l'être humain. Son cerveau à cortex plissé permet aussi d'étudier le rôle fonctionnel des plis corticaux, ce qui n'est pas possible chez le rongeur ou primate à cortex licencéphale.

Réduction

Le type d'expérimentation que nous réalisons permet de réaliser de nombreux enregistrements dans un nombre réduit d'animaux (20 maximum). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance par exemple et qu’il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies en jouets et tunnels divers et régulièrement mis tous ensemble dans une aire de jeu. Durant les week-ends, les animaux ne doivent pas effectuer de tâche comportementale. Leur état de santé est suivi en permanence, en collaboration avec un vétérinaire. Deux réunions du comité de suivi du bien-être animal sont faîtes chaque année, avec un suivi des recommandations du comité dans la durée (durée d'expérimentation, protocole de chirurgie, méthodes d'enregistrement…). Le comportement est motivé par une privation hydrique, raison pour laquelle nous suivons au plus près le poids des animaux ainsi que les marqueurs de bien-être suivants : + Poids – avant et après le week-end ; plus souvent si nécessaire. + État général de l'animal (activité, état global : fourrure, yeux...) – tous les jours. + Observation de l'état général des animaux – hebdomadaire – grâce à une méthode de scoring durant un examen clinique. L'évaluation de l'état général de chaque animal s'appuie sur la grille d'évaluation suivante : - le furet se cache ou de tente de mordre les expérimentateurs (comportement) - le furet cesse de s'alimenter (perte de poids) - le furet cesse de se nettoyer ou gratte de manière excessive un endroit de son corps (aspect du pelage) - état d'hydratation de l'animal (test du pli cutané) - état de l'implant crânien. Le protocole de chirurgie inclut l’administration d’anti-inflammatoire et d’anti-douleur en pré- et post-opératoire et les opérations sont réalisées sous analgésie et anesthésie. Sur le plan expérimental, un effort constant nous pousse vers le raffinement des différentes étapes de nos procédures. Tout d’abord nous portons un grand soin à l’habituation préalable à la contention chez les animaux implantés. Nous développons la pose de systèmes d'enregistrements chroniques chez les animaux pour obtenir des sessions d'enregistrements plus courtes. Enfin nous explantons un grand nombre d'animaux, quand cela est possible, à la fin de l'expérimentation, afin de les replacer.

Choix des espèces

Les furets apprennent rapidement une tâche ; ils ont par ailleurs une large gamme auditive, similaire à celle de l'homme. Leur cerveau est assez grand pour utiliser des électrodes avec 200 contacts. De plus leur cortex est convolué ; ces plis corticaux ne sont pas présents chez le rongeur à l’inverse de nombreux primates. Le furet permet d’étudier un putatif rôle fonctionnel de ces plis. Les individus femelles sont préférés en raison de leur petite taille. Les animaux ont entre 6 mois et 1 an quand ils arrivent au laboratoire, âge auquel ils sont adultes ; ce stade est choisi car le développement du cerveau est alors terminé.