Système nerveux

636 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans un ventricule cérébral sous anesthésie, des injections répétées et une pompe implantée sous la peau, puis passent des tests de mémoire dont un évitement passif où un stimulus électrique est appliqué sur les pattes. Le porteur présente les injections comme peu douloureuses et évoque un léger stress lors des tests. Il affirme que les modèles murins transgéniques développant progressivement la maladie d'Alzheimer sont les plus performants pour analyser les propriétés d'une molécule.

Objectifs

Ce projet de thèse a pour but de documenter de façon exhaustive la stratégie clinique qui sera sélectionnée pour le développement de la FENM dans la MA

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de préciser les effets pharmacologiques in vivo d'un candidat médicament et apporter des informations importantes avant le développement clinique de cette molécule de nouvelle génération potentiellement efficace pour modifier de façon durable le décours de la maladie, car neuroprotectrice.

Procédures

Une injection intracérébroventriculaire sera réalisée sous anesthésié gazeuse (durée 3 min). Injections intrapéritonéales pendant 7 jours (moins d'une minute). Les souris auront sous anesthésie une incision cutanée pour la pose de la pompe qui délivre le composé en continu (durée 5 min). Les capacités de mémorisation sont analysés avec des tests de comportement qui dure 8 min pour l'alternance spontanée, deux fois 10 min pour la reconnaissance d'objets, 90 et 60 secondes pour la mémoire spatiale et 2 fois 3 secondes pour le test d'évitement passif.

Impact sur les animaux

les procédures d’injections seront peu douloureuses avec une administration par voie intra péritonéale et par diffusion sous cutanée grâce au pompe Alzet. L'injection dans le ventricule se fait sous anesthésie gazeuse. Un léger stress est présent lors des tests de mémoire . un stimulus aversif sera administré au niveau des pattes de la souris. Les animaux ont la possibilité de remonter sur la plate-forme pour échapper au stimulus.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin du projet pour prélèvement et analyse des effets du traitement sur le cerveau

Remplacement

Les modèles précliniques d’étude des mécanismes complexes de neurodégénération dans la maladie d’Alzheimer les plus performants sont des modèles murins et plus particulièrement des modèles murins transgéniques développant la pathologie progressivement après plusieurs mois de vie. Les propriétés neuroprotectrices de la FENM seront analysées en administration chronique sur un modèle transgénique de la maladie d’Alzheimer, les souris APPSwe/PS1dE9 ainsi qu'un modèle pharmacologique d'injection de peptide amyloïde‐ß[25‐35] oligomérisé.

Réduction

Les molécules sont administrées dans une gamme de doses réduite (généralement 0.003 - 0.3 - 1 - 3 mg/Kg en fonction des résultats antérieurs). Les animaux sont testés sur des tests comportementaux adaptés au paramètre à mesurer. Les analyses statistiques sont optimisées aux données générées de façon à limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe a été déterminé de façon empirique mais a été depuis confirmé en analysant nos données antérieures à l'aide de logiciel statistiques.

Raffinement

Les animaux seront reçus une semaine avant le début de l'expérimentation et gardés en groupe de 8-10 individus par grande cage. Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Les traitements pharmacologiques envisagés ont déjà été utilisés et ne sont pas à l’origine de douleur visible ou de détresse. Mais un examen quotidien sera fait. Les animaux seront retirés de l'étude si les points limite sont atteints.

Choix des espèces

Les souris C57BL/6 mâles seront utilisées pour différencier l'effet des deux modes d'administrations (bolus VS infusion). Ces souris témoins sont le fond génétique des souris transgéniques APPPS1 utilisées pour la suite de l'étude, il est donc important de travailler avec le même fond génétique pour ce projet. Les souris APPPS1 seront par la suite utilisées pour tester l'efficacité des composés aux doses efficaces en bolus VS infusion. Cette lignée développe la pathologie progressivement avec des altérations comportementales dès 9 mois et qui sont très marquées à 12 mois d'âge. Les dépôts amyloïdes, la neuroinflammation, la gliose et le stress oxydant apparaissent même plus tôt, dès 6 mois, c'est donc un très bon modèle expérimental pour refléter les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Les souris C57/BL6 seront utilisées à l'âge de 3 mois qui correspond à l'âge adulte, puis à l'âge de 10 mois pour faire une comparaison avec nos souris transgénique traitées. les souris APPS1 à l'âge de 3 mois afin de visualiser si la FENM a un effet neuroprotecteur avant l'apparition des premiers signes de la pathologie, 6 mois afin de visualiser un effet neuroprotecteur sur le comportement de ces souris, puis 10 mois afin de vérifier un potentiel effet curratif de la FENM, lorsque les lésions histpathologiques de la MA sont iréversibles.

3 696 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes reçoivent par voie intraveineuse un composé qui simule une infection virale pour déclencher une activation immunitaire, puis la descendance est mise à mort après sevrage pour prélèvements. Le porteur qualifie les modèles animaux de "puissants et indispensables" et signale une perte d'appétit et de poids transitoire ainsi qu'un comportement altéré dans les 24 heures suivant l'injection. Il affirme que les interactions entre système immunitaire, cellules gliales et neurones au cours du développement ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Objectifs

L’activation du système immunitaire au cours de la grossesse (activation immunitaire maternelle), par exemple par des virus communs comme le virus de la grippe, est un facteur de risque pour plusieurs troubles psychiatriques et neurologiques, en particulier l’autisme et la schizophrénie. Les animaux utilisés à des fins scientifiques sont des modèles puissants et indispensables pour étudier les liens entre activation immunitaire maternelle et altérations du développement cérébral chez la descendance. Les rongeurs dont la mère a reçu pendant la gestation un composé qui induit une activation immunitaire maternelle en simulant une infection virale, présentent des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. La dopamine est un neurotransmetteur notamment impliqué dans la physiopathologie de la schizophrénie. Cependant les mécanismes responsables des dysfonctions de ces neurones sont inconnus. Dans ce projet, nous tenterons d’identifier les mécanismes responsables des dysfonctions des neurones qui sécrètent la dopamine dans un modèle d’activation immunitaire maternelle chez la souris.

Bénéfices attendus

Parmi les pathologies dont le risque est augmenté par l’activation immunitaire maternelle, la schizophrénie est une pathologie très courante (500 000 à 600 000 patients en France) directement associée à des altérations des neurones qui sécrètent la dopamine. Ainsi, preque tous les traitements pharmacologiques de la schizophrénie disponibles actuellement sont basés sur l’inhibition d’une molécule sur laquelle se fixe la dopamine. Ces thérapies traitent principalement les symptômes positifs (par exemple, les hallucinations et les délires) et la réponse aux médicaments antipsychotiques existants est très variable, avec environ 30 pour 100 des patients classés comme résistants au traitement. Le ciblage des voies de la dopamine dans la schizophrénie est issu de découvertes fortuites et n’est pas fondé sur une compréhension fine des dysfonctions sous-jacentes. Notre projet permettra de comprendre le lien entre un facteur de risque identifié de la schizophrénie (l’activation immunitaire chez la mère), des altérations des cellules immunitaires du cerveau (les cellules gliales), et les dysfonctions du système de la dopamine.

Procédures

Femelles gestantes vigiles : Une Injection de solution par voie intraveineuse (5 minutes). Femelles lactantes vigiles : Traitement antibiotique dans l’eau de boisson pendant 15 jours Puis après sevrage de la descendance : euthanasie selon une méthode réglementaire ou une chirurgie sans réveil permettant les prélèvements et analyses ultérieurs.

Impact sur les animaux

L’injection du composé mimant un virus induit une activation immunitaire, corrélée à une perte de poids d’environ 1 à 2 pour cent du poids total par rapport au poids des animaux témoins deux jours après l’injection, qui reflète une perte d’appétit liée à l’inflammation transitoire. Un stress transitoire est aussi attendu lors de la contention au moment de l’injection. Pendant la période transitoire d’activation immunitaire (c’est-à-dire dans les 24h après injection), il est attendu que les souris présentent un comportement modérément altéré, avec prise de nourriture amoindrie. Cependant, cette perte de poids ne persiste pas : dès le troisième jour après l’injection, les poids des souris ayant reçu le composé et celui des souris ayant reçu l’injection contrôle redeviennent similaires.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés selon des méthodes réglementaires pour des expériences de physiologie et de biochimie, ou après sevrage de la progéniture. Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont reçu des injections dans le cadre du projet.

Remplacement

L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à des pathologies psychiatriques, nécessite d’avoir recours à des animaux. En particulier, les interactions complexes au cours du développement postnatal entre système immunitaire d’une part, cellules gliales et neurones dans le cerveau d’autre part, ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre de souris incluses dans le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats significatifs et reproductibles. Le nombre total d’animaux impliqués est de 3696.

Raffinement

Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximums et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Dans tous les protocoles, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux utilisés par la mise en place de période d’accoutumance et l’emploi d’anesthésiants et antalgiques adaptés. L’évaluation de la souffrance sera basée sur un suivi quotidien (attitude corporelle, aspect du pelage, poids corporel) de sorte à administrer un traitement anti-inflammatoire/antalgique supplémentaire, ou sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites établis. L’animalerie est maintenue à une température constante entre 20 et 24 degrés avec un éclairage circadien (8 h / 20 h). Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis.

Choix des espèces

Le choix de l'espèce Mus musculus (souris) repose en premier lieu sur l’anatomie du cerveau de souris qui est très bien caractérisée, ainsi que sur le fait que les grandes étapes de développement du cerveau, les systèmes de neurotransmission et la répartition et la fonction des aires cérébrales sont bien conservés entre souris et être humain. Ces paramètres sont importants dans le contexte de l’étude de mécanismes impliqués dans des pathologies humaines. Les souris gestantes recevant une injection sont de jeunes adultes (8-15 semaines). Les souris soumises aux expériences pour l’étude du développement neuronal postnatal sont des souris juvéniles ou jeunes adultes (jour postnatal 15 à 100). Trois stades de développement seront étudiés : pic du turnover des synapses dans le cerveau en développement chez la souris juvénile ; stade adolescent auquel des changements résultant d’un changement du turnover des synapses se manifeste ; stade adulte pour étudier les conséquences à long terme.

186 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les expérimentateurs greffent des cellules tumorales dans le cerveau, laissent croître une tumeur cérébrale suivie par une grille de points limites, puis pratiquent des séances d'IRM sous anesthésie jusqu'à deux heures et demie avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur décrit une douleur modérée liée à la croissance de la tumeur et une douleur légère liée à l'IRM. Il affirme s'être assuré de "l'inexistence d'approches alternatives in vitro" capables de reproduire le dialogue entre cellules tumorales et vaisseaux cérébraux.

Objectifs

L’agressivité du glioblastome, une tumeur cérébrale de haut grade chez l’homme, est liée à la présence de cellules cancéreuses souches et à leur résistance aux traitements. Ces cellules souches cancéreuses sont situées dans une niche où elles établissent des interactions privilégiées avec les cellules environnantes, notamment les cellules vasculaires. Des données précédentes de notre laboratoire ont permis de montrer que bloquer la communication entre cellules cancéreuses souches et les cellules vasculaires réduit la progression tumorale in vitro et in vivo chez la souris. Des études récentes sur cellules in vitro suggèrent que la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires dépend pour partie de l’expression de facteurs d’adhésion et par partie de la signalisation calcique. Il est nécessaire de valider ces résultats dans un modèle expérimental in vivo qui reproduit au mieux les conditions pathologiques. L'objectif de ce projet est de caractériser in vivo, par imagerie, les conséquences de ces mécanismes moléculaires identifiés in vitro. Dans un second temps, nous souhaitons évaluer d'une stratégie thérapeutique anti-tumorale prenant appui sur ces mécanismes moléculaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre la communication entre cellules cancéreuses souches et cellules vasculaires et il permettra d'explorer comment la modulation pharmacologique de ces voies de communication favorise la régression tumorale. Cette étude devrait permettre de déterminer si le blocage de la communication entre les cellules tumorales et leur environnement réduit la progression des glioblastomes multiformes, des tumeurs cérébrales incurables chez l'homme (survie médiane actuelle de 15 mois).

Procédures

- greffe intracrânienne de cellules tumorales (sous anesthésie) (animalerie 1) - croissance d'une tumeur intracérébrale (suivi par grille de points limites spécifiques, animaleries 1 et 2) - IRM (sous anesthésie, durée 2h30 maximum, animalerie 2) - administration de médicaments au maximum une fois par jour pendant moins de 14 jours (animaleries 1 et 2) - euthanasie par perfusion intracardiaque sous anesthésie très profonde (animaleries 1 et 2)

Impact sur les animaux

- La greffe intracrânienne de cellules tumorales, conduite sous anesthésie, engendre une douleur modérée - La procédure expérimentale d'IRM, qui sera utilisée pour caractériser la tumeur, engendre une douleur légère et est conduite sous anesthésie. La phase terminale est réalisée sous anesthésie profonde (procédures sans réveil) - la croissance tumorale engendre une douleur modérée et fait l'objet d'un suivi et d'une grille de points limites particulière.

Devenir

Le tissu cérébral des animaux utilisés dans ce projet est analysé par histologie pour mettre en correspondance les analyses à l'échelle cellulaire et les observations réalisées dans les images in vivo. Pour réaliser ces analyses, tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Nous nous sommes assurés de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre cellules tumorales et cellules vasculaires cérébrales. Cette recherche n'a pas identifié de solution in vitro alternative pour notre étude. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : au final 20 animaux par groupe et 9 groupes sont prévus, pour un total de 180 souris sur 5 ans. Pour obtenir ces 20 animaux par groupe, nous avons pris en compte i) les problèmes d'implantation/croissance tumorale (15 pourcent), ii) les problèmes lors de l'imagerie (20 pourcent, principalement du au mouvement, risque à compter deux fois puisque l'imagerie est faite avant et après traitement sur chaque animal). Des groupes de 12 animaux complets (i.e. avec toutes les données IRM avant et après) seront suffisant pour obtenir une démonstration statistique. Ce chiffre a été obtenu suite aux calculs effectués dans G-Power (www.gpower.hhu.de) pour un size-effect de 1.25. Pour obtenir ces 12 animaux, et en considérant le risque maximal (12x1.15x1.2x1.2), 20 animaux seront donc commandés par groupe. De plus 6 souris servirtont à la mise au point la procédure d'implantation tumorale.

Raffinement

L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur (critères pris en compte : prostration, renfoncement des yeux, arrêt du nettoyage du pelage). Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques). L'environnement sera enrichi selon le programme mis en place par l’animalerie. Suite au transport, qui sera réalisé part un transporteur agréé, les animaux auront une semaine d'acclimatation avant le début des expériences.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. En effet, le cerveau de souris permet une analyse neuroanatomique de haute résolution concernant les réseaux cellulaires et vasculaires. Sa taille est compatible avec la microdissection d’aires cérébrales d’intérêt permettant des analyses biochimiques ou moléculaires. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les animaux seront adultes, pour travailler sur un cerveau mature et stable.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une lésion de la moelle épinière est induite chirurgicalement chez chaque animal sous anesthésie, suivie d'injections quotidiennes pendant 10 à 30 jours, pour étudier la réparation de la myéline et une piste thérapeutique contre la sclérose en plaques. Le porteur indique des nuisances liées à la chirurgie, hypothermie, hémorragie et douleurs post-opératoires, avec un point limite à 20 % de perte de poids. Toutes les souris sont euthanasiées pour des prélèvements post-mortem, le porteur décrivant le recours à l'animal comme "indispensable" pour valider les résultats obtenus sur cellules.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’identifier et déchiffrer de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la formation de la gaine de myéline autour des cellules nerveuses du système nerveux central (SNC) et périphérique, en condition physiologique et pathologique. Ce projet vise à étudier le rôle d’un récepteur membranaire, impliqué dans plusieurs mécanismes cellulaires, dans le contrôle de la synthèse de la gaine de myéline du système nerveux central et périphérique au cours du développement et à l’âge adulte, chez la souris. Dans un second temps, ce projet nous permettra aussi de montrer que ce récepteur est une nouvelle cible thérapeutique favorisant la réparation des gaines de myéline du SNC, chez la souris. La validation de cette cible ainsi que des composés sélectionnés sont des études très prometteuses, qui pourraient permettre de repositionner ces molécules actuellement utilisées dans d’autres pathologies, pour le traitement de maladies de la myéline.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’identifier de nouveaux mécanismes régulant la formation de la gaine de myéline autour des cellules nerveuses, lors du développement normal et dans des conditions pathologiques. Notre projet de sélection et de repositionnement de molécules thérapeutiques nous a permis de sélectionner 3 molécules avec un fort potentiel thérapeutique qui seront validées grâce à l’utilisation d’un modèle murin de lésions de la myéline, présentant des similitudes avec les lésions observées chez les patients. A terme, ces études permettront d'améliorer le traitement des lésions de la myéline chez les patients et de démontrer un rôle de ce récepteur dans les lésions de la sclérose en plaques.

Procédures

Nous utiliserons des souris afin de déterminer le rôle d’un récepteur membranaire qui semble impliqué dans le processus de myélinisation du système nerveux. Dans l’objectif d’étudier son rôle, au cours du développement et au cours du processus de réparation de lésions de la myéline, nous induirons de petites lésions de la moelle épinière chez la souris (une lésion par animal, sous anesthésie générale). L’analyse de ces lésions à différents temps permettra d’analyser l’impact de la protéine étudiée sur les différentes étapes du processus de réparation des lésions de la myéline. Nous utiliserons 560 animaux dans cette procédure expérimentale. La durée totale et maximale de cette procédure chirurgicale est de 30 minutes par animal et 30 jours post-chirurgie. Pour le groupe des souris inductibles, une injection d’un produit est nécessaire avant l’induction de la lésion (1X par jour pendant 5 jours par i.p. d’environ 5sec). Le groupe des souris sauvages recevra après la lésion une des molécules sélectionnées ou le véhicule seul (1X par jour par voie i.p, durée d’environ 5sec, ou par voie PO durée d’environ 5sec, pendant 10 à 30 jours). Pour la poursuite de l’étude, et pour tous les animaux, il est nécessaire d’obtenir des échantillons biologiques dans un état le plus proche possible de l’état physiologique. Cela implique d’éviter et de prévenir toute dégradation post-mortem.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont majoritairement liées à la chirurgie : hypothermie, hémorragie, risque anesthésique, douleurs post-opératoires. Un stress peut aussi être observé chez l’animal à cause de la contention quotidienne et de l’injection d’un produit. Il est notamment possible d’observer l’apparition d’hématomes dus à l’injection répétée de ce produit.

Devenir

Les prélèvements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Comprendre le rôle d’un récepteur, exprimé par la cellule responsable de la formation de la gaine de myéline, dans le système nerveux central, nécessite l’interaction de plusieurs types cellulaires et un environnement spécifique en fonction du stade du développement. Ainsi, le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de valider nos résultats déjà obtenus par des modèles cellulaires en dehors de l’organisme dans l’objectif de comprendre comment l’activité de ce récepteur impacte la myélinisation et la remyélinisation. Concernant la partie validation thérapeutique, une analyse bio-informatique et l’utilisation de lignées de cellules, nous ont permis de réduire notre liste de composés à tester et par conséquent le nombre d’animaux à inclure dans notre étude. Nos résultats préliminaires suggèrent un fort potentiel de remyélinisation des 3 molécules sélectionnées, actuellement en phase clinique dans d’autres pathologies.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables. Nous prévoyons l’utilisation de 560 souris qui vont subir une procédure expérimentale modérée : - 280 pour notre procédure de démyélinisation focale afin d’évaluer l’effet régénératif dans les souris transgéniques. - 280 pour notre procédure de de démyélinisation focale afin d’évaluer la régénération de la myéline après traitement par des molécules pharmacologiques sélectionnées. Certaines variations expérimentales pouvant être observées dans ces deux modèles, le nombre d’animaux de chaque groupe est le minimum requis pour obtenir des données statistiquement significatives.

Raffinement

Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage, bruit et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et matériel papier-coton), d’alimentation et de soins quand nécessaires seront parfaitement contrôlées (directive européenne 2010/63/UE). Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie et analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désigné. Ils seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie définies par les normes européennes (soit 22°C +/-2° pour la température et entre 45 et 65% d’hygrométrie). De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi : animaux hébergés en groupe, nid en coton. Une alimentation adaptée est proposée aux animaux en croisement pour couvrir les besoins de la gestation et de l’allaitement. -Une période minimale de 7 jours d'acclimatation est respectée. - Plusieurs points limites visant à réduire la souffrance et/ou la détresse de l'animal sont respectés : - Apparence et position anormale : dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le côté, hypothermie au cours de la chirurgie (la température de l’animal étant monitorée durant l’acte) - Comportements anormaux : agressivité soudaine, abattement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit, réduction de la mobilité - Perte de poids rapide ou progressive de 20 % (poids de référence pris le jour de la chirurgie) réalisée par pesée tous les jours pendant 5 jours puis 2 fois par semaine avant l'euthanasie - État de choc, léthargie, immobilité - Difficultés respiratoires. L'euthanasie de l'animal sera réalisée si l’on observe l’un de ces critères. Le vétérinaire désigné sera consulté en cas de complications ou effets indésirables constatés lors des procédures ou après celles-ci : présence de signes cliniques d’infection (ex: prostration, suppuration) afin de mettre en place les actions nécessaires.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix puisqu’en tant que mammifère, ses processus physiologiques se rapprochent de ceux décrits chez l’homme. Afin de comprendre le rôle d’un récepteur membranaire du facteur de croissance vasculaire dans la régulation de la myélinisation en condition physiologique et pathologique, il est nécessaire de réaliser des études in vivo, intégrant l’ensemble des interactions entre les différents types cellulaires et leurs environnements. Chez l’homme adulte, quand la gaine de myéline est endommagée ou détruite, un mécanisme de réparation se met en place afin de régénérer une nouvelle gaine de myéline afin de protéger les neurones de la dégénérescence. L’utilisation de modèles animaux, au stade équivalent (souris adulte), reproduisant certains aspects des pathologies démyélinisantes comme la sclérose en plaques, est indispensable pour évaluer la fonction de ce récepteur membranaire en contexte pathologique. Il existe aussi un ensemble d’outils (anticorps, lignées transgéniques permettant de tracer le devenir des cellules gliales) qui ont été développés principalement chez la souris. L’utilisation de la souris pour l’étude de ce récepteur au cours du développement du système nerveux et dans des conditions pathologiques est donc indispensable pour étudier le rôle de ce récepteur et identifier de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique pour le traitement des pathologies de la myéline. Nous utiliserons des animaux des deux sexes afin d’éviter tout biais potentiellement lié au sexe dans notre étude.

40 microcèbes, un petit primate, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 24 tués à l'issue et 16 réutilisés. Les animaux portent un gilet d'ECG, subissent des échographies sous anesthésie et cinq injections de molécules, et quatre d'entre eux une restriction calorique de 30 % avec abaissement de la température à 15 °C. Le porteur indique que les individus dont l'état se dégrade sont euthanasiés pour prélever les organes, ceux de 6 à 12 ans étant tous tués au cours du projet, le prélèvement de sang intracardiaque étant terminal. Il décrit le microcèbe comme un "meilleur modèle" du vieillissement cardiaque que les rongeurs et affirme qu'il n'existe "pas d'alternative" non animale.

Objectifs

Avec le vieillissement de la population, 75% des personnes de plus de 65 ans souffriront de déficiences cardio- vasculaires, limitant leur autonomie physique et cognitive et pouvant dégénérer en maladies potentiellement mortelles. Élucider et prévenir le remodelage cardiaque dû au vieillissement est un enjeu majeur en santé humaine, afin d'éviter la prolifération des maladies du rythme cardiaque dans les prochaines décennies. La fréquence cardiaque maximale diminue chez les personnes âgées, indépendamment du mode de vie. Chez ces personnes, le remodelage fonctionnel du nœud sinusal qui est le stimulateur naturel du cœur, et sa modulation anormale par le système nerveux autonome pourraient être à l'origine de la diminution de fréquence cardiaque. Les statistiques nous indiquent que 1 personne âgée sur 600 développera des brady-arythmies directement liées à la défaillance du nœud sinusal, appelées syndrome du sinus malade. Ce syndrome pourrait aussi être une des causes de la fibrillation auriculaire, l’arythmie la plus courante chez les personnes âgées, qui se vérifie dans 5 à 10 % de ces personnes. Pour clarifier la façon dont le remodelage du nœud sinusal et le tonus autonome anormal diminuent la fréquence cardiaque dans le vieillissement, nous allons étudier l'activité cardiaque chez un modèle de petit primate, le microcèbe. Les données seront comparées aux études déjà réalisées chez la souris et pourront, à plus long terme, permettre le développement de traitements visant à réduire la déficience cardiaque chez les personnes âgées.

Bénéfices attendus

Élucider et prévenir le remodelage cardiaque dû au vieillissement est un enjeu majeur en santé humaine, afin d'éviter la prolifération des maladies du rythme cardiaque dans les prochaines décennies, ainsi que la morbidité et mortalité associés à ces maladies. Pour clarifier la façon dont le remodelage du nœud sinusal et le tonus autonome diminuent la fréquence cardiaque dans le vieillissement, nous avons choisi un modèle de petit primate qui présente de plus grandes similitudes avec l’homme comparé à la souris. En effet, bien que de taille similaire aux petits rongeurs, le microcèbe à une espérance de vie (12 ans) bien plus longue que celles des souris (3 ans). Par conséquent, le nombre de battements cardiaques générés dans une vie chez le microcèbe est de 3 milliards, similaire au nombre qui peut attendre le cœur humain au long d’une vie alors que la majorité des autres mammifères génèrent un maximum de 1 million de battements cardiaques dans une vie. Ces comparaisons montrent la similarité entre homme et microcèbe et justifient l'utilité de cette espèce comme meilleur modèle pour des études sur le vieillissement cardiaque. A plus long terme, cela permettrait d'envisager des thérapies visant à réduire la déficience cardiaque au cours du vieillissement

Procédures

Contention pour rasage et pose du gilet incluant un dispositif d’ECG (5 minutes), enregistrement ECG dans lieu de vie (6h30) pendant 3 jours, anesthésie gazeuse (30 minutes), épilation à la crème dépilatoire (2 minutes), échographie photoacoustique (30 minutes), injection intrapéritonéale de molécules (durée 1 minute) avec un intervalle de 3 ou 4 jours, 5 injections au total suivi d'un ECG (1h) sur une durée de 2 semaines. Pour 4 animaux, restriction calorique de 30% et diminution de la température de la pièce à 15°. La durée totale du suivi est de 9 semaines pour chaque animal. En fin de procédure, lors de l'euthanasie le prélèvement de sang intracardiaque est fait sous analgésie et anesthésie profonde .

Impact sur les animaux

La contention nécessaire à la pose du gilet pour enregistrer les ECGs peut provoquer un léger stress. Les injections intrapéritonéales des molécules ou des anesthésiques entrainent aussi un stress de très courte durée. Les analyses de photoacoustique seront faites après anesthésie gazeuse de l’animal, ce qui permet ensuite un réveil très rapide. Les animaux en fin de vie seront euthanasiés sous analgésie et anesthésie pour permettre les prélèvements d'organes pour des études post mortem au niveau tissulaire et cellulaire.

Devenir

Tous les animaux dont l'état de santé se dégrade seront euthanasiés pour récupérer les organes d'intérêt et étudier l'effet du vieillissement sur ces organes. Donc on estime que tous les individus de la classe 6-12 ans seront euthanasiés au cours du projet et certains individus les plus âgés de la classe 1-5 ans pourraient présenter une dégradation de leur état de santé compte tenu de la durée du projet.

Remplacement

Il n'y a pas d'alternative non animale disponible pour l'étude du vieillissement et des dysfonction cardiaques dans la cadre de projet translationnel vers la santé humaine. Par ailleurs, la variabilité individuelle chez les primates mime la variabilité chez l'homme. Ainsi,cette forte similitude entre la physiologie des microcèbes et humaine, comparée aux rongeurs, permet d’obtenir des données plus fiables qui auront une meilleure applicabilité pour le développement de traitement clinique.

Réduction

Nos procédures sont planifiées de façon à réutiliser les mêmes animaux dans plusieurs tests non invasifs. Les expériences précédentes sur d'autres animaux de laboratoire, suggèrent que 10 animaux par groupe seraient suffisants pour appliquer des tests et mettre en évidence des différences statistiquement significatives. Nos protocoles prévoient un suivi individuel (avant et après traitement). Ainsi chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet de réduire le nombre d'individus dans les groupes, sans compromettre les objectifs du projet. Pour ce qui concerne les analyses statistiques, tous les tests seront faits de façon telle à comparer les groupes sur la base de l'âge et du sexe des animaux . Pour les données post mortem, les analyses sont faites sur le cœur isolé à partir des animaux dont l'euthanasie est décidée car en fin de vie ou présentant une altération forte de leur bien-être (blessure, pathologie) et pour lesquels les points limites de bien-être animal sont atteints. Tous les organes seront prélevés et conservés pour partage éventuel de tissus à la communauté scientifique, ce qui réduit le besoin d’animaux à plus large échelle.

Raffinement

Les microcèbes en élevage évoluent en volière enrichie avec des branches et des nichoirs et des tubes pour se cacher. Les animaux sont groupés par 4 ou 5 individus de même sexe. L’observation quotidienne des signes cliniques relatifs au bien-être des animaux est réalisée. Les indicateurs privilégiés sont l’absence de variation anormale du poids corporel et l’état de forme générale (prostration, réactivité, agressivité). Les animaux sont enregistrés par des dispositifs externes (holter), posés sous des gilets, ce qui évite l’installation d’implants télémétriques. Les enregistrements sont réalisés sur des animaux qui continuent à avoir une vie normale en élevage et qui portent le gilet seulement durant 6h30, et pas sur une durée de plusieurs mois comme c'est le cas pour des animaux implantés. De plus la technique de tomographie photoacoustique sous anesthésie gazeuse permet d’obtenir des informations structurales sur le cœur et le cerveau des animaux in vivo, sans intervention invasive. En cas d'atteinte des points limites, les animaux sont retirés de l'étude voire euthanasiés. Lors de l’euthanasie, pour éviter toute douleur avant la prise de sang intracardiaque et prélèvement d'organes, une analgésie et anesthésie sont réalisées.

Choix des espèces

Le nombre de battements cardiaques dans une vie est commun à plusieurs espèces de primates et trois fois plus élevé que dans les espèces de rongeurs (souris et rat) communément utilisées en recherche. Le microcèbe possède l'avantage, par sa petite taille, d'être facile à maintenir en élevage. De plus, au cours de leur vie (espérance de vie de 12 ans), ces lémuriens génèrent autant de battements cardiaques qu’une personne âgées, soit environ 3 milliards. Cela indique que les cœurs des microcèbes, des humains et d’autres primates doivent avoir des adaptations qui leur permettent de soutenir dans une vie, une activité cardiaque trois fois plus longue que les autres mammifères. De ce fait, le microcèbe est un meilleur modèle pour étudier les effets du vieillissement au niveau cardiaque . Le microcèbe est considéré comme âgé à partir de 5 ans donc nous comparerons les fréquences cardiaques des animaux âgés (plus de 5 ans) à celles d'animaux adultes (moins de 5 ans) . Notre étude sera donc réalisée sur des animaux , entre 1 et 5 ans pour les adultes et entre 6 et 12 ans pour les individus âgés.

240 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral est provoqué chirurgicalement chez chaque animal sous anesthésie, suivi d'injections d'une thérapie combinant vésicules extracellulaires et un traitement moléculaire. Le porteur indique une perte de poids d'environ 10 % et des déficits neurologiques présentés comme réversibles en une semaine, et utilise des rats hypertendus pour se rapprocher des patients. Tous les rats sont mis à mort pour prélever le cerveau, les retombées cliniques étant renvoyées au long terme avec un impact socioéconomique décrit comme "très important".

Objectifs

Face au manque de l’efficacité des traitements actuels contre l’AVC et de leur courte fenêtre thérapeutique, ce projet a pour but d’évaluer une nouvelle thérapie combinant les vésicules extracellulaires (VE) et un un traitement moléculaire mimétique des héparanes sulfates, à la suite d’une ischémie cérébrale chez le rat. Les effets bénéfiques des VE et du traitement moléculaire, administrés séparément, ont déjà été montrés dans des modèles in vitro et in vivo, y compris dans notre laboratoire. Les VE seront issues des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines préalablement traités ou non par le traitement moléculaire. La préexistence de l’hypertension artérielle chronique (HTA) est connue pour être un facteur de risque et un facteur aggravant important pour l’AVC. Aussi, pour se rapprocher le plus possible des conditions cliniques, nous utiliserons dans ce projet des rats normotendus et des rats hypertendus.

Bénéfices attendus

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un problème majeur de santé public. Ils représentent la 2ème cause de mortalité et la 1ère cause d’handicap chez l’adulte. Plusieurs facteurs de risque favorisent le déclenchement de cette pathologie dont l'hypertension artérielle chronique qui est le facteur de risque le plus important. Dans les AVC de types ischémiques, la thrombolyse et la thrombectomie mécanique sont les seules interventions approuvées par les autorités de santé. Cependant, ces interventions ne sont applicables que chez une minorité de patients. Aussi, il est crucial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les AVC. Dans ce contexte, notre projet devrait permettre le développement d’une nouvelle intervention thérapeutique associant les VE et le RGTA pour protéger et réparer le cerveau et améliorer la récupération neurologique après un AVC. L’impact socioéconomique d’un tel développement sera très important.

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (induction de l’AVC sous anesthésie générale) : 1 heure maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, les 240 animaux sont concernés. - Injection intra-artérielle (animal anesthésié ) : 1 fois (1 h après l’induction de l’AVC) ; 5 minmaximum par animal, les animaux du groupe 2, 5 et 6 sont concernés, donc 120 animaux au total. - Injection intraveineuse (animal anesthésié) : 1 fois, 24 h après l’induction de l’AVC ; 10 min maximum par animal. Les animaux des groupes 2, 3, 4, 5 et 6 sont concernés, donc 200 animaux au total

Impact sur les animaux

Dans le modèle d’ischémie utilisé, les animaux décrivent une perte de poids (10% environ) ainsi que des déficits neurologiques (diminution de l’activité locomotrice) pendant les 3-4 jours suivant l’induction de l’ischémie cérébrale. Cependant, la perte de poids et les déficits neurologiques sont réversibles et les animaux récupèrent spontanément un bon état général au bout d’une semaine. Ces critères seront pris en compte dans les points limites de l’étude.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort , sous anesthésie profonde, dans le but de récupérer les cerveaux pour analyses en post-mortem.

Remplacement

L’AVC, une pathologie complexe, fait intervenir différents acteurs moléculaires (molécules de signalisation cellulaire intervenant dans le fonctionnement cellulaire, l’inflammation et la mort cellulaire) ainsi que des acteurs cellulaires (y compris neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales). Bien que des tests aient déjà été réalisés sur des modèles cellulaires in vitro, pour l’instant, il n’existe aucun modèle de substitution qui permet de mimer dans sa complexité la physiopathologie de l’AVC. De plus, l’utilisation d’animaux présentant des facteurs de comorbidité (HTA) permet d’avoir un modèle se rapprochant de l’humain et de déterminer ainsi la stratégie à suivre pour le traitement de l’AVC ischémique.

Réduction

L’utilisation des méthodes d’investigation non invasives telles que l’imagerie par IRM et les tests de comportements se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux. Celles-ci permettent de suivre l’évolution de l’AVC à différents temps sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun de ces temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour l’étude. Dans le but de pouvoir réaliser des tests statistiques, l’estimation du nombre d’animaux par groupe est basée sur les données de nos études antérieures chez le rat et le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par une approche statistique. Par conséquent, nous estimons que 20 rats par groupe est suffisant pour réaliser les tests statistiques. Les résultats de la première cohorte nous permettront de réaliser des statistiques séquentielles et ainsi de décider du nombre d’animaux à inclure dans la deuxième cohorte pour obtenir des résultats significatifs et ainsi de réduire le nombre d’animaux au total

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront mis en groupe sociaux (2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes Européennes. Ils auront un temps d’adaptation avant toute expérimentation et ils bénéficieront également d’enrichissement via des stimulations sensorielles par différents objets disposés dans les cages. Tout au long du protocole, un personnel compétent surveillera les animaux afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriées et par le choix de points limites cohérents.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale : les modèles d’ischémie focale sont bien connus et de nombreux mécanismes de cette pathologie ainsi que des essais de neuroprotection ont ainsi été étudiés chez cette espèce animale. En effet, l’anatomie ainsi que la circulation cérébrale sanguine du rat sont bien décrites et, par ses grands traits, semblables à celles de l’Homme. De plus, cette espèce se prête facilement à l’étude fine des capacités sensorimotrices et cognitives par l’intermédiaire de tests comportementaux appropriés. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour l’étude de l’ischémie cérébrale. Les animaux utilisés ont un poids d’environ 250-350 g, âgés de 12 semaines au début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC chez le rat. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de la tête, implantation de dispositifs ou craniotomie, puis des tests de course sur tapis et sur roue et des tests visuo-vestibulaires, la tête maintenue fixe et sous restriction hydrique pour le motiver, avant sa mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique que certaines souris subissent une atteinte vestibulaire pouvant s'accompagner de déficits auditifs, et met en avant l'analgésie. Il présente ce projet de recherche fondamentale sur l'équilibre et le regard comme ne pouvant être mené que sur animal vivant et éveillé.

Objectifs

Le système vestibulaire est responsable de la stabilisation de la posture et du regard. Dans le cas de pathologies touchant le système vestibulaire, les patients souffrent de déséquilibres et d’oscillopsies liées à une mauvaise stabilisation du corps et du regard au cours des mouvements. Se mettent alors en places des substitutions sensorielles qui visent à permettre le rétablissement de l’équilibre grâce aux informations visuelles et proprioceptives. Ces mécanismes diffèrent selon que la perte vestibulaire est congénitale ou acquise. Les patients rapportent également des perturbations différentes selon la locomotion réalisée : de manière contre-intuitive, l’instabilité est parfois moindre lors de locomotions plus dynamiques. Il a été récemment démontré chez le xénope et la souris l’existence lors de la locomotion d’un signal nerveux provenant de la moelle épinière (copie efférente spinale), générée par des neurones spinaux générateurs de rythme, qui participe au contrôle du regard. Le but de ce projet est de caractériser comment ce signal interagit avec les réflexes responsables du contrôle du regard qui dépendent des entrées vestibulaires et visuelles : les réflexes vestibulo-oculaires et optocinétiques. Nous évaluerons également dans quelle mesure ce signal participe à la substitution sensorielle lors de pertes vestibulaires plus ou moins marquées. À l'aide de techniques comportementales, pharmacologiques et électrophysiologiques, l’influence des paramètres locomoteurs sur l’intégration des signaux visuels, vestibulaires et spinaux sera étudiée, en particulier au niveau des neurones vestibulaires centraux. Ce projet utilisera un maximum de 480 souris.

Bénéfices attendus

Le projet constitue un projet de recherche fondamental qui vise à une meilleure compréhension des signaux sensoriels et nerveux qui permettent le sens de l’équilibre et de l’orientation, par l’étude d’une voie nerveuse non encore décrite, potentiellement importante lors de situation pathologiques conduisant à des substitutions sensorielles. Bien que conduit chez l’animal, les retombées sociétales du projet concernent la recherche translationnelle chez l’homme et notamment la question de la réhabilitation motrice chez des patients atteints de pertes des fonctions sensorielles et de fonctions locomotrices.

Procédures

-Les animaux seront tous soumis à une chirurgie unique permettant l'implantation de dispositifs sur la tête d'une durée comprise entre 20 minutes, ou d'une craniotomie d'une durée de 60 minutes. -Certains animaux seront utilisés lors de tests comportementaux de type course sur tapis motorisé (durée 45min), à raison de 3 tests par semaine pendant 2 semaines. D'autres seront utilisés pendant des tests comportementaux de type course sur roue non motorisée (durée 30min) pendant 2 seaines et des tests sensorimoteurs visuo-vestibulaires (durée 45min) pendant 2 semaines. -Une partie des animaux recevra une injection unique (durée

Impact sur les animaux

Des chirurgies potentiellement douloureuses nécessaires au projet sont réalisées ; afin de minimiser le stress et la douleur, des traitements analgésiques et antalgiques adaptés sont mis en place. Le protocole d’apprentissage de la tâche de locomotion sur roue nécessite une restriction hydrique afin de motiver les souris à la course. Une fois la tâche acquise, son maintien pourra être le cas échéant effectué à l’aide de récompense (eau sucrée) permettant de lever la restriction. Lors de ces apprentissages et lors des tests, les souris sont maintenues tête fixe pendant le temps expérimental qui n’excède jamais 60min. Les souris déficientes vestibulaires peuvent présenter des déficits auditifs associés.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiées à la fin des procédures. Les cerveaux feront l'objet de prélèvements post-mortem et seront utilisés pour préciser la neuroanatomie des voies spino-oculaires étudiées ainsi que la localisation des neurones enregistrés au cours du projet.

Remplacement

L’intégration des signaux sensorimoteurs issus de l’oreille interne et de la moelle implique de nombreuses régions du cerveau et différents réseaux de neurones. Afin de comprendre les interactions entre systèmes, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.

Réduction

Des tests statistiques seront effectués en cours de protocole afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre des différences significatives entre les différents groupes testés. Le nombre de souris estimé l’a été en considérant que 20% des souris pourraient échouer à atteindre la vitesse minimale de 25cm/s lors de la tâche comportementale. Le nombre de souris pourra être diminué si cette estimation est supérieure à la réalité. L'électrophysiologie ne sera effectuée que sur souris contrôles et sur 1 unique groupe de souris, déterminé en fonction des résultats obtenus. Cette approche séquentielle permet de réduire de 120 le nombre de souris demandées.

Raffinement

Les souris sont maintenues par groupes de 4. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est controlé régulièrement pendant les phases de tests. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative visant à mieux comprendre le fonctionnemnt du cerveau des mammifères. Les animaux seront utilisés à l’âge où les réflexes sensorimoteurs étudiés sont matures, soit à partir de 6 semaines et jusqu’à 12 semaines (3 mois) pour les plus âgées.

156 macaques, à longue queue et rhésus, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une à deux chirurgies cérébrales par injection stéréotaxique, des prélèvements sanguins tous les quinze jours, des ponctions mensuelles de liquide céphalorachidien et des IRM répétées, avant sa mise à mort par perfusion intracardiaque pour prélever le cerveau. Le porteur affirme qu'aucun modèle in silico ni cellulaire ne permet d'étudier ces maladies et présente le primate comme "nécessaire" du fait de sa proximité avec l'humain. Les bénéfices annoncés, de nouvelles cibles thérapeutiques contre Alzheimer et Parkinson, restent formulés au conditionnel.

Objectifs

De nos jours dans le monde environ 36 millions de personnes sont atteintes de démences, dont 25 millions pour la maladie d’Alzheimer et 6 millions pour la maladie de Parkinson. En raison du vieillissement progressif de la population et de l'absence de traitement, le nombre de personnes souffrant de maladies neurodégénératives augmente considérablement et devrait croître de manière régulière dans les années à venir. Qu'elles soient génétiques ou acquises, leurs mécanismes d’initiation liés à des causes multifactorielles sont mal connus. Ainsi, il est nécessaire de créer et maîtriser des modèles le plus proche possible de la réalité pathologique. L’étude proposée ici permettra aux travers de différents modèles de primates non-humains de maladies neurodégénératives, d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de l’initiation et de l’installation des différentes pathologies afin de définir des nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les maladies neurodégénératives sont une cause majeure d’invalidité, de dépendance, d’institutionnalisation et d’hospitalisation. Elles ont un impact très important sur la qualité de vie des personnes atteintes ainsi que sur celle de leurs proches et de leurs aidants, et touchent ainsi une part importante de la population. Les traitements actuellement disponibles sont à visée symptomatique et d’efficacité relative. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine de ces pathologies c’est trouver les traitements de demain.

Procédures

Une chirurgie (2 heures environ), ou deux maximum espacées de 1 mois. Prélèvements sanguins de quelques minutes tous les 15 jours sur animaux vigiles en contention légère. Prélèvements de liquide céphalorachidien de l'ordre de 5 minutes une fois par mois sous anesthésie légère. IRM, avant l’injection stéréotaxique, 48 heures après et tous les 6 mois. La durée de l'IRM est de 1h30 à 2h.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie ou aux prélèvements biologiques. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible et infection au niveau des points de sutures. Pour l’imagerie : anesthésie. Pour les prélèvements liquide céphalorachidien (LCR) et sang : stress de l’anesthésie pour le LCR et de la contention (légère et rapide) pour le sang.

Devenir

Les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque aux temps expérimentaux définis. Le cerveau et éventuellement d’autres tissus seront alors prélevés puis mis à disposition pour réaliser les analyses post-mortem.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH car il n’existe pas de modèles mathématiques ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier les processus neurodégénératifs. Nous recherchons à travers l’utilisation des modèles animaux complexes et intégrés à mimer la pathologie humaine, impossible à trouver dans des modèles cellulaires. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme) pour étudier les mécanismes impliqués dans ces processus est une étape nécessaire à la découverte de nouvelles voies thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés sur un plateau de haute technicité (cadre stéréotaxique, Imagerie, stabulation) nous permettant la manipulation des animaux dans les meilleures conditions (chirurgie, déplacement…) et une grande reproductibilité dans les différents modèles ce qui limite le nombre d'animaux. Les prélèvements cérébraux réalisés à chaque fin d’étude sont destinés de prime abord aux études histologiques visant à identifier des marqueurs pour déterminer de nouveaux traitements, et servent également à renforcer notre banque de tissus (cérébrothèque) afin de proposer à la communauté scientifique des tissus de PNH et ainsi réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les chirurgies sont faites sous anesthésie générale et avec une couverture antalgique permettant de réduire le plus possible les douleurs ressenties, et des dispositifs de raffinement (monitoring cardiaque et respiratoire, maintien de la température corporelle, asepsie). Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’état des animaux est observé et quantifié selon des critères objectifs permettant d’établir des scores de bien-être et de déterminer des points limites à partir desquels les actions adaptées sont menées (des massages, le maintien de l’animal au chaud à l’aide d’une couverture, la modification de la nature et le change plus régulier de la litière, l’augmentation de la fréquence des pesées, le gavage avec des complément alimentaire, lait enrichi et jus sont quelques outils dont nous disposons en dehors de la sphère médicamenteuse pour améliorer l’état de santé de nos animaux).. . Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adapté au poids de l’animal, Les prélèvements de LCR sont faits sur animaux sédatés. Les prélèvements de sang sont réalisés sur animaux vigiles avec une légère contention. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée. L’échelle de bien être est là aussi utilisée pour estimer la gêne occasionnée par ce geste. Les animaux seront hébergés ensemble, dans une structure spécialement agrée pour l’hébergement et l’utilisation des PNH en recherche, disposant d’équipements et de protocoles adaptés au raffinement du milieu pour cette espèce (volière, nourriture variée, « jouet », fond sonore, etc.).

Choix des espèces

Ces modèles ont déjà été réalisés et validés chez les rongeurs (rats, souris), comme base d’étude des maladies neurodégénératives, mais la proximité d’espèce avec l’homme en fera toujours un modèle de choix, surtout dans la détermination de marqueurs prédictifs. Les maladies neurodégénératives sont des maladies chroniques progressives qui touchent le système nerveux central. Leur fréquence augmente avec l'âge chez l’homme. Afin d’être au plus près de cet état, dans ce projet, les animaux utilisés seront donc adultes.