Système nerveux

Une ablation des ovaires ou des testicules, puis quinze jours plus tard une injection de cellules cancéreuses au cœur de l'hypophyse: 345 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à trente-cinq jours. S'y ajoutent quatre prises de sang et, pour certains, des implants hormonaux sous la peau. Le projet cherche à comprendre comment le sexe et les hormones stéroïdes influencent le développement des tumeurs de l'hypophyse. Le porteur en attend des traitements plus personnalisés selon le sexe et le statut hormonal des patients, perspective laissée au conditionnel.

Objectifs

Le projet a pour but d'explorer comment le sexe et les hormones stéroïdes sexuelles influencent le développement, la progression, le comportement invasif ; et les caractéristiques cliniques, histopathologiques et moléculaires des tumeurs hypophysaires.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’un projet visant à approfondir les connaissances fondamentales sur les différences liées au sexe et le rôle des hormones stéroïdes sexuelles dans le développement et l'agressivité des tumeurs hypophysaires. Les stéroïdes sexuels pourraient favoriser l'invasivité tumorale par des mécanismes impliquant la prolifération cellulaire et les interactions avec le microenvironnement tumoral. En mettant l'accent sur le sexe comme variable biologique-clé en biologie tumorale, ce projet pourrait améliorer les traitements actuels et mener à des innovations thérapeutiques, offrant ainsi des solutions plus personnalisées aux patients en fonction de leur sexe et de leur statut hormonal. De nouvelles thérapies ciblées pourraient être développées pour moduler la synthèse et l'action des stéroïdes sexuels, notamment pour traiter les adénomes hypophysaires résistants aux traitements conventionnels chez l'homme et la femme.

Procédures

Procédures chirurgicales : Injection stéréotaxique de cellules tumorales hypophysaires dans l'hypophyse sous anesthésie générale gazeuse et sous analgésiques (durée 30 min). Chez certains rats femelles, l’injection de cellules cancéreuses sera précédée 15 jours avant du retrait des ovaires (sous anethésie générale gazeuse et sous analgésiques; durée 20 min). Chez certains rats mâles, l’injection de cellules hypophysaires sera précédée 15 jours avant du retrait des testicules (sous anesthésie générale gazeuse et sous analgésique, durée 15 min). Prélèvements sanguins: 4 prises de sang à J1, J14 , J28 et J35 post-chirurgie pour le suivi hormonal (10 min par prélèvement). Chez certains rats ,traitements pharmacologiques par insertion sous cutanée sous anésthésie d'implants à libération continue d'un anti-aromatase ou d'un antagoniste de srécepteurs des oestrogènes.

Impact sur les animaux

Le nuisances attendues sont : - douleurs modérés et stress liés au retrait des testicules/ovaires - douleurs et stress lié à l'intervention chirurgicale d'implantation tumorale - léger stress lié aux prélèvements sanguins, à la prise régulière de mesures du poids.

Devenir

Les animaux seront gardés vivants après l’ovariectomie des femelles et l’orchidectomie des mâles et seront soumis 15 jours après à une injection stéréotaxique de cellules hypophysaires pour induire une tumeur. Tous les animaux seront euthanasiés à 35 jours post-injection stéréotaxique des cellules hypophysaires ; le cerveau et les tumeurs hypophysaires seront prélevés pour faire des analyses biochimiques et moléculaires.

Remplacement

Les modèles animaux permettant d’étudier la progression tumorale chez l'être humain sont utiles à la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la pathogénicité tumorale et l’identification de possibles cibles thérapeutiques et/ou diagnostiques. Seule l’expérimentation utilisant un modèle in vivo mimant le plus fidèlement possible le microenvironnement tumoral permettra de répondre à nos questions. Le modèle in vivo permet notamment d’évaluer les interactions avec le système immunitaire ainsi que les régulations endocrines, ce qui est actuellement impossible avec des modèles in vitro ou in silico. Actuellement, il n’existe pas de modèle alternatif n’utilisant pas d’animaux qui permettrait de mimer fidèlement la pathologie telle qu’elle est observée chez l’humain.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés à été réduit au strict minimum afin d'avoir un nombre suffisant d’animaux pour réaliser une analyse statistique fiable. Ce nombre a été calculé à partir de données déjà publiées par notre laboratoire sur ce même modèle.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux seront appropriées pour réduire la douleur, la souffrance, l’angoisse ou les dommages que pourraient ressentir les animaux. Ils seront maintenus par trois dans chaque cage avec de l’enrichissement du milieu par copaux de bois et tunnel en carton. Dans le cadre de leur habituation à l’expérimentateur et afin d’améliorer leur bien-être, les rats reçoivent 3 jours d’affilé des chatouillis pour mimer leurs comportements sociaux de jeu. Ces chatouillis seront répétés juste avant d’opérer les animaux. Les animaux seront observés quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et les responsables du projet afin de ne pas méconnaitre tout signe de souffrance. La chirurgie est réalisée sous anesthésie gazeuse. Afin d’éviter toute hypothermie durant la chirurgie, l'animal est placé sur un tapis chauffant afin de maintenir sa température corporelle à 37°C. Pour minimiser les douleurs et stress potentiels de l’animal, des analgésiques sont administrés. Les rats sont pesés avant et quotidiennement après toute procédure pour évaluer la perte de poids. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.

Choix des espèces

Actuellement, le rat est la seule espèce animale chez laquelle a été développé un modèle de tumeur hypophysaire reproduisant le microenvironnement tumoral des tumeurs hypophysaires humaines. Les animaux seront utilisés à 10-12 semaines, âge auquel ils sont sexuellement matures.

56 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie du cerveau de deux à deux heures et demie sous anesthésie, des périodes d'isolement, des enregistrements de sommeil de vingt-quatre heures et des tests de mémoire spatiale. Le modèle vise à voir si l'activation d'un type de neurones de l'hippocampe améliore la mémoire dans une forme de maladie d'Alzheimer reproduite chez la souris. Les bénéfices, repérer plus tôt les dysfonctionnements cérébraux et ouvrir des pistes thérapeutiques, sont renvoyés au long terme.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer entraîne une détérioration progressive de la mémoire et d’autres fonctions du cerveau. Avant même l’apparition de lésions importantes, le fonctionnement des réseaux de neurones peut déjà être perturbé. Mieux comprendre ces changements précoces est important, car ils pourraient expliquer une partie des troubles de la mémoire observés au début de la maladie. Ce projet cherche à comprendre le rôle d’un type particulier de cellules du cerveau qui participent au bon contrôle de l’activité nerveuse. Ces cellules sont connues pour être importantes dans l’organisation de l’activité cérébrale et dans certaines fonctions cognitives, notamment la mémoire. Des travaux antérieurs suggèrent que leur fonctionnement est altéré dans la maladie d’Alzheimer, ce qui pourrait contribuer aux troubles observés. L’objectif du projet est donc de déterminer si l’activation ciblée de ces cellules peut améliorer le fonctionnement global du cerveau et les performances de mémoire dans un modèle murin de la maladie. En parallèle, le projet cherchera à identifier des modifications de l’activité cérébrale associées aux premiers stades de la maladie, afin de mieux comprendre comment apparaissent les dysfonctionnements. Plus largement, ce travail permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes précoces de la maladie d’Alzheimer. À plus long terme, il pourrait contribuer à identifier de nouvelles pistes pour repérer plus tôt certaines anomalies du fonctionnement cérébral et, à terme, orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes précoces impliqués dans les troubles de la mémoire au cours de la maladie d’Alzheimer. Il pourrait aider à identifier certaines modifications de l’activité cérébrale associées aux premiers stades de la maladie. À plus long terme, ces travaux pourront contribuer à faire émerger de nouvelles pistes pour repérer plus tôt certains dysfonctionnements cérébraux et, à terme, orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale à l’âge de 5 à 8 mois d’une durée d’environ 2h à 2h30. Ils seront isolés le temps du réveil de la chirurgie (maximum 12h), entre les phases d’acquisition et de rétention des tâches mnésiques (3h de délai, pendant lequel l’activité cérébrale est enregistrée) et la tâche d’association place-objet (5 min de délai). De la même manière, des enregistrements de sommeil de 24 ± 1h seront répétés 2 fois entre les sessions de comportement. Enfin les souris sont soumises à des tests comportementaux afin d’évaluer leur mémoire spatiale (3x10 mins sur 2 jours par animal pour le test de localisation d’objet et 20 minutes pour le test d’association place/objet).

Impact sur les animaux

L’anesthésie générale peut provoquer un stress transitoire lié à son caractère aversif. L’intervention chirurgicale peut entraîner une douleur modérée ainsi qu’une altération temporaire de l’état général dans les jours qui suivent. Des difficultés de cicatrisation ou, plus rarement, une infection au niveau de la plaie peuvent également survenir. Enfin, les périodes d’hébergement individuel nécessaires à certaines étapes de l’étude peuvent être une source de stress pour les animaux.

Devenir

Les souris seront mises à mort pour réaliser des prélèvements de tissus et effectuer des observations anatomiques et histologiques nécessaires à la validation scientifique de ce projet.

Remplacement

Ce projet vise à établir un lien causal entre le remodelage des neurones PV, l’amélioration des performances mnésiques et le rétablissement de dynamiques électriques cérébrales globales chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Une telle démonstration causale, couplant manipulation neuronale spécifique, enregistrements et évaluation comportementale, n’est pas réalisable chez l’humain, en particulier aux stades précoces. Les modèles murins génétiques permettent au contraire de sélectionner des animaux à un âge défini (ici 5 à 8 mois), correspondant chez le modèle utilisé à un stade avec troubles de la mémoire spatiale en l’absence de dépôts amyloïdes détectables selon nos critères. Enfin, l’étude de dynamiques cérébrales globales associées à des comportements complexes requiert un cerveau intact et ne peut pas être menée in vitro ; elle doit donc être réalisée chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum compatible avec les objectifs scientifiques du projet. Le protocole repose sur un suivi des mêmes animaux à différentes étapes de l’étude, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux nécessaires tout en augmentant la robustesse des comparaisons. Tous les animaux inclus contribuent à plusieurs volets du projet, avec l’enregistrement de l’activité cérébrale, l’évaluation de la mémoire et les analyses finales sur les tissus. Cette organisation permet d’éviter la constitution de cohortes supplémentaires. Le nombre d’animaux prévu tient également compte d’un risque limité d’exclusion, par exemple en cas de qualité insuffisante des enregistrements, de ciblage insuffisant de l’intervention ou de complication après la chirurgie. L’effectif retenu vise donc à obtenir un nombre suffisant de données exploitables sans avoir à recommencer une expérimentation complémentaire.

Raffinement

Plusieurs mesures sont mises en place pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux tout au long du projet. L’intervention est réalisée sous anesthésie générale, avec une prise en charge adaptée de la douleur avant, pendant et après la chirurgie. Les animaux bénéficient d’une surveillance rapprochée après l’intervention, avec une attention particulière portée à leur état général, à la cicatrisation et à la reprise de l’alimentation. Les conditions de maintien sont également adaptées pour limiter le stress : période d’acclimatation avant le début des expériences, familiarisation progressive à la manipulation, au transport et au dispositif d’enregistrement, hébergement en groupe en dehors des phases où un isolement temporaire est nécessaire, et présence de matériel permettant le nid et l’enrichissement du milieu de vie. Des points limites précoces ont été définis afin qu’un animal en difficulté puisse être pris en charge rapidement ou retiré de l’étude si nécessaire.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle de référence pour l’étude des maladies neurodégénératives et du fonctionnement de la mémoire. Son cerveau présente une organisation générale compatible avec l’étude des circuits impliqués dans la mémoire, ce qui permet d’explorer des mécanismes difficilement accessibles chez l’humain. Les animaux seront étudiés à l’âge adulte, à un stade correspondant à l’apparition de troubles de la mémoire dans le modèle utilisé. Ce choix est important pour analyser les changements précoces du fonctionnement cérébral, avant l’installation de lésions plus avancées, et pour étudier des mécanismes susceptibles de jouer un rôle au début de la maladie.

Une irradiation du crâne puis un gavage quotidien pendant quinze jours: 1 472 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Le protocole vise la neuroinflammation déclenchée par la radiothérapie, en particulier chez les personnes dont un défaut génétique empêche de réparer l'ADN abîmé par les rayons. Aux doses les plus fortes, le porteur indique une perte de poids, une baisse d'activité et des troubles de la cognition, le gavage ajoutant un inconfort qualifié de modéré. Il revendique par ailleurs l'intérêt de son modèle de souris déficientes en réparation de l'ADN pour étudier cette hypersensibilité aux rayons.

Objectifs

Le cerveau est particulièrement sensible aux radiations. Lorsqu’il est exposé à des rayonnements, par exemple lors du traitement d’un cancer, cela peut endommager les cellules et entrainer des problèmes cognitifs durables comme des troubles de la mémoire ou de la concentration. Or certaines personnes sont encore plus vulnérables car elles possèdent un défaut génétique : elles manquent d'une protéine qui répare normalement les dommages que peut subir l'ADN exposé aux rayonnements. Ces patients risquent alors des complications bien plus graves. Quand les radiations endommagent le cerveau, cela déclenche une inflammation au niveau de cet organe (dite neuroinflammation). Cette dernière est entretenue par les cellules de nettoyage du cerveau, appelées microglies. Elles persistent et continuent à produire des substances inflammatoires qui aggravent les dégâts. Nous cherchons à comprendre comment arrêter ou réduire cette inflammation pour prévenir les dommages cognitifs. Pour cela, nous étudierons donc : 1- D'où provient cette neuroinflammation induite par les rayonnements ? Nous rechercherons les fragments d'ADN anormaux qui s'accumulent après l'irradiation et activent le système immunitaire du cerveau. 2- Par quels mécanismes cette neuroinflammation est-elle déclenchée ? Nous identifierons les protéines impliquées dans la transmission du signal d'alarme déclenchant l’inflammation. 3- Comment la contrôler ? Nous testerons des molécules pour arrêter cette cascade inflammatoire et réduire l'activation des microglies. Nous espérons ainsi mieux comprendre le lien entre dommages radiologiques et inflammation du cerveau pour développer des traitements protégeant les cellules des neurones après une exposition à des rayonnements.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre de quelle façon les radiations déclenchent l'inflammation du cerveau, en particulier chez les personnes génétiquement prédisposées. Cela élargira notre compréhension de la toxicité des rayonnements sur les cellules. Par ailleurs, nous identifierons les acteurs moléculaires responsables du contrôle de l’inflammation dans le cerveau exposé à des rayonnements. Et enfin, nous confirmerons l’intérêt de notre modèle, de défaut génétique de réparation de l’ADN, pour l’étude de l'hypersensibilité aux rayonnements ionisants. L'objectif final est d'améliorer la prise en charge des patients traités par radiothérapie, en développant des médicaments capables de bloquer l'inflammation du cerveau et de prévenir le déclin cognitif, sans toutefois réduire l'efficacité du traitement anti-cancéreux. De plus, l’identification de patients, à haut risque de complications en fonction de leur profil génétique, permettra d’adapter les protocoles de radiothérapie en personnalisant les doses selon le risque individuel. Ainsi ce travail contribuera à ajuster les normes de radioprotection afin de mieux protéger les populations sensibles. Ce projet est donc à l’intersection de la recherche fondamentale et de la clinique, afin d'une part de comprendre les mécanismes biologiques, et d'autre part de développer des stratégies thérapeutiques concrètes pour prévenir les effets secondaires graves de la radiothérapie.

Procédures

L'étude comprend deux types d’interventions effectuées sur des souris. La première correspond à une irradiation unique (sous anesthésie), ciblée sur la tête, durant 5 minutes maximum. La seconde ajoute l’administration quotidienne d’un médicament anti-inflammatoire par voie orale (soit mélangé dans la nourriture, soit administré directement par la bouche). Le temps d’administration des médicaments ne prend qu’une minute par animal durant les 15 jours de traitement. Les animaux sont euthanasiés et leurs cerveaux collectés

Impact sur les animaux

Ce projet implique plusieurs manipulations pouvant entrainer des effets sur le bien-être des souris. Aux doses les plus fortes, une perte de poids et d’activité ainsi que des troubles du comportement et de la cognition pourraient être observés. Une neuroinflammation transitoire à persistante se mettra en place. La procédure de gavage provoque du stress ou un inconfort modéré pour les animaux. Les administrations d’analgésiques et d’anesthésique seront réalisées par voie sous-cutanée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour permettre d’effectuer des analyses histologiques ou moléculaires.

Remplacement

Notre projet étudie comment les radiations endommagent le cerveau et déclenchent une inflammation. Bien que nous utilisions des approches alternatives à l’aide de cultures cellulaires, elles ne peuvent pas à elles seules répondre à nos questions scientifiques. En effet, le cerveau est un organe extrêmement complexe avec de nombreuses structures différentes qui communiquent entre elles. Seul un cerveau intact et fonctionnel peut permettre de comprendre comment les radiations affectent simultanément toutes les structures du cerveau, d’observer la progression de l'inflammation dans le temps et de tester l’administration de molécules afin de limiter cette inflammation.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux à utiliser, nous avons sélectionné avec rigueur les conditions testées afin d’éviter les groupes inutiles. De plus, une phase pilote est prévue au début du projet afin de valider les procédures avant de mener les expériences complètes. Pour déterminer le nombre d'animaux requis par condition expérimentale, nous avons utilisé une approche statistique validée. Pour chaque échantillon biologique collecté, des analyses multiples (expression de gènes/protéines, histologie) seront mises en œuvre afin de limiter la répétition des expériences in vivo. Enfin, pour l’étude mécanistique des voies de signalisation impliquées, la priorité sera donnée à des expériences sur cellules en culture.

Raffinement

Nous avons mis en place plusieurs mesures pour minimiser l’inconfort et la souffrance des animaux pendant toute la durée du projet. Avant et après les procédures expérimentales, les cages des souris sont enrichies avec des éléments stimulants (tunnels en carton, coton, nourriture supplémentaire) pour améliorer leur bien-être quotidien. Une surveillance régulière du comportement des souris permettra de détecter rapidement tout problème. Pendant l’irradiation, les souris sont placées sous anesthésie générale afin de réduire le stress lié à la contention. La baisse de température corporelle dans l’appareil, sera compensée par un système de chauffage jusqu’au réveil de l’animal. Après irradiation et durant les traitements médicamenteux, une grille d'évaluation standardisée permettra de vérifier régulièrement l'état de l'animal (comportement, appétit, activité) et des critères limites ont été définis afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris est le meilleur modèle pour ce projet car son cerveau possède une organisation structurelle comparable à celle du cerveau humain. De plus, les processus inflammatoires et les mécanismes de réparation de l'ADN fonctionnent de façon similaire chez la souris et chez l'humain. Ainsi, les découvertes faites dans ce projet pourront être extrapolées à la compréhension de la physiologie humaine; Les animaux inclus dans cette étude seront de jeunes adultes de 6 semaines, afin d’étudier l’inflammation induite par les rayonnements sur un cerveau complètement développé, tout en évitant les effets du vieillissement.

2 366 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à quatre tests de mémoire, à des injections et parfois à l'ablation des glandes génitales. Nourries douze à quinze semaines d'un régime obésogène dès le sevrage, une partie subit une ou deux chirurgies sous anesthésie, puis une imagerie de la masse grasse en fin d'expérience. Le projet vise à comprendre le rôle des hormones sexuelles dans les troubles de mémoire liés à l'obésité, chez les mâles comme chez les femelles. Les stratégies thérapeutiques évoquées restent lointaines, quand la stérilisation et la mise à mort des 2 366 individus sont, elles, programmées.

Objectifs

L'obésité, en tant que défi de santé publique, réduit l'espérance de vie en raison des pathologies qu'elle favorise (hypertension, cancers, diabètes, etc.). Elle est également associée à des troubles de la mémoire, ce qui est particulièrement préoccupant durant l’enfance et l’adolescence, des périodes clés pour la maturation de structures cérébrales essentielles à la mémoire. Chez la souris, la consommation d'une nourriture riche en lipides pendant l'adolescence, en plus d'entrainer une prise de poids excessive, altère les capacités de mémoire en impliquant des mécanismes spécifiques dans certaines régions du cerveau. La majorité des travaux scientifiques ont été réalisés chez des mâles, alors que, chez l’humain, l’obésité touche de manière comparable les deux sexes. Afin de mieux transposer ces résultats, des études ont également été menées chez des femelles. Comme chez les mâles, la nourriture riche en lipides, à l’adolescence, a des effets négatifs sur la mémoire. Toutefois, les mécanismes impliqués semblent différer selon le sexe. L’objectif de ce projet est donc d’identifier le rôle des hormones sexuelles dans les altérations de la mémoire induites par un régime riche en lipides, chez les mâles comme chez les femelles.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet devrait produire des données expérimentales sur l'évaluation de la mémoire dans différentes conditions expérimentales (régime, age, sexe, traitement) chez la souris. Les résultats issus de ce projet devraient être accessibles à moyen terme, à l’issue de l’analyse complète des données et de leur diffusion via des publications scientifiques et des communications dans des congrès spécialisés. Et à plus long terme, ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des mécanismes à la base des effets délétères d'une nourriture hyperlipidique sur le cerveau et la mémoire en fonction du sexe et le rôle des hormones sexuelles, afin d'envisager potentiellement des stratégies thérapeutiques, puisque le surpoids concerne 47 % des français adultes et 17% des français souffrent d'obésité.

Procédures

Tous les animaux subiront, à au moins 48h d’intervalle, quatre tests comportementaux afin d'évaluer leur mémoire. Chaque étape de ces tests dure 10 minutes. Une partie des animaux subira lors de ces tests comportemantaux des injections périphériques ou locales. Une partie des animaux subira une fois un jeune de 5h préalablement aux mesures métaboliques (7 prélèvements sanguins sur une durée de 2 h). Une partie des animaux subira une ou deux interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire. Ces interventions durent entre 20 et 45 minutes avec une phase de réveil entre 5 et 20 minutes. Tous les animaux subiront en fin d’expérimentation, une seule analyse en imagerie d’une durée de 2 min afin d’évaluer la répartition de leur masse grasse/masse maigre et un seul prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

L’alimentation obésogène donnée pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes comme ceux utilisés dans notre étude. Outre la sterilité induite par le retrait des glandes génitales, il n'y a que peu d’effets secondaires notables. Les tests de comportement, ainsi que les injections peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation et limitée par la maitrise des expérimentateurs. Les prélèvements durant le test de tolérance au glucose pourront engendrer une légère douleur aux animaux. Les chirurgies pourraient entraîner dans les 48h suivant l’opération une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en vue de récupérer leurs cerveaux pour des analyses post mortem.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et du fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène et il n’est pas possible de le remplacer par des approches cellulaires sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. De plus, le nombre d’animaux sera réduit au mieux pour obtenir des résultats concluants lors de nos comparaisons statistiques. Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques produits, les besoins expérimentaux seront planifiés et les stratégies de croisement optimisées par l'utilisation de reproducteurs génotypés. Cela représente un total de 2366 animaux (1183 males et 1183 femelles) sur 5 ans.

Raffinement

Des critères objectifs d’arrêt des souffrances des animaux sont définis afin d’encadrer de manière objective et graduée les décisions visant à prévenir toute souffrance excessive. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré-, péri et post-opératoire pour limiter la douleur. Toutes les précautions d'asepsie et de confort seront prises pour limiter l'inconfort des animaux. Les jours suivant la chirurgie, les animaux sont surveillés attentivement une fois par jour pour s’assurer de leur bon rétablissement. Avec la mise en place de points limites, si un animal présente une anomalie il sera immédiatement isolé, surveillé et soigné pendant 3 jours jusqu’à amélioration. Si il n'y a pas d'amélioration et après avis de la cellule bien être et de l'avis du vétérinaire désigné, les animaux seront mis à mort. Si il y amélioration et durant les mois suivant la chirurgie, les animaux seront pesés 1 fois par semaine et un suivi avec des critères objectifs est mis en place. S’il n’y a aucun signe de mal-être chez l’animal, il passera en phase comportementale, qui sera optimisée pour durer le moins de temps possible. Une période d’habituation des souris à l'expérimentateur sera mise en place avant les taches comportementales afin de réduire le stress lié aux manipulations et aux procédures, contribuant ainsi à améliorer leur bien-être et la fiabilité des données recueillies. Les souris seront remises avec leurs congénères entre chaque phase de test. Les injections pharmacologiques seront réalisées de sorte à limiter les interventions sur l’animal.

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée dans ce projet est la souris. Ce choix s’explique par la possibilité de modifier de façon précise le fonctionnement de certains éléments du cerveau chez cet animal. Ce sont des animaux sur lesquels les traitements nutritionnels et l'induction de l'obésité sont faciles à conduire et notre équipe dispose d’une expérience de longue date pour conduire des approches nutritionnelles chez cette espèce. Le modèle de rongeurs soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Les chirurgies et les tests comportementaux, maîtrisés sur cette espèce dans notre laboratoire, sont facilement mis en œuvre et permettent d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives et émotionnelles, qui sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les souris seront exposées au régime hyperlipidique ou contrôle dès le sevrage (3 semaines) et pendant 12 semaines. Cette exposition commence dès le sevrage (jusqu’à l'âge adulte) afin de couvrir la période de l'adolescence. Certains animaux subiront une chirugie, une partie à l’âge de 4 semaines (pré adolescence) et une autre partie à l’âge adulte (8 semaines). Les taches comportementales seront réalisées à l'age adulte entre 15 et 18 semaines.

Exposés au fongicide in utero puis jusqu'au sevrage par l'alimentation de leur mère, à des doses dites réglementaires, 132 ratons subissent aussi six prélèvements sanguins hebdomadaires sous anesthésie, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le projet cherche à savoir si ce pesticide, autorisé aux doses en vigueur, altère les barrières protectrices du cerveau en développement. Le porteur présente les nuisances des prélèvements comme légères, un stress court et une hypothermie transitoire. Tous les ratons sont tués en fin de protocole pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Des études récentes montrent que certains pesticides, largement utilisés actuellement en agriculture pourraient poser un problème de santé publique important. Parmi les différents composés sur le marché, certains pourraient avoir une activité sur la consommation d'oxygène par les cellules. Dans le contexte du développement cérébral précoce, les barrières protectrices du cerveau nécessitent beaucoup d’énergie pour fonctionner correctement. Ainsi, l’altération de la respiration de ces barrières, provoquée par une exposition précoce au pesticide étudié est un facteur de risque méconnu de développement de pathologies cérébrales. L'objectif de cette étude est l’étude des altérations du fonctionnement des barrières protectrices du cerveau et du cerveau lui-même, provoquées par une exposition lors de la période périnatale (depuis le développement in utero jusqu'au sevrage) à un pesticides aux doses réglementaires.

Bénéfices attendus

Ce projet produira des données nouvelles et originales qui permettront aux agences réglementaires d’affiner leur analyse de risque sur la santé environnementale des populations exposées au pesticide étudié.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins hebdomadaires réalisés sous anesthésie générale. Nombre de prélèvements sanguins et durée : 6; 3 minutes chacun.

Impact sur les animaux

Les anesthésies gazeuses réalisées lors de prélèvement sanguins peuvent induire une légère hypothermie transitoire. La manipulation des animaux peut induire un stress léger de courte durée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin du protocole afin de collecter les tissus pour analyse.

Remplacement

Le projet envisage l'étude des barrières protectrices du cerveau en lien avec une exposition expérimentale à un pesticide. Les modèles in vitro de barrières sang-cerveau ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des intoxications périnatales. Ceci implique donc le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous avons calculé, sur la base des effet attendus, le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet.

Raffinement

Conformément aux exigences de raffinement, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie, et seront hébergés dans un environnement enrichi (bûchettes de bois, tunnel en plastique et éléments de nidification). Le suivi individuel consiste en une inspection visuelle du comportement et de l’apparence au quotidien. Des points limites spécifiques ont été définis et provoqueront la mise à mort des animaux si ils sont atteints. L'exposition au pesticide est réalisé par voie orale de façon naturelle via l'alimentation et sans manipulation des animaux. Les prélevement de sang sont réalisés sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le projet sera réalisé sur des rats Sprague Dawley qui est une espèce de référence pour l'étude du neurodéveloppement. Cette lignée a des portées nombreuses. Le projet prévoit d’utiliser des ratons jusqu'au sevrage afin d’étudier l’impact d'un pesticide sur l’intégrité des barrières protectrices du cerveau au cours du développement précoce.

Un AVC provoqué par chirurgie sous anesthésie d'environ 45 minutes, puis des tests de mémoire et de motricité répétés jusqu'à six fois par jour pendant douze à vingt jours: 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'objectif déclaré est de comprendre comment l'inflammation se propage après un AVC et provoque des troubles cognitifs tardifs. Le porteur décrit un modèle induisant un dommage cérébral limité, sans symptômes majeurs, tout en cherchant à reproduire des déficits de mémoire. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit la vascularisation cérébrale ni les tests de comportement.

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) résulte d'une interruption du flux sanguin dans une zone du cerveau, provoquant la mort cellulaire ainsi qu’une réaction inflammatoire dans cette région cérébrale. Les dommages induits chez les cellules produisent des symptômes qui se manifestent à court terme, tels que des déficits moteurs ou des difficultés à parler. Cependant, les dommages initialement induits par l’AVC dans une zone spécifique pourraient se propager dans d’autres aires cérébrales induisant ainsi de nouveaux symptômes. En fait, 70 % des survivants d'un AVC développent des troubles cognitifs tels que des déficits de mémoire, des difficultés à intégrer de nouvelles informations ou à s’adapter à de nouvelles situations. Ces symptômes se manifestent tardivement, de quelques semaines à quelques mois après l’AVC, ce qui offre la possibilité d’intervenir avec un traitement. Une bonne compréhension des mécanismes qui sous-tendent les troubles cognitifs se manifestant après l’AVC est donc nécessaire pour le développement de stratégies permettant d’éviter leur survenue. Nous émettons donc l’hypothèse que la propagation de l’inflammation de la zone initialement affectée par l’AVC aux autres régions du cerveau pourrait être à l’origine de troubles cognitifs. Dans cette étude, nous testons cette hypothèse en induisant un AVC limité à une région anatomique précise du cerveau d’un modèle de souris afin d’étudier l’évolution des conséquences à plusieurs niveaux, allant de l’expression du gène au comportement. Cette approche favorise une compréhension intégrative de comment des altérations précoces causées par l’AVC peuvent progressivement mener à des troubles tardifs à plus grande échelle, tels que la mémoire. Nous pourrons ainsi établir des liens entre les modifications observées dans le cerveau, notamment dans des régions qui ne sont pas touchées directement par la lésion, et les déficits de mémoire, afin d’identifier les mécanismes qui pourraient sous-tendre leur apparition.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser et comprendre les phénomènes après AVC au-delà de la zone initialement affectée. Cette compréhension est nécessaire afin d’établir de solides bases pour de futures recherches sur l’établissement de nouveaux traitements pour prévenir certains troubles cognitifs tardifs et pourrait avoir des répercussions positives et importantes pour la recherche préclinique. Les bénéfices attendus sont donc au profit de la santé humaine.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une chirurgie peu invasive pour induire l’AVC sous anesthésie générale (environ 45 minutes), et des tests comportementaux seront réalisés. Les souris seront soumises pendant 3 jours à des tests pour évaluer leur fonction motrice (duré max 5 minute par essai) et leur anxiété (durée max 5 minutes). Ensuite des autres tests seront utilisés pour évaluer la mémoire ainsi que la capacité à intégrer de nouvelles informations. Chaque test de la durée d’une minute est répété maximum six fois par jour pendant 12-20 jours selon le degré d'apprentissage des animaux. Les capacités de mémoire des souris pourraient également être étudiées avec un test plus court de reconnaissance d’objet nouveau.

Impact sur les animaux

La chirurgie d’induction de l’AVC induit un dommage cérébrale limité et ne s’accompagne typiquement pas des symptômes majeurs, rendant le modèle facilement utilisable tout en limitant la souffrance animale. Pendant la chirurgie des risques d’hypothermie et de déshydratation à cause de l’anesthésie peuvent survenir (nuisance modérée). Le seul symptôme observé post-chirurgie dans notre modèle et une légère perte de poids (usuellement inférieur à 10%) dès le lendemain de la chirurgie, et résolue dans la semaine suivante (nuisance légère). Les tests comportementaux peuvent engendrer une fatigue physique passagère (nuisance légère), ainsi qu’une légère hypothermie (nuisance légère).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après les expériences pour récupérer les cerveaux et faire une étude de l’inflammation.

Remplacement

Il n’existe pas encore, à ce jour, de modèle alternatif (tel que les cultures cellulaires) à l’induction d’AVC chez la souris suffisant pour reproduire les mécanismes complexes présents dans la pathologie humaine, impliquant notamment des structures sophistiquées comme la vascularisation cérébrale. La méthode que nous utilisons est cependant la méthode actuelle connue la moins invasive, permettant l’induction contrôlée et reproductible d’un AVC limité à une zone d’intérêt. Il n’existe pas non plus actuellement de méthode alternative permettant de remplacer les animaux dans les expériences de comportement, impliquant l’interaction complexe de différentes structures et systèmes cérébraux

Réduction

Le déroulement des expériences est organisé afin de limiter au maximum le nombre d’animaux : certains tests seront effectués sur la base de résultats des expériences précédentes. Les tests comportementaux choisis permettent d’étudier plusieurs aspects de la mémoire sur le même lot d’animal et sans altérer les résultats. En plus, sur les mêmes animaux nous testerons des signes d’une inflammation. Cela permet une étude longitudinale, et donc une réduction des animaux. Le nombre de souris a été déterminé à l’aide de tests statistiques.

Raffinement

Des mesures de raffinement seront mises en place durant toute la durée du projet pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. La douleur est prévenue grâce à des mesures anesthésiantes et analgésiantes. Les animaux sont toujours surveillés quotidiennement par le personnel animalier, et une surveillance accrue est réalisée par l’expérimentateur pendant au moins deux jours après la chirurgie, puis une fois par semaine. Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, il sera pris en charge par l’expérimentateur et le vétérinaire responsable qui appliquerons des soins conservatoires et une surveillance prolongée. Si les critères d’arrêt des souffrances sont atteints (points limites établis), l’expérience sera arrêtée. Nous vérifions que les animaux sont en bonne santé tout au long des tests et si des souffrances sont observées, des soins conservatoires seront également appliqués avec avis du vétérinaire, ou les expériences arrêtées en cas d’atteinte des points limites. Les animaux sont habitués à l’utilisateur et aux dispositifs utilisés pendant le test pour réduire le stress. Par expérience, il est coutumier de voir après quelques jours d’apprentissage que l’animal monte directement dans votre main lorsque vous ouvrez la cage et effectue la tâche sans appréhension, ni signe d’angoisse particulier.

Choix des espèces

Le modèle envisagé a déjà été développé chez la souris. L’étude sur la souris permet de faire des corrélations entre les phénomènes à niveaux cellulaire et le comportement et donc de répondre à notre question scientifique. Nous utiliserons des souris âgées de 16-28 semaines. Cette tranche d’âge permet d’étudier les conséquences d’un AVC sur une tache de mémoire chez un animal adulte. Nous utilisons des animaux adultes puisque, pour étudier les conséquences d’un AVC, les circuits neuronaux et vasculaires doivent être complètement développés.

Opérées de l'abdomen pendant la gestation, greffées de cellules humaines chez l'embryon puis injectées dans le cerveau à la naissance ou à l'âge adulte, 1 470 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Les chirurgies durent environ une heure, suivies d'injections d'analgésique toutes les huit heures pendant vingt-quatre heures. Le projet construit un modèle dit "humanisé" de la maladie d'Alzheimer pour en étudier les mécanismes précoces, avec une ouverture affichée vers des collaborations avec des start-ups. Les bénéfices thérapeutiques sont renvoyés au long terme, quand les atteintes chirurgicales sont immédiates.

Objectifs

Le projet à caractère scientifique a pour objectif de décrypter les mécanismes conduisant aux pathologies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer (MA), et impliquant certains récepteurs cellulaires. Le rôle important de ces récepteurs dans la mémoire et les processus cognitifs, progressivement altérés lors de l’évolution de la MA est démontré. L’avantage d’un modèle de greffe de cellules humaines ou selon l’appellation de « souris humanisée » est de fournir un contexte permettant de mieux appréhender les mécanismes de la dégénérescence neuronale évolutive, à des phases bien plus précoces que celles utilisées pour le diagnostic de la maladie, c’est-à-dire ceux de l’apparition des premiers symptômes chez les patients. Les nouvelles approches d’analyses sur cellule unique permettront de mieux caractériser et comparer les mécanismes moléculaires impliqués dans les formes familiale et sporadique de la MA, qui à ce jour sont suspectés différents mais encore non clairement identifiés dans les deux cas.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la pathogénèse des deux formes sporadique et familiale de la maladie d’Alzheimer (MA). A court terme, le projet devrait permettre de démontrer le potentiel des méthodes in-vivo utilisées pour décrypter ces mécanismes. Enfin, un transfert des compétences acquises et extension de l’étude sur cellules issues de patients devraient aussi permettre d’autres avancées. A plus long terme, le projet devrait pouvoir s’orienter vers l’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour la MA et offrir la possibilité de collaborer avec des start-ups déjà identifiées pour tester des molécules candidates pour traiter la MA.

Procédures

MODIFICATIONS texte en majuscules - 3 INJECTIONS SOUS-CUTANE (CHIRURGIES UNIQUEMENT), DUREE DE 15 SECONDES PAR INJECTION. - INJECTIONS SOUS-CUTANE SUR POUR TRAITEMENT POST-CHIRURGICAL : TOUTES LES 8 HEURES PENDANT 5 JOURS SOIT 15 REPETITIONS, DUREE DE 15 SECONDES PAR INJECTION. - UNE NJECTION INTRAPERITONEALE SUR L’ENSEMBLE DES ANIMAUX POUR ANESTHESIE LETALE EN FIN DE PROTOCOLE, 15 SECONDES / INJECTION. - CHIRURGIE ABDOMINALE CHEZ LA SOURIS GESTANTE). CHAQUE CHIRURGIE DURE ENVIRON 60 MIN, EN EXCLUANT LES TEMPS DE PREPARATION DE L’ANIMAL ET LES TEMPS POST-OPERATOIRES. -GREFFE DE CELLULES CHEZ L’EMBRYON DE SOURIS AU DERNIER TIERS DE GESTATION : DE 30 SECONDES CHACUNE. - INJECTION DANS LE CERVEAU CHEZ LA SOURIS NOUVEAU-NE: INJECTION 45 SECONDES PAR INJECTION DANS LE CERVEAU, UNE OU DEUX INJECTIONS. - INJECTION DANS LE CERVEAU CHEZ LA SOURIS ADULTE : INJECTION 30 MIN AU TOTAL /2 INJECTIONS PAR SOURIS.

Impact sur les animaux

MODIFICATIONS texte en majuscules Les effets indésirables chez les souris nouveau-nés comprennent le stress d’une courte séparation de leur mère (et réciproquement pour la mère par rapport à la portée), et une douleur modérée à l’injection difficile à évaluer à ce stade néonatal, mais bien anticipée par des antalgiques (injection s.c. de buprénorphine 30 min avant les chirurgies puis toutes les 8 heures pendant 24h (dose de 0.1 mg/kg). Pour les souris adultes subissant une chirurgie pour injection stéréotaxique sous anesthésie, les effets indésirables sont une douleur post-opératoire modérée contrôlée et gérée par des antalgiques (buprénorphine en s.c. 30 min avant la chirurgie et toutes les 8 heures pendant 24h à la dose de 0.1 mg/kg et metacam en forme injectable 5mg/kg en s.c. et en forma buvable dans l’eau de boisson pendant 5 jours). Pour les souris devant subir une laparotomie, les nuisances sont une douleur modérée post-opératoire du fait de la chirurgie abdominale contrôlée, anticipée et contrôlée par des antalgiques : injection s.c. de buprénorphine 30 min avant la chirurgie puis toutes les 8 heures pendant 24h (dose 0.1 mg/kg). L’ADMINISTRATION UNIQUE DE SUBSTANCE CHEZ LA SOURIS INDUIT UNE NUISANCE DE NIVEAU MODERE, DU FAIT DU STRESS DE CONTENTION, DE LA DOULEUR BREVE LIEE A LA PONCTION, DE L’INCONFORT ABDOMINAL TRANSITOIRE ET SURTOUT DE L’INDUCTION D’UN ETAT INFLAMMATOIRE GENERAL TRANSITOIRE. CELUI-CI PEUT SE TRADUIRE PAR UN ABATTEMENT, UNE DIMINUTION DE L’ACTIVITE, UNE PILOERECTION, UNE REDUCTION DE LA PRISE ALIMENTAIRE ET HYDRIQUE, UNE PERTE DE POIDS TRANSITOIRE ET UNE HYPOTHERMIE. LES ANIMAUX SERONT SUIVIS ETROITEMENT APRES INJECTION SELON UNE GRILLE DE SCORE CLINIQUE PREDEFINIE ET DES POINTS LIMITES SERONT APPLIQUES SANS DELAI EN CAS D’ALTERATION MARQUEE DE L’ETAT GENERAL.

Devenir

MODIFICATIONS LES SOURIS AYANT SUBI UNE OPERATION CHIRURGICALE ET TOTALEMENT CICATRISEES PEUVENT ETRE UTILISEES POUR PRELEVEMENTS DE CERVEAUX (APPRENTISSAGE DE COUPES TISSULAIRES). TOUS LES ANIMAUX INTEGRES DANS L’ETUDE SERONT MIS A MORT A LA FIN DE CHAQUE PROCEDURE DU FAIT DES ANALYSES PREVUES EXCLUSIVEMENT EX-VIVO. ILS NE PEUVENT ETRE NI REUTILISES, NI REPLACES, NI ADOPTES.

Remplacement

MODIFICATIONS texte en majuscules L’évaluation des processus associés à la maladie d’Alzheimer (MA) ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants et démontrés pour représenter un modèle d’étude pertinent. LA MA IMPLIQUE DES PROCESSUS DYNAMIQUES ET INTEGRES QUI NECESSITENT UN CERVEAU ENTIER VIVANT POUR ETRE RELIES CAUSALEMENT A DES ALTERATIONS COMPORTEMENTALES. LES MODELES IN VITRO/HUMAINS EX VIVO DECRIVENT UNIQUEMENT DES MECANISMES MAIS NE REPRODUISENT PAS TOUS LES SYMPTOMES, ET L’ETABLISSEMENT DE RELATIONS CAUSE‑EFFET ET L’EVALUATION PRECLINIQUE D’INTERVENTIONS SUR LA PROGRESSION ET LA COGNITION REPOSENT DONC ESSENTIELLEMENT SUR DES MODELES ANIMAUX. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages, atlas des régions cérébrales pour le repérage des structures en stéréotaxie), et de la manipulation plus aisée. Le modèle souris est un modèle de choix permettant de travailler sur des animaux manipulés génétiquement et est de ce fait celui retenu. Ce projet représente actuellement le seul modèle « humanisé » pour la MA permettant à terme une avancée thérapeutique ciblant les cellules humaines in-vivo et principaux acteurs en interaction constante dans l’évolution de la maladie.

Réduction

Puisqu’il s’agit d’un renouvellement de projet, les nombres d’animaux ont été optimisés par les études antérieures et sont réduits à leur minimum. Aucune étude pilote est nécessaire. Tous les protocoles d’injection sont largement maitrisés et chaque souris utilisée conduira à des résultats interprétables. Selon les résultats et leur interprétation, il est possible que la méthodologie soit à terme simplifiée sur un mode de chirurgie unique sans impact sur les objectifs scientifiques. Les analyses prévues sur cellule unique se feront selon un protocole déjà mis au point. Elles permettent d’obtenir une masse de données à partir de peu d’échantillons de tissus cérébraux. Les tissus non utilisés seront conservés à -80°C. Pour les greffes des souris dans l’utérus, les portées sont très larges, permettant de réduite à son strict minimum le nombre de souris gestantes. Le stade de greffe retenu a été optimisé lors de précédentes études, permettant une très bonne survie des nouveau-nés. Mâles et femelles seront utilisés en pourcentages les plus équivalents possibles et identifiés. Les animaux greffés seront mis à mort en fin d’expérience et non réutilisables. Le projet met en œuvre une collaboration avec un bio-informaticien possédant l’expertise des modes d’analyses transcriptomiques sur cellule unique et des tests statistiques associées. Pour les études relevant des analyses anatomiques/morphologiques, nous nous baserons sur nos études publiées selon des protocoles similaires.

Raffinement

MODIFICATIONS texte en majuscules Les chirurgies seront réalisées dans un laboratoire dédié exclusivement à la chirurgie L’élevage sera en cage individuelle par portée et des mesures seront prises pour éviter tout animal isolé au-delà d’une période de 24h. Les animaux seront placés sur dispositif chauffant pour maintenir une bonne température corporelle avant, pendant et après l’expérience et seront étroitement surveillés après chirurgie. Dans les procédures expérimentales, les souris feront l’objet d’une surveillance accrue ET RENFORCEE, de soins pré- et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur seront entreprises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris. CES MESURES COMPRENNENT UN RENFORCEMENT DE L’ANALGESIE, EGALEMENT LE MAINTIEN DES SOURIS A UNE BONNE TEMPERATURE SUR DISPOSITIF CHAUFFANT AU REVEIL DES CHIRURGIES, UNE LITIERE DOUCE. POUR LES FEMELLES GESTANTES, ELLES SERONT MAINTENUES AVEC UNE AUTRE FEMELLE POUR EVITER TOUT ISOLEMENT ET STRESS ASSOCIE. Pour les souris immunodéficientes, des conditions maximales d’asepsie seront appliquées. De façon générale et pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, nous rechercherons à minimiser la douleur par antalgiques, ajout de diet gel, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Nous renforcerons également l’enrichissement des cages. Nous surveillerons l’utilisation des cotons, et l’état de la nidification le cas échéant sous les dômes en carton. Durant les chirurgies, nous assurerons l’absence d’autres manipulations d’animaux dans la pièce de chirurgie et la préparation de tout le matériel sera réalisée en amont pour réduire les temps de manipulation. Deux expérimentateurs seront présents pour réduire les temps d’action. Tous les points limites seront contrôlés pour chaque procédure et anticipés par traitements analgésiques (injection s.c. de buprénorphine 30 min avant la chirurgie et toutes les 8 heures pendant 24h (0.1 mg/kg) pour un effet visible au plus tard dans un délai de 24 heures. En absence d’effets, l’animal est mis à mort.

Choix des espèces

L’évaluation du rôle du système nicotinique et d’un récepteur particulier chez l’homme dans les processus associés à la maladie d’Alzheimer ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages), et de la manipulation plus aisée. La souris représente un des meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également analyser et manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre de ce projet). Les animaux seront utilisés à trois stades de développement distincts : embryonnaire, néonatal et adulte. Pour la gestation, des femelles de 8-10 semaines seront utilisées. Les souris greffées seront sevrées à 4 semaines après naissance, en séparant mâles et femelles. Tous les animaux sevrés et injectés avec des vecteurs, seront utilisés à partir de 8 semaines et testés en groupe d’âge et protocoles indépendants jusqu’à 9 mois (3, 4, 5, 7 et 9 mois). Une condition de greffe de cellules sans vecteur sera initiés dès 1 mois. Le projet vise à étudier le développement de cellules humaines dans un contexte in-vivo, se rapprochant de conditions physiologiques et pathophysiologiques et mimant au mieux ce qui se passe dans la pathogénèse de la maladie d’Alzheimer chez les patients avant l’apparition des signes cliniques et également avant celle des premiers évènements cellulaires. Mieux comprendre les interactions entre les cellules greffées et celles de l’hôte présentant des stades de maturation différents, représente également un enjeu important pour le futur et les approches de médecine régénérative à venir.