Système nerveux

Privées de tout enrichissement dans leur cage pour ne pas gêner l'apparition du phénotype recherché, 735 souris subissent un suivi quotidien de 83 à 138 jours, avec des sessions comportementales de 5 à 45 minutes et des sons désagréables dont elles doivent apprendre à s'échapper. 390 sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 345 dans des procédures d'un niveau sévère, 615 d'entre elles passant par une chirurgie du crâne pour implanter une fibre optique, parfois accompagnée d'une manipulation du nerf vague. Le porteur revendique un "progrès éthique significatif" et présente ses procédures comme moins invasives que les équivalents existants, tout en annonçant une modélisation animale des conduites suicidaires, un stress chronique par corticostérone dans l'eau de boisson et des traitements au lithium, à la fluoxétine ou au diazépam. Toutes les souris sont tuées en fin d'expérience pour prélever leur cerveau, leur foie et leur intestin.

Objectifs

Ce projet a pour but de développer de nouvelles approches d’étude des comportements aversifs par échappement Pavlovien (c’est à dire ne requérant que les réflexes d’approche ou d'évitement) ou opérant (requérant ici une action volontaire) de sons désagréables mais non douloureux dans le suivi des symptômes anxieux et dépressifs (avec ou sans conduites suicidaires) et enfin de caractériser la pertinence du suivi non invasif de l’activité autonomique dans l’évaluation des altérations émotionnelles.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront des avancées majeures sur les plans fondamental, éthique et appliqué. Grâce au développement d’épreuves comportementales adaptées, le projet approfondira la compréhension des mécanismes cérébraux de l’axe intestin-cerveau impliqués dans l’anxiété et la dépression, ainsi que les processus cognitifs en situation aversive. Un volet crucial concerne la modélisation animale des conduites suicidaires, un outil qui fait actuellement défaut pour l'étude des mécanismes biologiques sous-jacents. Sur le plan méthodologique, l'approche longitudinale proposée constitue un progrès éthique significatif : en suivant les mêmes individus (profils anxio-dépressifs et capacités cognitives), nous réduisons considérablement le nombre d'animaux requis tout en minimisant leur stress par rapport aux méthodes conventionnelles. Enfin, d’un point de vue translationnel, ce projet évalue le microbiote intestinal comme levier thérapeutique contre les troubles liés au sevrage alcoolique. À plus long terme, ces recherches ouvriront la voie à des stratégies innovantes pour traiter la dépression résistante et améliorer la prévention du risque suicidaire.

Procédures

L'ensemble des animaux de cette étude sera soumis à un suivi expérimental longitudinal s'étendant sur une période de 83 à 138 jours, incluant des épreuves comportementales ou physiologique quotidiennes et divers traitements pharmacologiques temporaire. Le suivi phénotypique repose sur des sessions comportementales journalières de 5 à 45 minutes, durée optimisée pour garantir la robustesse des données, complétées dans certains cas par une évaluation de l'activité du système nerveux autonome sur des périodes de 5 minutes. En fonction des objectifs expérimentaux, l'activité neuronale sera ponctuellement mesurée par photométrie de fibre lors de deux à trois sessions stratégiques réalisées avant et après les traitements. Une chirurgie stéréotaxique unique, avec ou sans manipulation du nerf vague, sera pratiquée sur 615 individus pour permettre l'implantation de dispositifs de neuro-ingénierie. Les protocoles d'administration incluent des traitements chroniques par voie orale via l'eau de boisson, tels qu'une antibiothérapie de 15 jours ou une supplémentation en corticostérone, lithium ou fluoxétine sur 28 jours. Des interventions plus aiguës seront également pratiquées, comprenant des injections intra-péritonéales répétées de diazépam sur 4 jours ou de PCPA sur 7 jours, ainsi que deux gavages du microbiote de patients alcooliques espacés d'une semaine.

Impact sur les animaux

Le projet, impliquant un total de 735 souris, présente des degrés de sévérité allant de léger à sévère selon la nature des interventions. Afin de ne pas interférer avec le développement des phénotypes anxio-dépressifs recherchés, tous les animaux ne bénéficieront d'aucun enrichissement environnemental. Une partie de la cohorte est dédiée à la modélisation des troubles affectifs. Les animaux témoins sont soumis à des injections intra-péritonéales et à des tests comportementaux dont le stress transitoire, lié à la manipulation est classé en sévérité légère. Les animaux expérimentaux subissent, en complément, un protocole de stress chronique par supplémentation de corticostérone dans l’eau de boisson. Ce traitement, visant l'induction d'un phénotype anxio-dépressif stable, porte le degré de nuisance à modéré. Pour l'étude des circuits neuronaux, des groupes d'animaux subissent une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale afin d'injecter des rapporteurs calciques et d'implanter des fibres optiques. Le suivi par photométrie de fibre impose un couplage physique à un câble optique lors des tests, pouvant induire une gêne motrice. En raison du caractère invasif de la chirurgie et des contraintes liées aux enregistrements longitudinaux, ces interventions sont classées en nuisances modérées. Dans certains protocoles, l'ajout d'une étape de punition par chocs électriques de faible intensité — bien qu'évitables par l'animal — renforce cet état de stress, maintenant la classification en sévérité modérée. Les procédures liées à la consommation volontaire d'alcool atteignent un degré de nuisances sévères en raison du cumul de plusieurs facteurs de stress chroniques. Aux stress des tests comportementaux, de la chirurgie stéréotaxique, des enregistrements de photométrie et gavage ; s’ajoute l’isolement social. Les animaux sont logés individuellement pendant cinq semaines. Ce mode d'hébergement individuel est choisi pour faciliter l'auto-administration d'éthanol et exacerber les phénotypes anxio-dépressifs au sevrage.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées en fin d'expérience pour collecter et analyser ultérieurement leurs cerveaux et/ou organes périphériques (foie, intestin).

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. Le modèle animal reste le seul recours pour comprendre les mécanismes neuronaux intégrés tels que ceux sous tendant les altérations émotionnelles, cognitives et physiologiques dans l’anxiété, la dépression avec ou sans conduites suicidaires et le mésusage d’alcool et qui ne peuvent être modélisés in vitro ou in silico à ce jour.

Réduction

Le projet s’inscrit dans une approche de réduction et de raffinement des procédures d’évaluation des comportements de type anxieux et dépressif. Il se propose de vérifier la stabilité des comportements d’échappement Pavlovien ou opérant au cours de tests répétés. Une telle configuration permet l’utilisation des mêmes animaux pour l’évaluation de différentes stratégies thérapeutiques qui nécessiterait autrement l'utilisation d’un plus grand nombre d’animaux avec les outils actuels. Le nombre d’animaux pour chaque expérience a été choisi de manière à concilier la réduction du nombre d’animaux utilisés, tout en conservant un pouvoir statistique suffisant pour une interprétation raisonnable des données. Les études de traitements pharmacologiques sur le comportement et les activités physiologiques au niveau central et autonomique sera fait entre groupes et au sein du même groupe ce qui ne peut se faire d’après nos propres expériences et de la littérature qu’avec des analyses statistiques sur des populations d’un minimum de 15 souris par groupe.

Raffinement

Les évaluations émotionnelles, autonomiques et cognitives dans ce projet sont beaucoup moins invasives que les procédures équivalentes qui existent à ce jour. La plupart des procédures présentées ici remplacent les stimulations aversives par choc électrique par des stimulations sonores désagréables mais non douloureuses. Les évaluations autonomiques sur animal éveillé utiliseront un système non invasif récemment mis au point, remplaçant les enregistrements par capteur à demeure implanté sous anesthésie par des enregistrements par contact des pattes sur une grille, permettant ainsi de se dispenser de chirurgie d’implantation. De plus, en comparant l'état général du bien-être des souris avec les enregistrements non invasifs de leur activité autonomique, ce projet permettra d'évaluer la pertinence de cette dernière comme indice précoce d'une détérioration du bien-être animal Pour évaluer le bien-être des animaux, le suivi clinique quotidien sera évalué par un score de 0 à 2 pour chacune des 5 composantes suivantes : apparence (qualité du poil, propreté des yeux et du nez), posture et mobilité, comportement dans la cage d’hébergement et signes cliniques comme présenté dans l’annexe 1. Lorsque le total des différents scores sera supérieur à 8, il sera considéré que les animaux ont atteint un point limite et seront sacrifiés pour mettre fin à leur souffrance. La décision est prise par le responsable du projet en accord avec la structure chargée du bien-être de l'établissement utilisateur où sont hébergés les animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris adulte comme modèle biologique repose sur les fortes homologies anatomiques et fonctionnelles du système nerveux central entre les rongeurs et l'Humain. Ces similitudes, conservées au cours de l'évolution des mammifères, concernent tant la diversité des populations cellulaires cérébrales que les processus moléculaires sous-jacents aux fonctions supérieures. Le modèle murin constitue ainsi un outil translationnel de référence pour l'étude des mécanismes cellulaires et le développement de stratégies pharmacologiques ciblant les altérations émotionnelles, cognitives et décisionnelles. Le choix de la souris adulte est ici impératif, ce stade de maturité étant le seul à garantir l’expression complète et stable du répertoire comportemental complexe (anxiété, dépression, processus décisionnels). L’utilisation exclusive d’animaux adultes permet ainsi d’étudier des mécanismes physiopathologiques pleinement établis.

Deux chirurgies sous anesthésie générale, la seconde onze jours après la première, puis des séances d'observation comportementale : 376 rats vont être utilisés pour tester douze molécules antidépressives de synthèse, tous tués à l'issue pour que leurs cerveaux soient prélevés. 328 d'entre eux sont déclarés en gravité sévère, 48 en gravité modérée. Le porteur écrit pourtant qu'"aucune nuisance n'a été rapportée" avec la technique d'administration continue, et que les rats opérés "ne présentent aucune altération comportementale caractéristique d'un stress, d'une souffrance ou d'un inconfort particulier". Les deux tests comportementaux sur lesquels repose tout le projet ne sont jamais nommés.

Objectifs

Les molécules actuellement disponibles pour le traitement de la dépression et des troubles de l'humeur sont loin d'être optimales. En effet, seuls 1/3 des patients répondent pleinement aux médicaments, et même dans ce cas, on n'observe une amélioration thérapeutique qu'après plusieurs semaines d'administration continue, un problème qui peut s'avérer crucial, notamment dans les cas de crise suicidaire. Sur la base de travaux menés durant les 20 dernières années, nous avons récemment proposé la création d’une nouvelle classe de molécules antidépressives, susceptibles de présenter à la fois un meilleur taux de réponse et une rapidité d’action 5 à 10 fois plus importante que les molécules classiques. Grâce à une collaboration avec un laboratoire de chimie organique nous avons mis en place un processus de synthèse chimique et obtenu un petit nombre de molécules correspondant au design théorique que nous avions proposé. Les tests de validation in vitro ont montré que ces composés correspondaient au profil ciblé. Suite à ces travaux préliminaires, nous avons lancé un programme de synthèse de molécules plus ambitieux en termes de nombre (12 composés sont planifiés), et plus précis encore dans le ciblage des profils pharmacologiques. Le présent projet vise à valider le potentiel d’antidépresseur rapides de ces nouvelles molécules chez le rongeur. Pour cela, nous confirmerons la non-toxicité de ces médicaments potentiels en suivant en détail l’état de santé d’une petite cohorte d’animaux, puis nous procèderons à deux tests comportementaux. Le premier de ces tests permet de détecter si un composé donné a un potentiel d’antidépresseur, mais il ne donne pas de renseignement sur la vitesse d’apparition d’un éventuel effet. Le second est précisément connu et validé pour permettre de mesurer cette vitesse.

Bénéfices attendus

Le programme auquel se rattachent ces expériences permet d’espérer qu’au moins l’une des molécules obtenues satisfasse aux conditions requises pour entrer dans un programme de développement en phase d’essais cliniques. En cas de réussite, il deviendrait alors possible à terme de proposer la mise sur le marché d’une nouvelle classe de médicaments antidépresseurs, capables d’agir plus rapidement que les molécules actuelles.

Procédures

Pour l’étude-pilote de validation, les animaux seront soumis à une chirurgie de très courte durée (3-5 min), permettant d’administrer le composé en continu. Le premier test comportemental se fait sur deux sessions séparées de 24 h. La première session dure 15 min, il s’agit d’une phase d’habituation. Le lendemain, le composé test est administré en aigu, puis l’animal est replacé dans le même test comportemental pour 5 min. Dans le second test comportemental, les animaux seront soumis à deux chirurgies, sous anesthésie générale: la première nécessaire au test comportemental en lui-même (environ 30 min par animal), la seconde 11 jours plus tard pour permettre d’administrer nos composés en continu, comme décrit ci-dessus. Puis, 3 et 14 jours après cette seconde chirurgie, les animaux seront soumis à deux séances d’observation comportementale, d’une durée de 10 min chacune. Cela revient donc à 4 interventions sur la durée de vie à la mort de l'animal pour ce test.

Impact sur les animaux

Nous surveillerons tout particulièrement les risques d’apparition d’effets secondaires indésirables dus à l’utilisation de nos nouvelles molécules sur les animaux lors de l’étude-pilote. Même si, sur la base de leurs profils pharmacologiques, il semble peu probable que de tels phénomènes se produisent, les fonctions vitales (respiration, rythme cardiaque, réflexes entre autres) seront surveillées de près durant tout le temps d’administration. Cette administration en continu des composés nécessite une chirurgie. Il s’agit d’un geste extrêmement minime effectué sous la peau du dos, qui ne nécessite d’anesthésier l’animal que durant quelques minutes : aucune nuisance n’a été rapportée suite à l’utilisation de cette technique. Le second test repose sur un autre type de chirurgie avant de passer aux expériences comportementales proprement dites. Cette dernière chirurgie provoque des douleurs modérées ; cependant, il a été montré que les rats opérés ne présentent aucune altération comportementale caractéristique d’un stress, d’une souffrance ou d’un inconfort particulier. La surveillance des animaux sera donc celle qui est classiquement mise en œuvre après une chirurgie, les risques de nuisance étant de type post-opératoire : infections, douleurs inflammatoires, réouverture de plaie.

Devenir

A l'issue de l'étude-pilote et des deux tests, tous les animaux seront mis à mort : il sera nécessaire de prélever les cerveaux pour analyser le tissu cérébral en post-mortem.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons valider, à l'aide de deux tests comportementaux, le potentiel de nos molécules comme nouveaux antidépresseurs, à action rapide. Par définition, un modèle comportemental ne peut pas s'effectuer autrement que sur le système intégré que représente un animal entier, et vivant.

Réduction

Les expériences de pharmacologie in vitro que nous avons menées en amont de ce projet nos ont permis d’éliminer 15 molécules, qui ne correspondaient pas au profil visé. Ces composés ne seront donc évidemment pas testés in vivo. Seules 12 molécules ont répondu à nos critères, elles seront synthétisées dans les quantités nécessaires pour le présent programme in vivo durant les 5 années prévues pour sa réalisation. Nous utiliserons le nombre minimal d'animaux permettant l'obtention de résultats statistiquement fiables et robustes. Pour cela, nous avons procédé à l'estimation du minimum requis pour chaque lot expérimental, en nous basant sur les acquis de travaux précédents, et sur des calculs statistiques. L’étude-pilote de validation nécessitera d’utiliser 4 animaux par cohorte ; pour ce qui concerne les tests comportementaux, nous avons déterminé qu'il sera nécessaire d'utiliser un effectif compris entre 8 et 10 animaux par lot en fonction de la variabilité propre à l’expérimentation. Nous avons ainsi établi un grand total de 376 rats nécessaires pour réaliser l’ensemble du projet.

Raffinement

En ce qui concerne le suivi des animaux, notre priorité sera de viser à favoriser au maximum leur bien être durant la totalité de l’étude. Un minimum de 14 jours d’adaptation sera appliquée à chaque animal dès leur arrivée à l‘animalerie, où ils seront placés en cages collectives par groupe de 2 individus. Lors de l’étude-pilote, leur état de santé sera examiné en profondeur de manière quotidienne. Si un effet toxique est suspecté suite à l’administration d’une des molécules prévues dans le programme, les expériences seront immédiatement arrêtées, et le produit définitivement écarté de la suite du projet. De même, une pesée et une observation quotidienne seront réalisées durant les périodes post- opératoires afin de s’assurer du bon état des plaies chirurgicales, des sutures et du bien-être général. Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux recevront un anti inflammatoire afin de lutter contre l’apparition de toute douleur éventuelle. En outre, nous utiliserons des anesthésiants locaux autour des zones opérées. Des points limites définis préalablement permettront de s’assurer que tous les animaux maintenus dans les procédures expérimentales sont dans les conditions optimales pour limiter stress, souffrance et inconfort. Si l’un ou plusieurs de ces points limites est atteint, des procédures de soin seront mises en place suivant un arbre décisionnel prédéfini, impliquant les expérimentateurs et le vétérinaire de la structure.

Choix des espèces

Le second test, qui nous permet d'évaluer la cinétique d'effet d'un traitement antidépresseur potentiel, a été validé chez le rat et n’est pas transposable à la souris. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte (entre 7 et 9 semaines), qui correspond à ce qui est classiquement choisi pour le type d’expériences que nous réalisons.

Électroporées in utero après ouverture de l'abdomen de leur mère, opérées à la naissance ou à l'âge adulte par craniotomie pour recevoir électrodes ou canules, 779 souris et 589 rats vont être utilisés, dont 184 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils développent des crises d'épilepsie spontanées ou provoquées par des injections répétées d'un agent convulsivant ou par un séjour de vingt minutes dans une enceinte chauffée, avec secousses musculaires, mâchonnements et hypersalivation. Leur activité cérébrale est enregistrée trois jours par mois, pendant un à six mois selon l'espèce. Tous sont tués pour prélever le tissu cérébral, les crises provoquées qui ne cessent pas d'elles-mêmes après cinq minutes étant stoppées par injection d'une benzodiazépine.

Objectifs

Les malformations du cortex cérébral sont à l'origine d'épilepsies pharmaco-résistantes chez l’enfant et l’adolescent. L'étude des mécanismes conduisant à ces épilepsies est un défi, car les malformations corticales sont généralement diagnostiquées seulement après les premières crises. En outre, il est impossible d'accéder directement aux changements qui se produisent dans le cerveau des patients et conduisent à l'émergence et à la progression de l'épilepsie. C’est pourquoi les organismes modèles sont essentiels pour mieux comprendre cette maladie et de son évolution, et pour développer de meilleurs traitements. Dans ce projet, nous utiliserons des enregistrements électrophysiologiques pour étudier l'activité électrique du cerveau, des analyses du transcriptome pour mesurer l'expression des gènes, ainsi que des analyses histologiques et anatomiques. Cette approche combinée, multimodale, sera appliquée chez plusieurs modèles rongeurs reproduisant des malformations corticales similaires à celles rencontrées chez l’humain, et responsables de crises d’épilepsie. Cette étude nous aidera à mieux comprendre l’évolution pathologique de l'activité cérébrale, en la reliant aux régions cérébrales impliquées et aux changements dans l'expression des gènes, à des étapes cruciales de cette évolution : avant que les crises n’apparaissent, au moment des premières crises et lorsque la maladie est établie. Notre objectif à long terme est d’identifier de nouveaux marqueurs prédictifs de la progression de l’épilepsie, ainsi que des candidats potentiels pour des thérapies ciblées visant à en infléchir l’évolution.

Bénéfices attendus

Notre objectif à long terme est de mieux comprendre les réseaux responsables des crises dans les hétérotopies de la matière grise (des malformations cérébrales responsables d'épilepsie), d’identifier de nouveaux marqueurs prédictifs de la progression de l’épilepsie, ainsi que des gènes candidats ou mécanismes potentiels pour des thérapies ciblées visant à en infléchir l’évolution. Le volet expérimental présenté ici fait partie d’un projet collaboratif au périmètre plus vaste impliquant également des études cliniques menées chez des patients, permettant ainsi un dialogue fructueux entre recherche clinique et préclinique.

Procédures

Les animaux seront soumis à interventions chirurgicales réalisées sous anesthésie/analgésie : 1) pour les femelles gestantes, laparotomie afin d’exposer les cornes utérines et procéder à la transfection par électroporation (entre 30 min et 1h) ; 2) pour les jeunes adultes et les adultes, incision de la peau et implantation des émetteurs de télémétrie entre peau et muscle, incision du scalp et craniotomie pour implantation des électrodes (2h) ; 3) pour les nouveau-nés et juvéniles, incision du scalp et craniotomie pour mise en place de canules pour délivrer des vecteurs viraux (15 à 25 min). Ces interventions sont uniques et sont associés à des soins pré-, per- et post-opératoires. Les animaux seront également soumis à des protocoles d’induction de crises d’épilepsie par des moyens pharmacologiques (injections répétées toutes les 10 min de doses sous-convulsives d’un agent convulsivant, maximum 6 doses et 1h), ou par l’hyperthermie (placement dans une enceinte chauffée pendant 20 min maximum). Lorsque ces crises induites ne cessent pas spontanément après 5 min, elles sont stoppées par injection d’une benzodiazépine. Les animaux seront également soumis à des enregistrements continus et à long terme de l’activité cérébrale réalisés sous monitoring vidéo, sur des périodes de 1-3 mois pour les souris et 4-6 mois pour les rats. Ces enregistrements sont réalisés dans la cage et l’environnement de stabulation, sans contrainte (émetteurs sans fil pouvant être allumés/éteints sans contention grâce à des transpondeurs magnétiques). Ces périodes d’enregistrement durent 3 jours par mois (4-5 sessions de 3 jours sur une période de 6 mois chez le rat ; 3 sessions de 3 jours sur une période de 3 mois chez la souris).

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir les nuisances associées aux interventions chirurgicales (laparotomie pour les femelles gestantes et l’implantation des émetteurs de télémétrie, incision du scalp et craniotomie pour implantation des électrodes et des canules), ainsi qu’à l’inconfort associé à la récupération post-chirurgie. Ces nuisances seront contrôlées par l’anesthésie et l’analgésie, ainsi que par les soins pré-, per- et post-opératoires. Les animaux vont subir des crises d’épilepsie spontanées ou induites par des moyens pharmacologiques ou l’hyperthermie. Les crises d’épilepsie spontanées du modèle rat présentant des malformations bilatérales sont des crises « absence » associées à un arrêt comportemental mais sans convulsion ni perte de conscience ni de contrôle postural. Même si elles sont très fréquentes, elles n’entrainent aucun désagrément majeur. Lorsqu’elles sont induites par des conditions favorisant leur survenue (pharmacologie, hyperthermie), les crises sont d’abord associées à des secousses myocloniques des membres et du corps, des mâchonnements, de l’hypersalivation. La phase ultime de la crise est convulsive, tonico-clonique et généralisée. Elle est associée à une perte de conscience brève et transitoire. Si les crises d'épilepsie n'entraînent pas de douleurs physiques, des blessures peuvent néanmoins survenir, liées à des chocs possibles contre les parois de l'enceinte d’observation lors des secousses myocloniques ou des convulsions. Ces blessures, très légères (ex saignements du museau suite à un choc), sont difficiles à prévenir (les parois de la cage ne peuvent pas être capitonnées afin de permettre l’observation) et ne surviennent que très rarement. De plus, les manifestations épileptiques sont peu marquées du fait de l'immaturité des animaux aux stades de développement testés (étude limitée aux stades juvéniles). La récupération post-crise fait l’objet d’un suivi attentif. Si un état de mal épileptique survient et se prolonge plus de 5 minutes, il est stoppé par injection d’une benzodiazépine. La mort de l’animal peut survenir dans de rares cas.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour prélèvement du tissu cérébral en vue d’analyses histologiques et anatomiques. Ces analyses sont destinées à confirmer la présence de malformations corticales et à mesurer leur position et étendue, ceci, notamment, afin de réaliser des corrélations anatomo-fonctionnelles. Ces analyses sont également destinées à mesurer l’étendue des régions cérébrales concernées par l’expression des protéines transduites par les vecteurs viraux ou confirmer le site d’implantation des canules ou des électrodes. Enfin, la mise à mort est nécessaire afin d’explanter, le cas échéant, les dispositifs expérimentaux utilisés pour les explorations fonctionnelles (implants de télémétrie, électrodes).

Remplacement

Une part importante des expérimentations est réalisée in vitro (principe de remplacement), sur tranches de tissu cérébral maintenue en survie artificielle lors d’enregistrements électrophysiologiques, ou pour des études transcriptomiques et anatomiques réalisées après extraction de tissu et préparation de spécimens histologiques. Les explorations fonctionnelles menées in vivo sont limitées aux explorations ne pouvant être effectuées que chez l’animal entier. C'est le cas des explorations liées aux crises d'épilepsie, qui nécessitent pour se manifester de préserver le contexte in vivo, permettant d'évaluer modifications comportementales liées à la crise, en plus de l'activité électro-clinique globale.

Réduction

Ce projet combine des approches multiples (moléculaires, anatomiques et fonctionnelles, in vivo et ex vivo) menées chez 4 organismes modèles (et des témoins) appartenant à 2 espèces de rongeurs au sein d’une même équipe de recherche (3 chercheurs, 1 post-doctorant, 1 doctorant, 2 ingénieurs), permettant une utilisation au plus juste des effectifs d’animaux soumis à expérimentation. Les estimations d'effectif sont faites en utilisant un outil d'estimation des effectifs basé sur le calcul de puissance et en tenant compte du taux de succès des expérimentations.

Raffinement

Les explorations fonctionnelles menées in vivo sont limitées aux explorations ne pouvant être effectuées que chez l’animal entier : il s’agit de l’enregistrement de l’activité cérébrale par électro-encéphalographie, pratiquée dans des conditions très semblables aux explorations effectuées chez les patients avec épilepsie (principe de raffinement). Ces enregistrements sont effectués par télémétrie, grâce à des transmetteurs télémétriques permettant des enregistrements sans contrainte ("sans fil"). Les transmetteurs utilisés permettent, en plus du suivi de l'activité électrique cérébrale, de suivre la température corporelle, l'activité motrice et le rythme cardiaque, ce qui garantit une surveillance continue des indicateurs cliniques. Enfin, une partie des animaux explorés fait l'objet d'un suivi vidéo continu pour surveiller les indicateurs comportementaux associés aux crises d'épilepsie.

Choix des espèces

Le rat est adapté aux études électrophysiologiques et comportementales, mais il n’existe que peu de rats génétiquement altérés. La transfection par électroporation (voir procédures) permet d’inactiver l’expression corticale de gènes d'intérêt de manière focale et de créer un cortex mosaïque au sein duquel une population altérée se développe dans un environnement sauvage. Il est ainsi possible de créer des modèles avec des hétérotopies sous-corticales semblables à celles des patients, comme des hétérotopies en bande ou des hétérotopies nodulaires. La souris est adaptée aux études électrophysiologiques et comportementales, et de nombreuses lignées génétiquement altérées sont disponibles, permettant l'étude des conséquences de l'invalidation d'un gène, dans un tissu ou un organe spécifique. Ici, nous étudierons 2 modèles d'hétérotopies induites par l'inactivation conditionnelle et restreinte au télencéphale dorsal de 2 gènes, par croisement avec une lignée Cre. Les 2 modèles présentent des hétérotopies sous-corticales et péri-ventriculaires semblables à celles des patients.