Système nerveux

912 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance modérée. Selon les groupes, ils subissent l'implantation chirurgicale d'une sonde respiratoire, cardiaque ou cérébrale portée sept jours, puis reçoivent de la cocaïne et du fentanyl avant des enregistrements pouvant durer jusqu'à 48 heures. L'étude vise à mieux comprendre la surmortalité des overdoses associant les deux drogues et à optimiser un antidote, application renvoyée à l'humain. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer le rat, dont le fonctionnement cardio-respiratoire serait proche du nôtre.

Objectifs

Le fentanyl est un antidouleur puissant dont le surdosage entraîne une difficulté à respirer pouvant rapidement entrainer la mort, parfois associée à une rigidité musculaire. Les données récentes montrent que les surdosages impliquant le fentanyl sont fréquemment associés à des drogues stimulantes, notamment la cocaïne. Les mécanismes d'interactions entre les drogues sur leur distribution dans le corps, sur leurs effets physiques ou comportementaux, ainsi que leur contribution à la surmortalité observée, demeurent toutefois mal caractérisés. Par ailleurs, l’efficacité d'un antidote pourrait être altérée en contexte de prise des 2 drogues en meme temps. Cette étude analysera différents effets du traitement sur l'organisme, notamment la respiration, le système nerveux et le cœur. Elle examinera également la façon dont la substance se répartit dans le corps et est éliminée, ainsi que ses effets sur le comportement. Enfin, elle évaluera son efficacité et la possibilité d'inverser ses effets a l'aide d’une antidote. L’objectif final est d’améliorer la compréhension des mécanismes de la toxicité combinée fentanyl- cocaïne et d’optimiser la prise en charge aiguë chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront d’apporter une analyse intégrée et mécanistique de la toxicité combinée du fentanyl et de la cocaïne, depuis les interactions de distribution et d'élimination jusqu’aux conséquences respiratoires, neurologiques et comportementales. En effet, les co-intoxications fentanyl- stimulant et leur surmortalité sont une problématique de santé publique majeure à l’heure actuelle. L’identification précise des déterminants de la synergie toxique et de la surmortalité associée à cette co-intoxication contribuera à une meilleure compréhension de la physiopathologie. Ces données expérimentales constitueront une base nécessaire pour optimiser l’utilisation d'un antidote en contexte d'utilisation simultanée de plusieurs drogues, affiner les stratégies de prise en charge aiguë des overdoses et, à plus long terme, orienter le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblées.

Procédures

Une première partie des animaux aura : une chirurgie sous anesthésie générale pour l’implantation d’une sonde (10 minutes), + port de cette sonde pendant 7 jours, puis une injection de drogue et une mise en enceinte de mesure respiratoire pendant 6 heures. Une deuxième partie des animaux subira : une chirurgie sous anesthésie générale (40 minutes) avec implantation d’un cathéter veineux et d’une sonde cérébrale+ port d’un cathéter et d’un guide pendant 7 jours, puis une injection de drogue et des prélèvements répétés sur animal vigile pendant 7 heures. Une troisième partie des animaux (si nécessaire en fonction des expériences précédentes) subira : une chirurgie sous anesthésie générale (35 minutes) pour l’implantation d’une sonde au niveau du diaphragme et port d’une sonde pendant 7 jours, puis une injection de drogue et un enregistrement musculaire respiratoire pendant 24 heures. Une quatrième partie des animaux (si nécessaire en fonction des expériences précédentes) subira : une chirurgie sous anesthésie générale (35 minutes) pour l’implantation d’une sonde cardiaque, + port d’une sonde et d’un cathéter de 7 jours, puis une injection de drogue et un enregistrement cardiaque sur 24 heures. Une cinquième partie des animaux (si nécessaire en fonction des expériences précédentes) subira : une chirurgie sous anesthésie générale (35 minutes) pour l’implantation d’électrodes cérébrales, port d’une sonde pendant 7 jours, puis une injection de drogue et un enregistrement de l’activité cérébrale sur 48 heures. Une sixième partie des animaux subira des administrations quotidiennes, ainsi que des taches comportementales de locomotion, perception du danger et impulsivité, avec observation seule.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront être soumis à un stress transitoire lors des manipulations et des injections. Les études fonctionnelles nécessiteront un isolement temporaire des rats dans des dispositifs expérimentaux (enceintes pour l'enregistrement respiratoire ou pour les prélèvements sanguins) pendant plusieurs heures, susceptible d’induire une contrainte environnementale modérée. Les rats seront hébergés en cage individuelle à la suite de la chirurgie jusqu'à la fin de l'experience. Un faible risque de complications locales est attendu, notamment thrombose ou infection du site d’implantation. L'administration de fentanyl pourra induire une sédation, une réduction de l'activité motrice, des modifications de la régulation de la température, une raideur des muscles, ainsi qu'une modification de la respiration. L'administration de cocaïne pourra induire une agitation, des problèmes neurologiques ou cardiaques. L’intensité et la durée de ces effets indésirables sont susceptibles de varier en fonction de la molécule administrée, des doses utilisées et des associations testées. Les taches comportementales peuvent également etre accompagnées de modifications comportementales (activité motrice augmentée avec cocaine et sédation avec fentanyl).

Devenir

Pour l’ensemble des expériences la réutilisation des animaux est impossible en raison de la récupération après le décès des appareillages de mesure, l'atteinte d'un point limite qui requiert la mise à mort des animaux et pour les taches comportementales en raison du prélèvement cérébral prévu en fin d'experience.

Remplacement

L’ensemble des expériences ne sont pas remplaçables par des expériences sur des modèles mathématiques ou sur des cellules. Le rat constitue un modèle nécessaire à cette étude en raison d’une étude des conséquences sur le système cardio-respiratoire comparable à celle de l’être humain. De plus, il offre la possibilité de caractériser le comportement en termes de distribution et d'élimination par le corps des diverses molécules, dont les différentes phases ne peuvent être pleinement évaluées qu'en utilisant des rats dont le volume sanguin est compatible à une étude longitudinale sur le même animal. Pour les études respiratoires, cardiaques et neurologiques, la pose des sondes est plus aisée sur le rat et donc les résultats seront plus reproductibles.

Réduction

Les effectifs ont été determinés selon les expériences comme nécessitant 10 à 14 rats par groupe à l’aide de tests statistiques permettant une analyse des résultats obtenus adaptée. De plus, si aucun effet ventilatoire significatif n’est observé à la suite des associations de drogues, la suite des expériences ne seront pas réalisées dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

L’ensemble des expériences sont réalisés par un personnel compétent. Pour améliorer leur bien-être, les animaux sont hébergés en groupes sociaux dans des cages contenant de l’enrichissement. La surveillance quotidienne des animaux sera assurée par un personnel qualifié, et des points limites spécifiques adaptés aux différentes experiences seront mis en place pour détecter et réduire toute souffrance ou douleur. Si nécessaire, des analgésiques seront administrés, tout en veillant à ne pas perturber le déroulement de l'expérience. En cas de besoin, des méthodes réglementaires de mise à mort anticipée seront appliquées. Toutes les interventions chirurgicales prévues dans ce projet seront réalisées sous anesthésie générale et accompagnées d'une gestion adéquate de la douleur pendant la période périopératoire. De plus, une ouate en silicone sera utilisée après la chirurgie pour favoriser une meilleure cicatrisation et une prise en charge plus rapide en cas de saignement.

Choix des espèces

Le rat, est un modèle de référence dans notre champ d’étude du fait de son fonctionnement cardio-respiratoire très proche de l'humain. En plus de sa taille adéquate qui permet une facilité et une répétition des prélèvements, son métabolisme est très semblable à celui de l’humain, ce qui facilitera la translation des données. L’objectif de ce projet étant d'appliquer les résultats à l'etre humain, les modèles animaux doivent représenter au mieux les patients auxquels s’appliqueront les résultats de celui-ci. Les données en vie réelle montrent que les intoxications aiguës aux opioïdes concernent dans la grande majorité des cas des sujets masculins et d’âge jeune inférieur à 30 ans. Des rats jeunes adultes (7 à 8 semaines) sont utilisés dans ce projet afin de disposer d’animaux ayant atteint une maturité complète, tout en conservant un fonctionnement respiratoire, cardiovasculaire et métabolique stable. Ce choix permet de limiter la variabilité liée à l’immaturité biologique observée chez les animaux plus jeunes, ainsi que les altérations de fonctionnement et les maladies chez des animaux plus âgés.

197 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance modérée, pour étudier le rôle d'un neuropeptide, la kisspeptine, dans le traitement cérébral des odeurs sociales. Chaque animal subit une neurochirurgie d'environ cinquante minutes, les femelles une ovariectomie, des frottis vaginaux et des prélèvements d'urine répétés, plus six injections avant des tests olfactifs. La chirurgie peut provoquer hémorragies, baisse de température et douleurs pendant deux à trois jours, et l'isolement sept jours avant les tests ajoute un stress. Les souris ayant reçu un traitement sont tuées pour prélever le cerveau, celles servant aux prélèvements d'urine étant tuées ou remises à d'autres chercheurs.

Objectifs

Chez la plupart des animaux, les odeurs sont cruciales pour communiquer des informations sur leur identité, leur organisation sociale, leur maturité sexuelle et leur territoire. Ces odeurs sociales sont perçues, intégrées et codées par des voies cérébrales spécifiques, afin de déclencher des comportements sociaux appropriés. Il a été montré que la kisspeptine, un neuropeptide déterminant dans le contrôle de la reproduction, ou son récepteur, sont exprimés dans deux structures cérébrales connectées participant au relai des informations olfactives. Récemment, une de ces deux régions cérébrales participant à l'apprentissage à partir d'expériences aversives, a été impliquée dans la régulation des comportements sociaux et reproducteurs chez les mammifères. Les lésions de cette structure chez les rongeurs entraînent une altération de la sensibilité aux stimuli olfactifs et provoquent une diminution de la réactivité sexuelle et un évitement des contacts sexuels. Cependant, le rôle de la Kisspeptine dans les deux structures cérébrales d’intérêt comme centres de traitement olfactif régulant les comportements sociaux reste peu compris à ce jour. L'objectif de ce projet est donc de déterminer le rôle de la Kisspeptine dans la modulation du traitement des odeurs d'attraction sexuelle par le cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de montrer que la Kisspeptine n'est pas seulement un régulateur clé de l'axe « cerveau-appareil génital » mais qu’il peut aussi agir en amont dès la transmission des odeurs. Les résultats issus de ce projet pourront potentiellement permettre d'ouvrir la voie vers l'utilisation de la Kisspeptine en voie intranasale pour la modulation des comportements sexuels chez les rongeurs de manière non invasive.

Procédures

Les neurochirurgies seront d'une durée moyenne de 50 minutes par animal. Une seule neurochirugie sera effectuée par animal. Les ovariectomies sont d'une durée de 15 minutes environ par animal. Pour déterminer le stade du cycle sexuel, les femelles auront 4 à 8 frottis vaginaux, prélévement de quelques secondes. Ces femelles seront vigiles et maintenues pendant le prélèvement. Selon les résultats des tests comportementaux, l'urine sera prelevée entre 4 à 8 fois pour chaque animal, en maintenant la souris et en massant délicatement son ventre afin de favoriser la miction dans le tube et ainsi récolter l'urine. Quelques secondes suffisent pour récolter l'urine. Chaque souris recevra au total 6 injections de traitement (Kp10, Kp54 ou contrôle) (1 fois/semaine) juste avant le test olfactif. Chaque test olfactif durera 10 minutes. Toutes les injections sous cutanées ne dureront que quelques secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l'injection des traitements ou du retrait des ovaires peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. Elle peut induire une douleur post opératoire pendant 2-3 jours essentiellement localisée au niveau du site d’incision du crâne ou des flancs. Un stress dû à la manipulation des animaux pour récolter leurs urines ou réaliser les administrations intranasales est possible. Il s’agira d’un stress aigü de quelques minutes n’induisant pas d’effet à long terme. Les animaux expérimentaux isolés 7 jours avant les tests de comportement sexuel pourront présenter du stress lié à leur hébergement solitaire.

Devenir

Tous les animaux test recevant un traitement intranasal ou dans la LHb seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures. Les animaux utilisés pour les prélévements d'urine seront euthanasiés par le personnel animalier ou mis à disposition d'autres chercheurs pour d'autres études.

Remplacement

A ce jour aucune méthode alternative non animale (in vitro et/ou de modélisation) ne peut être utilisée pour ce projet qui est dépendant de l'interconnectivité de neurones appartenant à plusieurs structures olfactives et cérébrales. Il est donc impératif d’utiliser un animal entier pour comprendre les mécanismes de transmission et de régulation interconnectant l’olfaction et les fonctions comportementales des mammifères.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum compte tenu des techniques utilisées et pour maintenir la possibilité d'une mise en évidence statistique. La taille des échantillons est définie à partir des résultats obtenus lors d'expériences précédentes effectuées par notre groupe dans le cadre de tests similaires ainsi que des tailles d'effet observé dans la littérature. Nous avons aussi tenu compte de la variabilité entre les expériences, de la prévalence comportementale, de la survie post-opératoire, et de l'efficacité des injections. Le nombre d’individu défini par groupe permet d'assurer une puissance statistique suffisant pour obtenir des résultats robustes. Dans l'optique de réduire la quantité de souris nécessaires, nous réutiliseront les mêmes animaux pour l’étude comportementale d’évitement et de préférence sexuelle. Enfin la significativité des résultats sera testée en utilisant les tests statistiques appropriés. Dans le détails, nous aurons donc besoin de 197 animaux au total, 65 animaux stimuli (15 mâles pour les comportements sexuels et collecte d'urine, 30 femelles pour la collecte d'urine et 20 femelles pour le comportement sexuel); 60 animaux pour la procédure 1 : 10 animaux pour chacun des 3 groupes et pour les 2 sexes; 72 animaux pour la procédure 2 : 12 animaux par groupe pour chacun des 3 groupes et pour les 2 sexes

Raffinement

Lors des chirurgies, les souris recevront une sédation analgésique suivi d’une anesthésie. Les animaux recevront un traitement analgésique post-opératoire par injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroidien. L’administration d'anti-inflammatoire sera poursuivie pendant 2 à 3 jours post-opératoires si nécessaire. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant les chirurgies pour éviter le dessèchement. Durant la procédure et la période de réveil, les animaux seront maintenus sur un matelas chauffant et leur température sera monitorée afin d'éviter une hypothermie. La fréquence respiratoire sera également monitorée pendant la procédure. Si une hypothermie et/ou une détresse respiratoire est observée (diminution fréquence respiratoire d’au moins 50%), l’animal recevra un antagoniste de l'anesthésique et la procédure sera interrompue. Si l’état de santé de l’animal le permet, une nouvelle tentative sera effectuée après 7 jours de récupération. Dans le cas contraire, l’animal sera euthanasié conformément aux points limites définis dans nos procédures. De plus, une surveillance quotidienne des animaux ayant subi la chirurgie sera effectuée tout au long de l'expérimentation.

Choix des espèces

Notre recherche porte sur la mise en évidence des régulations des comportements socio-sexuels induits par l’olfaction chez les mammifères. La souris est un excellent modèle animal de référence. La souris est une espèce sociale présentant des comportements socio-sexuels innés et bien décrits majoritairement régulés par les signaux olfactifs. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes qui seront âgés de 8 semaines, âge minimum de la maturité sexuelle, nécessaire à notre étude.

Opérés du crâne sous anesthésie pendant environ une heure, puis soumis à une perfusion intracardiaque qui les tue, 625 rats sont utilisés dans des procédures classées en souffrance modérée. Le projet étudie le rôle du lactate et du glucose dans la communication entre neurones et astrocytes. Le RNT évoque un inconfort transitoire et une douleur modérée après l'opération, pris en charge par un suivi visant à minimiser l'impact sur le bien-être des animaux non-humains. Le nombre de 625 rats n'est rattaché à aucune justification chiffrée dans le texte.

Objectifs

« Le cerveau fonctionne grâce aux neurones, qui communiquent entre eux au niveau de petites structures spécialisées appelées synapses. Des recherches récentes montrent que d’autres cellules, présentes dans le cerveau entre les vaisseaux et les neurones, communément appelées astrocytes, jouent un rôle important dans cette communication neuronale. Pour fonctionner, les neurones ont besoin d’énergie. Il a longtemps été considéré que le glucose était leur seule source. Mais de plus en plus de travaux suggèrent que le lactate, une molécule produite à partir du glucose par les astrocytes, pourrait aussi fournir de l’énergie aux neurones. Plus spécifiquement : l’astrocyte récupère le glucose dans le sang, le transforme en lactate, puis l’envoie aux neurones. Une fois dans le neurone, le lactate est transformé en énergie. Les neurones peuvent aussi récupérer directement du glucose. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre, dans une région précise du cerveau appelée cortex somatosensoriel primaire, quelle source d’énergie les neurones utilisent selon leur activité et donc le niveau de demande énergétique : uniquement le glucose, uniquement le lactate, ou les deux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre comment les neurones obtiennent l’énergie dont ils ont besoin pour fonctionner correctement. Les neurones utilisent normalement du glucose, mais il est possible qu’ils tirent également de l’énergie d’une molécule produite par d’autres cellules du cerveau, appelées astrocytes. Savoir exactement quelle source d’énergie les neurones utilisent est crucial pour comprendre comment le cerveau fonctionne, apprend et mémorise. Ces connaissances fondamentales permettront de mieux comprendre le fonctionnement normal du cerveau et poseront les bases pour développer, à l’avenir, des stratégies pour prévenir ou traiter des maladies où le métabolisme énergétique est altéré.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale, d'une durée d’environ 1h afin d’identifier la source d’énergie dont les neurones ont besoin en fonction de leur activité. Ils seront ensuite soumis à une perfusion intra cardiaque après injection d’anesthésiques. La sévérité de la procédure est modérée.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient ressentir un inconfort transitoire lié à la manipulation et à la chirurgie, ainsi qu’une douleur modérée durant la période post-opératoire. Des perturbations temporaires de l’état général, comme une diminution de l’activité ou de l’appétit, peuvent également survenir. Ces effets sont limités dans le temps et pris en charge par un suivi attentif afin de minimiser l’impact sur le bien-être des animaux.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

Dans ce projet, nous étudions la communication entre les neurones et les astrocytes dans le cerveau. Ces interactions sont trop complexes pour être reproduites avec des ordinateurs ou des cellules en culture, il est donc nécessaire de travailler sur des animaux vivants. Le rat est un animal très utilisé pour comprendre le rôle des astrocytes dans la communication entre neurones et dans la plasticité du cerveau, qui est la base de la mémoire. Pour ces raisons, il n’est pas possible de remplacer les expériences animales par d’autres méthodes.

Réduction

Nous utilisons des tests statistiques pour déterminer le nombre d’animaux minimal nécessaire . Ce nombre permet de garantir des résultats fiables tout en limitant l’utilisation d’animaux. Nous avons aussi pris en compte les risques liés aux interventions, afin d’assurer la qualité des données. Au total, 625 rats sur cinq ans seront utilisés, ce qui correspond au minimum nécessaire pour atteindre nos objectifs scientifiques.

Raffinement

Des mesures de RAFFINEMENT seront mises en place durant toute la durée du projet. Des points-limites ont été établis entraînant une prise en charge de l’animal afin d’anticiper toute souffrance et réduire au mieux l'inconfort des animaux suite à la chirurgie (anesthésie, analgésie, gel oculaire lubrifiant pour protéger la cornée tapis chauffant) jusqu’à leur récupération complète.

Choix des espèces

Le rat est classiquement utilisé pour comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme et présente donc une bibliographie importante permettant de réduire le nombre d'animaux. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les rats seront réceptionnés à l’âge de 6 semaines, injecté à 7 semaines minimum puis les expériences seront réalisées à l'age de 11 à 16 semaines.

Injectées d'un composé bactérien qui provoque une inflammation généralisée, puis soumises à des tests de mesure du seuil de douleur, 440 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'inflammation induit fièvre, perte de poids et sensibilité accrue à la douleur. Le projet étudie comment cette inflammation dégrade la morphine et des neurotransmetteurs dans le cerveau. Le liquide céphalorachidien et les tissus cérébraux sont prélevés sous anesthésie, suivis d'une injection qui tue l'animal.

Objectifs

Le sepsis, résultant d’une inflammation généralisée induite par un pathogène, est à l'origine de 20% des décès mondiaux (11 millions en 2020 selon l’Organisation Mondial de la Santé). Dans 70% des cas cette pathologie entraine de nombreux problèmes neurologiques potentiellement associé à une forte dégradation de certains neurotransmetteurs dans le cerveau. Lors d’un sepsis, l’organisme réagit en augmentant l’expression des enzymes de dégradation des neurotransmetteurs (qui subissent une dégradation similaire à la morphine). Notre but est d’étudier la dégradation des neurotransmetteurs et de la morphine (qui représente un traceur de la dégradation) dans un modèle d’inflammation généralisée chez la souris. Nous voulons également déterminer si l’inhibition d’une voie intracellulaire peut restaurer des niveaux normaux de neurotransmetteurs et ainsi faciliter la guérison. MODIFICATION- Nous avons montré qu’un inhibiteur d’une voie intracellulaire diminue de 90% la dégradation de la morphine dans un modèle de culture cellulaire. Cependant, le produit de dégradation de la morphine se retrouve piégée dans les cellules. Chez la souris, l’administration de cet inhibiteur améliore considérablement l’effet analgésique d’une faible dose de morphine dans un modèle d’inflammation généralisée induit par un composé pathogène bactérien. Un de nos buts est d’étudier la dégradation de la morphine et des neurotransmetteurs dans le liquide céphalorachidien dans notre modèle inflammatoire traité ou non avec l’inhibiteur de la dégradation.

Bénéfices attendus

Notre but est de définir si une inflammation généralisée induite par un composé pathogène bactérien provoque une dégradation accrue de la morphine et donc une diminution de ses effets antidouleurs. Par ailleurs, nous voulons identifier les neurotransmetteurs également dégradées et déterminer si l’inhibition d’une voie intracellulaire spécifique ou une délétion génétique peut être bénéfique lors d’une inflammation généralisée. Une telle démonstration permettrait d’envisager de nouveaux traitements contre les conséquences de la neuroinflammation induite par le sepsis. Ces travaux détermineront quels neurotransmetteurs sont plus dégradées et si l’utilisation d’un inhibiteur de la dégradation peut normaliser leurs taux et une favoriser une guérison. -MODIFICATION- Ce projet a aussi pour but de vérifier que le l’inhibiteur provoque une séquestration des molécules dégradées dans les cellules empêchant son élimination du cerveau. Les prélèvements de liquide céphalorachidien permettront d’étudier l’effet de l’inhibiteur sur la dégradation de morphine et de neurotransmetteur ainsi que leur élimination cérébrale.

Procédures

16 groupes de souris subiront des injections de substances sur animal vigile (30sec) et 8 groupes auront des tests de mesure du seuil de douleur (25sec) et 4 groupes d’animaux auront un test de comportement locomoteur (10min). Les 16 groupes auront une chirurgie terminale sur animal anesthésié (10min). Modification : un prélèvement sur animal anesthésié d'une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Notre modèle d’’injection de composé pathogène bactérien chez la souris induit une inflammation aiguë (protocole d'une durée de 48h). Elle peut être associée à une fièvre et une perte de poids transitoires chez les animaux. Par ailleurs, ce composé pathogène ne provoque pas de douleur mais induit une sensibilité accrue à la douleur. Il peut également induire une diminution de l'activité locomotrice et des diarrhées. - MODIFICATION - Les injections induiront un stress léger lié à la contention, ainsi qu'une douleur aigue liée à la piqure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour obtenir des fluides biologiques et des tissues cérébraux à analyser en spectrométrie de masse .

Remplacement

Nos études utilisant des cultures cellulaires ont montré qu’une stimulation avec un composé pathogène bactérien augmentait la dégradation de la morphine et qu’un inhibiteur spécifique abolissait cette augmentation. Cependant, les cultures cellulaires ne reflètent pas la complexité du cerveau qui comporte de nombreux types cellulaires qui interagissent. Il en est de même pour les cultures organotypiques. Chez la souris, l’injection d’un composé pathogène bactérien induit une neuroinflammation ponctuelle qui provoque une diminution de l’activité motrice, ainsi qu’une sensibilité plus forte au stimulation thermiques, deux paramètres qui ne peuvent pas se mesurer sur des cellules en culture ou des cultures organotypiques. Le but du projet est de montrer que, chez la souris, l’augmentation des enzymes de dégradation diminue les quantités de morphine et de certains neurotransmetteurs en conditions inflammatoires. Ainsi, nos études nécessitent des animaux car (1) les modèles cellulaires ou organotypiques ne permettent pas de caractériser l’action d’un composé sur douleur et/ou la locomotion. (2) les cultures cellulaires et organotypiques ne permettent pas de modéliser la dégradation de la morphine et des neurotransmetteurs dans le cerveau entier.

Réduction

440 animaux (160 souris mâles et 160 souris femelles C57BL/6J + 60 souris mâles et 60 souris femelles mutantes) sont nécessaires aux études statistiques. En effet, nos études antérieures ont montré que des effectifs de 10 animaux par groupe sont nécessaires pour observer l’effet d’un traitement analgésique. De plus, un effectif de 10 nous permet d’écarter un animal en cours de procédure (suite à des blessures consécutives à des bagarres ou d’un problème technique) sans impacter la robustesse de l’étude. Si ces éléments ne sont pas anticipés, une nouvelle étude avec tous les groupes contrôles devra être rajoutés ce qui va à l’encontre du principe de réduction du nombre d’animaux. Les expériences sont réalisées en plusieurs lots avec un maximum de 40 animaux répartis sur les différentes conditions. MODIFICATION- un groupe de 80 animaux a été rajouter pour réaliser les études sur le liquide céphalorachidien.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec des objets (tunnel transparent pour la manipulation, frisure et carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation, bâtons de bois à ronger) pour réduire leur stress et stimuler leur interaction sociale. Avant chaque procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur et au test (i.e., pièce et ambiance sonore du test, matériel utilisé lors du test) est réalisée durant 14 jours. Par ailleurs, des indicateurs du bien-être des animaux ont été établies pour chacune des procédures réalisées et des points limites ont ete etablis pour soustraire l'animal a la souffrance. MODIFICATION - Les prélèvements de liquide cephalorachidien seront effectuées sous anesthésie générale. Les souris recevront, en fin de prélèvement, une injection entrainant leur mort. Tout au long de l’étude, une formation continue en expérimentation animale ainsi que le suivi constant de la littérature permettent d'intégrer tout nouvel élément contribuant au bien-être animal.

Choix des espèces

Dans notre cas, l’utilisation du modèle de la souris permet une comparaison avec les autres études précédemment effectuées. En effet, 70% des études portant sur l’analgésie aux opiacés et les modèles inflammatoires induit par le LPS sont réalisées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de la souris est cohérente avec nos derniers travaux sur l’effet de la morphine et de son métabolisme ainsi que sur les résultats préliminaires obtenus sur le modèle de douleur neuropathique. Nous nous sommes focalisé sur cette espèce car c’est le prérequis avant une application des hypothèses chez l’homme qui possède des voies métaboliques similaires. Le modèle de souris jeune adulte reste la référence dans les études précliniques. Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines afin d’avoir des animaux qui sont physiologiquement matures. D’autre part, la mise en place du SNC et du système opioïde est uniquement mature chez l’adulte.

Les souris qui montrent les premiers signes moteurs, une démarche saccadée, sont mises à mort avant que la paralysie ne les empêche de se nourrir. 312 souris génétiquement modifiées sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit dans le cerveau, par chirurgie sous anesthésie, une inoculation d'agrégats d'alpha-synucléine humaine qui reproduit une forme de maladie de Parkinson ou d'atrophie multisystématisée et conduit à la paralysie. Le porteur indique comparer douze formes de la protéine agrégée pour relier leur structure à la sévérité de la maladie, la mise à mort servant à prélever et analyser le cerveau.

Objectifs

L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions du cerveau des patients atteints de maladie de Parkinson ou d’atrophie multisystématisée, où elle se présente sous une forme agrégée. De structures différentes selon les maladies, ces agrégats sont associés à une gravité particulière dans le cas de l’atrophie multisystématisée, rendant les patients rapidement dépendants d’un fauteuil roulant et avec une survie inférieure à 10 ans. Le projet vise à disposer d’échantillons cérébraux de souris modifiées génétiquement, avec des lésions bien identifiées et caractérisées, afin de pouvoir analyser à très haute résolution la structure spatiale de la protéine alpha-synucléine formée lors de l’apparition de la maladie induite par un panel de différents agrégats d’alpha-synucléine inoculés à la souris. Le but est de mieux comprendre les relations entre structures moléculaires de la protéine et sévérité de la maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires pathologiques de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et de la structure à l’échelle atomique de la protéine pathologique. Il s‘agit en particulier de mieux comprendre pourquoi l’atrophie multisystématisée présente, parmi les différentes maladies associées à cette même protéine, une gravité particulière aboutissant en quelques années seulement à la mort des patients.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris modifiées génétiquement à l'âge de 6-8 semaines, réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 312 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes. Aucun prélèvement n’est réalisé du vivant de l’animal.

Impact sur les animaux

Les animaux font l’objet d’une inoculation réalisée sous anesthésie générale et locale. Ces inoculations peuvent induire de faibles pertes de poids et un faible risque d’infection au site d’incision chez les souris. Réalisées afin de reproduire la maladie humaine, ceci entraîne l’apparition précoce des premiers signes cliniques moteurs qui se manifestent par une démarche saccadée de l’animal. La confirmation de ces premiers signes cliniques détermine la décision de mise à mort des animaux selon une grille de scoring, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur qui empêcherait l’animal de se nourrir et boire à volonté.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’expression d’une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine chez les souris modifiées génétiquement utilisées dans ce projet conduit irrémédiablement à une paralysie, survenant plus précocément suite à l’inoculation d’alpha-synucléine sous forme agrégée. Leur mise à mort est ainsi réalisée dès l’apparition des premiers signes cliniques, permettant de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition de signes cliniques neurologiques et la pathologie cérébrale, ainsi que la structure de la protéine qui s’accumule dans le cerveau lors de la maladie. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les 12 groupes expérimentaux, correspondant à 12 formes d’alpha-synucléine agrégée différentes, sont constitués chacun de 26 souris adultes, mâles et femelles. Dans chaque groupe expérimental 14 souris sont prévues afin de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d’incubation, des lésions et des caractéristiques biochimiques de la protéine présente dans le cerveau. Les 12 autres souris sont prévues pour extraire et purifier cette protéine afin d’étudier sa structure spatiale à très haute résolution.

Raffinement

Les inoculations dans le cerveau sont réalisées sous anesthésies générale et locale, après administration d’un antalgique, afin de limiter la douleur. Les animaux sont maintenus sur tapis chauffant pour lutter contre l’hypothermie. Les animaux sont hébergés en cages ventilées par groupes de 5 mâles ou 5 femelles, suivis quotidiennement, et les enrichissements présents dans la cage, comme les cachettes et les éléments de nidification, sont doublés en cas de conflits dans la cage. L’expérience des zootechniciens permet de repérer rapidement les souris qui présentent les premiers signes de déficits moteurs, se traduisant par une démarche saccadée et un déséquilibre, selon une grille de score adaptée à ce modèle de souris. Ceci permet d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris âgées de 6-8 semaines, dans lesquelles l’expression d’alpha-synucléine humaine permet les comparaisons des durées de survie et des caractéristiques de la maladie. Seule cette lignée de souris particulière permet aujourd’hui à la fois la reproduction d‘une diversité des pathologies et de leurs sévérités, telle qu’elle existe chez l’homme, et une analyse structurale de la protéine en cause.

Pour étudier une région du tronc cérébral impliquée dans la douleur chronique, 528 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Une partie subit une chirurgie qui induit une douleur neuropathique, une autre des injections provoquant un modèle de fibromyalgie, et une chirurgie stéréotaxique d'environ une heure trente cible des neurones précis. Le résumé insiste sur l'analgésie et le suivi mis en place, tout en décrivant des modèles conçus pour maintenir une hypersensibilité douloureuse. Les tissus cérébraux sont prélevés après la mise à mort, une étape que le porteur juge "indispensable" pour vérifier le ciblage.

Objectifs

La douleur chronique touche des millions de personnes dans le monde et altère profondément la qualité de vie. Elle s'accompagne fréquemment de comorbidités invalidantes tels qu’une fatigue excessive et des troubles de l’humeur (anxiété, dépression) contribuant à une aggravation du tableau clinique. Malgré son impact considérable, les mécanismes cérébraux impliqués dans l'installation et le maintien de ces états douloureux persistants restent insuffisamment compris, et les traitements disponibles demeurent souvent inefficaces. Ce projet s'intéresse à une région du tronc cérébral impliquées dans le traitement des expériences aversives et la régulation de l'humeur via un contrôle inhibiteur sur les circuits dopaminergiques du cerveau. Des travaux récents suggèrent que cette région s'active en réponse à la douleur et que réduire son activité pourrait atténuer certaines réponses douloureuses. Cependant, son rôle dans la douleur chronique reste peu étudié. Afin de mieux comprendre le rôle de cette région, nous avons choisi d'explorer deux grandes formes de douleur chronique aux mécanismes distincts : la douleur neuropathique, causée par une lésion du système nerveux (comme dans certaines douleurs post-traumatiques ou post-chirurgicales), et la fibromyalgie, une maladie caractérisée par une douleur diffuse et persistante sans lésion identifiable, pour laquelle les options thérapeutiques sont aujourd'hui particulièrement limitées. Nous cherchons à déterminer si diminuer l'activité de cette région peut atténuer certaines manifestations de ces douleurs chroniques, telles que l'hypersensibilité à la douleur et les altérations émotionnelles associées. Pour cela, nous utilisons des souris génétiquement modifiées permettant de cibler et de réduire temporairement l'activité des neurones de cette région, puis nous évaluons l'impact de cette manipulation à l'aide de différents tests comportementaux utilisés pour étudier les symptômes liés à la douleur chronique. Ces travaux apporteront des données inédites sur l'implication de cette structure cérébrale dans différentes formes de douleur chronique. Si son implication dans ces processus est confirmée, cette région pourrait représenter une cible thérapeutique nouvelle et prometteuse pour des pathologies encore trop souvent insuffisamment soulagées.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des données causales et spécifiques sur le rôle d'une région du tronc cérébral dans la douleur chronique. En combinant des modèles de douleur neuropathique et de fibromyalgie avec une approche permettant d'agir de façon ciblée sur les neurones de cette région, ces travaux permettront de déterminer si inactiver cette structure contribue à réduire l'hypersensibilité à la douleur, la fatigue et les troubles émotionnels associés. Sur le plan translationnel, si l'implication de cette région est confirmée, elle pourrait représenter une cible thérapeutique nouvelle pour des pathologies encore insuffisamment traitées.

Procédures

Une partie des animaux subira une courte intervention chirurgicale sous anesthésie générale (environ 30 minutes) permettant d'induire un modèle de douleur neuropathique. Une autre partie recevra des injections (durée :

Impact sur les animaux

Les interventions chirurgicales peuvent entraîner une gêne passagère et une légère perte de poids, généralement résorbées en quelques jours. Les animaux bénéficient d'une analgésie adaptée et d'un suivi attentif jusqu'à récupération complète. Les modèles utilisés induisent une hypersensibilité à certaines stimulations, reflétant les symptômes étudiés. Les animaux conservent leur mobilité et leur accès libre à la nourriture et à l'eau. Les manipulations peuvent générer un léger stress, limité par une habituation progressive des animaux à l'expérimentateur et à l'environnement de test avant le début des expériences. Les effets liés aux manipulations et aux chirurgies sont modérés et transitoires. Les phénotypes douloureux induits, bien que persistants par nature, restent d'intensité modérée et font l'objet d'une surveillance quotidienne.

Devenir

À l'issue des expériences, les animaux sont euthanasiés sous anesthésie profonde afin de permettre le prélèvement et l'analyse des tissus cérébraux. Cette étape est indispensable pour vérifier que la région du tronc cérébral ciblée a bien été atteinte lors de la chirurgie stéréotaxique.

Remplacement

Les objectifs de ce projet nécessitent d'étudier simultanément la sensibilité à la douleur, les performances motrices, la fatigue et les comportements émotionnels dans un organisme vivant et vigile. Ces dimensions ne peuvent pas être reproduites par des approches in vitro ou in silico, qui ne permettent pas de rendre compte de l'intégration de ces différentes composantes par un système nerveux central intact. Par ailleurs, la région cérébrale étudiée n'a été identifiée et caractérisée que chez les mammifères, ce qui ne permet pas d'utiliser des organismes non-mammifères. L'utilisation de la souris est en outre indispensable car elle permet, grâce à une lignée transgénique spécifique, de cibler sélectivement les neurones de cette région (ce qui n'est pas réalisable avec d'autres espèces à ce jour).

Réduction

Les expériences sont conçues de façon à utiliser le nombre minimal d'animaux nécessaire. Ce nombre a été calculé au plus juste en s'appuyant sur les données disponibles dans la littérature scientifique et sur des méthodes statistiques reconnues, tout en tenant compte des variations naturelles entre individus. Afin d'éviter toute expérience inutile, une phase préliminaire permet d'identifier les tests et les moments les plus pertinents avant de réaliser les expériences principales, limitant ainsi le nombre total de manipulations. Enfin, les expériences sont réalisées par petites séries successives, avec des bilans réguliers permettant d'arrêter dès que les résultats obtenus sont suffisants (sans nécessairement utiliser le nombre maximal d'animaux prévu.

Raffinement

Les souris sont hébergées en petits groupes dans des cages enrichies, contenant des tunnels, du coton, des bâtonnets à ronger et du matériel de nidification, afin qu'elles puissent se reposer, explorer et exprimer des comportements naturels. Avant toute expérience, les animaux sont habitués progressivement à l'expérimentateur, aux salles et aux dispositifs de test, afin de réduire le stress pouvant être associé à un environnement nouveau ou aux manipulations. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie et analgésie, et l'état de chaque animal est surveillé attentivement après l'intervention pour vérifier sa bonne récupération. Une alimentation enrichie est mise à disposition durant cette période. Les sessions expérimentales sont courtes et espacées de périodes de repos afin d'éviter la fatigue. Des seuils limites stricts sont appliqués lors des tests impliquant des stimulations afin d'éviter toute exposition excessive. Des points limites sont définis pour chaque procédure afin de garantir le bien-être des animaux : tout animal les atteignant ou présentant des signes de détresse fait l'objet d'une interruption immédiate des expériences et d'une prise en charge vétérinaire. L'état général de chaque animal est surveillé quotidiennement tout au long du projet. Toute nouvelle méthode validée permettant d'améliorer le confort des animaux ou de réduire la douleur sera intégrée au projet dès qu'elle sera disponible.

Choix des espèces

Le protocole requiert des souris génétiquement modifiées permettant de cibler spécifiquement les neurones de la zone étudiée ; cette ressource n’existe pas de façon équivalente dans d’autres espèces utilisables. Les études exigent des systèmes nerveux matures : les animaux seront adultes (en général ≥ 8 semaines en début de procédure, et ≤ 12 mois en fin de procédure), afin d’éviter les effets liés au développement ou au vieillissement.

12 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, l'un des plus gros effectifs du lot. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale sous anesthésie, soit pour injecter une substance et implanter du matériel sur la tête, soit pour opérer des embryons chez des femelles gestantes, soit pour coudre une paupière et priver l'animal de la vue d'un œil. Une partie est ensuite entraînée à des tâches pendant des séances d'enregistrement de l'activité cérébrale. Les organes sont prélevés après la mise à mort, l'effectif de plus de douze mille souris restant sans justification dans le résumé.

Objectifs

Le cerveau est composé de nombreux types de neurones, organisés en réseaux qui remplissent différentes fonctions selon leur emplacement. Certaines zones du cerveau traitent les informations sensorielles de base, comme la vue ou le toucher, tandis que d’autres zones interviennent dans des tâches plus complexes, comme la réflexion ou la prise de décision. Cette organisation influence la façon dont le cerveau apprend et s’adapte, notamment pendant certaines périodes clés du développement. Dans notre projet, nous cherchons à comprendre comment différents types de neurones interagissent dans plusieurs régions du cerveau de la souris, en particulier quand l’animal perçoit son environnement ou réalise des tâches. Pour cela, nous utilisons des souris modifiées génétiquement permettant d’étudier différents types de neurones, et différentes techniques, comme l’injection de substances spécifiques, l’observation de l’activité cérébrale ou la manipulation de certains neurones. Ces méthodes nous permettront de voir comment les réseaux du cerveau changent et influencent le comportement. L’objectif final est de mieux comprendre comment la diversité des neurones et de leurs connexions contribue au fonctionnement du cerveau et à l’apparition de certaines maladies.

Bénéfices attendus

Au niveau scientifique ce projet pourrait permettre d’obtenir des connaissances fondamentales sur les fonctions cérébrales et par conséquent aider à comprendre les mécanismes sous-jacents à certains troubles neurologiques et psychiatriques. A plus long terme ce projet pourrait donc contribuer à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces pathologies et par conséquent améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Tous les animaux auront une chirurgie réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée (une fois, durée 1h maximum). Les chirurgies consisteront soit à injecter une substance au niveau du cerveau pour induire des modifications génétiques puis implanter du matériel sur la tête de l’animal, soit à opérer des femelles gestantes pour réaliser ces mêmes injections chez leurs embryons, soit à induire une déprivation sensorielle par la fermeture d’un œil. Une partie des animaux ayant reçu l’injection participeront ensuite à des expériences d’enregistrement de l’activité cérébrale. Pour cela ils seront entrainés à raison de 3 séances par jour pendant 1 semaine en augmentant progressivement le temps de chaque séance (de quelques minutes à 1h). Ils réaliseront ensuite soit 1 séance unique de 2.5h (procédure 4) soit 1 séance d’enregistrement de 45 minutes par jour, avec 4 séances par semaine, pendant 2 mois maximum (procédure 3). Les animaux faisant la séance unique devront être anesthésiés avant les enregistrements pour mettre en place le dispositif d’enregistrement nécessaire pour enregistrer l’activité cérébrale (une fois, sous anesthésie générale, durée inférieure à 15 minutes). Une autre partie des animaux ayant reçu l’injection participera à 4 tests comportementaux vigiles répartis sur 8 semaines maximum. Le premier test permettra d’évaluer l’attrait de la souris pour la nouveauté (1 session de 10 minutes par jour pendant 4 jours). Le deuxième permettra d’évaluer la peur innée (1 session de 30 minutes maximum). Le troisième permettra d’évaluer les capacités visuelles des animaux (3 sessions de 15 minutes maximum, max 3 jours). Le quatrième permettra d’évaluer la perception de la profondeur et les réponses comportementales liées à la peur des hauteurs, un comportement inné chez les rongeurs (1 sessions de 5 minutes maximum, une fois). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire. Une partie d’entre eux sera euthanasiée au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée.

Impact sur les animaux

Les chirurgies seront associées à un risque de douleurs post-opératoire. Il existe un risque de légers saignements au cours de la chirurgie. Il est possible que les heures suivant la chirurgie, l'animal présente des signes d'activité spontanée réduite. Les chirurgies réalisées sur les souriceaux impliqueront également un risque de rejet par leur mère. La ligature des paupières générera une gêne et un inconfort pour les animaux en post-opératoire. L’anesthésie générale mise en place pour les chirurgies engendrera un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et de dépression cardiorespiratoire. L’implantation de matériel sur la tête des animaux pourra générer une gêne et un inconfort dus à l’encombrement spatial qu’il représente. Les tests comportementaux impliqueront un stress pour les animaux en lien avec le changement d’environnement, les tests comportementaux en eux-mêmes et la nécessité d’avoir la tête fixée pour une partie des tests. De manière générale la manipulation des animaux peut engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d’expérience soit pour réaliser des prélèvements et analyses post-mortem pour répondre à notre question scientifique, soit parce qu’il ne sera pas possible de les réutiliser en raison des manipulations génétiques déjà réalisées.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car aucun modèle artificiel ne permet de reproduire fidèlement le fonctionnement réel du cerveau. Notre objectif étant de comprendre comment différents types de neurones interagissent dans plusieurs régions du cerveau, il est essentiel d’observer directement ces circuits dans un cerveau intact. Les cellules cultivées en laboratoire ne reflètent pas avec précision la complexité des connexions entre neurones. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie des neurones des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact il est donc nécessaire d’avoir recours à un animal vivant pour les réaliser. De plus, il n'existe aucun modèle remplaçant l'utilisation d'animaux qui permettrait d'étudier les propriétés du réseau dans le cerveau entier d’un animal vigile.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (12 700) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Notre choix des effectifs par groupe est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille de chaque groupe sera déterminée par l'utilisation de tests statistiques appropriés, y compris le calcul de puissance. La taille réelle de l'échantillon, et donc la signification statistique, dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce, avec accès à l’eau et à la nourriture en illimité et un enrichissement environnemental adapté. Ils seront observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci sera déclarée à la structure chargée du bien-être animal, au vétérinaire et à l’équipe de recherche pour mettre en place une prise en charge adaptée pour l’animal. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée. La gestion du risque d’hypothermie est assurée par l’utilisation d’un tapis chauffant thermorégulé et de chambres d’induction et de réveil chauffées. Un gel de protection oculaire sera appliqué sur les yeux des animaux anesthésiés pour éviter toute sécheresse oculaire. Le réveil des animaux sera surveillé et un suivi post-opératoire renforcé est réalisé pendant 3 jours, tous les animaux seront examinés quotidiennement. Concernant la chirurgie impliquant des souriceaux nous vérifierons de manière spécifique la bonne reprise en charge des petits par leur mère. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pendant les 24h minimums suivants la chirurgie les animaux auront accès à de l’eau gélifiée et de la nourriture directement dans le fond de la cage pour faciliter leur récupération. Les animaux impliqués dans les tests comportementaux ou les enregistrements cérébraux post-chirurgie bénéficieront d’une période de récupération de 4 jours minimum avant tout autre geste. Pour les tests comportementaux et sessions d’enregistrements les animaux auront une période d’habituation aux tests et à l’environnement de test. Ils auront également des périodes de repos entre les différents tests comportementaux. L’euthanasie médicamenteuse s’effectuera après une sédation de l’animal pour réduire le stress et la douleur qu’elle pourrait générer.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits neuronaux chez la souris sont similaires à celles d’autres mammifères. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de neurones que nous voulons étudier. Le développement du cerveau des souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Les approches expérimentales multiples réalisées chez la souris permettent une analyse complète allant du comportement jusqu’à l’activité d’un seul neurone. Les souris peuvent être génétiquement modifiées facilement (bonne connaissance de leur patrimoine génétique et outils disponibles pour le modifier) révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Ainsi, dans ce projet nous pourrons utiliser plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées nous permettant d’étudier différentes cellules spécifiques et leurs interactions. Une partie des procédures nécessitent des interventions chirurgicales qui ne peuvent être pratiquées que sur des animaux adultes, nous utiliserons donc dans ce cas des animaux de plus de 30 jours, ou de plus de 60 jours pour le cas des femelles devant être gestantes donc sexuellement matures. Nous réaliserons également nos injections pour l’induction de modification génétique sur des embryons ou des souriceaux (3 jours) afin de garantir une large diffusion de la modification dans le cerveau. Cela permet d’assurer une expression uniforme et une couverture optimale des régions cérébrales ciblées pour nos études fonctionnelles et anatomiques.

Jusqu'à cinquante examens IRM de deux heures et cent prélèvements sanguins par animal sur cinq ans, sous anesthésie répétée : 12 macaques, six à longue queue et six rhésus, sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Contrairement à la plupart des projets, ils ne sont pas tués à l'issue mais réutilisés dans de nouveaux projets après avis vétérinaire. Le porteur reconnaît que la contention et les suites de l'anesthésie peuvent nuire aux animaux et entraîner une perte de poids, et que le lithium administré peut endommager la fonction rénale. L'étude vise à développer des méthodes d'imagerie métabolique du cerveau.

Objectifs

De nombreuses pathologies cérébrales, neurodégenératives ou psychiatriques, présentent des altérations précoces du métabolisme énergétique, de la neurotransmission ou de la physiologie cellulaire notamment des gradients ioniques transmembranaires. De nouvelles approches d’imagerie par résonance magnétique à haut champ offrent des perspectives prometteuses pour l’étude non-invasive de ces processus physiologiques et biochimiques. Cette multitude d’informations pourraient aider dans la compréhension des processus physiopathologiques en cours dans de nombreuses maladies cérébrales et pour l’évaluation de nouvelles thérapies. Notre projet vise à repousser les limites de l’imagerie métabolique par RMN à travers le développement et la validation d’outils dédiés à l’IRM à haut champ, notamment les schémas d’acquisition optimisés pour les différents noyaux d’intéret en recherche biomédicale et observables in vivo. Nous mènerons des expériences chez le primate non-humain anesthésié pour développer et valider de nouveaux outils d’imagerie cérébrale. En particulier, ces outils serviront à détecter et cartographier la distribution cérébrale en lithium, un élément possédant des propriétés neuroprotectrices et régulateur de l’humeur, chez des animaux auxquels auraient été administrées un traitement aigüe ou chronique aux sels de lithium à des doses thérapeutiques. D’autre part, ces méthodes seront mises en œuvre pour étudier l’activation cérébrale chez l’animal.

Bénéfices attendus

Les méthodes validées et données de référence acquises à l’occasion de ce projet seront utiles pour aider dans la compréhension des processus physiologiques et biochimiques en condition normales et préfigurer les études de recherche biomédicale chez l’Homme par IRM à ultra-haut champ magnétique qui pourraient à terme participer à l’évaluation de nouvelles thérapies.

Procédures

Dans certains cas, des prélèvements sanguins (de quelques secondes) pourront être réalisés chez l’animal anesthésié (juste avant ou juste après l’examen IRM). Le projet prévoit des examens IRM chez l’animal anesthésié à une fréquence maximale bimensuelle et une durée typique de 120 minutes. En pratique, nous envisageons moins de 50 examens IRM et moins de 100 prélèvements sur 5 ans pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Les examens IRM sont en eux-mêmes non-invasifs. Par contre, le stress de la contention et les contrecoups de l’anesthésie peuvent être délétères entrainant une possible perte de poids. A long terme ou en cas de surdosage, les sels de lithium peuvent etre délèteres à la fonction rénale.

Devenir

Après avis favorable du vétérinaire, les animaux pourront être réutilisés dans de nouveaux projets.

Remplacement

Nos tests préliminaires seront systématiquement menés sur des objet-tests aux dimensions et caractéristiques électromagnétiques comparables à celles d’un cerveau de macaque adulte. Toutefois, aucun objet-test ne reproduit la complexité anatomique, fonctionnelle et métabolique du cerveau. Le passage par l’expérimentation animale demeure donc une nécessité.

Réduction

Nous comptons utiliser une douzaine de macaques (mâles et femelles), nombre suffisant à la mise au point de nos méthodes et à l’acquisition de données de référence. Les analyses statistiques nécessaires à la validation de nos méthodes, notamment pour l’évaluation de leur reproductibilité et l’établissement de valeurs/images de référence seront déployées. Dans la mesure du possible, nous comptons utiliser des macaques ayant déjà participé à d’autres projets de recherche afin de limiter globalement le nombre de PNH nécessaires en recherche biomédicale.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux stables. Les animaux seront anesthésiés lors des examens RMN et leurs paramètres physiologiques (température corporelle, nombre de respirations par minute) seront suivis en continu afin d’éviter tout effet négatif ou inconfort pour les animaux. Le réveil après les anesthésies est également surveillé de près pour s’assurer que l’animal récupère bien et se nourrit. Les animaux sont suivis régulièrement afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les points-limites et la structure chargée du bien-être animal et les conseils vétérinaires.

Choix des espèces

Phylogénétiquement très proche de l'homme (développement cortical et sous-cortical), le macaque permet de poursuivre le développement des méthodes préalablement mises au point chez les rongeurs dans des conditions plus proches de l'examen chez l'humain notamment en matière de résolution et d'équipement. Il s'agit d'une étape nécessaire à la validation de nos approches avant l'application chez l’Homme. Pour des raisons pratiques (équipements IRM et autres appareillages) de mise en œuvre, des animaux adultes seront examinés. Pour le macaque, dans le souci de réduire le nombre global d’animaux utilisés dans des protocoles de recherche, nous souhaitons réutiliser dans la mesure du possible des macaques adultes sains âgés de moins de 15 ans au début du projet.