Système nerveux
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Etudes moléculaires chez un nouveau modèle rat du Syndrome de Down et de la Maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent un jeûne de six heures, une pose de bague d'identification et une biopsie de l'oreille, puis un prélèvement de sang sous anesthésie avant d'être tués pour des analyses moléculaires post-mortem. Le projet vise à caractériser une nouvelle lignée de rats reproduisant la trisomie 21 et la maladie d'Alzheimer, le porteur avançant que ce modèle pourrait éclairer les mécanismes des deux pathologies. Sur le remplacement, il affirme qu'"aucune alternative" n'existe et que l'étude du cerveau exige un organisme vivant étudié dans sa globalité.
Objectifs
Le Syndrome de Down (SD) ou Trisomie 21 touche 1 naissance sur 800 et représente la forme la plus fréquente de retard mental. Par ailleurs, les personnes atteintes du SD développent de nombreuses comorbidités parmi lesquelles la maladie d’Alzheimer (MA). Nous venons ainsi de créer un tout nouveau modèle de rats du SD pouvant également être utilisé pour étudier le développement de la MA. Ce dernier pourrait notamment contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique du SD, ainsi qu’à l’identification de mécanismes impliqués dans le développement de la MA dans ce contexte du SD. L’objectif de ce projet est donc de réaliser une première caractérisation de ce modèle grâce à des analyses moléculaires effectuées sur des échantillons de sang/plasma ainsi que sur le cerveau. Les résultats de ces analyses sont sensibles à la prise alimentaire des animaux. De ce fait, il est nécessaire de réaliser une mise à jeun des animaux afin de contrecarrer les effets de la prise alimentaire, cette dernière étant très aléatoire d’un individu à l’autre. Les animaux seront donc soumis à une privation alimentaire avant d’effectuer un prélèvement sanguin qui sera réalisé sous anesthésie générale.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de caractériser un nouveau modèle de rats du SD. Les bénéfices potentiels de ce projet sont multiples (i) une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques du SD, (ii) une meilleure compréhension du rôle de l’interaction 2 gènes dans le développement de la MA dans le SD, l’un de ces gènes étant connu pour son implication dans le SD et l’autre dans la MA et (iii) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de la MA dans le SD. Par ailleurs, les mécanismes identifiés pour le développement de la MA dans le SD pourraient également s’appliquer aux personnes de la population générale affectées par la MA. Par la suite, cela pourrait potentiellement permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le SD et la MA.
Procédures
Dans le cadre de cette étude, les animaux seront soumis à une privation alimentaire en vu d’une mise à jeun. Cette privation alimentaire sera d’une durée de 6h. Elle sera réalisée une seule fois par rat et sur la totalité des animaux du projet, soit 24 rats. Ces animaux seront ensuite anesthésiés pour pouvoir réaliser un prélèvement sanguin. Pour cela, un mélange anesthésique sera administré par voie intrapéritonéale, cette injection est réalisée en 1 à 2 mins par rat. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé, il se fait en 1-2 mins. A noter que l’injection d’anesthésique et le prélèvement de sang sont réalisés qu’une seule fois par rat. Par ailleurs, les animaux seront soumis à la pose d’une bague à numéro unique permettant de les identifier, ainsi qu’au prélèvement d’une biopsie d’oreille afin de déterminer quels animaux sont porteurs de la modification génétique. Ces deux actes sont réalisés une seule fois par animal et de façon successive en 2-3 mins.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à une privation alimentaire afin de réaliser une mise à jeun. Cette privation alimentaire peut induire un stress léger chez l’animal. Par ailleurs, le prélèvement sanguin nécessite d’anesthésier l’animal au préalable via une injection d’anesthésique par voie intrapéritonéale. Cette injection n’induit qu’une douleur minime et très brève au site d’injection liée à l’introduction de l’aiguille. Elle peut également induire un stress de courte durée chez l’animal du fait de la contention nécessaire pour pouvoir effectuer l’injection. Concernant la pose d’une bague à numéro unique et du prélèvement d’une biopsie d’oreille, ces deux actes, réalisés de façon successive, ne génèrent qu’une douleur minime et un stress léger chez l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux prévu dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir réaliser des analyses moléculaires en post-mortem.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo.
Réduction
Cette demande concerne la réalisation de prélèvements sanguins et du cerveau sur des animaux mis à jeun en vu de réaliser des analyses moléculaires. Le recul et les connaissances que nous avons sur la mise en œuvre de ces analyses nous permettent d’estimer que le nombre d’animaux nécessaire est de 6 animaux/génotype/sexe. Cet effectif a été déterminé afin d’avoir un nombre minimal d’animaux tout en ayant des résultats scientifiquement interprétables et ce en prenant en compte une variabilité inter-individu attendue. Par ailleurs, cette étude sera réalisée sur des mâles et des femelles afin d’utiliser l’ensemble des animaux produits et de vérifier qu’il n’y a pas de différence en fonction du sexe.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à une mise à jeun qui n’est en rien délétère pour l’animal. En effet, elle est réalisée sur une période très courte (6h) et pendant la phase de jour, période pendant laquelle les rats dorment principalement et mangent peu, ils ne seront donc que peu perturbés. Il n’y a donc pas de point limite concernant la mise à jeun. Par ailleurs, un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie/analgésie générale profonde. Ainsi, aucune douleur n’est attendue. Le prélèvement de sang ne commencera qu’après la perte totale des réflexes de retrait lors du pincement de la patte et des réflexes de fermeture palpébrale témoignant d’une anesthésie profonde. Les points limites seront donc déterminés en fonction des observations faites pendant l’anesthésie/analgésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l’animal). La procédure d’anesthésie sera arrêtée si ces points limites sont atteints. Par ailleurs, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien permettant de s’assurer de leur bien-être et de leur santé. Si les animaux présentent des signes de mal être ou de douleur (plaies, hérissement du poil, attitude voûtée, perte de poids, altération de la respiration, comportement anormal (perte de réactivité, animal prostré)), ils seront placés sous surveillance accrue et présentés au vétérinaire. Si un traitement est envisageable, il sera mis en place (antiseptiques, antibiotiques, analgésiques). A noter que le traitement utilisé devra être adapté au cas pas cas en fonction des symptômes rencontrés. Si aucun traitement n’est envisageable et que l’état de l’animal persiste ou se dégrade au cours de la journée, il sera mis à mort. Ainsi, l’atteinte de points limites concernant le bien-être et la santé des animaux sera déterminée sur la base des observations quotidiennes de nos animaux. Par ailleurs, tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par deux, le rat étant une espèce très sociable, et disposeront d’un bâton à ronger en guise d’enrichissement.
Choix des espèces
La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques et neurodégénératives requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme que ne l’est la souris. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez le rat. L’étude sera réalisée chez des rats âgés de 3-5 mois, car c’est l’âge auquel ont été faites les analyses moléculaires sur les précédents modèles rat du SD. Le but étant de pouvoir comparer les résultats obtenus.
Développement d’applications thérapeutiques pour améliorer le transfert de thérapies au cerveau par ultrasons
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 136
368 souris et 136 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des ultrasons focalisés destinés à ouvrir la barrière protégeant le cerveau, avec injection de microbulles et d'agent de contraste, certains subissant en plus une chirurgie et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que l'ouverture de la barrière peut provoquer une inflammation cérébrale transitoire et que les animaux présentant des effets visibles en imagerie sont tués sans réveil. Les retombées annoncées, un meilleur passage des médicaments contre les cancers du cerveau et une thérapie génique du syndrome de l'X fragile, sont renvoyées au conditionnel.
Objectifs
La principale limite à l’efficacité des thérapies dans le cerveau est leur accès restreint en raison d'une barrière protégeant le cerveau qui limite le passage de la majorité des médicaments. Récemment, les ultrasons guidés par imagerie de résonance magnétique et associés à des microbulles ont attiré l’attention en tant que moyen non invasif pour permettre temporairement ce passage. Pour améliorer les traitements, il faudrait pouvoir faire passer ceux-ci plusieurs fois d'affilée au travers de cette barrière. Dans cette étude nous étudierons donc les effets de cette méthode au niveau des vaisseaux sanguins mais aussi l’intérêt de plusieurs ouvertures en faisant des analyses sur le tissu cérébral sain. Dans un second temps nous évaluerons le potentiel thérapeutique de cette méthode chez des rats et des souris présentant le syndrome de l'X fragile, une maladie neuro développementale due à la déficience d'un gène menant à des problèmes de développement du cerveau. Notre but sera donc de déterminer les meilleures conditions d’ouverture de la barrière dans le cerveau (temps d’ouverture, taux d’augmentation du passage des molécules) afin d’améliorer le passage de molécules thérapeutiques de manière non invasive. En plus des données que nous obtiendrons par imagerie par résonance magnétique et l'acquisition des signaux reflétant le caractère réversible ou non de l’ouverture de la barrière, nous évaluerons le passage des molécules d’intérêt et étudierons les changements morphologiques des vaisseaux ayant reçu une onde ultrasonore afin d’en évaluer leur intégrité après traitement. La caractérisation de ces effets permettra d’optimiser les conditions pour déposer localement des médicaments dans un cadre thérapeutique. Pour la partie applicative, nous évaluerons le potentiel thérapeutique de l'injection de thérapie génique chez des souris mimant le syndrome de l’X fragile.
Bénéfices attendus
Les ultrasons représentent un espoir majeur de traitement de nombreuses pathologies cérébrales. Dans le cas des cancers cérébraux, la moyenne de survie chez l'homme est de 15 mois environ. Chez l'animal, plusieurs études ont montré que l'on pouvait guérir des cancers cérébraux, ce qu'aucun essai préclinique n'avait montré jusqu'ici. Les essais cliniques chez l'homme sont en cours. Nous souhaitons ici évaluer des approches plus performantes que les traitements habituels et profiter d'une délivrance par ultrasons. Avec le développement en cours des ultrasons chez l'homme, les méthodes que nous proposons pourraient être rapidement bénéfiques chez l'humain. Dans le cas du syndrome X fragile, une maladie génétique, nous souhaitons évaluer le potentiel des ultrasons pour réaliser de la thérapie génique. Cette approche pourrait permettre de corriger, au niveau génétique, des anomalies localisées dans le cerveau.
Procédures
Suivant les procédures, une partie des animaux subiront des chirurgies sous anesthésie et n'excedant pas 30 minutes. Tous les animaux seront exposés à des tests d'imagerie médicale pour une durée maximale de 2h, anesthésie incluse. Les animaux peuvent être amenés à participer à plusieurs séances d'imagerie (8 au maximum), dans ce cas celles-ci seront espacées d'au moins 24h. Pour les besoins de l'imagerie médicale effectuée dans ce projet, une partie des animaux recevront une injection d'agent de contraste. Tous les animaux recevront une séquence ultrasonore ainsi qu'une injection intraveineuse d'une solution de microbulles. Les injections de produits à visée thérapeutiques sera aussi effectuée sur une partie des animaux.
Impact sur les animaux
L'utilisation des ultrasons focalisés guidés par imagerie de résonance magnétique peuvent provoquer une inflammation transitoire du cerveau qui se résorbe au bout de quelques jours. Cette inflammation est un effet normal dû à cette procédure qui ne provoque pas de dommages apparents pour l'animal. Si des effets néfastes sont visibles en imagerie, les animaux seront mis à mort sans réveil.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Le projet portant sur l’étude de la réponse d’organe entier (cerveau), et plus particulièrement la frontière à l'interface entre le système vasculaire et le système nerveux central, il nous est impossible de remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique. De plus, il n'existe pas à ce jour de méthodes alternatives, n'impliquant pas d'animaux vivants, qui permettent l'étude de l'effet sur le cerveau du passage de particules virales à travers la barrière grâce aux ultrasons. L’étude qui en découle comporte des analyses biologiques afin d'évaluer l’impact des ultrasons qui ne sauraient être remplacés par un modèle informatique ou cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé avec l’aide d’un logiciel permettant d’évaluer le nombre d’animaux minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres à mesurer (données préliminaires obtenues dans d’autres expériences). Ce nombre tient compte des risques de mort et d’exclusion d’un animal lors des différentes procédures. Le nombre d’animaux nécessaires à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront herbergés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux fixés par le ministère, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. L’ensemble des expérimentations seront réalisées sous anesthésie adaptée. Dans le cas où certains signes seraient observés, un traitement antalgique adapté sera mis en place.
Choix des espèces
L’ensemble des animaux sera utilisé à l'âge adulte (6 à 9 semaines pour la souris et 6 à 8 semaines pour le rat).
Rôle de deux enzymes dans l’épileptogenèse chez la souris atteinte de la sclérose tubéreuse de Bourneville sur le cerveau. 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une chirurgie crânienne sous anesthésie pour des injections, toutes reçoivent des injections quotidiennes pendant quinze jours, et 600 sont opérées pour la pose de transmetteurs enregistrant les crises. Le porteur indique que ces souris, modèles de la sclérose tubéreuse de Bourneville, développent des crises d'épilepsie pouvant être létales pour 10 % d'entre elles. Les bénéfices avancés, de nouveaux biomarqueurs et pistes thérapeutiques, restent formulés au conditionnel.
Objectifs
Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels dans le cerveau. Ces modèles nous permettrons de mieux comprendre les mécanismes conduisant à des désordres neurologiques et des crises épileptiques.
Bénéfices attendus
L'établissement de modèles murins pertinents de la sclérose tubéreuse de Bourneville avec atteintes cérébrales permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose tubéreuse de Bourneville et de découvrir des mécanismes génétiques responsables du développement de malformations corticales et de la formation des crises d’épilepsie. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans la sclérose tubéreuse de Bourneville et dans d’autres pathologies neurologiques et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
1200 souris seront utilisées dont 600 souris qui auront de la chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie de 3 minutes) pour subir des injections. Les 1200 souris seront soumises à des traitements pharmacologiques par injections quotidienne pendant 15 jours d'une durée de 1min. 600 souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale de 20 min afin d’enregistrer les crises épileptiques et les paramètres physiologiques en continue sans stress des animaux sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La cinétique des signes cliniques des animaux épileptiques est bien connue et démontrent un phénotype précoce et sévère. Nous anticipons que le phénotype des animaux que nous avons générés, sera potentiellement moins sévère que celui des animaux épileptiques. Cependant, nous ne pouvons exclure que ces animaux développent un phénotype équivalent et nous nous attendons à observer chez ces animaux la survenue des crises épileptiques même si plus tardives et moins fréquentes mais qui pourraient être léthales pour 10% des souris. Les traitements pharmacologiques par injection n'entrainent pas d'effet néfaste. Les injections répétées sont susceptibles d’entraîner des irritations, si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. La pose des transmetteurs pour permettre la télémétrie se fera sous anesthésie générale. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après les chirurgies. Il n'est pas connu de risque de rejet du transmetteur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Le développement corticale et l’épilepsie est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations endocrines. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes d'intérèt sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. les traitements pharmacologiques ne présentent pas de toxicité et ont déjà été testées in vitro ainsi que in vivo aux mêmes doses. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.
Réduction
L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. Dans ce modèle, un groupe de 25 animaux est suffisant donc des groupes de 25 animaux seront utilisés. L'estimation du nombre d'animaux a été réalisé en comptant une perte de 10% de nos animaux.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton, de bâtonnets de bois et de tunnel. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites 2 fois par semaine. Le traitement pharmacologique choisi sera administré quotidiennement et sera effectué par un technicien expérimenté à l'aide de seringues très fine qui donnent une injection quasi indolore. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Les traitements pharmacologiques par injection ne provoquent pas d'effet néfaste. Les injections auront lieu alternativement à gauche ou droite. Pour éviter une irritation, une solution apaisante sera appliquée. La pose de transmetteur sera faite sous anesthésie générale avec une analgésie. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après la chirurgie. Des points limites spécifiques ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.
Choix des espèces
Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes d'intérèt, jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons d’un large répertoire de lignées de souris modèles, ce qui permet d’évaluer l’interaction parmi plusieurs éléments de cette signalisation ; 4) nous disposons également de nombreux outils adaptés à la souris ; 5) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. 6) l'âge postnatal est le stade de développement privilégié pour étudier la survenue des crises épileptiques.
Mécanismes biologiques du codage prédictif dans le néocortex de la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent jusqu'à trois chirurgies crâniennes d'une heure sous anesthésie, la pose d'une plaque de tête et l'implantation d'électrodes, puis une contention de la tête et un entraînement en réalité virtuelle, parfois sous restriction d'eau pour les motiver. Le porteur affirme que l'enregistrement cérébral est "indolore" car le cerveau ne possède pas de récepteurs de la douleur, tout en reconnaissant douleur post-opératoire, risque d'infection et perte de poids. La recherche est présentée comme fondamentale, ses retombées médicales étant renvoyées au "long terme".
Objectifs
Nous étudions les mécanismes neuronaux qui sous-tendent le comportement animal. Notre hypothèse est que les processus mentaux génèrent constamment des prédictions sur le monde extérieur. Cette hypothèse considère le cerveau comme une machine prédictive capable de bien plus qu'une simple analyse des informations sensorielles arrivant par les yeux, les oreilles, etc. Au contraire, l'expérience antérieure est utilisée pour construire des modèles internes du monde qui sont ensuite utilisés pour prédire les événements extérieurs. Si vous êtes assis dans votre jardin, si vous voyez le chat du voisin sauter la clôture, vous vous y attendez et l'activité cérébrale produite par cette scène est faible. En revanche, si un kangourou saute la clôture, cet événement n'est pas prévu par votre modèle interne de votre jardin, et l'activité cérébrale sera élevée pour traiter cette situation inattendue et potentiellement dangereuse. À l'inverse, si vous déménagez en Australie et que vous vivez dans l'arrière-pays, votre modèle interne sera rapidement mis à jour par les expériences que vous avez vécues en voyant un kangourou sauter la clôture et vous ne serez pas surpris la prochaine fois que cela se produira. Nous étudions les fondements biologiques de ce calcul, comment les modèles internes sont formés et comment ils régissent la perception et le comportement. Nous utilisons des souris pour nos recherches, car elles possèdent un riche répertoire comportemental et une architecture cérébrale similaire à celle des humains. En outre, nous disposons d'outils de recherche inégalés pour enregistrer et modifier l'activité cérébrale des souris. Nous étudions comment les cellules du cerveau se connectent les unes aux autres et comment elles communiquent afin de permettre un traitement prédictif. En outre, nous étudions les souris au cours d'un comportement naturaliste dans un environnement de réalité virtuelle, où nous pouvons contrôler ce qu'elles voient, de sorte que nous pouvons introduire des événements inattendus (comme le kangourou). En enregistrant et en modifiant l'activité cérébrale au cours de ces comportements, nous pouvons mieux comprendre quels calculs le cerveau des mammifères effectue et comment. Ce travail est essentiel pour comprendre les processus mentaux. Il est important de noter que la compréhension du fonctionnement d'un esprit sain nous permettra de mieux comprendre ce qui ne va pas dans les maladies psychiatriques, comme la dépression ou la psychose.
Bénéfices attendus
Bénéfices principaux: Ce programme de recherche vise à combiner des techniques expérimentales de pointe avec des approches nouvellement développées afin d'ajouter de nouvelles connaissances fondamentales à notre compréhension de la fonction cérébrale et des structures qui la soutiennent. Nous publierons ces données dans des revues de premier plan et diffuserons les résultats lors de conférences nationales et internationales. Nous nous engageons aussi activement à rendre nos données, notre code et nos développements techniques open source. Bénéfices secondaires: La nature invasive de nos approches expérimentales permet d'obtenir une quantité inégalée d'informations sur la structure et la fonction du cerveau, mais elle est limitée à l'étude d'organismes modèles. Cependant, la compréhension du cerveau des rongeurs conduira inévitablement à une meilleure compréhension du cerveau humain. Cette recherche de découverte fondamentale ne peut être réalisée sans l'utilisation d'animaux. La connaissance du cerveau sain est nécessaire à la réparation causale des dysfonctionnements dans les pathologies. Nos travaux apporteront de nouvelles connaissances sur les calculs cérébraux fondamentaux qui sont déréglés dans les maladies psychiatriques et, à long terme, de nouvelles pistes pour améliorer la santé humaine. Selon l'OMS, la santé mentale et les maladies neurologiques représentaient 13 % de la charge totale de morbidité dans le monde en 2004. Le coût de la maladie en 2010 était estimé à 2,5 billions de dollars US pour les maladies mentales (contre 0,3 billions de dollars US pour le cancer), et atteindra 6 billions de dollars US d'ici 2030 (The Global Economic Burden of Noncommunicable Diseases. Genève : Forum économique mondial 2011).
Procédures
Les animaux subiront au maximum trois interventions chirurgicales d'une heure sous anesthésie gazeuse. Ces interventions comprennent des injections dans le cerveau et la mise en place d'une plaque de tête pour faciliter l'immobilisation des animaux pendant l'enregistrement. En outre, des électrodes d'enregistrement peuvent être implantées. Pendant et après l'opération, les souris recevront une injection d'anesthésique local dans le crâne, un analgésique et un anti-inflammatoire. Pour la procédure 1, quelques semaines après l'opération, des études ex vivo seront menées en utilisant des méthodes d'enregistrement et d'optogénétique de pointe. Pour les procédures 2 et 3, les animaux seront entraînés à la réalité virtuelle et des enregistrements électriques du cerveau seront effectués pour étudier le codage neuronal. Les souris peuvent ressentir une gêne légère et transitoire pendant quelques jours, le temps qu'elles s'habituent à la fixation de la tête. Les séances d'entraînement et d'enregistrement dureront de 1 à 3 heures et seront répétées de manière ponctuelle pendant 2 à 7 jours. L'enregistrement cérébral est indolore, car le cerveau ne possède pas de récepteurs de la douleur. Les stimuli (visuels et vestibulaires) sont indolores.
Impact sur les animaux
En général, toutes les procédures sont bien tolérées par l'animal et n'affectent pas le phénotype général de la souris. En ce qui concerne la chirurgie implantaire, les désagréments comprennent la douleur postopératoire, le risque potentiel d'infection et la perte de l'implant. Les souris auront besoin de quelques jours pour se remettre de la chirurgie. Le cerveau n’étant pas sensible, la douleur liée à la chirurgie sera due uniquement à des aspects périphériques. En ce qui concerne les expériences comportementales, les nuisances peuvent inclure le stress lié à l'isolement et le stress lié à la manipulation. Dans certains cas, la restriction d'eau sera utilisée pour motiver le comportement des animaux, ce qui peut entraîner une baisse de poids modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort sans cruauté à la fin des procédures. Les cerveaux seront prélevés pour des analyses anatomiques et physiologiques ultérieures afin d'obtenir le maximum de données sur chaque animal.
Remplacement
Malgré un siècle de recherche sur le cerveau, la science est encore loin de comprendre les détails biologiques de la fonction cérébrale. L'étude des processus cognitifs chez les animaux et les tissus cérébraux vivants est essentielle pour la recherche biologique fondamentale. À mesure que nous en apprendrons davantage sur les neurones et les synapses à l'étude, nous pourrons utiliser davantage la modélisation mathématique et informatique. Cependant, pour que les approches de modélisation soient utiles, elles devront être étroitement limitées par des mesures biologiques. L'utilisation d'animaux est inévitable pour les questions scientifiques importantes que nous souhaitons aborder. Cependant, nous utiliserons également la modélisation informatique aux niveaux synaptique, cellulaire et réseau pour tester des scénarios possibles afin de générer des hypothèses testables.
Réduction
Les objectifs nécessitent l'utilisation de lignées de souris transgéniques. Le nombre d'animaux requis reflète les schémas de reproduction connus, la taille des portées et la demande. Dans la mesure du possible, les lignées seront maintenues à l'état homozygote, afin de limiter le nombre de descendants présentant des génotypes inappropriés. Pour la plupart des expériences quantitatives, le plan sera basé sur les directives ARRIVE (https://arriveguidelines.org/) et nous utiliserons le nombre minimum d'animaux pour fournir une description adéquate basée sur l'expérience précédente (la nôtre et celle de la littérature) . Nous avons une expertise statistique à l'Institut pour déterminer adéquatement la taille de l'échantillon en fonction de l'analyse de puissance. Nous utiliserons les méthodes de recherche les plus modernes qui maximisent la quantité de données recueillies sur chaque animal. De plus, en effectuant des enregistrements répétés sur les mêmes animaux, nous pouvons obtenir des données plus précieuses sur la dynamique des processus neuronaux des individus, réduisant à nouveau le nombre d'animaux nécessaires, par rapport aux expériences ponctuelles uniques. Enfin, dans la mesure du possible, le tissu cérébral d'un animal sera partagé et/ou déplacé pour d'autres analyses expérimentales, par exemple, l'histochimie dans un tissu fixé après des enregistrements in vivo.
Raffinement
Toutes les mesures visant à atténuer ou à minimiser la douleur, la souffrance, la détresse ou les dommages durables à l'animal seront prises. Des protocoles expérimentaux ont été affinés en utilisant les pratiques vétérinaires les plus modernes et en prévoyant des périodes de récupération pour réduire le stress et la souffrance des animaux. La douleur et/ou la détresse des animaux sont réduites par sédation, analgésie, anesthésie ou tout autre moyen approprié pour réduire la douleur ou la détresse, suivant une pratique vétérinaire reconnue. Les injections cérébrales stéréotaxiques et les chirurgies d'implantation seront réalisées dans des conditions aseptiques pour prévenir les infections post-chirurgicales. La récupération de l'animal après l'opération est directement surveillée dans une salle de réveil jusqu'à ce que l'animal soit ramené dans sa cage d'accueil. Une fois que les animaux sont retournés dans leur cage d'accueil, ils sont observés au moins deux fois par jour. De plus, les souris sont généralement hébergées en groupes et bénéficient d'un enrichissement environnemental, ce qui réduit considérablement les niveaux de stress par rapport au logement isolé. Enfin, nous surveillons en permanence les meilleures pratiques et les nouvelles informations disponibles dans la littérature internationale (par exemple https://www.nc3rs.org.uk/3rs-resources). Cette action respectera les principes de la déclaration de Bâle (www.basel-declaration.org), qui défend l'idée que les expérimentations animales en recherche fondamentale et appliquée doivent être planifiées et réalisées avec le plus grand soin et qui contribue à apporter à la société informations ouvertes et transparentes sur les expérimentations animales.
Choix des espèces
Les souris C57BL/6J sont choisies car leur système nerveux est largement similaire à celui de l'homme et qu'elles disposent d'une riche boîte à outils génétique pour les expériences. En outre, elles ont une bonne acuité visuelle, sont suffisamment petites pour être fixées sur la tête et constituent l'espèce de mammifère la plus simple pour réaliser ces expériences. Les objectifs de cette recherche sont de découvrir les mécanismes de la fonction cérébrale bien développée chez les animaux adultes. Pour certaines expériences (par exemple celles nécessitant un long temps d'expression des vecteurs viraux), nous utiliserons des animaux juvéniles (P18+). Pour la plupart des expériences, des animaux âgés de P35+ seront utilisés.
Effet de deux mutations dans un gène impliqué dans le développement cérébral chez la souris EU2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une électroporation in utero sous anesthésie, une chirurgie de trente minutes, pour introduire deux mutations d'un gène du développement cérébral reproduisant des traits proches de l'autisme. Le porteur indique que les animaux peuvent présenter stress, douleur post-opératoire, bagarres entre mâles et retards de croissance, et précise que les organismes génétiquement modifiés ne peuvent être ni replacés ni relâchés. Les reproducteurs âgés comme les souriceaux sont tués pour prélèvement de tissus, les bénéfices restant une meilleure compréhension du neurodéveloppement "à terme".
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.
Remplacement
Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.
Choix des espèces
Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.
Modulation métaboliques et transcriptionnelles dans la rétine au cours du processus neurodégénératif
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour étudier les atteintes de la rétine dans des maladies neurodégénératives. Elles subissent des prélèvements de larmes, des injections intrapéritonéales et des injections dans l'œil de vecteurs viraux sous anesthésie, avant mise à mort pour prélever le système nerveux central. Le porteur indique que l'injection dans l'œil provoque une douleur locale et une sécheresse oculaire, traitées par gel et antalgique, et que les modèles de Parkinson restent asymptomatiques sur la période étudiée. Il affirme que le remplacement n'est pas applicable, tout en prévoyant d'approfondir ensuite les analyses sur des cultures de rétine.
Objectifs
L'impact des handicaps visuels (atrophies optiques, glaucome, dégénérescence maculaire) s’accroît dans nos pays développés avec l’augmentation de la communication visuelle et le vieillissement de la population. Des déficiences du système visuel sont également retrouvées dans des pathologies neurodégénératives, qu’elles ciblent directement le système visuel comme dans le cas de l'Atrophie Optique Dominante (AOD), ou indirectement comme la Maladie de Parkinson (MP). En effet, la patients atteints de MP subissent des troubles visuels très précocement, avant même l’apparition des premiers symptômes moteurs. De ce fait, l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires expliquant ces défaillances visuelles pourrait permettre de déterminer des facteurs prédictifs ou pronostiques de l'évolution de ces pathologies. L’AOD et la MP ont des étiologies très différentes mais présentent toutes 2 des troubles dans la physiologie de la rétine et/ou du nerf optique, liées à des défauts de l’activité des mitochondries. Ces dysfonctions mitochondriales produisent un stress cellulaire auquel les cellules tentent de répondre en modifiant leur activité métabolique et ceci passe par une reprogrammation de l’expression de certains gènes. Ainsi, notre projet vise à étudier le remodelage métabolique et transcriptionnel de la rétine et du nerf optique au cours de l’évolution des processus dégénératifs dans le but d’étudier la sensibilité particulière de la rétine dans le processus neurodégénératif et de déterminer de potentiels biomarqueurs pronostiques précoces pour ces pathologies.
Bénéfices attendus
Notre projet, validé par différentes instances scientifiques et financeurs, permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes physiopathologiques de ces maladies, notamment dans leurs étapes précoces impliquant des dysfonctionnements mitochondriaux dans les neurones. Nos résultats permettront également de définir des biomarqueurs pronostiques précoces, voire des cibles thérapeutiques pour ces pathologies pour lesquelles il n’existe encore à l’heure actuelle que très peu de prise en charge.
Procédures
Les animaux seront soumis à (1) des prélèvements non-invasifs sur animaux vigiles (larmes), de facon hébodmadaire tout au cours de lexpérimentation - ces prélèvements sont réalisés à l'aide de papier buvard (30 secondes) ; (2) injections intrapéritonéales sur animaux vigiles (1ml/100g, 5 secondes) ; (3) des procédures chirurgicales sous anesthésie : injections intravitréennes de vecteurs viraux (2ul, 1 min). Tous les animaux sont concernés.
Impact sur les animaux
Les injections intravitréennes de vecteurs viraux induisent une douleur locale et transitoire qui sera gérée par l’application de d’un antalgique oculaire juste après l’injection. Une sécheresse oculaire peut également être observée dans les 2 à 3 jours qui suivent l’injections. Nous appliquerons systématiquement et quotidiennement un gel lubrifiant sur les yeux des souris les 3 premiers jours après l’injection. Les modèles de Parkinson que nous utiliserons dans ce projet sont asymptomatiques pour les périodes étudiées, les souris ne devraient donc pas présenter de stress, douleur ou de souffrance particulière en dehors des procédures d’injection et chirurgie, qui seront elles réalisées sous analgésie/anesthésie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanisés en fin de procédure car les études porteront sur les tissus frais du système nerveux central.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne reproduiraient pas l’ensemble des voies et des interactions cellulaires impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Néanmoins, une fois que nous aurons validé ces points chez l’animal, l’analyse des mécanismes moléculaires sera approfondie à partir de cultures organotypiques de rétines murines que nous avons également mis en place au laboratoire.
Réduction
Nous planifierons chaque expérience pour minimiser le nombre d’animaux tout en permettant une analyse statistique fiable de nos résultats. Pour le modèle d’AOD, la déplétion d’OPA1 induite avec une injection de vecteur viral sera réalisée sur un œil, tandis que l’autre œil recevra le vecteur contrôle, minimisant ainsi à la fois le nombre de souris et le risque de variabilité inter-groupes. Les modèles d’induction de Parkinson choisis ont été déjà validés par nous-mêmes et nos collaborateurs et nous savons que des groupes de 5 souris sont en général suffisants pour pouvoir exploiter les résultats. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres cellulaires et moléculaires sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences in vivo.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi rapproché quotidien des animaux dès l’initiation des différents modèles. Ce suivi nous permettra d'évaluer l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). L’expérimentation sera arrêtée et l’animal euthanasié en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites définis en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal. De plus, les personnes responsables du projet ont été formées à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques ; elles garantissent la formation et l’encadrement des autres expérimentateurs impliqués dans les procédures expérimentales. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont reportés dans les livrets de compétences tenus à jour des personnes concernées.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour le développement de ces modèles pathologiques du fait de son faible coût, de sa facilité de manipulation et de son adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour être déficients en Foxo3 ou exprimer une sous unité ribosomique taguée qui n’existent que chez la souris. Enfin, les caractéristiques des modèles de MP et d’AOD utilisés dans ce projet ont été établis chez cet animal, et nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc ...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 10 semaines au début de l'expérience. A ce stade, les souris ont terminé leur croissance et possèdent un système neuronal et immunitaire mature et fonctionnel.
Fonction et potentiel thérapeutique des neutrophiles dans la maladie de Charcot
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dans deux modèles de la maladie de Charcot. Elles reçoivent des anticorps par voie intraveineuse et des prises de sang, sont suivies par des tests de motricité et de coordination, puis subissent une ponction intracardiaque sous dose létale d'anesthésique pour prélever le système nerveux. Le porteur indique que l'un des modèles perd progressivement sa masse musculaire jusqu'à des difficultés à se déplacer et que la maladie y est fatale, tout en affirmant que les souris ne montrent pas de signes de douleur. Il présente le recours à l'animal comme "indispensable" et le seul à reproduire les interactions entre système immunitaire et système nerveux.
Objectifs
La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, fatale, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière et qui sont responsables de la contraction des muscles volontaires. La maladie de Charcot touche environ 7000 patients en France. La maladie débute généralement entre 50 et 70 ans par une faiblesse musculaire, évoluant rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire qui conduit au décès dans les 2 à 3 ans suivant l'apparition des symptômes. Malgré l'explosion des connaissances sur les processus pathologiques centrés autour du neurone moteur, d’autres faisceaux d’évidences suggèrent que la maladie met en jeu le système immunitaire. Le système immunitaire comprend de nombreux médiateurs de l’inflammation, un processus qui peut influencer les maladies neurodégénératives comme la maladie de Charcot. Les neutrophiles représentent une population de globules blancs très abondante dans le sang et la première barrière de défense de l’organisme contre les infections bactériennes. Ils ont récemment été montrés comme jouant un rôle dans la maladie d’Alzheimer. En revanche leur rôle dans la maladie de Charcot demeure inconnu. Notre objectif est de comprendre la fonction des neutrophiles dans la maladie et d’évaluer leur potentiel comme cible thérapeutique. A cette fin, nous aborderons cette problématique par une description précise des défauts de cette population de cellules immunitaires au cours du temps. Notre dernier objectif est d’évaluer une approche d’immunothérapie visant sélectivement les neutrophiles. Le but de ce projet est donc de fournir un nouvel éclairage sur la maladie en mettant en évidence la contribution d’un nouveau type cellulaire du système immunitaire et offrir de nouvelles perspectives.
Bénéfices attendus
Identifier de nouveaux acteurs cellulaires qui contribuent à la dégénérescence des neurones moteurs dans la maladie de Charcot permet d’avoir une vue plus complète de la maladie et proposer ainsi de nouvelles pistes thérapeutiques. Les bénéfices de cette étude présentent donc un potentiel clinique. Ce projet propose de faire progresser nos connaissances scientifiques sur cette pathologie qui est particulièrement complexe. Notre connaissance encore incomplète de la pathologie explique pour une grande part les nombreux échecs thérapeutiques rencontrés chez les patients jusqu’à présent. Notre projet propose d’explorer une population de cellules du système immunitaire. Facile d’accès en terme thérapeutique, le système immunitaire facilite ainsi le développement des thérapies. Notre projet explore une approche d’anticorps thérapeutiques qui a un fort potentiel clinique comme l’illustre l’efficacité des anticorps médicaments dans la sclérose en plaque par exemple. L’utilisation de deux modèles différents de la maladie est un point fort de cette étude en mimant l’hétérogénéité clinique de la maladie de Charcot. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et potentielles applications dans deux modèles différents. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et potentiellement un/des dépôts de brevet.
Procédures
Le projet implique de délivrer des anticorps thérapeutiques dans la circulation sanguine des souris et de réaliser des prélèvements sanguins. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (1-2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention et celle d’une piqure. Afin de suivre l’évolution des capacités motrices des souris atteintes de la maladie de Charcot, les animaux seront suivis par des tests comportementaux simples, non invasifs, ne nécessitant pas de déprivation de nourriture. Deux tests comportementaux moteurs seront ici utilisés pour définir les capacités motrices et les propriétés de coordination motrice. Chaque test prend moins de 5 min par souris. Notre étudions le rôle de certaines populations de globules blancs dans la pathologie et leur potentiel thérapeutique. Nous avons besoin de réaliser des études d’histologie du système nerveux et de cytométrie du système immunitaire. A cette fin, une préparation des tissus est nécessaire avant de procéder à la biopsie. Nous procédons donc à une perfusion ou ponction intra-cardiaques sur des animaux anesthésiés ayant reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal. Des souris pourront se trouver hébergées individuellement, dans un environnement enrichie amplifié pour une durée de 21 jours.
Impact sur les animaux
La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable dont l’issue est inexorablement fatale. Les modèles souris que nous utilisons ont été très bien caractérisés dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation de la règle des 3Rs. Le trait commun de la pathologie chez ces deux lignées de souris est la diminution des capacités motrices. Ces modèles présentent une atteinte motrice variable, un début et une progression de la maladie différents. Les modèles de la maladie de Charcot ont été particulièrement bien décrits quant au tableau et à la chronologie clinique de la pathologie. Un des modèles présentent une réduction progressive de la masse musculaire commençant par les membres inférieurs. Cette amyotrophie se traduit par une perte de poids et des difficultés déambulatoires. Le deuxième modèle perd très lentement ses capacités à effectuer une tache motrice et présente une posture anormale (dandinement) qui est stable pour suivre un déclin normal lié à l’âge et à la prise poids. Ce modèle présente une atteinte motrice plus légère qui n’est pas associée à une espérance de vie plus courte. Les souris, comme c’est le cas chez les patients, ne présentent pas de signes de douleurs. Notre objectif est d’améliorer les symptômes moteurs par des anticorps thérapeutiques. L’administration d’anticorps thérapeutiques dans la circulation est une approche peu invasive, maitrisée et standardisée. Les animaux qui rentrent dans l’évaluation thérapeutique sont impliqués dans du comportement moteur consistant à évaluer de façon non-invasive, non-douloureuse, très peu contraignante et de courte durée la capacité à effectuer une activité motrice simple.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier les liens entre système immunitaire et système nerveux central et déterminer les paramètres histologiques en liens avec des caractéristiques cliniques et un effet thérapeutique. L’autre nécessité est liée à la pathologie elle-même, qui est fatale chez l’homme et également dans un des modèles murins utilisé ici, et rentre dans le cadre de l’étude de l’approche thérapeutique sur l’espérance de vie des souris qui auront reçu ou non le traitement.
Remplacement
La maladie de Charcot est une maladie fatale et incurable qui se caractérise par une perte des neurones qui contrôlent l’activité des muscles squelettiques. L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système intégrant la complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux. Une telle interaction qui se met en place durant des mois et qui implique d’autres cellules autres que le neurone moteur, ne peut pas être mimée in vitro. Seul les modèles expérimentaux mammifères présentent la complexité des interactions entre les cellules du système immunitaire et les cellules du système nerveux, et les barrières physiologiques comme les méninges. Cependant, afin d’explorer les mécanismes impliqués dans l’interactions neutrophiles et neurones moteurs, nous développons des systèmes de cultures in vitro entre neutrophiles et neurones moteurs. Notre objectif étant également de développer une thérapie utilisant des anticorps ciblant cette population de globules blancs, l’utilisation des modèles animaux de la maladie de Charcot est également indispensable. La validation d’une approche thérapeutique qui intervient dans la complexité de cette communication entre système immunitaire et système nerveux requiert un modèle physiologique complet que seul l’animal offre. Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour tout transfert thérapeutique potentiel vers la clinique.
Réduction
Nous avons donc déterminé pour une durée du projet de 4 années, un nombre total de 590 souris. Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Pour un premier modèle de la SLA chaque cohorte est composée de 24 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologiques, de séquençage et de cytométrie. Pour le second modèle, chaque cohorte est composée de 14 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologique, de séquençage et de cytométrie. Afin de minimiser le nombre d’animaux, ceux qui ont servi à la reproduction sont inclus dans les cohortes expérimentales. Nous utilisons également des cohortes mixtes male et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage. Notre projet inclut également une étude in vitro qui permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèles de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, igloo, lanières de papier craft et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Les points limites sont définis par le suivi régulier du poids des souris et leur capacité à effectuer une tache motrice reflexe simple. Pour chaque modèle animal de la maladie de Charcot un arbre décisionnel spécifique est défini et suivi par les expérimentateurs associés au projet. De plus une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. L’administration d’anticorps thérapeutiques est réalisée avec un anesthésique appliqué localement et les animaux sont suivis régulièrement après chaque injection. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur ou d’infection est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. Une grille d’évaluation définie par la structure du bien-être animal nous permet de suivre les animaux ainsi identifiés et de prendre rapidement des mesures adaptées.
Choix des espèces
Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité et valorisation des résultats: début précoce/tardif, progression lente/rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. L’exploration des propriétés phénotypiques et génétiques des neutrophiles au cours de la maladie ainsi que le protocole d’immunothérapie que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la pathologie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie d’immunothérapie. La complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle à la physiologie complexe qui se rapproche de celui de l’homme. Les modèles de la maladie de Charcot qui sont utilisés récapitulent les principales étapes de la maladie. Nous utiliserons 2 modèles différents qui permettent de représenter l’hétérogénéité clinique et génétique de la maladie. Afin de suivre la maladie nous utiliserons les lignées à trois stades significatifs. L’âge de chaque stade étant différent en fonction du modèle. Nous utiliserons les souris 1) au stade précédent les premiers signes moteurs, c’est le stade asymptomatique. 2) Le stade de début de la maladie ou les premiers signes moteurs sont quantifiables. 3) Un stade ou la maladie est installée, qui est le stade symptomatique. L’espérance de vie des souris est également étudiée dans une procédure thérapeutique.
Rôle du transporteur des monocarboxylates 2 (MCT2) dans un modèle murin de démyélinisation du système nerveux central
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
510 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'un transporteur dans la formation de la myéline. Une partie reçoit cinq injections de tamoxifène puis subit une lésion chirurgicale de la moelle épinière sous anesthésie, l'autre, âgée de cinq jours, reçoit les injections avant d'être tuée à divers stades du développement. Le porteur signale des douleurs post-opératoires, un risque d'hémorragie et d'hypothermie et des hématomes liés aux injections répétées, avant prélèvement des tissus. Il présente les modèles murins comme "indispensables" au motif que les cultures et les invertébrés ne reproduisent pas la myélinisation.
Objectifs
Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le contrôle de la formation de la gaine de myéline qui protège les neurones dans le système nerveux central. Dans des conditions pathologiques, la formation d’une nouvelle myéline, processus appelé remyélinisation, est importante pour protéger les fibres nerveuses d’une dégénérescence et pour restaurer la conduction rapide de l’influx nerveux. La myélinisation et la remyélinisation sont des processus contrôlés par de nombreux facteurs et signaux, qui sont souvent altérés dans plusieurs maladies comme la sclérose en plaques. Notre hypothèse est que le lactate, via son transporteur, est une source énergétique importante pour la myélinisation et de la remyélinisation. L’objectif de notre projet est de déchiffrer le rôle de ce transporteur dans le processus de la myélinisation dans des conditions physiologiques et pathologiques afin de développer de nouvelles stratégies de thérapie régénérative pour les pathologies de la myéline. L’étude sera menée sur des souris portant des modifications génétiques qui perturbent le fonctionnement de ce transporteur ainsi que sur des souris contrôles. L’étude nous permettra de mieux comprendre l’implication de ce transporteur ainsi que son rôle dans la réparation des lésions de la myéline.
Bénéfices attendus
Il est nécessaire afin de mieux comprendre les mécanismes pathologiques dans les maladies demyélinisantes du système nerveux central, telle que la sclérose en plaques pour laquelle les thérapies régénératives sont encore limitées. Nos recherches pourraient ainsi contribuer au développement des nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Nous utiliserons des souris afin de déterminer le rôle d’une protéine qui semble impliquée dans le processus de myélinisation du système nerveux central. Pour cela nous réaliserons une étude du processus de réparation des lésions de la myéline ainsi qu’une étude au cours du développement du système nerveux central de la souris. Nous allons (objectif 1) réaliser 5 injections de tamoxifène (une injection par jour durant 5 jours ; volume injecté déterminé par pesée quotidienne de l’animal), puis 48h après la dernière injection, nous induirons une lésion de la moelle épinière, sous anesthésie générale et analgésie (une lésion par animal). Cette opération dure 20-30 minutes par souris. Nous utiliserons 210 animaux pour cette étude. La durée totale de la procédure sera au maximum de 30 jours. Après euthanasie des animaux, on procèdera à la récupération des tissus d’intérêt en vue de leurs analyses. Pour l’étude de cette protéine au cours du développement (objectif 2), nous utiliserons 300 animaux. Les animaux, âgés de 5 jours, recevront 5 injections de tamoxifène (une injection par jour durant 5 jours ; chaque injection durant environ 15 secondes). Ils seront ensuite euthanasiés à différents temps expérimentaux afin d’analyser l’impact de la délétion de cette protéine sur la myélinisation.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont majoritairement liées à la chirurgie (lésions démyélinisantes): hypothermie, hémorragie, risque anesthésique, douleurs post-opératoires. Un stress peut aussi être observé chez l’animal à cause de la contention quotidienne et de l’injection d’un produit. Il est notamment possible d’observer l’apparition d’hématomes dus à l’injection répétée de ce produit.
Devenir
Les prélévements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l’étude de processus biologiques complexes comme le processus de myélinisation au cours du développement ou la réparation des lésions de la myéline. Le rongeur est donc l’une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude car il présente un système nerveux myélinisé comme chez l’Homme.
Réduction
Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement significatives. Nous prévoyons l’utilisation de 210 animaux pour la procédure de démyélinisation focale afin d’évaluer la remyélinisation et 180 animaux pour réaliser l’étude développementale. Lors de l’étude étude développementale le génotypage des animaux ne pouvant être réalisé avant leur utilisation ; la génération des lots expérimentaux nécessitera l’utilisation de 300 animaux. Soit un total de 510 animaux sur ce projet.
Raffinement
Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage, bruit et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et matériel papier-coton, animaux hébergés en groupe), d’alimentation et de soins quand nécessaire (directive européenne 2010/63/UE) seront contrôlées. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Durant la procédure de chirurgie, les animaux seront placés sous anesthésie. Les points limites sont ceux définis en amont. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désigné. L’euthanasie de l’animal sera réalisée si l’on observe l’un de ces critères absolus.
Choix des espèces
Pour comprendre le rôle d’une protéine d’intérêt dans la réparation de lésions de la myéline, il est nécessaire de réaliser des études in vivo en condition physiologique. L’utilisation de modèles murins, reproduisant certains aspects des pathologies de la myéline chez l’homme, est donc indispensable pour évaluer la fonction de notre protéine en contexte pathologique et pour identifier de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique. Les animaux utilisés seront âgés de 12 semaines, afin d’avoir atteint une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes). De plus, à cet âge, la chirurgie est facilitée par la relative faible masse musculaire des animaux.
Elevage de lignées murines transgéniques avec génotypage par méthodes invasives
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système respiratoire
62 764 souris vont être utilisées dans une procédure d'identification et de génotypage impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit un tatouage aux doigts et une amputation du bout de la queue sans anesthésie, la contention constituant la principale source de stress. Le devenir dépend du génotype, une partie rejoignant d'autres protocoles ou l'élevage, une autre étant tuée dès le sevrage faute d'utilisation possible ou une fois trop âgée pour la reproduction. Le porteur affirme que les prélèvements salivaires ou pileux ne sont pas assez fiables et présente le tatouage et la biopsie de queue comme les seules méthodes "aussi performantes".
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de caractériser génétiquement les animaux. Ces animaux sont identifiés par tatouage aux doigts et caractérisés à l’aide du prélèvement du bout de la queue. Cette DAP d’identification et de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres DAP) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour • la formation, • le maintien des compétences, • les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo (hors champ de DAP).
Bénéfices attendus
Le génotypage est une étape nécessaire pour déterminer quels sont les animaux dont le génotype est pertinent pour mener à bien les expérimentations, dans le but de trouver des thérapies innovantes qui puissent être transposées en recherche clinique. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; - d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux de cette DAP seront soumis à deux gestes techniques invasifs consécutifs: 1/ l'identification par tatouage digital: 1 fois, durée de quelques secondes 2/ biopsie de queue: 1 fois, durée de quelques secondes
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure, puis leur devenir est différent selon leur génotype: a/- ils sont prévus pour expérimentation, formation ou maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP): utilisation continue b/- ils sont sélectionnés pour entretien des colonies, puis mis à mort lorsque trop âgés ou mauvais reproducteurs c/- ils sont utilisés ex vivo, donc mis à mort avant utilisation (hors champs DAP) d/- ils sont mis à mort dès sevrage si aucune utilisation possible au vu de leur génotype e/- ils sont mis à mort à tout moment si atteinte d'un point limite (par décapitation ou dislocation cervicale selon l'âge)
Remplacement
Les méthodes alternatives à l'expérimentation animale se développent de plus en plus, cependant pour certaines problématiques telles que l'étude de phénomènes physiologiques elles restent incomplètes et insuffisantes, puisqu'elles ne mettent pas en jeu toutes les interactions au sein d'un organisme vivant. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’EU établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’EU. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté à jour de ses formations. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté en respectant les conditions d’asepsie établies dans l’établissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère.
Choix des espèces
Au sein de notre EU les équipes de recherche utilisent le modèle souris pour sa facilité de manipulation technique, génétique, la rapidité de production de lots expérimentaux, et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Les animaux sont identifiés et prélevés entre 7 et 12 jours selon la règlementation européenne.
Étude du rôle d’ApoE4 sur les altérations du protéome synaptique menant à la dégénérescence synaptique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 425 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les protéines des synapses dans un modèle de maladie d'Alzheimer. Une partie sert à créer et maintenir les lignées et reste vivante à l'animalerie, l'autre est tuée après biopsie de l'oreille, gavages et prélèvement du cerveau. Le porteur signale qu'environ 15 % des souris du modèle développent une paralysie des membres postérieurs vers 7 à 8 mois. Les bénéfices thérapeutiques annoncés sont renvoyés au 'moyen/long terme'.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L'apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L'isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l'hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA par l’intermédiaire des astrocytes (cellules nourricières des synapses) et des microglies (cellules immunitaires du cerveau). Nous voulons identifier comment ApoE4 et les microglies modifient les protéines dans les synapses mais également qui produit ces protéines : le neurone lui-même, ou l’astrocyte, connu pour son interaction étroite avec les synapses. Nous utiliserons des souris P301S, l’un des rares modèles de MA à reproduire la perte synaptique comme observée dans la MA. J'analyserai les protéines synaptiques spécifiquement produites par des neurones ou par des astrocytes chez ces souris. Cette étude nous permettra d'identifier précisément comment ApoE4 et les microglies modifient les protéines dans les synapses endommagées par la MA, ainsi que l'origine cellulaire de ces protéines (neurone ou astrocyte).
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4, des astrocytes et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des microglies pour préserver un échange astrocyte/synapse physiologique et qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.
Procédures
- Une biopsie rapide de l'oreille (2 secondes) - Des traitements par gavage oral 1 fois/24 h pendant 5 jours continus, et dans une diète purifiée pendant un mois et dans l'eau de boisson pendant 2 semaines) - Une euthanasie sous anesthésie/analgésie par injection (unique).
Impact sur les animaux
Le gavage oral ne se fait pas sous anesthésie mais sera fait par des experts animalier afin de réduire le stress des souris lors de la procédure et seront faites sur un temps répété relativement court de 5 jours (un gavage par jour). Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables qui seront discutés dans la procédure et pour lesquels des points limites stricts seront établis. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement ANL.
Devenir
Pour la partie du projet permettant la création et maintien de lignées de souris à phénotype dommageable, une partie des souris sera gardée afin de maintenir les lignées à l'animalerie, l'autre partie sera utilisée pour la partie du projet avec les traitements, perfusion et prélèvements des tissus. Pour la partie du projet avec les traitements, perfusion et prélèvements des tissus, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analyser.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin.
Réduction
Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l'expérience, la souris sera euthanasiée. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Pour ces points limites, l’animal sera euthanasié. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois.
Choix des espèces
Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, la dégénérescence synaptique responsable des troubles cognitifs dans la MA est très difficilement modélisable in vitro et nécessite des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. Pour étudier l’impact d’ApoE4 sur la dégénérescence synaptique, nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées (P301S) exprimant la protéine tau humaine mutée. Ces souris développent une perte synaptique et des troubles cognitifs comme chez les patients MA. Les souris P301S croisées avec des souris transgéniques exprimant les isoformes humaines ApoE2, ApoE3 ou ApoE4 dans un précédent projet, seront utilisées pour l'étude. Pour la procédure 1, les souris seront utilisées pour la reproduction dès 8 semaines. Pour la procédure 2: - Toutes les souris de la procédure 2 seront traitées par gavage à l’âge de 4 mois permettant ainsi l’expression d'une molécule par les neurones ou par les astrocytes. - Une cohorte sera utilisée à 7 mois (avec traitements 1 mois et 2 semaines avant) afin d'évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle - Une cohorte sera utilisée à 10 mois (avec traitements 1 mois et 2 semaines avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle
Étude du rôle d’ApoE4 sur l’interaction synapse- astrocyte menant à la dégénérescence synaptique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle de la protéine ApoE4 dans la dégénérescence des synapses. Elles reçoivent une injection rétro-orbitaire et sept injections sous-cutanées, ainsi qu'un régime déplétant les microglies pendant un mois, avant mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur signale que les injections rétro-orbitaires peuvent provoquer une cécité ou une tumeur locale et qu'environ 15 % des souris du modèle développent une paralysie des membres postérieurs. Les bénéfices thérapeutiques sont renvoyés au 'moyen/long terme'.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L'apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L'isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l'hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA par l’intermédiaire des astrocytes (cellules nourricières des synapses) et des microglies (cellules immunitaires du cerveau). Le rationnel derrière cet objectif est d'identifier les protéines à l'interface astrocytes/synapses et comment elles sont affectées par ApoE4 et les microglies. Pour cela, nous marquerons et identifierons les protéines à l'interface neurone-astrocyte. Nous utiliserons des souris transgéniques P301S qui reproduit la dégénérescence synaptique comme observée chez les patients MA.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4, des astrocytes et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des microglies pour préserver l'interaction astrocyte/synapse et qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.
Procédures
- Une injection rétro-orbitaire et 7 injections sous-cutanées - Une euthanasie sous anesthésie/analgésie par injections IP et sous-cutanée (unique) - Une diète spéciale permettant la déplétion des microglies (1 mois).
Impact sur les animaux
Il n’y pas d’effets indésirables attendus sur les animaux liés à l’utilisation des traitements proposés (diètes). Les interventions telles que les injections rétro-orbitaires et la perfusion intra-cardiaque seront réalisées sous anesthésie. Suite aux injections RO, les souris pourraient développer de possibles effets indésirables comme un gonflement autour du site d'injection, une exophtalmie, un traumatisme oculaire, une cécité ou encore une croissance tumorale localisée. En ce qui concerne les injections sous-cutanées, elles seront faites sur un temps répété relativement court de 7 jours (une injection par jour) mais pourraient engendrer des plaies ou nécroses. Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables. Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique suivi d'une perfusion intracardiaque.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analysé.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants (cellules iPS et système CRISPR/Cas9), ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin.
Réduction
Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l'expérience, la souris sera euthanasiée. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Pour ces points limites, l’animal sera euthanasié. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois.
Choix des espèces
Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles puisqu'elles développent de la perte synaptique et des troubles cognitifs. - Toutes les souris du projet seront injectées via injection retro-orbitaire à l’âge de 4 à 5 mois (sous anesthésie) permettant d'identifier les protéines à l'interface synapse-astrocyte. - Une cohorte (cohorte 1) sera utilisée à 7 mois (euthanasie et collecte des tissus) afin d'évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle - Une cohorte (cohorte 2) sera utilisée à 10 mois (euthanasie et collecte des tissus) afin d'évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle
Cibler la signalisation mTORC1 des cellules gliales pour limiter la neuroinflammation hypothalamique dans le développement de l’obésité
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 356 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie du crâne ou une chirurgie vasculaire, des tests métaboliques avec prélèvements sanguins, un régime gras, des mises à jeun de vingt-quatre heures et une exposition au froid, ainsi que des isolements en cage individuelle, avant mise à mort pour prélever des tissus. Le porteur reconnaît des douleurs postopératoires liées à l'incision du crâne et un stress d'isolement et de contention, l'objectif étant d'étudier le rôle des cellules immunitaires du cerveau dans l'obésité. Sur le remplacement, il affirme que ces interactions entre le cerveau et les organes ne sont pas modélisables in vitro.
Objectifs
Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité et ses comorbidités, il est nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Dans le cerveau, on trouve des neurones qui sont sensibles à des signaux (hormones, sucres, graisses…) qui les renseignent sur l’état énergétique global de l’organisme. La consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses entraîne une inflammation du cerveau. La microglie, qui forme les cellules immunitaires du cerveau, est impliquée dans la régulation du poids corporel. Elle participe à la mise en place de l’'inflammation cérébrale lors de la consommation d'un régime gras. Son activation est variable en fonction de la longueur de la consommation du régime (entre les premiers jours et plusieurs semaines). Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués restent mal connus. Nous allons étudier deux molécules qui agissent sur l'activation de la microglie afin de déterminer si elles sont importantes pour la mise en place de l'inflammation cérébrale.
Bénéfices attendus
Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires du cerveau (microglies) dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime gras riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans le cerveau. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation de la microglie afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.
Procédures
Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. 1) Analyse de la composition corporelle : durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 1 à 4 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées au minimum de 3 semaines (1356 animaux). 2) Neuro-chirurgie : sous anesthésie générale + protocole analgésique. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée dans la vie de l’animal (60-75 minutes, 384 animaux). Une partie des 384 animaux subiront une deuxième chirurgie (60-75 minutes, 96 animaux) et une troisième anesthésie (45 minutes, les mêmes 96 animaux). 3) Chirurgie vasculaire : sous anesthésie générale + protocole analgésique. Une seule chirurgie vasculaire sera effectuée dans la vie de l’animal (30 minutes, 204 animaux). 3) Test de tolérance au glucose/insuline/pyruvate et clamp hyperglycémique : réalisé sur souris vigiles. Maximum 10 prélèvements sanguins de 10µl. Un seul test de chaque type sera réalisé durant toute l’étude (120 minutes, 492 animaux). 4) Tests de calorimétrie indirecte (288 animaux concernés au maximum) : isolement de l’animal vigile en cage individuelle enrichies (pendant deux semaines).
Impact sur les animaux
Dans notre étude, les animaux seront parfois isolés à l’âge adulte (suite à une chirurgie ou lors des sessions de cages métaboliques). Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal ou limiter la dégradation des implants. Au-delà du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Certains animaux subiront un stress métabolique lors de la mise à jeun pendant 24h et les 24h à une température de 4°C. Les prélèvements sanguins (maximum de 44 µl prélevés en une journée) peuvent induire une gêne passagère. Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. L’incision de la peau du crâne et la déshydration induite par l’anesthésie peuvent provoquer des douleurs post-opératoires.
Devenir
À l’issue de toutes les procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer des tissus, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les conqéquences des changements moléculaires microgliaux.
Remplacement
Le but de ce projet est de comprendre le rôle de la microglie hypothalamique sur un ensemble de variables métaboliques intégrées, telles que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. A noter, ce projet a d’abord fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures cellulaires) afin de mieux cibler les voies de signalisation impliquées dans notre hypothèse. De plus, les modèles génétiques nécessaires pour répondre à notre question scientifique ont été développés chez la souris.
Réduction
Sur la base de nos études antérieures, nous avons adapté le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 24 semaines et seront habitués pendant 1 semaine minimum. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique et une chirurgie vasculaire, qui seront réalisées sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.
Choix des espèces
LLa régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le métabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, l'inflammation hypothalamique et la réactivité microgliale induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 24 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 ou 25 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.