Système nerveux
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Modulation de la formation de la cicatrice gliale après une lésion de la moelle épinière chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris subit une lésion de la moelle épinière sous anesthésie, par section partielle ou par contusion, provoquant une paralysie des pattes, une incontinence urinaire, un risque d'escarres et une douleur pouvant atteindre l'hyperalgie et l'allodynie. L'objectif est de tester un traitement oral limitant la cicatrice gliale pour favoriser la récupération motrice. Le porteur affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité de la lésion in vivo et qualifie ce modèle animal d'"incontournable".
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière (LME) touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques sensori-moteurs minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs neuropathiques. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une LME. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une LME. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle physique et chimique à la repousse des cellules nerveuses lésées, empêchant ainsi la récupération fonctionnelle. Cette cicatrice est majoritairement composée de deux types de cellules. Nous avons montré chez des individus jeunes, qu’un traitement pharmacologique qui limite la prolifération d’une des deux populations cellulaires formant la cicatrice, donné par voie orale avant et juste après une section partielle de la moelle épinière favorise la récupération motrice chez les souris. Dans un but de transposition à la clinique, nous allons tout d’abord étendre notre approche (1) à un traitement initié plus tardivement lors de phases chroniques après la LME (transposition aux patients chroniques) et (2) à des individus plus âgés. De plus nous allons tester ces approches dans un autre modèle de LME, la contusion (ou choc) médullaire, plus proche de la réalité clinique.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière (LME) induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement curatif. Développer des travaux s’intéressant aux phases aiguës et chroniques représentent donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Les lésions médullaires étant d’origines variées chez l’homme (section par arme blanche, choc et écrasement…) nous utilisons des modèles similaires chez l’animal car ils représentent actuellement les paradigmes expérimentaux les plus pertinents pour comparer à la pathologie humaine. De plus, l’étude à des âges différents est aussi importante dans un contexte de translation à la clinique avec une population vieillissante dans les pays industrialisés. Notre projet est donc conçu avec un objectif de recherche translationnelle grâce à (1) l'utilisation d'un traitement par voie orale, (2) le traitement post lésionnel en phases aigüe et chronique, (3) l’analyse dans 2 modèles lésionnels, (4) l’étude d’individu jeunes et âgés, et (5) le suivi de l'évolution de la lésion par IRM comme chez l’homme. Nous obtiendrons aussi des informations mécanistiques sur le dialogue moléculaire des deux populations cellulaires formant la cicatrice gliale.
Procédures
Tout ou partie des animaux seront soumis à plusieurs interventions. Le prélèvement de tissu d’oreille est nécessaire pour effectuer le génotypage des animaux et sera effectué sur animaux vigiles de manière unique au moment du sevrage (J21). Les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale d'une durée 30 min (n=376) . Les animaux seront évalués à différents temps au niveau comportemental (2 tests différents sans contraintes pour l’animal) afin de déterminer la récupération des fonctions motrices après lésion de la moelle épinière (fréquence, durée, nombre). La moitié des animaux recevra via l’alimentation un traitement pharmacologique pour une durée de 7 jours soit juste après la lésion, soit 4 semaines ou 10 semaines après la lésion (le composé est inséré dans les croquettes). Les animaux recevront des injections quotidiennes en intra-péritonéal durant 7 jours soit juste après la lésion, soit avant l'euthanasie des animaux en fonction des groupes étudiés. Les animaux recevront une injection en sous cutanée d'anesthésique local (moins de 1min) puis une injection IP d’anesthésique (moins d'1 minute) afin de procéder aux prélèvements de tissus post-mortem et d’initier les études moléculaires, cellulaire ainsi que l’analyse des tissus.
Impact sur les animaux
Le génotypage peut induire un stress pour l’animal. Les injections quotidiennes en i.p. peuvent induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion spinale (hémisection) ou des deux pattes (contusion), une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection et dès le 14ème jour après la lésion dans le cas de la contusion. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré dans les deux modèles lésionnels, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection et le 14ème jour après une contusion. Nuisances sensitives : suite à la chirurgie des signes de détresse (pilo-érection, déshydratation, apparence voûtée, yeux enfoncés ou comportement d'isolement) peuvent être observés. 24-48hrs suivant la lésion, la douleur des animaux peut être de niveau 3 (hyperalgie, allodynie). Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de domination peuvent être observés. Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée.
Devenir
A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques, cellulaires et moléculaires. Notre projet est donc conçu avec un objectif de recherche translationnelle grâce à (1) l'utilisation d'un traitement par voie orale, (2) le traitement post lésionnel en phases aigüe et chronique, (3) l’analyse dans 2 modèles lésionnels, (4) l’étude d’individu jeunes et âgés, et (5) l'imagerie de la lésion par IRM. Nous obtiendrons aussi des informations mécanistiques sur le dialogue moléculaire des deux populations cellulaires formant la cicatrice gliale. L’analyse des tissus du système nerveux central est le seul moyen permettant de valider ou non nos hypothèses.
Remplacement
La règle des 3R sera appliquée. L’alternative à l’expérimentation animale est encouragée par l’utilisation des cultures primaires de neurones et de cellules gliales. Néanmoins, l’environnement cellulaire des neurones dans son ensemble (astrocytes, microglies) est limité par les co-cultures. Les cellules cultivées ne peuvent pas remplacer la complexité physiologique et pathologique que l’on a in vivo. In vivo un nombre important de populations cellulaires interagissent tant sur le plan moléculaire que structurel, ceci ne peut être reproduit in vitro. Les modèles animaux de traumatisme médullaire représentent donc actuellement le paradigme expérimental le plus pertinent qui reproduit fidèlement la pathologie humaine. Ces modèles animaux seront utilisés pour étudier l’altération tissulaire et cellulaire ainsi que les modifications moléculaires in vivo et nous aideront à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. Ces approches thérapeutiques ne peuvent être menées que chez l’animal et représentent une étape préclinique capitale et incontournable si l’on projette une application clinique.
Réduction
Ce projet permet l’utilisation de tous les animaux produits. De plus de nombreuses analyses sont effectués sur les mêmes animaux. Grâce aux études précédentes que nous avons mené mais également par anticipation des approches statistiques que nous utiliserons nous avons déterminé un nombre d’animaux permettant de conclure sans engager d’expériences supplémentaires tant pour les approches comportementales, histologiques (évaluation de la puissance statistique d’un protocole en fonction des effectifs) . Afin d’optimiser les lots, nous avons décidé de développer cette étude portant à la fois sur les 2 sexes, mais également à deux âges différents, ce qui permet l’utilisation de tous les animaux générés. Dans le cadre de l’étude transcriptomique, nous veillons à optimiser les lots d’animaux générés en réservant les animaux porteurs du transgène pour les expériences de biologie moléculaire, les compagnons de portée non transgénique seront utilisés dans les autres expériences.
Raffinement
Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées (biais). Réduction de la souffrance : soins quotidiens spécifiques (zone d’incision vérifiée, vessie vidangée manuellement 2 fois par jour, absence d’escarre, prise alimentaire vérifiée). Signes de détresse vérifiés 2 fois par jour après la lésion [au moins 2 semaines, (pilo-érection, déshydratation, apparence voûtée, yeux enfoncés, perte de poids, comportement d'isolement)]. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.
Choix des espèces
Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les LME, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Travailler avec cette espèce nous permet de comparer avec les résultats précédemment obtenus dans notre groupe et dans les autres équipes de recherche. Les souris expriment un marqueur fluorescent, ), spécifiquement dans les astrocytes et la microglie . Ceci permet le tri cellulaire et l’obtention de population pure de cellules ainsi que l’identification sans marquage des cellules gliales . Nous travaillons avec ces deux souches depuis de nombreuses années et avons donc de nombreuses données disponibles. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 1, 2, 6 ou 12 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée plus importants et surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique. Les animaux sont gardés 1, 2, 6 ou 12 semaines pour avoir un suivi des évènements moléculaires, cellulaires, tissulaires et phénotypiques en phase chronique. Ceci est primordial dans le cadre d’une transposition à la clinique pour des patients aigus et chroniques.
Rôle de deux enzymes dans l’épileptogenèse chez la souris atteinte de la sclérose tubéreuse de Bourneville sur le cerveau. 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une chirurgie cérébrale sous anesthésie pour la pose de transmetteurs, toutes reçoivent des injections quotidiennes pendant quinze jours, et le porteur anticipe des crises d'épilepsie potentiellement mortelles pour 10 % des animaux. L'objectif est de créer des souris porteuses de deux gènes inactivés pour étudier la sclérose tubéreuse de Bourneville. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut reproduire le développement cortical et l'épilepsie.
Objectifs
Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels dans le cerveau. Ces modèles nous permettrons de mieux comprendre les mécanismes conduisant à des désordres neurologiques et des crises épileptiques.
Bénéfices attendus
L'établissement de modèles murins pertinents de la sclérose tubéreuse de Bourneville avec atteintes cérébrales permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose tubéreuse de Bourneville et de découvrir des mécanismes génétiques responsables du développement de malformations corticales et de la formation des crises d’épilepsie. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans la sclérose tubéreuse de Bourneville et dans d’autres pathologies neurologiques et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients réfractaires aux traitements actuels.
Procédures
1200 souris seront utilisées dont 600 souris qui auront de la chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie de 3 minutes) pour subir des injections. Les 1200 souris seront soumises à des traitements pharmacologiques par injections quotidienne pendant 15 jours d'une durée de 1min. 600 souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale de 20 min afin d’enregistrer les crises épileptiques et les paramètres physiologiques en continue sans stress des animaux sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
La cinétique des signes cliniques des animaux épileptiques est bien connue et démontrent un phénotype précoce et sévère. Nous anticipons que le phénotype des animaux que nous avons générés, sera potentiellement moins sévère que celui des animaux épileptiques. Cependant, nous ne pouvons exclure que ces animaux développent un phénotype équivalent et nous nous attendons à observer chez ces animaux la survenue des crises épileptiques même si plus tardives et moins fréquentes mais qui pourraient être léthales pour 10% des souris. Les traitements pharmacologiques par injection n'entrainent pas d'effet néfaste. Les injections répétées sont susceptibles d’entraîner des irritations, si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. La pose des transmetteurs pour permettre la télémétrie se fera sous anesthésie générale. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après les chirurgies. Il n'est pas connu de risque de rejet du transmetteur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Le développement corticale et l’épilepsie est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations endocrines. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes d'intérèt sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. les traitements pharmacologiques ne présentent pas de toxicité et ont déjà été testées in vitro ainsi que in vivo aux mêmes doses. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.
Réduction
L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. Dans ce modèle, un groupe de 25 animaux est suffisant donc des groupes de 25 animaux seront utilisés. L'estimation du nombre d'animaux a été réalisé en comptant une perte de 10% de nos animaux.
Raffinement
Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton, de bâtonnets de bois et de tunnel. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites 2 fois par semaine. Le traitement pharmacologique choisi sera administré quotidiennement et sera effectué par un technicien expérimenté à l'aide de seringues très fine qui donnent une injection quasi indolore. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Les traitements pharmacologiques par injection ne provoquent pas d'effet néfaste. Les injections auront lieu alternativement à gauche ou droite. Pour éviter une irritation, une solution apaisante sera appliquée. La pose de transmetteur sera faite sous anesthésie générale avec une analgésie. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après la chirurgie. Des points limites spécifiques ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.
Choix des espèces
Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes d'intérèt, jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons d’un large répertoire de lignées de souris modèles, ce qui permet d’évaluer l’interaction parmi plusieurs éléments de cette signalisation ; 4) nous disposons également de nombreux outils adaptés à la souris ; 5) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. 6) l'âge postnatal est le stade de développement privilégié pour étudier la survenue des crises épileptiques.
Rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité cérébrale au cours du développement pubertaire de la souris mâle.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
144 souris mâles vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales puis subissent un acte chirurgical terminal de vingt minutes, le cerveau étant prélevé pour analyses. L'objectif est fondamental, étudier le rôle de l'œstradiol dans la plasticité cérébrale au cours de la puberté. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet cette analyse et qu'il n'est "pas possible" de remplacer le recours à l'"organisme entier".
Objectifs
La puberté est une période critique de développement aboutissant à la maturité sexuelle. C’est un moment de plasticité cérébrale intense, associé à de considérables changements hormonaux, neuraux et comportementaux. La puberté est déclenchée par la réactivation de l'axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique. L'augmentation pubertaire de la sécrétion des stéroïdes sexuels et la localisation cérébrale des récepteurs des œstrogènes suggère un rôle clé de l’œstradiol dans la neuroplasticité pubertaire. De plus, les récepteurs des œstrogènes ont été localisés au sein des mitochondries, suggérant un rôle de l'œstradiol dans les changements qui ont lieu à la puberté. L'objectif de ce projet est d'étudier les changements de plasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire. Des souris mâles seront utilisées afin d’étudier la morphologie neuronale et mitochondriale au cours du développement hypothalamique et d’identifier les périodes les plus sensibles aux changements hormonaux.
Bénéfices attendus
Les données obtenues contribueront à déterminer les périodes clés de plasticité du cerveau et le rôle des œstrogènes pubertaires dans ces processus. Ceci est particulièrement pertinent dans le contexte du développement de meilleurs traitements pour les troubles de la puberté mais également pour les troubles psychiatriques et comportementaux qui se manifestent souvent pendant cette période.
Procédures
Les animaux (n=144) subiront un acte unique de chirurgie terminale effectuée sous anesthésie et analgésique d’une durée de 20 minutes. A l’issue de cet acte terminal les prélèvements sont réalisés pour analyse.
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales. Les produits administrés n’ont pas d’effet douloureux connus, les animaux auront le seul inconfort de la contention et de l’injection. Pour la mise à mort, les animaux sont anesthésiés profondément avant la chirurgie terminale par une personne expérimentée. Les animaux sont observés attentivement pendant l’anesthésie et toute modification comportementale caractéristique d'une douleur intense, d'une détresse respiratoire ou d'une souffrance sera considérée comme point limite. Au besoin, une dose de rappel d’anesthésique sera effectuée.
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses neuroanatomiques et morphologiques.
Remplacement
L'étude du rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité au cours du développement pubertaire nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses neuroanatomiques et neuroendocrines de physiologie intégrée qui n’est pas possible d’analyser à l’aide de méthodes alternatives et/ou substitutives. Il n'est donc pas possible de remplacer l’utilisation d’organisme entier.
Réduction
Le nombre total d'animaux utilisé est 144. Il a été calculé au plus juste pour garantir la puissance statistique de l’étude. L’expertise scientifique de l’équipe dans l’étude neuroanatomique des fonctions de reproduction permet de connaitre le nombre d’animaux nécessaire par groupe afin d’obtenir des résultats fiables. Les effectifs utilisés ont été calculés au plus juste afin d'obtenir une analyse statistique significative le cas échéant, compte tenu de la variabilité interindividuelle. Afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs régions du cerveau seront analysées pour chaque animal. Les autres organes (hypophyse, ovaire, dents, squelette...) seront proposés aux collaborateurs de l'équipe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. L'anesthésie profonde de l'animal est vérifiée par le pincement de la patte arrière et l'absence du réflexe de clignement de paupière suite à une stimulation de l'œil. Une analgésie sera effectuée 20 minutes avant la chirurgie terminale.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et neuroanatomiques grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...) et de données dans la littérature permettant, d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Ce projet apportera de nouvelles connaissances complémentaires quant aux changements cérébraux qui ont lieu en particulier dans l’hypothalamus au cours du développement postnatal et pubertaire.
Rôle de la leptine dans les altérations comportementales liées au syndrome de Rett
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ces souris génétiquement modifiées reproduisent le syndrome de Rett, avec difficultés respiratoires, troubles moteurs, crises d'épilepsie et une espérance de vie réduite à deux mois pour les mâles, auxquels s'ajoutent des injections sous-cutanées quotidiennes et des prélèvements sanguins. Le résumé évoque des analyses comportementales sans préciser lesquelles. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut reproduire les réseaux neuronaux du syndrome et présente le rôle de la leptine comme un espoir thérapeutique.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. Ce syndrome entraine un polyhandicap qui se manifeste par une déficience intellectuelle sévère, infirmité motrice, des troubles respiratoires et présence d’activité épileptique. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif de la maladie. Diverses thérapies géniques ou pharmacologiques sont envisagées pour traités ce syndrome. Notre objectif est de développer une approche thérapeutique ciblant la leptine. La leptine est une hormone sécrétée par le tissu adipeux, capable d’agir au niveau du cerveau et de contrôler de nombreuses fonctions physiologiques telles que la prise alimentaire, le métabolisme, les activités respiratoires et cardio-vasculaires, l’anxiété, les fonctions cognitives et la susceptibilité à l’épilepsie. Ces fonctions sont affectées chez les patients atteints du syndrome de Rett et chez les modèles murins, ce qui soulève la possibilité que des niveaux excessifs de leptine puissent contribuer à la progression du syndrome de Rett. En accord avec cette hypothèse, des taux élevés de leptine circulante ont été observés chez des patients atteints du syndrome de Rett et dans des modèles de murins. Notre objectif est de tester le rôle de l’hormone adipocytaire, leptine, dans les troubles comportementaux associés au syndrome de Rett sur un modèle murin.
Bénéfices attendus
Notre espoir est de démontrer un rôle de la leptine dans l’éthologie du syndrome de Rett et ainsi ouvrir une nouvelle approche thérapeutique pour traiter cette maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées quotidiennes entre le 40ieme et 50ieme jour de vie postnatale pour les mâles et entre le 60ieme et 80ieme jour de vie postnatale pour les femelles. Un prélèvement sanguin sera effectué au début et à la fin du traitement.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons le modèle murin. Il s’agit de souris transgéniques qui présentent des symptômes qui rappellent les troubles décrits chez les patients atteints de syndrome de Rett, et donc un phénotype dommageable. Ces souris mâles présentent des difficultés respiratoires, des problèmes de locomoteur, des troubles cognitifs et une perte de poids à partir d'un mois. Leur espérance de vie est de 2mois. Les souris femelles hétérozygotes présentent les mêmes troubles vers l'âge de 6 mois. Elles présentent également dans certains cas, des activités épileptiques spontanées et contrairement aux mâles une prise de poids progressive. Elles ne présentent pas de surmortalité par rapport aux souris sauvages.
Devenir
Les animaux utilisés pour les analyses comportementales et neuronales seront euthanasiés.
Remplacement
Seule l'expérimentation chez l'animal permettra de remplir les objectifs de ce projet. Il n'est actuellement pas possible pour les méthodes in vitro (non animales) de reproduire les processus pathologiques complexes du syndrome de Rett. L’organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux ne peuvent être reproduits dans des modèles de lignées cellulaires ou de cultures neuronales.
Réduction
Des calculs statistiques utilisant les données d'études antérieures ont été utilisés pour calculer le nombre minimum d'animaux requis tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement significatifs. Les tâches proposées permettent d’évaluer les animaux sur plusieurs paramètres (comportementaux et immuno-histologie; électrophysiologie et histologie, prélèvements sanguins), réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Pour les enregistrements électrophysiologiques, 2 chercheurs seront mobilisés. La présence de 2 chercheurs pour les analyses électrophysiologiques permettra d’augmenter le nombre de neurones enregistrés par animal, et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés pour atteindre une taille de l’échantillon (nombre de neurones enregistrés) permettant une analyse statique.
Raffinement
Les animaux seront habitués à la manipulation par l’expérimentateur. Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement via l’observation de leur aspect général (poil hirsute, position voutée, yeux) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation). Le suivi de leur poids sera également un critère. Lorsque les points limites sont atteints (signes visibles de la maladie, perte ou prise de poids excessive) les animaux seront sacrifiés. L'équipe continuera à examiner les dernières découvertes afin d'identifier toute nouvelle possibilité d'affiner l'expérience de ces animaux, tout en atteignant les objectifs de l'étude.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale. Elle présente de nombreux intérêts : sa taille, son rythme rapide de reproduction et une gestation courte par rapport à d’autres organismes-modèles. De nombreux animaux existent permettant par exemple de déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans différentes pathologies. Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement qui récapitulent les symptômes décrits chez les patients atteints du syndrome de Rett. Il s’agit donc d’un modèle pertinent concernant les objectifs du présent projet. Pour ce projet, des injections seront effectuées sur des mâles âgés de 40 jours de vie postnatale, pendant 10 jours consécutifs et chez des femelles âgées de 60 jours pendant 20 jours. Les analyses comportementales et histologiques seront réalisées entre le 50ieme et 55ieme jour de vie postnatale pour le mâles et aux alentours du 80ieme jour de vie pour les femelles. Ces stades développementaux correspondent aux périodes d'apparition et d'aggravation des symptômes.
Imagerie fonctionnelle du cerveau chez les cichlidés Amatitlania nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra par IRM (EU 1/2).
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
540 poissons cichlidés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Chaque animal reçoit une injection de manganèse comme produit de contraste puis passe une IRM d'environ deux heures sous anesthésie, pour cartographier les régions du cerveau liées à leurs capacités cognitives. Le porteur reconnaît une toxicité possible du manganèse sur le long terme et une douleur liée à l'injection, et indique que les poissons ne pourront pas être réutilisés car ils ne seront plus naïfs. Il conclut que ces trois espèces au grand cerveau ne peuvent pas être remplacées pour cette étude fondamentale.
Objectifs
Certains poissons téléostéens comme les Labres et les Cichlidés présentent des comportements semblables à ceux de l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau des cichlidés, en particulier les espèces Amatitlania nigrofasciata (A. nigrofasciata), Neolamprologus brichardi (N. brichardi), et Pseudotropheus zebra (P. zebra). Ces trois espèces ont des origines géographiques, une taille et des comportements différents. Les cerveaux des poissons téléostéens sont organisés de façon très différente par rapport aux cerveaux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. En particulier, une structure de la partie ventrale du cerveau, le lobe inférieur, n'existe que chez les téléostéens, et n’est pas retrouvée chez les mammifères ou les oiseaux. Les fonctions de cette structure demeurent inconnues, et nos travaux précédents suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans les fonctions cognitives remarquables des cichlidés et des labres. Mieux connaître la fonction du lobe inférieur chez les poissons téléostéens permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux aussi différents que ceux des téléostéens ont pu permettre l’émergence de comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Bénéfices attendus
Les cichlidés présentent des comportements assez complexes incluant certaines capacités cognitives dites de « haut niveau ». Cependant, les structures cérébrales impliquées demeurent méconnues. Afin d’expliquer comment les cerveaux des poissons produisent ces comportements, des études fonctionnelles sont nécessaires. Nos études précédentes montrent que l'organisation globale du cerveau de poissons téléostéens est très différente de celle des tétrapodes, et que le lobe inférieur, une structure unique aux téléostéens, pourrait être impliquée dans ces comportements complexes. Cette étude fonctionnelle permettra de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Procédures
Injection d’un produit de contraste sous anesthésie (moins de 5 minutes), et, à distance, imagerie par résonnance magnétique (IRM) sous anesthésie durant environ 2 heures. Le nombre des animaux utilisés au cours des 5 ans du projet est de 540 au total. Chaque animal subit la procédure une fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées à l’isolement des poissons, au stress du transport et à l’anesthésie, ainsi que la potentielle toxicité du manganèse sur le long terme (peu de recul sur les effets d’une injection de manganèse au-delà d’un mois) et la douleur liée à son injection.
Devenir
Même si ce projet est constitué uniquement d’une procédure de classe légère, les animaux ne pourront pas être réutilisés pour des tâches de comportement, puisqu’ils ne seront plus naïfs. De ce fait, il n’est pas possible de les réutiliser, et leur mise à mort est nécessaire. Suite à la mise à mort, les cerveaux des animaux seront prélevés et pourront servir à des expériences de neuroanatomie. Le replacement ou l’adoption des animaux n’est pas une solution retenue en raison du nombre d’animaux impliqués, et du fait que les effets à long terme d’injection de manganèse sur la santé des poissons ne sont pas connus.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées. Notre étude nécessite un échantillonnage d'espèces qui ont un grand cerveau avec des capacités cognitives de haut niveau, et qui possèdent un lobe inférieur développé, ce qui est le cas des cichlidés. Les tests comportementaux prévus ne peuvent être réalisé que sur ces animaux. Les trois espèces que nous souhaitons utiliser, A. nigrofasciata, N. brichardi, P. zebra, ont des comportements très différents et des cerveaux organisés de façon différentes. De ce fait, il est pertinent et nécessaire d'utiliser ces trois espèces de cichlidés.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses, et nous privilégierons des tests statistiques qui permettront de limiter le nombre d’individus nécessaires. Des études IRM précédemment publiées chez les mammifères, oiseaux et amphibiens nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être sera particulièrement observé par des zootechniciens compétents. Une communication entre le personnel de zootechnie et les expérimentateurs permettra un suivi adéquat des animaux. Nous n'attendons pas de souffrance lors de nos tests mais dans chaque cas, nous suivrons les signes visibles d’un animal souffrant et procéderons si nécessaire à une interruption de l’expérience, à une analgésie ou à une euthanasie. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, rétraction des pigments. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement pour fournir de l'enrichissement. Les poissons seront mis à l’isolement (individualisés) dès que les tests comportementaux auront commencés et pour une durée maximum d’un mois. Un contact visuel entre les poissons sera possible puisque les aquariums seront placés les uns à côté des autres. Lors du transport des animaux vers la plateforme d’imagerie, ce transport s’effectuera dans une boite en polystyrène opaque munie de chaufferettes permettant de maintenir les animaux à une température adéquate. De plus, ce transport sera de courte durée.
Choix des espèces
Les poissons téléostéens ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses anatomiques étudiant les structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez A. nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra, mais chaque espèce présente des comportements particuliers et qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude fonctionnelle de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser l’imagerie nécessaire à ce projet avec une résolution suffisante. L’utilisation de cichlidés, et en particulier de ces trois espèces, dont la taille du cerveau permet l’imagerie, semble donc toute indiquée. Nous travaillerons sur des jeunes adultes (taille du corps à partir de 3 cm) car il nous est nécessaire d’étudier un cerveau pleinement développé.
Effets therapeutiques de l’ouverture de la barriere hemato-encephalique sur la propagation des lesions dans un modele murin de maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 20 reproducteurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris transgéniques reçoivent une inoculation intracérébrale d'extraits de cerveaux de patients atteints d'Alzheimer, puis cinq séances d'ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons sous anesthésie, avant un test de mémoire. Le porteur indique que ces souris développent une paralysie des membres postérieurs et un amaigrissement, et que la chirurgie intracérébrale peut provoquer une douleur. Il affirme qu'aucune alternative non animale ne peut se substituer à ces souris transgéniques.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable qui est devenue un impact majeur de santé publique. La maladie d’Alzheimer est caractérisée par l’accumulation anormale de différentes protéines dans le cerveau des patients. Une de ces protéines est nommée Abéta et se dépose sous forme de plaques appelées plaques amyloïdes. De nombreux essais cliniques, chez l’animal et chez l’homme, montrent une élimination de la protéine Abéta du cerveau des patients mais sans effet sur les symptômes. Une autre protéine, la protéine tau, s’accumule également dans le cerveau des patients. Tau s’agrège à l’intérieur des neurones et fait l’objet de nombreuses recherches cliniques et pré-cliniques, notamment parce qu’elle est fortement liée au déclin cognitif des patients. Un obstacle majeur au développement de thérapies efficaces dans la maladie d’Alzheimer repose cependant sur l’existence d'une barrière « sang-cerveau » qui contrôle les entrées et sorties entre le cerveau et l’extérieur. Cette barrière a pour rôle de protéger le cerveau. Cependant, la barrière sang-cerveau rend aussi difficile la pénétration des molécules thérapeutiques dans le tissu cérébral. Ces dernières années, un moyen d’ouvrir cette barrière a été décrit. Il s’agit de l’utilisation d’ultrasons appliqués sur la surface du crâne, associée à l’injection intraveineuse de microbulles (produits de contraste échographique couramment utilisés) qui permettent de distendre, de manière transitoire et sans effet secondaire, les parois de la barrière et ainsi autorisent la pénétration des molécules thérapeutiques. Cette technique a déjà été appliquée avec succès dans le traitement par chimiothérapie des tumeurs cérébrales. Concernant la maladie d’Alzheimer, il a été montré chez l’animal des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière seule sur l’élimination des protéines pathologiques (Abéta et tau). Cependant, les effets de l’ouverture de barrière sur la propagation des lésions dans le cerveau ne sont pas connus. En particulier, est-ce que l’ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau permet de freiner la progression des agrégats de protéines tau en empêchant leur passage d’une aire cérébrale à une autre ? Cette question constitue l’objet de notre travail. Celui-ci sera réalisé sur des souris génétiquement modifiées pour reproduire les accumulations de protéine tau caractéristiques de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Plusieurs études récentes ont montré des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière via l’association des ultrasons avec les microbulles chez l’animal avec une diminution de l’accumulation de la protéine Abéta et de la protéine tau dans le cerveau. Le ou les mécanismes par lesquels l’ouverture seule de la barrière (non associée à l’injection de molécule thérapeutique) permettrait ces effets thérapeutiques restent à ce jour non connus. Par ailleurs, d’autres études ont montré que l’inoculation intra-cérébrale d’extraits de cerveaux d’individus atteints de maladie d’Alzheimer provoquait expérimentalement, chez l’animal, une augmentation de la propagation de la pathologie. Ainsi, notre projet a pour visée de déterminer l’effet de l’ouverture de la barrière par ultrasons sur la propagation de la pathologie tau. Notre hypothèse est que l’ouverture de barrière permettra de freiner la dissémination-propagation des lésions. Au long terme, ces recherches pourraient permettre le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques innovantes et, parallèlement, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Les animaux transgéniques sont un modèle de maladie d’Alzheimer avec des lésions cérébrales et des signes cliniques (paralysie, perte de poids) qui peuvent être précoces. Pour cette raison, les animaux feront l’objet d’un suivi rapproché pendant toute la durée de l’étude (examen et pesée 1-2 fois par semaine). Pour les animaux, il y aura au maximum 3 étapes expérimentales : La première consiste en l’inoculation intra-cérébrale des extraits de cerveaux de patients présentant une Maladie d’Alzheimer. Celle-ci est réalisée, chez 130 souris, sous anesthésie générale. Cette chirurgie est unique, d’une durée d’environ 30 minutes, et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). Par la suite (15 jours plus tard), aura lieu la seconde étape (ouverture de la barrière par ultrasons). Cinq séances d’ouverture de la barrière par ultrasons (en externe, sans ouverture du crâne) seront réalisées à un rythme d’une séance par semaine. Lors de chacune de ces séances, les souris seront anesthésiées. La durée d’une séance pour chaque animal est d’environ 10 minutes. Au bout de 5 semaines de traitement par ouverture de barrière, 80 des 130 animaux seront finalement évalués par un test de mémoire non-invasif (observation du comportement spontané dans une enceinte carrée pendant 2x10 minutes). Le test sera réalisé 72 heures après la dernière séance de sonication. A la fin de l’étude, l’examen du cerveau des souris sera effectué en postmortem afin d’explorer l’effet de l’ouverture de la barrière sur la propagation de la pathologie chez les souris. Pour produire les 130 souris nécessaires au projet, nous utiliserons les animaux reproducteurs de notre colonie (20 mâles transgéniques). Le nombre total d’animaux est donc de 150.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisées dans cette étude présentent un phénotype dommageable et développent vers l’âge de 7 mois (parfois plus tôt) des lésions des voies motrices entraînant une paralysie des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement lié aux difficultés d’accès à la nourriture et à la boisson. Comme nous utiliserons des souris jeunes (4-6 mois) nous ne devrions pas observer ces phénotypes dommageables. Les deux manipulations chirurgicales de ce projet (inoculations intracérébrales et ouverture de la barrière hémato-encéphalique) sont associées aux risques anesthésiques habituels. Ceux-ci comprennent le risque d’hypothermie lors de l’anesthésie, le risque de déshydratation et le risque de d’anomalies cardiaques et respiratoires liées au produit anesthésique. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie si celle-ci est correctement réalisée (chirurgie courte, utilisation de produits anti-douleurs). Concernant l’étape d’ouverture de la barrière, il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. En effet, celle-ci n’implique pas d’ouverture cutanée. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané de l’animal, sans restriction d’accès à l’eau ou à l’alimentation, sans menace pour l’animal, et impliquant un stress modéré lors de la manipulation (sortie de la cage) et du placement dans un nouvel environnement.
Devenir
A l’issue de la procédure, l’ensemble des animaux expérimentaux (n = 130) sera ensuite euthanasié pour prélèvement de leurs cerveaux à visée d’analyse. Les animaux transgéniques servant à la reproduction (n = 20) seront euthanasiés.
Remplacement
L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale. Ce modèle de souris est le modèle le plus couramment utilisé dans les études précédentes sur le sujet.
Réduction
Le nombre d’animaux produits et maintenus sur site est réduit au maximum. La taille des groupes d’animaux (10-20 souris par groupe expérimental) produits pour les futures études est définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature afin de permettre de générer des données fiables. L’ensemble des animaux seront produits sur site (colonie implantée depuis plusieurs années). 7 lots expérimentaux seront utilisés : Expérience 1 (étude pilote) – Effet de l’ouverture de la barrière sur la propagation des lésions cérébrales 3 lots d’animaux (normaux ou transgéniques) recevront une inoculation intracérébrale couplée (ou pas) à une ouverture de la barrière. Ces 3 lots serviront à l’évaluation du traitement sur la cible principale (lésions tau dans le cerveau). Expérience 2 (plan expérimental complet) - Effet de l’ouverture de la barrière sur les fonctions cognitives et les lésions cérébrales 4 lots d’animaux (normaux ou transgéniques) recevront une inoculation intracérébrale (« Alzheimer » ou « contrôle ») couplée à une ouverture de la barrière. Les animaux seront ensuite testés dans un test de mémoire. Ces 4 lots permettront une description complète (clinique, neuropathologique et biochimique) des effets du traitement (inoculation intracérébrale + ouverture de la barrière). Au total, 130 souris seront utilisées pour les expériences et 20 souris transgéniques seront utilisées pour la production des animaux expérimentaux.
Raffinement
L’établissement utilisateur où sont hébergés les animaux étant agréé, les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées quotidiennement. Les animaux sont hébergés par groupes de 4 ou 5 souris et bénéficient également d’un enrichissement matériel (coton ou kraft pour faire un nid, maisons en cellulose). Nous avons déjà mis en place un programme qui vise au suivi rapproché de la lignée de souris modèle de maladie d’Alzheimer afin de détecter l’apparition de symptômes dommageables. Ce suivi sera réalisé pendant toute la durée de l’étude, de la naissance à la mort, et permettra de détecter les animaux avec des signes cliniques et de prendre des mesures adaptées (prise en charge de la douleur, aménagement environnement, euthanasie). Les deux étapes du projet (inoculation intracérébrale et ouvertures de la barrière hémato-encéphalique) sont associées aux risques anesthésiques habituels (hypothermie, deshydratation, sur- ou sous-dosage) pour lesquels plusieurs mesures seront mises en place (tapis chauffant, réhydratation avant la chirurgie, surveillance rapprochée de la sédation). Une surveillance post-opératoire sera également mise en place. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie chez l’animal mais nous avons prévu de prévenir celle-ci par l’administration d’anti-douleurs (analgésiques) avant et après la chirurgie associée à l’anesthésie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie. Concernant les étapes d’ouverture de la barrière « sang-cerveau » et d’évaluation comportementale, il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané de l’animal, avec accès à l’eau et l’alimentation, sans renforcement aversif, et n’impliquant à priori pas de stress majeur chez l’animal (si ce n’est la manipulation et le placement dans un nouvel environnement). Le suivi rapproché des animaux au cours de la phase d’élevage et d’expérimentation permettra d’identifier l’atteinte de points limites et d’intervenir pour minimiser toute souffrance animale.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris transgéniques qui développent des lésions similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle autre que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du présent projet. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal à l’âge adulte. Les injections intracrâniennes seront effectuées sur les animaux jeunes adultes (âgés de 4 mois), âge auquel les lésions de type Alzheimer ne sont pas encore importantes et la boite crânienne est mature et stable, autorisant une chirurgie stéréotaxique précise. Les traitements d’ouverture de barrière seront initiés à l’âge de 4.5 mois (début des lésions) sur une durée d’un mois et demi avant évaluation comportementale et l’euthanasie des animaux. L’évolution des lésions à 6 mois pourra ainsi être évaluée et leur régression après traitement mesurée.
Etude des effets de la stimulation magnétique répétitive trans-médullaire sur l’inflammation du tissu cérébral, la neurogenèse hippocampique et la cognition après lésion de la moelle épinière chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
138 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. La plupart subissent une lésion de la moelle épinière sous anesthésie, qui provoque une paralysie des membres postérieurs et des difficultés à se déplacer pour se nourrir, puis une partie reçoit une stimulation magnétique et passe un test de reconnaissance d'objet. Le porteur veut mesurer l'effet de cette stimulation sur l'inflammation cérébrale et la cognition après le traumatisme. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux expériences sur l'animal vivant et conclut que le modèle animal reste nécessaire.
Objectifs
Les traumatismes médullaires sont le plus souvent d’origine traumatique (LMT) et entrainent un handicap fonctionnel majeur chez l’homme (paraplégie ou tétraplégie, incapacité à se déplacer, assistance ventilatoire à vie…). De plus, il a également été mis en évidence chez les patients atteints de LMT que ces derniers souffraient de troubles cognitifs avec par exemple une survenue d’épisodes dépressifs. Récemment, une étude chez l’animal a permis de démontrer que la LMT induit une inflammation massive de l’encéphale, pertube la neurogenèse hippocampique et entraine un déclin des fonctions cognitives. Des études menées dans notre laboratoire ont permis de mettre évidence pour la première fois que la transplantation de cellules gliales olfactives au niveau du site de lésion médullaire permet de réduire l’inflammation cérébrale et permet également de restaurer les fonctions cognitives. Nous voudrions ici reproduire ces résultats mais avec un autre type de thérapie, la stimulation magnétique répétitive trans-médullaire (rTSMS). En effet, dans une précédente étude nous avons démontré que cette thérapie permet d’induire une récupération fonctionnelle motrice et tissulaire chez la souris et également chez le rat. La rTSMS a notamment un rôle sur l’inflammation et la réactivité microgliale. De ce fait, ce projet a pour objectif de mesurer les effets de la stimulation magnétique répétitive trans-médullaire sur l’inflammation du tissu cérébral, la neurogenèse hippocampique et la cognition après lésion de la moelle épinière.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra d’avoir une meilleure connaissance sur les bénéfices d’une méthode non invasive (stimulation magnétique répétitive) notamment sur la capacité de ce traitement à induire une récupération des fonctions cognitives chez la souris suite à une lésion de la moelle épinière. Cela permettrait, sur un plus long terme, d’envisager de proposer ce traitement après lésion médullaire chez l’Homme afin d’éviter les problèmes cognitifs qui surviennent après ce type de lésions.
Procédures
- 118 souris seront utilisées sur lesquelles seront réalisées une lésion de la moelle épignière sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. Le lendemain et jusqu’au 15ème jour, sous anesthésie générale, la moitié des souris (soit 49 souris) sera utilisée pour la procédure de stimulation magnétique pendant 10 minutes à raison de 10hz pendant 10 secondes suivies de 20 secondes sans stimulation à un intensité de 0.4T. 30 souris seront utilisées afin de réaliser des expériences de reconnaissance d’objet, ces expériences sont non-invasives et non douloureuses et se feront sur animal vigile. Ces expériences nécéssitent de réaliser trois cessions par temps expérimentaux (15, 30 et 60 jours après la réalisation de la lésion). Chacune des cessions durera entre 5 et 10 minutes. 20 animaux « controles » sans lésion seront également utilisés afin d’obtenir des valeurs controles pour les différents expériences (histologie, RT-QPCR et test cognitif). L’ensemble des animaux (138 souris) sera fixé, 61 jours après la lésion pour ceux (118 souris) ayant subis une lésion afin de récupérer la moelle épinière et le cerveau. La chirurgie qui permet de fixer les animaux durera 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
- Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie - Paralysie des membres postérieurs - Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s’abreuver après le reveil
Devenir
L’ensemble des animaux (138 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (61 jours maximum après la lésion de la moelle épinière) afin de procéder au prélévement de la moelle et du cerveau. Les souris ayant subis des lésions médullaires ne peuvent faire l’objet d’un don ou bien d’une « réutilisation ».
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer l’inflammation et la neurogenèse hippocampique, ainsi que la récupération fonctionnelle de l’animal suite à une lésion de moelle épinière après un traitement par stimulation magnétique répétitive.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué à partir des études précédentes effectuées dans notre Laboratoire, à savoir que les expériences histologiques et de RT-qPCR nécessitent un minimum de 6 à 10 animaux et les expériences fonctionnelles nécessitent un minimum de 12 à 15 animaux. Des tests statistiques non paramétriques de type Mann Whitney seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6 par groupe. L'utilisation de 10 à 15 animaux pour certaines expériences se justifie par la variabilité pouvant être observée notamment lors des tests fonctionnels (motivation des animaux).
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés après induction gazeuse sans contention. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse aux mécanismes cellulaires et moléculaires présents dans la moelle épinière et le cerveau adulte. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettrait de pouvoir proposer des thérapies plus efficaces aux personnes souffrant de paraplégie ou de tétraplégie. Il nécessite la mise en place de modèles comparables aux pathologies humaines. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de modèles animaux. Les lésions médullaires chez l’Homme concerne le jeune adulte, de ce fait afin de mimer au mieux ces lésions, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines.
Evaluer le rôle potentiel du récepteur 5-HT7 de la sérotonine et l’intérêt de ses ligands pour des applications thérapeutiques dans la sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une démyélinisation est induite par la cuprizone, puis les souris reçoivent un gavage quotidien pendant six semaines, des séances d'IRM sous anesthésie et, pour la mise à mort, une perfusion ou une ponction intracardiaque, afin de tester une molécule ciblant le récepteur 5-HT7 dans la sclérose en plaques. Le porteur indique n'attendre pas de douleur liée à la cuprizone mais reconnaît que les injections quotidiennes peuvent stresser les animaux. Il affirme que l'évaluation de ces ligands "nécessite l'utilisation de l'animal" pour considérer un "organisme entier".
Objectifs
L’objectif du projet est de caractériser le rôle du récepteur 5HT7 dans les processus de démyélinisation/remyélinisation, la réponse inflammatoire en particulier son rôle sur la microglie, macrophages résidents du système nerveux central. Nous déterminerons si l’activation de ce récepteur avec une molécule que nous venons de caractériser et qui cible ce récepteur permettra de ralentir les signes pathologiques dans la sclérose en plaques. Nous comparerons son efficacité par rapport à une molécule de référence ciblant également le récepteur 5-HT7 mais qui possède des propriétés pharmacologiques différentes comparées à la molécule à tester. Nous utiliserons un modèle animal de la maladie après traitement cuprizone chez des animaux sauvages et des animaux dont le gène codant pour le récepteur 5-HT7 est non fonctionnel, ceci afin d'explorer le rôle du récepteur dans le développement de la maladie.
Bénéfices attendus
Parmi les bénéfices attendus du projet, nous espérons l'identification d'une molécule qui permettra de réduire d'au moins 50% la demyélinisation et capable d'induire la remyélinisation. L'efficacité du traitement sera évaluée après analyse des images IRM obtenues et la quantification des immunomarquages qui seront réalisés après mise à mort à 6 semaines et 12 semaines pour suivre les paramètres inflammatoires et le niveau de myélinisation.
Procédures
Les animaux ne seront soumis à aucune intervention impliquant des procédures chirurgicales. Des injections par voie orale (15sec/gavage/jour) seront réalisées tous les jours pendant 6 semaines sur 220 animaux vigiles. Une partie des animaux (160 animaux) sera utilisée pour l'imagerie IRM (5 acquisitions de 45 minutes/animal réalisées à intervalle de 3 semaines). Pour se faire les animaux seront anesthésiés et placés dans l'imageur IRM pendant maximum 45 minutes pour l'acquisition des images. 80 animaux recevront un agent de contraste par voie intraveineuse sous anesthésie générale (5min/injection/animal) avant de réaliser les acquisitions IRM sous anesthésie (5 acquisitions de 45 minutes/animal réalisées à intervalle de 3 semaines). La moitié des animaux (360 animaux) recevront une dose sublétale d'anesthésique (15 sec/injection intrapéritonéale) avant perfusion intracardiaque. L'autre motié des animaux (360 animaux) sera anesthésiée sous isoflurane avant prélèvement sanguin intracardiaque (5 min/souris) et récupération des tissus.
Impact sur les animaux
Nous ne nous attendons pas à l'apparition de douleur suite au traitement cuprizone qui est ajoutée dans la nourriture. De même, le suivi par IRM n'est pas connu pour induire de la souffarnce. Cependant l'injection quotidienne de ligands du récepteur 5-HT7 peut induire un stress des animaux. Si nous n'avons pas observé d'effet indésirable après adminisstration unique, l'administration répétée peut induire différents effets indésirables tels qu'un inconfort dû à l’injection ou des effets secondaires liés au composé (comme la sédation par exemple).
Devenir
A la fin des procédures, tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des mesures biochimiques et histologiques (prélèvement sanguin et cerveau).
Remplacement
Des études in vitro seront réalisées en parallèle des études in vivo afin d’obtenir plus d’informations sur les mécanismes d’actions et les voies de signalisation impliquées. Cependant, l’évaluation de l’effet anti-inflammatoire et neuroprotecteur des ligands du récepteur 5-HT7 de la sérotonine nécessite l’utilisation de l’animal afin de considérer un organisme entier et de confronter l'effet de nos ligands à la complexité des mécanismes neurologiques mis en jeux dans la démyélinisation /remyélinisation induite par la cuprizone.
Réduction
Les approches décrites nécessitent des cohortes de 10 animaux minimum par groupe. Chaque expérience sera réalisée deux fois indépendamment afin d’assurer la validité statistique des résultats
Raffinement
Les souris seront hébergées en portoirs ventilés dans des cages disposant d'un environnement enrichi dès leur arrivée. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture. Les animaux seront observés tous les jours durant la durée de chaque procédure pour s’assurer de leur bien-être et pour détecter d'éventuels signes de souffrance, en plus des pesées (2 fois/semaine). La cuprizone, contrairement aux modèles animaux d’Encephalomyélite Autoimmune Expérimentale (EAE), mimant la sclérose en plaques chez la souris, n’induit pas de paralysie de l’animal. Le suivi IRM sera effectué sous anesthésie gazeuse et les animaux seront maintenus sur un tapis chauffant à 37°C. Une grille de score, l'utilisation de points limites, d'un arbre décisionnel et de critères d'arrêt de souffrance seont utilisés. Ainsi, si un animal présente un signe de souffrance lors des observations quotidiennes, l'utilisation d'analgésique ou la décision de mise à mort sera prise en concertation avec le responsable du bien- être des animaux du projet.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies du système nerveux central. L’existence de nombreuses lignées transgéniques et la disposition d’outils moléculaires spécifiques (eg. anticorps spécifiques, sondes moléculaires …) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons également des souris inactivées pour le gène du récepteur 5-HT7 (5-HT7 KO), afin de discriminer l’implication des autres récepteurs de la sérotonine dans les résultats observés. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (8 à 14 semaines) afin de garantir un système nerveux central mature.
Imagerie et electrophysiologie chez la souris pour etudier l’adaptaiton motrice
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne avec fixation d'une pièce sur la tête, puis une dizaine de séances d'enregistrement du mouvement, d'imagerie calcique et d'électrophysiologie, pour étudier l'adaptation motrice. Le porteur reconnaît des dommages osseux et tissulaires liés à la chirurgie et une restriction en eau imposée aux souris pour les motiver pendant les tests. Il affirme que ce projet de neurophysiologie "ne peut être conduit que sur animal vivant" et libre de ses mouvements.
Objectifs
La capacité d'apprendre des programmes moteurs précis et coordonnés et de les adapter à un environnement changeant est essentielle à la survie de tous les animaux. Élucider les interactions cellulaires et réseau au cours de l'adaptation motrice nécessite un paradigme comportemental qui permet l'observation simultanée de l'adaptation neuronale et comportementale aux changements entre la réafférence perçue et attendue. Dans une expérience classique chez l'homme, la réafférence perçue est découplée de la réafférence attendue à l'aide de lunettes à prisme qui déplacent le champ visuel de plusieurs degrés tandis que les gens utilisent des mouvements balistiques pour localiser une cible dans l'espace. Chez les sujets en bonne santé, l'échec initial à localiser une cible informe les tentatives futures, et les sujets adaptent les programmes moteurs pour localiser de manière fiable les cibles extrêmement rapidement. Cependant, les patients présentant des déficits cérébelleux ne parviennent pas à adapter les programmes moteurs à la nouvelle réafférence sensorielle produite par les lunettes, vraisemblablement parce que la comparaison entre la réafférence perçue et attendue ne peut être réalisée sans le cervelet. Nous avons récemment développé une nouvelle tâche comportementale chez des souris à tête fixe qui nous permet d'utiliser l'électrophysiologie et l'imagerie pour observer l'activité de cellules individuelles dans le cerveau, et récapitule les composants essentiels de l'expérience des lunettes à prisme chez l'homme : les souris à tête fixe utilisent un membre antérieur pour contrôler un joystick qui déplace un distributeur d'eau. Nous utiliserons des techniques d'électrophysiologie et d'imagerie pour observer comment divers types de cellules du cervelet et cortex perçoivent, apprennent, et stockent la réafférence attendue générée par des perturbations de la réafférence attendue.
Bénéfices attendus
Notre recherche vise à comprendre les bases fonctionnelles qui permettent au cerveau d'effectuer des tâches motrices. Nous serons ainsi en mesure, à terme, de démontrer comment divers types de cellules du cervelet et cortex perçoivent, apprennent, et stockent des mémoires nécessaires pour adapter nos mouvements dans un environnement qui change. Une meilleure compréhension du fonctionnement des neurones dans les structures concernées est nécessaire pour permettre de diagnostiquer et traiter des pathologies neurologiques liées à des dysfonctionnements moteurs.
Procédures
Les souris de cette étude subiront 4 procédures. Les animaux subiront 1 chirurgie de < 1 heure et environ 10 séances (< 2 heures chacune) de comportement couplé à des enregistrements de mouvement d'un membre anterieur, d'imagerie calcique, et d'electrophysiologie.
Impact sur les animaux
Les chirurgies prévues par le protocole impliquent des dommages osseux et tissulaires. En conséquence, les animaux peuvent être potentiellement exposés à la douleur combinée à une perte de poids, à l'immobilité ou à un comportement anormal. Avant, pendant et après la chirurgie, nous traitons ces problèmes potentiels par l'administration de médicaments analgésiques et anti-inflammatoires. La durée typique de récupération après une opération est de 1 à 2 jours, période pendant laquelle les animaux sont traités avec ces médicaments. La fixation crânienne sur la tête va initialement induire un stress chez l'animal et réduire très légèrement sa mobilité. Après que l'animal se soit habitué et afin de s’assurer que les souris boivent au cours des expériences de comportement, les souris seront restreintes en eau. Si il y a une réduction du poids corporel qui dépasse 15 % par rapport au poids initial, le souris est donné de l’eau tout de suite.
Devenir
Tous les animaux sont mises à mort après anaesthésie pour prélèvement d'organes et analyses microscopique des cerveaux. L'étude des cellules post-mortem nous permet d'identifier la localisation et l'identité des neurones qui ont été enregistrés pendant les expériences.
Remplacement
L'intégration des informations sensorimotrices pendant les perturbations sensorielles implique de multiples régions et réseaux cérébraux. Afin de comprendre le rôle des neurones dans le comportement moteur, il est donc primordial de réaliser des expériences sur animal vivant et libre de ses movement afin de conserver la structure et l’activité des réseaux neuronaux sous-jacents. : Il s’agit d’un projet de neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.
Réduction
A fin de réduire le nombre d'animaux, cette étude d'imagerie in vivo est réalisée avec des implants chroniques. Une fois implantés, les animaux sont maintenus en vie et utilisés pour de nombreuses sessions d'enregistrement. L'optimisation des soins aux animaux contribue en outre à l'utilisation d'animaux pour plusieurs sessions d'enregistrement. Enfin, nous utiliserons les tests statistiques appropriés afin d’obtenir des résultats exploitables à partir du plus petit nombre d’animaux possible.
Raffinement
Les animaux sont gardés dans des cages dans l'animalerie avec leurs congénères. Les cages seront enrichies de roues de course et des rouleaux pour se cacher. Les souris seront maintenues avec nourriture ad libitum. Leur état général sera surveillé de façon quotidienne pendant toute la durée du protocole. Pour éviter toute souffrance, tout signe de douleur, angoisse ou stress chez les animaux sera soulagé avec des analgésiques et anti-inflammatoires. Une grille précise d’évaluation des points limites sera utilisée. La surveillance régulière de l'animal permettra d'arrêter toute procédure expérimentale en cas de signes d’anxiété ou de souffrance définis dans l’échelle d’évaluation.
Choix des espèces
La souris a été choisie car nous pouvons utiliser des techniques génétiques qui ne sont pas possible avec d'autres espèces. Nous serons en mésure de mésurer et perturber l’activité dans le cerveau pendant une tâche motrice. Il s'agit de mammifères dont le fonctionnement du cerveau peut être comparé à celui de l'homme pour les questions abordées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge où structures cérébrales impliquées dans le mouvement sont maturées, au-déla de 30 jours après la naissance.
Etude du rôle des cytokines inflammatoires sur la réactivité astrocytaire dans un modèle d’allodynie mécanique chez le rat.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
270 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections de cytokines inflammatoires, dont jusqu'à six injections directement dans le liquide céphalo-rachidien au niveau du tronc cérébral, pour provoquer une allodynie, une douleur déclenchée par un contact normalement indolore, puis subissent des tests comportementaux avant d'être tués. Le porteur reconnaît qu'il lui est "impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l'expérience", puisque c'est la douleur elle-même qui est étudiée. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne remplace l'étude in vivo de l'intégration de la douleur.
Objectifs
La douleur est un processus physiologique nécessaire à la survie : elle prévient l’organisme d’un danger imminent et permet la mise en œuvre de réponses adaptées qui visent à en limiter les effets délétères. Cependant, lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui aparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Les traitements disponibles ne sont souvent que partiellement efficaces et peuvent s’accompagner d’effets secondaires importants. Il est donc essentiel de découvrir de nouveaux traitements, et pour ce faire, de déchiffrer les mécanismes responsables de l’apparition de ces douleurs chroniques. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. En condition physiologique, les informations non douloureuses et douloureuses ne sont pas intégrées au même niveau du tronc cérébral, permettant ainsi de dissocier distinctement les deux modalités sensorielles (tact et douleur). Cependant, en condition pathologique, comme dans le cas de l’allodynie, le tact va être capable de devenir douloureux. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans l'apparition de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau trigéminal sont peu connus. Les résultats obtenus ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution des canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation de canaux astrocytaires, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Diverses études démontrent que certaines molécules libérées, dont les cytokines, sont capables d’activer les astrocytes. C'est pourquoi nous nous intéresserons à savoir quelle cytokine induit un dysfonctionnement et de déterminer si son blocage a des effets bénéfiques.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation d'un canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 3 : • Injections intra-péritonéales : ces injections(
Impact sur les animaux
Injectant des cytokines pro-inflammatoires chez l’animal, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse. Cependant, puisque nous travaillons sur la douleur, il nous est impossible de soulager la douleur de ces animaux le temps de l’expérience. Les résultats obtenus des travaux du laboratoire ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.
Devenir
A la fin des procédures , les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique, protéique ou électrophysiologique.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique.
Réduction
Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (lésion de notre région d’intérêt lors des injections intracisternales, problème au moment de la dissection, mauvaise apprentissage lors de l’habituation aux tests comportementaux…). Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux maximum par groupe: habituation, injections médullaire et systémique,comportement, stimulation et perfusion. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et immunohistochimiques seront réalisées avec les mêmes groupes.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g.Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à J+7 après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort par injection intrapéritonéale létale de pentobarbital (150 mg/kg). Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.
Choix des espèces
La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée et est la plus adaptée pour les études comportementales dans le domaine de la douleur en santé humaine. Nous utiliserons des animaux entre 3 à 5 et de 5 à 8 semaines (de 3 à 8 semaines), pour comparer avec les données du laboratoire.
Identification de molécules thérapeutiques chez un modèle murin atteint du syndrôme de Wolfram
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Porteuses de la mutation du syndrome de Wolfram, elles développent un syndrome vestibulaire, une surdité puis une cécité au fil des premières semaines de vie, reçoivent une injection intrapéritonéale quotidienne pendant quinze jours et passent des tests vestibulaires jusqu'à trente jours, avant d'être tuées pour analyse du cerveau. Le porteur classe ces procédures en gravité légère alors que les animaux perdent l'audition et la vue du fait de la lignée. Il affirme que ce modèle murin est "indispensable" et le seul recours "in vivo" autre que l'humain à présenter ces symptômes.
Objectifs
Le syndrome de Wolfram est une maladie génétique caractérisée par un diabète sucré, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. Cette maladie ne dispose aujourd'hui d'aucune thérapie. L'identification de la wolframine comme responsable de la pathologie et la compréhension récente du rôle cellulaire de la protéine dans les processus neurodégénératifs (comme Alzheimer, Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique ou la maladie de Huntington) permet aujourd'hui d'envisager des approches thérapeutiques. Le modèle d'étude est une souris qui présente la même mutation que l'Homme. Cette souris développe plusieurs déficits au cours du temps: à l'âge de 21 jours, celle ci développe un syndrome vestibulaire, à 24 jours une perte d'audition, à 27 jours une surdité et à 30 jours, une cécité totale. Il est important de caractériser les souris mutantes pour définir les paramètres d'efficacité des candidats médicaments testés et ainsi trouver un futur traitement.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur le modèle mutant. Le bénéfice à terme est d'amener en clinique des composés à visées thérapeutiques pour des pathologies rares/orphelines pour lesquelles il n'existe actuellement aucun traitement
Procédures
Les animaux vont être identifiés par une petite perforation au niveau de l'oreille. Les animaux auront au cours de leur vie une injection par jour par voie intrapéritonéale pendant 15 jours (avec une durée d'injection inférieure à 30 secondes). Suite à ces traitements, une batterie de tests non anxiogènes mais suffisants seront réalisés à P21 (au 21e jour de son développement), P24, P27 et P30 d'une durée de 5 minutes pour l'ensemble des tests par souris afin de tester le déficit vestibulaire et ainsi voir la progression des symptomes, maximale à P30 pour établir in fine une preuve de concept d'efficacité de ces composés sur un modèle murin.
Impact sur les animaux
les animaux vont présenter les symptomes du Wolfram notamment le syndrome vestibulaire ( mouvements de tête et rotation du corps) . La procédure d'identification par perçage d'un petit trou à l'oreille est légèrement stressante mais permet une identification rapide, peu invasive, permanente et qui n’engendre pas de prélèvement d’une biopsie supplémentaire pour le génotypage de l’animal. Les injections péritonéales peuvent engendrer un léger stress. Les tests vestibulaires utilisés dans le projet n'engendrent pas de stress particulier pour les animaux car ils sont habitués à la manipulation au préalable
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post-mortem.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle mammifère est le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques du syndrome de Wolfram, type déficit vestibulaire, dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. L’utilisation de modèles animaux est essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.
Réduction
Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe fait également références aux études antérieures réalisées au laboratoire. Une veille bibliographique sera également prise en compte durant la durée du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire l'euthanasie de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères.
Choix des espèces
Afin de mimer rapidement les symptômes du syndrome de Wolfram en vue d'un traitement curatif, la souris reste à ce jour le modèle se rapprochant au plus près de l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge de 15 jours pour des injections chroniques de molécules pendant 15 jours. Nous souhaitons traiter les souris en préventif c'est à dire avant l'apparition du déficit vestibulaire (âge 21 jours).
Le circuit Hippocampe-Accumbens dans le vieillissement: démêler la physiologie de l’APP
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes subissent une chirurgie stéréotaxique du cerveau, injection de virus ou pose d'une pompe dans l'hippocampe et le noyau accumbens, suivie de tests comportementaux nommés d'anxiété, de sociabilité, de cognition et de dépression, puis d'une mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut provoquer la mort ou un AVC, et propose de tester une stimulation visuelle à 40 Hz censée corriger les effets du vieillissement. Il affirme que les structures et réponses de la souris sont "similaires" à celles de l'humain, sans avancer d'autre bénéfice que la compréhension d'un circuit cérébral.
Objectifs
Dernièrement, la plupart des recherches se sont concentrées sur les états dégénératifs pathologiques, en utilisant des modèles génétiques de souris, non représentatifs de la maladie humaine. Afin de comprendre les formes pathologiques du vieillissement, une compréhension du vieillissement physiologique est essentielle. Les connaissances portent surtout sur l'hippocampe (HPC), car le déclin des performances lié à l'âge dépendant de cette région est constant pour toutes les espèces. Malgré une réduction significative du volume du noyau accumbens (NAc) également observée chez les personnes âgées, cette structure a reçu peu d'attention dans le contexte du vieillissement. Le lien de causalité entre les effets du vieillissement sur l’HPC et le NAc reste à établir. Des preuves cliniques renforcent ce lien : l'atrophie du NAc est corrélée aux pires scores cognitifs. Il a été montré chez les rongeurs que les neurones de l'HPC dorsal (dHPC) projettent vers le NAc et forment des synapses. Ces observations suggèrent que le dysfonctionnement synaptique précoce de l'HPC est susceptible d'empiéter sur les réseaux de sortie de l'HPC vers des structures sous-corticales spécifiques, telles que le NAc, véhiculant des fonctions non cognitives. Bien que le processus de vieillissement soit multifactoriel, des changements dans l'expression/le traitement des protéines pourraient expliquer le déclin de la fonction hippocampique. Dans ce projet nous étudions une protéine fortement exprimée dans l’HPC et qui est cruciale pour la fonction neuronale dans des conditions physiologiques. La manière dont l'âge modifie son expression et son traitement physiologique reste mal caractérisée. Ainsi, les modifications de l'expression et de son métabolisme sont susceptibles d'impacter fortement la fonction physiologique neuronale. Ce projet vise à aborder les mécanismes fondamentaux qui sous-tendent les comportements mal-adaptatifs impliquant l'association entre le contexte spatial et les résultats saillants, au cours du vieillissement, et à valider une approche de stimulation cérébrale non invasive pour atténuer ces dérégulations.
Bénéfices attendus
L'un des principaux résultats liés au vieillissement de la population est la perte d'autonomie et de motivation due au déclin cognitif. Pourtant, les altérations du vieillissement cérébral au niveau des circuits neuronaux restent peu étudiées. La nouveauté de ce projet repose sur l'utilisation de techniques de pointe pour lutter contre l'impact du vieillissement dans un circuit récemment décrit, qui relie deux structures cérébrales fortement affectées par le vieillissement : l'hippocampe dorsal et le Noyau Accumbens. De plus, ces structures sont associées à la mémoire épisodique et à la motivation, respectivement, des fonctions connues pour être altérées dans le vieillissement. Ce projet propose d'utiliser le traitement de stimulation par entraînement visuel (vGENUS), afin de restaurer les phénotypes cellulaires/circuits et comportementaux altérés. Il s'agirait donc d'évaluer l'efficacité thérapeutique d'une thérapie non invasive pour contrer le dysfonctionnement des circuits du vieillissement.
Procédures
Tous les animaux de ce projet seront soumis à la chirurgie stéréotaxique pour injecter des virus AAV ou pose de pompe osmotique dans les régions du cerveau concernées par cette étude, c'est à dire l'hippocampe et le noyau accumbens. Pour chaque souris la durée de la chirurgie est d' environ 40 min suivies de 2h de réveil et analgésie. Les procédures de comportement ne sont pas invasives et ne sont pas censées causer du stress ou de la douleur aux souris. Les procédures de comportement auront une durée d'environ 7 jours: évaluation des niveaux d' anxieté (durée du test 10 min, 1 fois), évaluation de sociabilité (10 min, 1 fois), évaluation de cognition (2h30, 1 fois) et évaluation de dépression (12h, 1 fois).
Impact sur les animaux
Les tâches comportementales en soit ne devraient pas induire de nuisances ou effets indésirables sur les souris. Elles sont libres de leurs mouvements et sont habituées à l'expérimentateur pendant plusieurs jours afin de réduire leur stress. Les chirurgies stéréotaxiques sont faites dans la mesure du possible sans impacter le bien-être de l'animal. Les souris sont anesthésiées et sous analgésique, leur température corporelle est contrôlée et toute l'étape de réveil est suivie ainsi que le rétablissement avec des vérifications quotidiennes. Toutefois, des incidents peuvent survenir lors de la chirurgie (mort rare mais possible, problèmes d'AVC, etc.) pendant le réveil, ou le rétablissement. Les souris qui souffriraient seraient immédiatement prises en charge pour trouver une solution. Si aucun traitement de l'animal ne suffit, alors la mise à mort sera décidée. En ce qui concerne les stimulations visuelles, l'animal ne devrait pas souffir puisqu'il s'agit d'ondes gamma de 40Hz pendant une semaine, à mesure d'une heure par jour. Les souris seront toutefois surveillées afin d'identifier tout comportement anormal (agitation inhabituelle, immobilité, tremblements, perte de poils, etc.)
Devenir
Ce projet a été dessiné de façon à pouvoir corréler les aspects comportementaux avec les modifications cellulaires sur un même animal. A l'issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour récuperer le cerveau et faire des analyses d'activité neuronale par electrophysiologie ou pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet s'intéresse à l'étude des fonctions cognitives, notamment l'association entre une récompense nutritive et un contexte, liées au vieillissement, dans le but de mieux comprendre des mécanismes liés aux maladies neurodégénératives. Les réponses et structures impliquées chez la souris sont similaires à celles de l'Homme.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé dans chaque procédure a été calculé par analyse prédictive afin d'utiliser uniquement le nombre nécessaire à l'obtention d'un résultat statistiquement pertinent. Le projet requiert des animaux adultes et âgées, mâles et femelles afin de ne pas avoir le biais lié au sexe des souris. Certaines souris seront utilisées dans plusieurs procédures afin de limiter le nombre de souris utilisées (les souris partenaires lors du test d'interaction sociale sont utilisées dans le test de mémoire spatiale liée à la récompense sociale).
Raffinement
La douleur est contrôlée et réduite au minimum (par l'utilisation d'analgésique) afin de s'assurer du bien-être de l'animal et de mesurer un comportement proche de la normale, pour une souris de laboratoire. Les souris sont suivies quotidiennement et une détérioration de leur état général (perte de poids hors restriction alimentaire, pelage souillé, prostration, etc.) induira un arrêt de la procédure et leur mise à mort. Une fiche d'observation basée sur une grille de score sera remplie pour chaque animal. Un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance a été établi en prenant en compte des points limites adaptés.
Choix des espèces
nous utiliserons des souris adultes et âgées. Nous avons une excellente connaissance des caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris de par l'abondance des travaux scientifiques et techniques déjà publiés. La souris possède un éventail génétique vaste, une reproductibilité fiable et rapide, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre projet. La souris constitue un excellent modèle pour l’étude des conséquences du vieillissement d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires du vieillissement, et les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures sous-corticales étudiées (hippocampe et noyau accumbens) sont très proches de ceux du cerveau humain. De plus, nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie).