Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire chez la souris femelle.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
144 souris femelles vont être utilisées dans une chirurgie terminale menée sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chacune subit un acte unique de vingt minutes suivi du prélèvement du cerveau, pour analyser la morphologie des neurones de l'hypothalamus à différents âges entre le dixième et le soixantième jour de vie. Le porteur décrit un inconfort limité à la contention et à l'injection, et renvoie les retombées à de meilleurs traitements des troubles de la puberté et de troubles psychiatriques. Sur le remplacement, il affirme que l'étude d'un réseau neuronal complexe dans l'"organisme entier" exige l'animal vivant.
Objectifs
La puberté est une période critique de développement aboutissant à la maturité sexuelle. C’est un moment de plasticité cérébrale intense, associé à de considérables changements hormonaux, neuraux et comportementaux. Cela est d’autant plus important que la perturbation de l’initiation de la puberté est associée à un risque plus élevé de développer de nombreuses maladies neurologiques. La puberté est déclenchée par la réactivation de l'axe hypothalamo-hypophysaire-gonadique. L'augmentation pubertaire de la sécrétion des stéroïdes sexuels et la localisation cérébrale des récepteurs des œstrogènes suggère un rôle clé de l’œstradiol dans les changements qui ont lieu à la puberté. L'objectif de ce projet est d'étudier les changements de plasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire. Des souris femelles seront utilisées afin d’étudier la morphologie neuronale au cours du développement hypothalamique et d’identifier les périodes les plus sensibles aux changements hormonaux.
Bénéfices attendus
Les données obtenues contribueront à déterminer les périodes clés de plasticité du cerveau et le rôle des œstrogènes pubertaires dans ces processus. Ceci est particulièrement pertinent dans le contexte du développement de meilleurs traitements pour les troubles de la puberté mais également pour les troubles psychiatriques et comportementaux qui se manifestent souvent pendant cette période.
Procédures
Les animaux (n=144) subiront un acte unique de chirurgie terminale effectuée sous anesthésie et analgésique d’une durée de 20 minutes. A l’issue de cet acte terminal les prélèvements sont réalisés pour analyse.
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales. Les produits administrés pour l’anesthésie, l’analgésie et l’euthanasie n’ont pas d’effet douloureux connus, les animaux auront le seul inconfort de la contention et de l’injection (piqure de l’aiguille).
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses neuroanatomiques et morphologiques.
Remplacement
L'étude du rôle de l’œstradiol dans la neuroplasticité de l’hypothalamus au cours du développement pubertaire femelle nécessite des modèles animaux pour pouvoir étudier le réseau neuronal complexe au sein de l’organisme entier. Des animaux vivants seront donc nécessaires pour ce projet. Ce projet comporte des analyses neuroanatomiques et neuroendocrines. Il n'est donc pas possible de le développer par des méthodes alternatives et/ou substitutives..
Réduction
Les effectifs utilisés (144 animaux au total) ont été calculés au plus juste afin de garantir la puissance statistique, compte tenu de la variabilité interindividuelle. L’expertise scientifique de l’équipe dans l’étude neuroanatomique des fonctions de reproduction permet de connaitre le nombre d’animaux nécessaire par groupe afin d’obtenir des résultats fiables. Afin de réduire le nombre d'animaux, plusieurs régions du cerveau seront analysées en même temps pour le même animal. Les autres organes (hypophyse, ovaire, dents, squelette...) seront proposés aux collaborateurs de l'équipe comme cela est fait habituellement au sein de l’équipe.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie, sous la supervision de soigneurs et d’un vétérinaire qualifié. L'hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne 2010/63/UE en termes d'espace et d'environnement. Les souris seront soumises à un cycle lumière- obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l'enrichissement, un nid sera placé dans la cage. Avant chaque procédure chirurgicale, une analgésie sera effectuée par l’injection d’un analgésique 20 minutes avant la procédure. Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s'assurer que toute souris présentant un ou plusieurs points limites sera euthanasiée. Toutes les euthanasies des animaux seront effectuées sous anesthésie générale. L'anesthésie profonde de l'animal est vérifiée par le pincement de la patte arrière et l'absence du réflexe de clignement de paupière suite à une stimulation de l'œil. Une analgésie sera effectuée 20 minutes avant la chirurgie terminale.
Choix des espèces
La souris est l'un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et neuroanatomiques grâce à la disponibilité d'outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques...) et de données dans la littérature permettant, d'une part de comparer les résultats obtenus avec ceux des autres laboratoires et d'autre part d'implémenter les connaissances sur cette thématique. Ce projet utilisera des femelles à différents jours postnataux (JPN) : JPN10, JPN15, JPN20, JPN25, JPN30, JPN35, JPN40, JPN45 et JPN60. Cela apportera de nouvelles connaissances quant aux changements cérébraux qui ont lieu en particulier dans l’hypothalamus au cours du développement postnatal et pubertaire.
Etude de l’effet antalgique de l’oligodésoxynucléotide IMT504 sur l’hypersensibilité viscérale d’origine colique dans un modèle d’inflammation intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent du dextran sulfate de sodium qui détruit la barrière intestinale et provoque une colite, subissent des injections quotidiennes pendant cinq jours et un test de distension du côlon au moyen d'un ballonnet, avant mise à mort pour prélèvement de tissus. Le porteur indique évaluer la sévérité de la colite par la consistance des selles, la perte de poids et la présence de sang, et teste une molécule antalgique, l'IMT504. Il affirme que l'étude du comportement douloureux ne peut se faire que sur l'animal vigile, la caractérisation du mécanisme étant ensuite renvoyée à des modèles cellulaires.
Objectifs
La prise en charge des douleurs viscérales reste, à ce jour, limitée en raison de la faible efficacité des thérapies antalgiques actuellement disponibles, de leurs effets indésirables, notamment sur la physiologie intestinale, et de l’origine de ces douleurs souvent multifactorielle et hétérogène selon les pathologies considérées. Le besoin d’innovation thérapeutique demeure ainsi pressant dans ce domaine de recherche puisque ces douleurs présentent généralement une forte composante cognitivo-émotionnelle pouvant affecter durablement la qualité de vie des patients. L’IMT504 est une molécule agissant sur le système immunitaire initialement développée en tant qu’adjuvant vaccinal permettant de promouvoir la production d’anticorps afin d'accroître l'efficacité des vaccins. Depuis ces premières études, un rôle nouveau de cette molécule a été mis en évidence dans le traitement des douleurs chroniques au niveau cutané en agissant notamment sur le recrutement et l’activation de cellules immunitaires impliquées dans la résolution de l’inflammation. Le côlon est un organe soumis à une surveillance immunitaire permanente du fait de sa proximité avec la lumière intestinale contenant une multitude de corps étrangers alimentaires et microbiens. La rupture de la barrière intestinale est un évènement fréquemment associé aux pathologies intestinales entrainant, de fait, un passage accru de ces corps étrangers à travers la paroi intestinale aboutissant à une réaction immunitaire et inflammatoire et, consécutivement, à la sensibilisation des neurones innervant l'intestin transmettant l'information douloureuse intestinale. Ce phénomène peut être modélisé chez l’animal par administration de Dextran Sulfate Sodium (DSS) chez l’animal. Cette molécule, en détruisant les cellules intestinales séparant le contenu du tube digestif du reste de l'organisme, va rompre l’intégrité de la barrière intestinale et, par le biais des mécanismes cités précédemment, provoque une hypersensibilité viscérale. Le but de ce projet est donc, dans un premier temps, d’étudier la cinétique de recrutements de populations de cellules immunitaires dans le modèle d'inflammation colique au DSS et, par la suite, d’évaluer les effets de l’administation d’IMT504 sur la sensibilité viscérale dans ce modèle en lien avec la modulation des populations de cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a un objectif double. Tout d'abord évaluer l'effet de l'IMT 504 sur la douleur viscérale dans un contexte inflammatoire. Actuellement, un projet d'étude clinique réalisé par nos collaborateurs argentins expérimentant l'effet de cette molécule sur des douleurs d'origine somatique va bientôt être mis en oeuvre. Ainsi, cette molécule pourrait constituer une alternative aux molécules antalgiques actuellement disponibles dans le traitement des douleurs viscérales avec un transfert potentiellement rapide chez l'homme. Dans un second temps, l'IMT504 constitue un outil de recherche fondamentale nous permettant de caractériser les interactions entre les cellules neuronales et immunitaires dans un modèle de douleur intestinale. En effet, la capacité de l'IMT504 à recruter des cellules immunitaires impliquées dans la résolution de l'inflammation nous permettra d'étudier la capacité de ces cellules à réduire l'activité neuronale, et par là-même, le contrôle du message douloureux par les cellules immunitaires. Ainsi, outre le caractère pharmacologique de ce projet, de nouveaux aspects sur la physiopathologie des douleurs viscérales inflammatoires seront étudiés.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une injection sous-cutanée quotidienne durant 5 jours consécutifs d'IMT504 ou de la molécule contrôle (Chlorure de sodium). Pour l'evaluation de la sensibilité colique, les animaux seront soumis à un test de distension colorectale qui consiste à appliquer des pressions de distensions croissantes à l'aide d'un ballonnet préalablement inséré dans le côlon distal des animaux. Chaque distension dure 20s et un intervalle d'au moins 4min est respecté entre chaque épisode de distension. Au total le test de sensibilité colique dure donc 30 minutes.
Impact sur les animaux
L'administration de DSS induit une colite dont la sévérité sera évaluée quotidiennement par l'expérimentateur par la mesure du score DAI (Disease Activity Index) en prenant en compte les 3 critères suivants: consistance des selles, perte de poids, et présence de sang dans les selles.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour la collection de tissus et des analyses mécanistiques réalisées in vitro.
Remplacement
Les études sur le comportement douloureux des animaux ne peuvent être effectués uniquement sur l'animal vigile. Les expérimentations visant à caractériser le mécanisme d'action de l'IMT504 seront ensuite réalisées in vitro sur des modèles cellulaires.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Les animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.
Choix des espèces
Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (10 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Etude des conséquences sur le métabolisme et le vieillissement de mutations dans les canaux ioniques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Quatre souris sont recensées dans le tableau des dommages attendus, une sans réveil et trois en souffrance sévère, alors que le résumé annonce par ailleurs 480 animaux. Le porteur décrit l'induction d'une migraine chronique par injections répétées, une douleur qui ne sera soulagée ni par analgésique ni par anesthésique puisque ce sont ses conséquences qui sont étudiées, les animaux étant tués en fin de procédure pour prélèvement des tissus. Il indique surveiller des points limites et euthanasier tout animal atteignant un score de douleur élevé ou perdant du poids. Sur le remplacement, il affirme que les effets métaboliques à long terme et le vieillissement exigent un "organisme vivant" impossible à modéliser in vitro.
Objectifs
La migraine est un trouble neurologique invalidant, d'origine génétique, environnementale et/ou hormonale, avec une prévalence estimée à 15% de la population. Elle se caractérise par des maux de tête sévères, généralement unilatéraux et lancinants qui peuvent être accompagnés de nausées, vomissements et de photophobie. Par ailleurs, la douleur chronique représente un stress pour l'organisme dont les conséquences à long terme sont encore peu connues. Des études cliniques ont corrélé une augmentation de l'incidence des pathologies cardio-vasculaires et des cancers et une diminution de la durée de vie chez des patients qui présentent des niveaux chroniques de douleur. Ce projet vise à étudier les conséquences cellulaires et moléculaires de la douleur migraineuse chronique sur le métabolisme, et en particulier à déterminer si des canaux ioniques potassiques à deux domaines pores (famille des K2P), qui régulent la transmission de la douleur et dont des mutations chez l'homme induisent la migraine, exercent un contrôle sur les paramètres métaboliques impliqués dans le vieillissement. Ce projet nécessitera 480 animaux.
Bénéfices attendus
La migraine est considérée comme l'une des maladies les plus invalidantes au monde, affectant environ 15 % de la population mondiale. Elle se manifeste par une céphalée lancinante unilatérale et s'accompagne de multiples symptômes tels que nausées, vomissements, photophobie, phonophobie ou allodynie cutanée. En parallèle, différentes études cliniques ont permis de corréler une augmentation de l’incidence des pathologies cardio-vasculaires, des cancers et une diminution de la durée de vie, à des niveaux chroniques de douleur chez des patients humains. De plus, les souris déficientes pour TRPV1, un canal ionique impliqué dans la perception de la douleur thermique, sont caractérisées par une meilleure espérance de vie. Enfin, des mutations génétiques chez C. elegans et chez D. melanogaster modifiant la transduction des signaux sensoriels augmentent également la longévité des individus. Il est admis que les crises de migraine commencent par l'activation des neurones sensoriels dans les ganglions trigéminaux (TG). L'hyperexcitabilité des fibres TG innervant les méninges induit la libération de neuropeptides (par exemple la substance P et le peptide CGRP) qui déclenche la vasodilatation des vaisseaux sanguins environnants et une inflammation locale, conduisant à la migraine. De plus, les fibres C exprimant les canaux TREK1, TREK2 et TRESK innervent le le pancréas et leur stimulation induit la sécrétion de CGRP, provoquant l’inflammation et inhibant le relargage d’insuline. Ces données suggèrent fortement que l’activité des canaux ioniques et en particulier de TREK1, TREK2 et TRESK a un impact sur le métabolisme et le niveau général de santé de l’individu. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la migraine et plus généralement de la douleur chronique de manière à limiter son impact sur le métabolisme en collaboration avec la Fédération Hospitalo-Universitaire.
Procédures
Dans chacune des procédures, un phénotype migraineux sera induit chez les animaux à 2 stades de leur vie : à 3 mois et à 12 mois. Ce modèle de migraine classiquement utilisé en études pré-cliniques et cliniques consiste à induire des symptômes chroniques migraineux par injection systémique intra-péritonéale d'un "donneur de NO", l'isosorbide dinitrate (ISDN, Risordan ©, Sanofi) pendant 4 jours, à raison de 1 injection/jour. Chez la souris, une injection quotidienne d'ISDN pendant 4 jours induit une hypersensibilité mécanique douloureuse chronique quantifiée quotidiennement avec un appareil de von Frey dynamique qui consiste à appliquer une rampe croissante de pression sur la paume de la patte arrière avec un filament automatique et à mesurer la pression (en grammes) induisant le retrait volontaire de la patte par la souris qui témoigne d’une douleur mécanique. Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles déterminent un seuil avec possibilité d’échappement. Une allodynie chronique se développe progressivement, mise en évidence par une diminution des valeurs de force nécessaires (seuils) pour induire le retrait réflexe (volontaire) de la patte. L’hypersensibilité douloureuse mécanique (4 tests dans la vie de l'animal) et thermique (4 tests) des souris sera quantifiée par les tests de von Frey et de Hargreaves respectivement sur des groupes de souris indépendants. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront mesurés par prélèvement d'une goutte de sang (4 tests) sur des groupes de souris indépendants. Les mesures d'exercice spontané et de motricité seront réalisés 4 fois dans la vie de l'animal, sur 2 groupes de souris indépendants. Chacun de ces tests dure environ 3h excepté la mesure de l'exercice volontaire qui est évaluée après une semaine.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la douleur migraineuse qui sera induite et qui ne pourra être soulagée ni par des analgésiques ni par des anesthésiques puisque ce sont ses conséquences que nous étudierons. Pour cette raison, nous évaluons à un niveau sévère la gravité de nos procédures et nous compenserons par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Dès l'entrée en procédure, les animaux seront soumis à un contrôle quotidien par le principal expérimentateur de façon à relever tout changement d'aspect (dos voûté, pelage non entretenu) et de comportement (apathie, souris à l'écart), à mener leur habituation aux différents tests et à réaliser des injections intrapéritonéales si nécessaire. Ce suivi quotidien permettra aussi un contrôle visuel et expérimental (niveau de sensibilité douloureuse) de l'état de l'animal et de ses sites d'injection. Ainsi, tout animal qui présenterait des signes d'infection au site d'injection, de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement basal anormal (prostration, apathie..) ou d‘une pathologie quelconque (plaie...) serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans notre étude des conséquences de la douleur. Un suivi du poids corporel sera également effectué toutes les semaines par pesée. Une perte de poids comprise entre 10 et 15 % du poids de la semaine précédente conduira à une surveillance accrue de l'animal. Celui-ci sera euthanasié si son état ne s'est pas amélioré la semaine suivante. Un suivi tous les 2 jours sera aussi organisé après les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (pendant 6 jours). En plus du suivi par les expérimentateurs, les animaux seront suivis quotidiennement par l’équipe de l’animalerie de l’institut afin de détecter le plus rapidement tout signe de mal-être. Un formulaire permettant l'évaluation de la douleur sera rempli systématiquement. Les animaux seront sacrifiés à un score égal ou supérieur à 3 dans le tableau de l'évaluation de la douleur en annexe.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chacune des procédures. Dans le cadre des procédures 1 et 2, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. Dans le cadre des procédures 3 et 4, les animaux seront anesthésiés (procédure sans réveil) et une perfusion intracardiaque sera réalisée afin de prélever des tissus de qualité optimale pour les analyses histologiques post mortem.
Remplacement
Nos études préalables menées sur des neurones en culture et chez les rongeurs ont permis de caractériser le phénotype migraineux des animaux mutants pour les K2P d’intérêt. De plus, les effets métaboliques analysés sur le long terme et le suivi du vieillissement des animaux requièrent un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant. Les pathologies associées au vieillissement (diabète, néoplasmes, etc) sont d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Leur apparition et leur gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro. De plus, nos résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet.
Réduction
Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique permanente) ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique paramétrique (student t-test ou ANOVA si plus de deux groupes) ou non paramétrique afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Pour évaluer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.
Raffinement
Notre expertise dans le domaine de la douleur nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et nous porterons une attention particulière à limiter toute forme de stress de nos animaux (habituation en amont de chaque procédure). Aucun des animaux élevés pour ce projet ne présente de phénotype dommageable. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer la douleur et de mettre en oeuvre des points limites précoces. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle d'étude, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l'humain, et de la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons à notre disposition tous les outils déjà mis au point et validés pour pouvoir étudier les modèles génétiques des canaux ioniques TREK1, TREK2 et TRESK dans la souris. 2 âges seront étudiés: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux. Chaque animal sera utilisé à 3 et 12 mois pour réduire le nombre total d’animaux, et parce que chaque animal sera son propre contrôle interne.
Programme d’immunisation de lapins pour la génération d’anticorps polyclonaux suite à une injection unique
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.
Procédures
1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.
Imagerie de la neuroinflammation par ultrasons, chez la souris nouveau-né et la jeune souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souriceaux reçoivent une injection de molécule pro-inflammatoire dans le péritoine ou directement dans le cerveau à cinq puis trente jours de vie, avec ouverture de la boîte crânienne par craniotomie et imagerie par ultrasons sous anesthésie. Le porteur décrit un retard de croissance, des troubles comportementaux et moteurs, et un risque de mort par surdosage anesthésique, la mise à mort étant justifiée par les injections et la craniotomie subies. Il présente ce modèle comme applicable à terme au nouveau-né prématuré humain et affirme que ces caractéristiques du cerveau en activité sont impossibles à reproduire hors de l'organisme.
Objectifs
La neuroinflammation est une réaction inflammatoire (réaction de l'organisme aux lésions et infections) qui se produit dans le cerveau. Lorsqu’elle survient peu avant ou après la naissance, la neuroinflammation peut impacter des phases critiques du développement du système nerveux central et avoir des conséquences à long terme sur la santé de l’individu (handicaps moteurs, troubles comportementaux, déficits cognitifs…). Cette étude vise à mieux comprendre l’impact de l’inflammation sur le développement cérébral. Nous nous intéressons ici à trois caractéristiques du cerveau : la connectivité entre différentes régions cérébrales lorsqu'elles sont activées, l’architecture vasculaire et la rigidité. La connectivité analyse l’activation simultanée de plusieurs aires cérébrales structurellement différentes. La neuroinflammation engendre des défaillances de cette connectivité fonctionnelle. L’inflammation modifie également les vaisseaux sanguins de la zone touchée, puisqu’elle se traduit par un afflux important de sang à cet endroit. L’architecture vasculaire à l’échelle des microvaisseaux fera l’objet d’une partie de cette étude. Enfin, la neuroinflammation, de par ses conséquences au niveau vasculaire notamment, pourrait modifier la rigidité du cerveau, et nous chercherons à quantifier cette modification. Les ultrasons biomédicaux, utilisés à des fins d’imagerie diagnostique, sont un moyen parfaitement adapté à l’étude de ces trois caractéristiques. L’essor considérable qu’ils ont connu au cours des dernières années a permis d’augmenter le niveau de détail des images, spatialement et temporellement, et leur sensibilité. Dans notre étude, trois techniques d’imagerie ultrasonore seront utilisées : les ultrasons fonctionnels pour étudier la connectivité fonctionnelle, l’imagerie superrésolution pour cartographier l’architecture cérébrale à l’échelle des microvaisseaux, et l’élastographie pour mesurer la rigidité du cerveau inflammé.
Bénéfices attendus
Ce projet contribue à enrichir les recherches faites sur la neuroinflammation chez le souriceau, en utilisant une méthode jusque-là peu utilisée pour étudier ce sujet : l’imagerie par ultrasons. En particulier, l’étude de l’impact possible de l’inflammation sur la rigidité du cerveau constitue la principale avancée de ce projet. A plus long terme, les données collectées serviront à la recherche sur le nouveau-né humain prématuré. La neuroinflammation est en effet une conséquence de la prématurité des enfants, dans 20 à 40% des cas. Elle est à l’origine de la plupart des lésions dans le cerveau du nourrisson, regroupées sous le terme d’encéphalopathie du prématuré. Mieux comprendre les modifications de vascularisation, de connectivité et de rigidité induites par la neuroinflammation contribuera à élargir les outils pronostiques de la prématurité, afin de pouvoir mettre en place des interventions plus précoces et ouvrir la voie à de nouveaux traitements.
Procédures
- Les animaux recevront une injection (à travers le péritoine, sans anesthésie, 1 min ; ou directement dans le cerveau, avec anesthésie, environ 30 min) d’une molécule pro-inflammatoire, à deux stades de croissance différents (5 jours et 30 jours après la naissance). - Les animaux au 30ème jour après la naissance nécessitent une opération chirurgicale d'ouverture de la boîte crânienne, au cours de laquelle ils seront placés sous anesthésie générale (environ 1h). - Toutes les mesures d’imagerie ultrasonore (imagerie fonctionnelle, élastographie, imagerie superrésolution) sont réalisées sous anesthésie générale (durée variable en fonction des mesures à effectuer : entre 15 min et 1h30). - L'imagerie superrésolution nécessite en plus l'injection de microbulles dans la circulation sanguine, réalisée sous anesthésie, à l'aide d'une seringue très fine, adaptée à la taille de l'animal (environ 2 min).
Impact sur les animaux
- L’administration intra-péritonéale (i.e., dans le péritoine) ou intra-cérébroventriculaire (i.e., directement dans le cerveau) peut créer une infection locale dans la zone d’injection. - L’injection de molécule inflammatoire engendre un retard de croissance chez les animaux concernés, qui se traduit morphologiquement par une taille et un poids inférieurs à la normale. De plus, les animaux injectés sont susceptibles de développer des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible…) et moteurs. - Une dose mal estimée d’anesthésie au cours des acquisitions en imagerie peut engendrer le réveil des animaux si trop faible, ou leur mort si overdose, ce qui justifie une étape préalable d'ajustement des doses. - La manipulation des animaux au cours des injections, ainsi que l’injection elle-même, sont sources de stress pour les animaux.
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés. Ils auront en effet reçu des injections et/ou subi une craniotomie donc ne pourront pas être maintenus en vie.
Remplacement
Notre étude s’intéresse à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel, qu’il est par conséquent impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques).
Réduction
Au total, notre projet nécessitera au maximum 1140 animaux. Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique.
Raffinement
- Des grilles de scoring en fonction de l’âge des animaux seront proposées pour s’assurer du bien être des animaux et déterminer les points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus des animaux. Suite à l’inflammation, on surveillera régulièrement la prise de poids et l’apparition éventuelle de troubles comportementaux (isolement, agressivité) : la molécule inflammatoire sera injectée le matin, puis les animaux seront surveillés 1h, 6h, 10h, 22h et 24h après l’injection (deux personnes se relaieront pour la surveillance). Si l’un de ces points limites est atteint, et/ou à la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés. - Les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. - Pendant les chirurgies nécessaires pour la mise en place des appareils d’imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l’animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure de chirurgie sera interrompue et l’animal euthanasié. - Au cours des acquisitions en imagerie, sous anesthésie générale, les constantes physiologiques suivantes seront mesurées en continu : fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température.
Choix des espèces
Dans le cas de l’étude de la neuroinflammation, la littérature montre que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; il pourra donc, à plus long terme, être appliqué au cas du nouveau-né humain. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de la neuroinflammation sur certaines caractéristiques du cerveau, à différents stades de croissance : les animaux seront utilisés au cours du développement, à un stade encore immature du cerveau (5 jours après la naissance), et à plus long terme, lorsque le cerveau a atteint sa maturité (30 jours après la naissance).
Etude de la fonction de différents variants de gènes durant le développement du cerveau dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie pour injecter et modifier génétiquement les embryons par électroporation in utero, avec un risque d'avortement, puis les femelles et les souriceaux de 7 à 21 jours sont euthanasiés pour prélever les cerveaux. Le porteur décrit une recherche fondamentale sur les gènes du développement cérébral, menée en parallèle sur la drosophile et des cellules humaines, mais affirme qu'une approche in vivo chez le mammifère est "indispensable". Les bénéfices cliniques éventuels sont présentés comme un "socle pour de futures découvertes", sans application directe.
Objectifs
Le développement du cerveau se produit par une succession d’étapes de prolifération et de différenciation cellulaire très contrôlées dans le temps par différents facteurs. Nous nous intéressons aux mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent la façon dont les cellules sont générées au cours du temps. Notre objectif est de comprendre le rôle de certaines protéines et donc les gènes dont elles sont issues, dans ces processus et de les étudier dans un contexte in vivo, au cours du développement d’un cerveau de Mammifère. Certaines de ces protéines présentent des modifications qui peuvent modifier son mode de fonctionnement. De plus, certains gènes vont pouvoir compenser la perte d’autres gènes. Ce sont tous ces mécanismes et ces dynamiques que nous voulons étudier. Dans ce but, nous réaliserons au cours du développement embryonnaire, c'est-à-dire lors de la gestation, des transferts de gènes...par une technique que l'on appelle l'électroporation. Nous pourrons ainsi étudier l’effet de la version modifiée sur le développement des cellules du cerveaux (neurones et des cellules qui les accompagnent que l’on appelle cellules gliales) et comprendre les mécanismes fins mis en jeu. Ces échanges de gènes se feront à des moments précis du développement embryonnaire, lors de la génération de populations de cellules précises, dans le cortex cérébral et le cervelet. Nous étudierons la prolifération des cellules, le nombre de cellules générées, les différents type-cellulaires, la morphologie et la taille des neurones…) Cette étude chez la souris permettra de compléter avec un modèle in vivo de mammifère, des études réalisées chez la drosophile et sur des modèles in vitro sur cellule humaine.
Bénéfices attendus
Cette étude in vivo permettra d’acquérir des connaissances précieuses sur les mécanismes mis en jeu dans la régulation de la génération des différentes cellules du cerveau lors du développement. Elle sera mise en perspective avec d’autres études menées en parallèle chez la drosophile et dans des cultures in vitro de cellules humaines ou organoïdes, afin de comprendre comment ces mécanismes se sont ajustés au cours de l'évolution, dans différentes espèces. De plus, cette étude constituera un socle pour de futures découvertes permettant de comprendre certaines maladies développementales du cerveau. Par exemple, la microcéphalie qui peut être due à des altérations de la durée de certaines étapes clés lors du développement. De plus en plus d’études montrent que des conditions comme le syndrome du chromosome X fragile et les troubles du spectre autistique seraient dus à un déséquilibre des neurones excitateurs et inhibiteurs. Il est probable que ce déséquilibre soit dû à des altérations subtiles dans la chronologie de la génération de ces neurones. Les mécanismes explorés dans cette étude pourraient donc apporter des pistes de réflexion voire des réponses pour parvenir à mieux expliquer ces troubles du développement.
Procédures
Pour ce projet, il est prévu d’utiliser 2850 animaux. Des interventions sous anesthésie générale sont réalisées sur les femelles gestantes pour faire des injections aux embryons en cours de développement dans l’utérus. Une prise en charge de la douleur est assurée lors de la chirurgie des femelles gestantes par l’utilisation d’analgésiques. La chirurgie doit durer au maximum 30 min. Des injections intrapéritonéales de produits seront aussi réalisées sur animal vigile, en contention afin de permettre de figer les cellules en train de se diviser pour ensuite pratiquer des analyses de l’ADN. Cette injection unique doit durer quelques secondes.
Impact sur les animaux
Lors de l’électroporation in utero, les animaux seront anesthésiés, ce qui entraine un potentiel risque pour l’animal (hypothermie, non récupération d’une pleine vigilance) et les embryons (risques d’avortement). Un risque hémorragique, infectieux est possible au niveau du site de chirurgie. Une douleur lors des injections est possible, elle ne doit pas durer plus que le temps de l’injection. La contention pourra, elle aussi, générer un stress à l’animal.
Devenir
Les femelles gestantes seront euthanasiées dans le but de prélever et d’analyser les cerveaux des embryons afin d’étudier le développement des cellules. Les souriceaux (P7-P21) seront euthanasiés dans le but de prélever et d’analyser leur cerveau afin d’étudier le développement des cellules.
Remplacement
Notre projet vise à comprendre les mécanismes de développement du cerveau en prenant en compte toute sa complexité (diversité des types cellulaires, interactions cellulaires, contraintes physiques, signalisations…). Suivant le principe de remplacement, des études sur drosophiles, ainsi que sur cellules humaines, un travail in vitro ou encore l’utilisation d’organoïdes sont réalisées et permettent de disséquer certains aspects et mécanismes impliqués dans les processus étudiés. En revanche, il est indispensable dans le cadre de cette étude, de passer par une approche in vivo chez le Mammifère afin de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, les outils génétiques disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision le moment d’inactivation du gène d’intérêt.
Réduction
Le nombre d’animaux (2850) utilisés sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement robustes et sera calculé pour chaque type d’analyse. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillons en étroite collaboration avec des statisticiens présents dans notre unité pour définir toutes les tailles d'échantillons et les tests statistiques appropriés. Nous comptons observer de nombreux paramètres (stade différentiation des cellules selon le stade développement, longueur des axones, morphologie des cellules, …) qui pourront être analysés sur les mêmes échantillons.
Raffinement
L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement en portoirs ventilés (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (maison et matériel pour faire un nid, papier kraft), d’alimentation et de soins quand nécessaires, seront contrôlées. Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale pour les animaux arrivant de l’extérieur. Les femelles gestantes seront regroupées (2 par cage) afin d’éviter leur isolement et auront une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie (pré- et post-opératoire) ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. En cas d’observation de la moindre douleur post-opératoire, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur persiste, les animaux seront euthanasiés pour éviter toute souffrance. Durant toute la période d’anesthésie, l’animal sera placé sur tapis chauffant afin de maintenir sa température. Toute injection sera réalisée avec une seringue adaptée et une aiguille très fine. Des points limites ont été établis : En cas de non-récupération de la complète vigilance suite à la chirurgie, l’animal sera examiné par la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire. Si aucun signe d’amélioration n’est visible après 24h (prostration, état du pelage, réduction de mobilité, absence de prise de poids lors de la gestation, etc), l’animal sera euthanasié car un état de stress prolongé pourrait compromettre le bon déroulé de l’expérience. Si des signes d’avortement (saignements, expulsion de fœtus morts, écoulements vaginaux anormaux…) sont observés, l’animal sera euthanasié. Tout au long de la vie des animaux, un suivi rigoureux sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et du vétérinaire.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des femelles gestantes d’au moins 2 mois y compris leurs embryons et des souriceaux. Afin d’inactiver ou intégrer nos gènes d’intérêt au stade embryonnaire, les interventions sont réalisées sur les femelles gestantes sous anesthésie générale pour faire des injections aux embryons en cours de développement dans l’utérus. Une injection supplémentaire d’agents intercalants de l'ADN sera réalisée sur ces femelles gestantes dans le cas où les tissus seront prélevés au stade embryonnaire. Dans le cas où les tissus seront prélevés sur souriceaux, l’injection se fera sur les souriceaux (P7, P21). Ces produits permettront de marquer les cellules en train de se diviser pour ensuite pratiquer des analyses. Pour notre étude, nous utiliserons des modèles de mouches, ainsi que des modèles in vitro de cellules humaines et organoïdes. Cependant, il est indispensable de comparer ces données avec un modèle in vivo de cerveau de Mammifère. Nous avons fait le choix de la souris car les outils génétiques et moléculaires développés dans notre domaine de recherche ont été réalisés pour des travaux chez la souris. Les animaux génétiquement modifiés qui sont nécessaires à cette étude sont uniquement disponibles chez la souris. Notamment, les lignées génétiquement modifiées qui vont nous permettre d’explorer les stades de développement qui nous intéressent disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision l’inactivation de nos gènes d’intérêt.
Etude biochimique, histologique et pharmacologique chez la souris modélisant des malformations corticales génétiques épileptogènes chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
32 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des femelles gestantes subissent une chirurgie pour modifier génétiquement le cerveau des embryons par électroporation in utero, et leur descendance développe des crises d'épilepsie, provoquées si besoin par injection d'un agent épileptogène, avec des traitements par injections, gavage ou injection intracérébrale. Le porteur décrit des crises pouvant être quotidiennes, des œdèmes cérébraux, de l'agressivité et des avortements, et prévoit la mise à mort dès l'atteinte de points limites ou dans les deux heures suivant l'injection épileptogène. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit ni les crises ni les interactions cellulaires et conclut au recours à des "organismes entiers".
Objectifs
L'épilepsie touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Les épilepsies focales sont parmi les plus fréquentes et sévères des épilepsies, et sont souvent liées à une malformation cérébrale, en particulier ce que l’on appelle les dysplasies focales corticales. Les dysplasies focales corticales sont caractérisées par une désorganisation locale du cortex cérébral et la présence de cellules neurales anormales et de taille anormalement grande. Ces anomalies du développement sont responsables d’épilepsies qui résistent aux traitements médicamenteux sont associées à des déficits cognitifs et des pathologies psychiatriques précoces. Les dysplasies focales corticales sont induites par plusieurs gènes d’une voie de signalisation particulière appelée mTOR (mechanistic target of rapamycin, cible de la rapamycine chez les mammifères). Ces anomalies du développement cérébral peuvent être dues à des mutations génétiques présentes uniquement dans une population neuronale restreinte et apparaissant précocement au cours du développement du cerveau. Il est nécessaire de mieux comprendre l’origine des crises épileptiques suite à ces mutations afin de pouvoir développer de nouveaux médicaments antiépileptiques, et potentiellement proposer une médecine personnalisée. Afin de modéliser ces épilepsies focales d’origine génétique, nous proposons d’induire ces mutations dans le cerveau au cours du développement en travaillant directement sur les embryons au niveau de l’utérus de souris en gestation. Cette technique dite « d’électroporation » permet d’induire l’expression de gènes mutés ou d’en inhiber d’autres dans une sous-population de neurones, mimant ainsi les mutations (c’est-à-dire présentes uniquement dans la partie du cerveau affectée par cette épilepsie). Ce travail de recherche permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des crises épileptiques en fonction des différents gènes mutés. Nous évaluerons, tout d’abord, ces nouveaux modèles génétiques de malformations cérébrales à l’origine des crises d’épilepsie d’un point de vue histologique et biochimique. Puis nous testerons différents traitements antiépileptiques innovants sur nos modèles par voie injectable, orale ou intracérébrale. Enfin, nous testerons l’effet de ces traitements sur des crises provoquées par l’injection d’un agent qui génère des crises d’épilepsie dans nos différents modèles si les crises n’arrivent pas spontanément.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche permettra de créer de nouveaux modèles de malformation corticale épileptogène induite par des mutations génétiques. Ces pathologies sont rares, graves et orphelines. En effet, la majorité des patients atteints par ces mutations présente une épilepsie pharmaco-résistante qui nécessite donc le recours à une ou plusieurs chirurgies couteuses et invasives (tant sur le plan physique que psychologique) pour contrôler les crises. Il est donc urgent d’utiliser des modèles reproduisant la physiopathologie de ces maladies afin de : - tester des thérapies innovantes afin de permettre à court terme de diminuer voir d’abolir le recours à ces chirurgies mais également de proposer une thérapie aux patients présentant une forme non opérable. - découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter à la fois l’épilepsie mais également les comorbidités associées à ces pathologies (autisme, dépression, troubles de l’hyperactivité, …) - mieux comprendre le lien entre voie mTOR (mechanistic target of rapamycin, cible de la rapamycine chez les mammifères) et épilepsie afin d’ouvrir de nouvelles perspectives de recherches et de thérapies pouvant potentiellement être utilisées pour des patients atteints de différentes mutations.
Procédures
Chirurgie sous anesthésie et analgésie sur les mères gestantes afin d’induire des mutations dans le cerveau des embryons à travers la paroi utérine (électroporation in utero), afin de générer les groupes d’animaux génétiquement modifiés pour la suite de notre étude. Durée maximale 1h, une seule fois. Pour les souris électroporées (différents lots) : -Euthanasie sans traitement préalable (souris n’ayant pas de modification génétique ou simple observation clinique). -Traitement intrapéritonéal : injection intrapéritonéale de molécules thérapeutiques (1 injection de 30s tous les 2 jours pendant 2 semaines). -Traitement par voie orale (Gavage) : Administration par gavage de molécules thérapeutiques (1 gavage de 1 min tous les 2-3 jours pendant 3 semaines maximum). -Traitement par injection intracérébrale : injection unique sous anesthésie générale en analgésié, durée maximale 1h10. -Traitement et Pentylènetétrazole : injection intrapéritonéale de molécules thérapeutiques (1 injection de 30s tous les 2 jours pendant 2 semaines) OU Gavage de molécules thérapeutiques (1 gavage de 1 min tous les 2-3 jours pendant 3 semaines maximum) OU Injection intracérébrale (1 injection unique sous anesthésie et analgésie) PUIS Injection intrapéritonéale d’un agent épileptogène (1 injection de 30s).
Impact sur les animaux
1) Pour l’opération permettant d’induire des mutations dans le cerveau d’embryons d’une femelle gestante (électroporation in utero, procédure 1) : Isolement de la femelle préopératoire et jusqu’à la naissance des embryons. Risques de déficience respiratoire, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Possible douleur au niveau du site d’ouverture et utérin, inconfort général durant les heures suivant la chirurgie, perte d’embryon(s), mise-bas prématurée. Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. 2) Pour les souris génétiquement modifiées issues de la procédure 1 : Le développement prédit de crise d’épilepsies avec potentiellement plusieurs crises par jour. Possible agressivité des souris envers leurs congénères pouvant entrainer stress et blessures. 3) Injection chronique intra-péritonéales : stress durant la manipulation des souris, perte de poids et possible douleur (œdème, hématome) dus à l’insertion répétée de l’aiguille sur le site d’injection. 4) Gavage oral : stress durant la manipulation des souris, perte de poids et possible douleur au niveau de l’œsophage due à l’insertion répétée de la sonde dans le système digestif. 5) Injection intracérébrale : Injection intracérébrale sous anesthésie. Risques de déficience respiratoire, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Possible douleur au niveau du site d’ouverture et inconfort général durant les heures suivant l’injection. Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. Œdème cérébral dû à l’injection. 6) Injection de Pentylènetétrazole : stress durant la manipulation des souris, perte de poids, crises épileptiques et possible douleur sur le site d’injection.
Devenir
Femelles gestantes opérées afin d’induire des mutations cérébrales dans le cerveau des embryons : les femelles gestantes seront euthanasiées après le sevrage des souriceaux. Du fait de la chirurgie, elles ne peuvent être réutilisées pour des accouplements. Procédures exploratoire, traitements et injection de Pentylènetétrazole (agent inducteur de crises épileptiques) : les souris seront euthanasiées dès qu’un point limite sera atteint, ou dans les 2 heures suivant l’injection de Pentylènetétrazole ou en fin de procédure (âge maximum 1an). Nos analyses nécessitant le prélèvement du tissu cérébral, aucune souris ne peut être gardée en vie en fin de procédure.
Remplacement
Les résultats attendus de cette étude ne peuvent être obtenus par modélisation informatique car celle-ci nécessite des données expérimentales encore manquantes. De même, la culture cellulaire ne reproduit pas les interactions cellulaires, les voies de migration cellulaires, ni les crises d’épilepsie. La modélisation in vitro n’est donc pas indiquée dans notre type d’étude. De plus, nous ne pouvons éthiquement pas reproduire les modifications cérébrales nécessaires à notre étude chez des patients sains, ni tester nos traitements expérimentaux sur les patients atteints de ces troubles sans études précliniques préalables. Enfin l’utilisation d’organismes entiers, à la physiologie proche de l’humain et communément utilisé en étude préclinique nous permettra de tenir compte de la pharmacodynamie et de la pharmacocinétique de nos potentiels traitements. Nous pourrons ainsi rapporter les éventuels effets indésirables, la durée de traitement, la dose efficace et les effets attendus de nos traitements lors de nos discussions avec les cliniciens en charge des patients atteints de ces troubles avec lesquels nous travaillons étroitement.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences en testant préalablement la faisabilité des expériences, en combinant différents protocoles au cours d’une même expérience et en réalisant une exploitation maximale des données à l’aide de l’utilisation appropriée de tests statistiques. Le calcul du nombre d’animaux est fait suivant les recommandations internationales par calcul de puissance statistique afin d’obtenir des résultats fiables. Il nous faut donc au moins 10 souris par groupe traitement. Ce calcul de puissance sera ajusté selon les premiers résultats, car nous ne pouvons pas encore prédire les différences de moyennes entre nos groupes (soit 5760 souris). La première procédure comprend un groupe exploratoire (288 souris), pour lequel, nous avons prévu 3 souris par groupe afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, tout en obtenant des résultats fiables. Nous ne sélectionnerons que les souriceaux positifs aux mutations génétiques induites au stade embryonnaire. Dans la mesure du possible, nous utiliserons les souris contrôles (non mutées) comme contrôles de plusieurs modifications génétiques. Cependant, ne connaissant pas la physiopathologie de ces mutations induites, nous ne pouvons pas d’avance connaitre l'âge des souris utilisées dans les groupes de traitement. Nous ne pouvons donc pas être certains de la possibilité de ce double-emploi des contrôles. Nos calculs du nombre de souris se basent donc sur le scénario utilisant le nombre maximal de souris où aucun des pathologies induites par les 4 mutations prévues ne présenterait un décours concomitant à un autre et où chaque groupe aurait donc son propre groupe contrôle. Enfin, nous avons prévu un groupe exploratoire, nous permettant d’identifier le stade de traitement le plus adéquat afin de limiter les groupes d’études des différents traitements. Enfin nous commanderons nos souris gestantes à un stade permettant de vérifier l’état de gestation. Notre période d’acclimatation sera donc réduite (2 à 7 jours) mais la livraison à un stade de gestation plus précoce permettant le temps d’acclimatation recommandé engendrerait la livraison de femelles potentiellement non gestantes, inutilisables, à euthanasier. La souche que nous utilisons étant peu sensible au stress, nous préférons donc utiliser une période d’acclimatation courte afin de réduire le nombre d’animaux. Dans ces conditions, le taux de survie des mères à ce type de chirurgie est très proche de 100 pourcent.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages ventilées (maximum 6 par cage) avec accès à l’eau et à des croquettes à volonté, enrichies d’un nid de coton, et d’une maison en cas d’inconfort (animal isolé) ou pour les souris gestantes. Les souris injectées avec un convulsivant seront isolées pendant une période de 10 à 120min (selon durée des symptômes) dans une cage de grande dimension afin de limiter les risques de commotions ou de blessures lors des convulsions, après 30min de familiarisation à la cage. Le phénotype de nos lignées est encore inconnu. Les premiers lots de souris seront donc observés 3 fois par semaine du stade P10 (afin de limiter les risques de rejet de la mère par de trop nombreuses manipulation du nid) et jusqu’à 3 mois, puis quotidiennement après apparition de la première crise épileptique du lot. Les lots suivants seront surveillés quotidiennement au stade d’apparition des crises. Si une souris fait une crise de plus de 15 minutes ou présente une posture hypertonique post-crise, elle sera euthanasiée. De plus, lors des injections avec le convulsivant, si une souris fait plus de 15 crises, elle sera euthanasiée. Les souris feront donc l'objet d'une surveillance étroite par le personnel de soin animalier et de l’équipe de recherche. Le poids, l'apparence physique et des changements de comportement seront les facteurs pris en compte. En cas d’apparition d’un comportement d’agressivité envers les congénères, la cage sera enrichie (maisonnette, boule de papier, séparateurs) et ne sera changée que partiellement afin de conserver la hiérarchie de dominance au sein du groupe. En cas d’inefficacité de ces mesures, la souris agressive sera isolée dans une cage enrichie afin d’éviter le risque de blessure. Avant le début de la chirurgie, nous administrons une dose d’analgésique. En cas de souffrance post-chirurgicale, la souris recevra une nouvelle dose toutes les 24h, jusqu’à la mise-bas des souriceaux. Après cette mise-bas, nous surveillerons les signes de douleur de la femelle, et si les souriceaux sont bien nourris par observation de la présence de lait dans l’estomac à travers la peau. Dans les groupes de traitement et injection de convulsivant : les mouvements, le poids, le grimace-score, la respiration et les réflexes tels que le retrait de la patte seront observés attentivement jusqu’à euthanasie de fin de procédure (maximum 2h). S'ils révèlent une dégradation ou une souffrance de l'animal, celui-ci sera euthanasié plus précocement.
Choix des espèces
Notre choix a été motivé par des raisons scientifiques : (1) Nos études portent sur des modèles génétiques d'épilepsie nécessitant des modifications génétiques ciblées, possibles chez la souris (2) Les souches des souris que nous utiliserons ont été majoritairement utilisées pour modéliser les crises d’épilepsies. Elles ont donc été explorées de manière exhaustive de la molécule au comportement, permettant une solide base scientifique sur laquelle baser nos travaux. (3) Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les femelles gestantes seront utilisées à l’âge adulte (plus de 2 mois). Leurs embryons seront génétiquement modifiés au cours de la gestation. L’efficacité de notre méthode de modification génétique des souris utilisées par la suite est vérifiée visuellement par la présence ou non de tache fluorescente à l’aide d’une lampe. Pour le groupe exploratoire, les souris seront euthanasiées à 4 stades différents avant et après sevrage : -un stade postnatal précoce afin de caractériser le développement cérébral de nos modèles -un stade précoce à l’apparition des crises épileptiques -un stade tardif après l’apparition des crises -un stade supplémentaire selon les symptômes observés chez les premiers lots Pour les traitements, les souris seront utilisées après sevrage et au stade déterminé par le groupe exploratoire, jusqu’à l’âge d’un an maximum.
Effet neuro protecteur et neuro régénérateur de nouvelles biomolécules dans un modèle souris de glaucome
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
2670 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un pincement du nerf optique leur provoque une cécité d'un œil, suivi d'injections de biomolécules dans l'œil ou par voie intraveineuse, le porteur indiquant que le pincement et les injections oculaires causent une douleur. La mise à mort est justifiée par la récupération des rétines et des nerfs optiques, aucune souris ne pouvant selon le porteur être réutilisée, replacée ou adoptée. Il présente l'effet neuroprotecteur et régénérateur de ces molécules comme une piste pour éviter la cécité dans le glaucome, au conditionnel.
Objectifs
Le glaucome est une des principales causes de déficit visuel. Les neurones présents dans la rétine (RGC, Cellules Ganglionnaires Rétiniennes) transmettent les informations captées par les photorécepteurs sous forme de signal électrique par via leur fibre nerveuse (axone) qui parcourt le nerf optique (NO) jusqu’au cerveau. Dans le glaucome, ces axones et les RGC dégénèrent, provoquant une cécité irréversible. Un modèle robuste de cette pathologie est obtenu chez la souris par un pincement maitrisé du NO provoquant la dégénérescence des axones qui le composent. Nous souhaitons tester dans ce modèle les propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices de biomolécules « NV » Sur des cultures de neurones, les NV favorisent la survie des cellules, l’élongation des prolongements cellulaires qui permettent les connections entre neurones et leur repousse après lésion. Ces résultats suggèrent que les NV pourraient être utilisés pour protéger les RGC de la mort cellulaire (effet neuroprotecteur) dans le glaucome et favoriser la repousse de leurs axones dans le NO (effet neurorégénérateur). Nos études ont montré que l’injection intraoculaire de vecteurs AAV2 (virus adéno-associé 2) codant pour le peptide NV de première génération (AAV2-NV1) favorise la survie des RGC et la repousse de leur axone, efficacité renforcée en présence de CNTF (ciliary-derived neurotrophic factor), un facteur de croissance neuroprotecteur et neurorégénérateur (effet synergique d’AAV2-NV1 et AAV2-CNTF). De plus, ces travaux ont permis de montrer l’absence de toxicité ou d’effets secondaires lors de l’injection intraoculaire d’AAV2-NV1. Nous avons développé de nouvelles générations de NV, modifiées pour augmenter leur affinité pour leur cible et donc leur efficacité, et conjuguées à des CPM (Cell Penetrating Molecules) tels que les VHH (molécules dérivées de chaines lourdes d’immunoglobulines de lama capables de franchir les membranes cellulaires) ou des peptides étiquettes (ciblage préférentiel des neurones en fixant le récepteur de l’acétylcholine) afin d’augmenter leur stabilité et leur adressage aux neurones. Nous souhaitons tester ces nouvelles générations de NV dans le modèle souris de glaucome afin d’identifier la molécule ayant l’efficacité maximale avec une toxicité minimale pour ensuite développer ce candidat comme médicament pour le glaucome en l’amenant à l’essai clinique.
Bénéfices attendus
Les biomolécules NV développées dans notre laboratoire possèdent des propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices susceptibles d’apporter une réponse à de nombreuses pathologies dégénératives. Dans le glaucome, l’augmentation de la pression intraoculaire cause une dégénérescence des axones dans le nerf optique, une mort des cellules ganglionnaires rétiniennes et à terme la cécité. Dans le cadre de ce projet, l’administration de ces molécules a pour but d’induire la régénération des fibres axonales dans le nerf optique après lésion, ce qui aura pour bénéfice de reconnecter l’œil au cerveau et donc d’éviter la cécité causée par cette lésion. Leur effet neuroprotecteur devrait quant à lui permettre la survie des cellules ganglionnaires rétiniennes dans la rétine, dont les axones forment le nerf optique.
Procédures
Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur de nos biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes) et est réalisé sous anesthésie profonde et analgésie. L’injection intravitréenne de nos biomolécules NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes). L’injection intraveineuse de NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes).
Impact sur les animaux
Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur des biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Il est attendu que le pincement du nerf optique et l’injection des biomolécules NV dans l’œil causent une douleur chez la souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, toutes les procédures requièrent la récupération de tissus (rétines, nerfs optiques) destinés à être analysés en vue de démontrer l’effet thérapeutique de notre molécule NV.
Remplacement
Les biomolécules NV utilisées dans ce projet sont préalablement validées in vitro pour leur efficacité et leur absence de toxicité sur des cultures de cellules neuronales, des cellules épithéliales rétiniennes et des explants de rétines. Les cellules neuronales et épithéliales rétiniennes ne nécessitent pas l’utilisation d’animaux (lignées cellulaires). Les explants de rétine, réalisés à partir de rétines de souris, permettent de tester plusieurs constructions et concentrations de NV avec un nombre réduit de souris, ce qui permet par la suite de ne tester in vivo que les molécules NV efficaces in vitro. Les explants de rétine constituent un modèle in vitro très proche du modèle in vivo (même espèce, même tissu) et facilite l’extrapolation.
Réduction
Le nombre d’animaux requis pour établir l’efficacité des biomolécules dans ce modèle a été calculé par un test de puissance statistique à partir de nos résultats antérieurs. La mise à mort des animaux pour la récupération des yeux et des nerfs optiques étant nécessaire au projet, la réutilisation des animaux n’est pas envisageable. Les deux yeux des souris seront valorisés quand cela sera possible afin de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les techniques de chirurgie de l’œil nécessaires à la réalisation du projet ont été acquises auprès d’un laboratoire de référence. La maîtrise des bons gestes chirurgicaux limitera les risques d’altération de la lentille lors des injections intraoculaires et augmentera la probabilité de créer des lésions du nerf optique bien calibrées et donc exploitables. Les animaux recevront des antalgiques avant et après lésion ainsi qu’une anesthésie locale juste avant le pincement du nerf optique. Les gestes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane. La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 3 jours suivant les pincements/injections, puis bihebdomadaire. Les animaux seront mis à mort en cas de dépassement des points limites fixés pour les différentes procédures. Après le réveil des animaux, les animaux sont remis dans leur cage et gardés pour une durée variable dépendante de la procédure (entre 1 heure et 44 jours pour la procédure la plus longue).
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris pour sa taille et son anatomie, particulièrement adaptées à la chirurgie ophtalmique. De plus, certains de nos tests seront réalisés avec des souris génétiquement modifiées existantes. Souris adultes âgées de 8 semaines. Les expériences sont réalisées à un stade où les rétines sont matures et dans lesquelles les neurones ont une capacité régénératrice minime afin de reproduire des conditions semblables à celles de la pathologie chez l’homme.
Correction d’anomalies du développement cortical à l’aide d’ARN messagers dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré. Des femelles gestantes subissent une ouverture de l'abdomen sous anesthésie pour injecter des ARN messagers dans le cerveau des embryons, et les souriceaux subissent un tatouage des coussinets et une biopsie de la queue, pour tester si ces ARN corrigent des malformations cérébrales d'origine génétique. Le porteur reconnaît que la biopsie provoque une douleur et que la chirurgie peut faire souffrir si l'analgésie est mal conduite. Il affirme que le développement du cortex ne peut être étudié qu'in vivo chez le mammifère.
Objectifs
Notre laboratoire s’intéresse au développement du cortex cérébral. Des anomalies génétiques chez l’homme affectant les processus de prolifération et différentiation cellulaire peuvent aboutir à des malformations du cerveau. Des études nous ont permis de mettre au point des particules d’ARN ayant la faculté d’entrer spécifiquement dans les cellules en division des cerveau embryonnaires. Ce projet vise à déterminer si cette approche est pertinente pour développer une approche thérapeutique. Nous voulons donc tester chez la souris, la capacité des ARNm à compenser la perte de 2 gènes d'intérêt et corriger les anomalies de développement du cerveau qui leur sont associées.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de déterminer si l’utilisation d’ARN est une bonne approche thérapeutique pour corriger les anomalies cérébrales d’origine génétique.
Procédures
Les souriceaux des lignées subiront un tatouage des coussinets des phalanges et une biopsie à la queue. Les femelles gestantes de la procédure 2 subiront une anesthésie générale de 45 minutes, comprenant une ouverture de l'abdomen et des points de sutures. Des injections sous cutanées sous anesthésie d'une durée de deux minutes 2 fois par jours pendant 3 jours. Les embryons subiront une injection intra-cérébrale d'une durée de 5 secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie à la queue provoque une douleur. Les actes chirurgicaux des procédures peuvent entrainer une souffrance si elle est mal prise en charge par le traitement analgésique. L'étape d’anesthésie peut également provoquer un stress chez l’animal
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques et génétiques.
Remplacement
Les questions scientifiques que nous nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère en développement. En effet, le développement du cortex des mammifères et de son fonctionnement ultérieur est de mieux en mieux caractérise chez la souris et aucun modelé in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d’animaux nécessaire à l’obtention d’un résultat significatif déterminés par une approche statistique.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant et après la procédure. La litière utilisée dans la cage est spécifique pour les animaux opérés et permet de diminuer le risque d'infection de la cicatrice. Lors des actes chirurgicaux, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées par anesthésie gazeuse et reçoivent des injections d'analgésiques en pré- et post-opératoire. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance et la prise en charge analgésique continue pendant 72h. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique supplémentaire ou la mise à mort de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projets tels que les modèles génétiquement modifiés. Pour le génotypage et les biopsies, les souriceaux ont entre 7 et 10 jours, âge a quel on peut tatouer les coussinets des phalanges. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. L'expérimentation est menée sur des embryons à E12.5 et E15.5 qui correspondent à la fenêtre d’expression de nos gènes d’intérêt. Les souriceaux à P2 et P10 nous permettent de voir l'effet de notre traitement sur les phénotypes qui apparaissent à ces stades.
Étude d’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle des impacts neurobiologiques du stress hypoxique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis gardés en vie et rendus à leur animalerie d'origine. Ils subissent un stress d'hypoxie et trois séances d'imagerie IRM sous anesthésie légère, pour mesurer les effets d'un déficit d'oxygène sur l'hippocampe et évaluer une plante, Guiera senegalensis, comme antioxydant. Le porteur indique que l'hypoxie pourrait détruire des neurones sans pour autant affecter le bien-être de l'animal, et surveille la respiration pendant l'anesthésie. Il affirme que cette étude comportementale et neurobiologique nécessite des animaux vivants dotés des structures cérébrales voulues.
Objectifs
Les radicaux libres sont connus pour être responsables d’un vieillissement cellulaire. Dans des conditions normales, les radicaux libres sont produits à de faibles concentrations et agissent comme des molécules de signalisation pour les cellules. Dans certaines situations, le nombre de radicaux libres présents dans les cellules est trop important. Ce stress oxydant conduit à un dysfonctionnement cellulaire, voire à la mort cellulaire. Il a été incriminé dans la physiopathologie de nombreuses affections humaines (par exemple la maladie d’Alzheimer). L’hypoxie (un déficit d’apport en oxygène dans les tissus de l’organisme) est l’une des causes de stress oxydant. Au niveau cérébral, l’hypoxie génère des processus inflammatoires qui peuvent se solder par une destruction des neurones au niveau de l’hippocampe, structure très impliquée dans l’apprentissage et la mémoire. L’apnée, c’est-à-dire un arrêt de la respiration pendant au moins 20 secondes, même si elle est volontaire, pourrait participer à la genèse d’un stress oxydant à travers l’hypoxie créée. En Afrique, Guiera senegalensis (Combretaceae) est une plante utilisée en pharmacopée traditionnelle. Ses feuilles possèdent de nombreux composés, notamment les flavonoïdes et les acides polyphenoliques, qui sont des antioxydants naturels. L’objectif général de ce projet est d’évaluer les effets bénéfiques de l’extrait hydroéthanolique des feuilles de Guiera senegalensis dans la gestion du stress oxydant et dans la prévention d’impacts neurobiologiques de l’hypoxie au niveau cérébral.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une information précieuse sur le lien entre hypoxie sous apnée et les corrélats neurobiologiques dans l’hippocampe comme prédicteurs de désordres mnésiques, ainsi que le bénéfice potentiel de Guiera senegalensis dans le traitement des effets hypoxiques des phénomènes d’apnée naturelle. De plus, ce projet permettra d’entrevoir une applicabilité potentielle de cette plante dans des pathologies liées au stress oxydatif. Autrement dit, Guiera senegalensis pourrait offrir un choix alternatif ou complémentaire dans la prévention et le traitement de ces pathologies. Il permettra également de collecter des données pilotes nécessaires pour un projet collaboratif plus large, qui se propose de corréler les données acquises sur ce modèle d’apnée chez le rat avec des données acquises sur des apnéistes humains.
Procédures
Trois séances d’imagerie sont prévues pour caractériser le modèle d’hypoxie cérébrale à 1 jour, 7 jours et 15 jours post-induction. Chaque séance (d’une durée d’environ 1/2 journée) comprendra une session d’acquisition IRM (d’une durée maximale de 2 heures).
Impact sur les animaux
Le modèle d'hypoxie pourrait induire des lésions cellulaires et des processus inflammatoires qui pourraient se solder par une destruction de certains neurones au niveau de l'hippocampe, mais cela ne devrait pas affecter le bien-être de l'animal. L’examen IRM étant une modalité de neuroimagerie totalement non-invasive et non-irradiante, les potentiels effets indésirables sont liés au fait que l’examen est réalisé sous anesthésie légère. Pour éviter tout risque d’arrêt respiratoire, la fréquence respiratoire est surveillée en permanence tout au long de l’examen. Il est également possible d’observer une légère perte de poids le lendemain de l’examen, suite au stress potentiellement induit par la combinaison transport (~10min)/examen (~2h) entre les deux bâtiments d’expérimentation se faisant face.
Devenir
Après l’examen IRM les animaux seront gardés en vie et retourneront en hébergement dans leur animalerie d’origine.
Remplacement
L’évaluation comportementale et neurobiologique en réponse à un stress hypoxique induit par apnée, nécessite l’utilisation des animaux vivants possédant les structures cérébrales requises. L'analyse cellulaire des différentes structures cérébrales ne peut être réalisée in silico ou en cellule isolée, ni même chez les invertébrés.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal et de façon longitudinale avec des approches non-invasives comme l’IRM. Les analyses statistiques seront celles classiquement utilisées dans la littérature.
Raffinement
Que ce soit durant leur transport ou lors de l’examen IRM, une grande attention est apportée au bien-être des animaux, et tout est mis en œuvre pour éviter les sources potentielles de stress. Transports : Les animaux sont transportés dans leur boîte habituelle (enrichie), avec leurs partenaires habituels et manipulés par les personnes assurant leur suivi quotidien. Les boîtes sont protégées du froid ou du chaud éventuel. Manipulations/anesthésie avant/après examen IRM : Ces actes sont réalisés par les personnes qualifiées assurant le suivi quotidien des animaux. Examen IRM : Il est réalisé sous anesthésie, dans un berceau chauffé uniquement dédié à ces animaux, avec contrôle de la respiration et de la température. Lors d’une acquisition IRM, si la respiration sort des limites prévues, l’examen est immédiatement interrompu et l’animal est mis sous surveillance accrue jusqu’à sa récupération. En dehors des sessions d’examen IRM, les animaux seront hébergés par groupe (2 à 4) avec de l’enrichissement autant que possible (tunnel transparent de couleur rouge, bâton à ronger, papier à déchiqueter). Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance (mise en place de points limites) et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec la Structure bien être animale et les conseils vétérinaires.
Choix des espèces
La littérature concernant le stress hypoxique est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. De plus, la littérature sur les expériences d’apnée est plus importante chez le rat. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales, biochimiques, immunohistochimiques et de neuroimagerie par IRM. Des rats nouvellement sevrés (~23-26 jours) seront utilisés en accord avec les données de la littérature concernant la période adaptée à un bon apprentissage de la nage chez les rats.
Conséquences de l’obésité maternelle sur le développement neuronal et comportemental de la descendance
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de léger à sévère, dont 520 en souffrance sévère. Les femelles sont rendues obèses par un régime riche en graisses, puis leur descendance subit des tests comportementaux et des analyses neuronales, pour étudier l'effet de l'obésité maternelle sur le cerveau des petits. Le porteur mentionne des tests comportementaux évaluant les capacités cognitives, mnésiques, émotionnelles et sociales sans en préciser le détail, et décrit comme atteinte une dégradation du comportement maternel. Les rubriques sur les dommages et le raffinement restent brèves au regard des 520 souris classées en souffrance sévère.
Objectifs
Le projet a pour but d'étudier et comprendre les conséquences neuronales et comportementales à long terme de l'obésité maternelle sur le développement du cerveau de la descendance
Bénéfices attendus
L'obésité maternelle est un facteur aggravant dans la survenue de maladies neurologiques et neuropsychiatriques. Nous espérons identifier des mécanismes moléculaires et cellulaires altérés par l'obséite materenlle dans l'espoir de développer des stratégies thérapeutiques et/ou préventives pour limiter les conséquences à long terme et sur la survenue de maladies neurologiques.
Procédures
Les animaux seront soumis a différent tests comportementaux dans le but d’évaluer l’impact de l’obésité maternelle induit par un régime alimentaire riche en graisse sur leurs capacités cognitive, mnésique, émotionnelle et sociale. Ces tests comportementaux seront réalisés entre le 8ieme et 10ieme jour de vie postnatale (un test) et entre le 2ieme et 4ieme mois de vie (4 tests). Des analyses neuronales, visant à étudier l’activité neuronale et l’évolution de différents marqueurs moléculaires, seront réalisées en parallèles des analyses comportementales aux mêmes âges
Impact sur les animaux
L’un des dommages de cette étude sera la prise de poids des femelles soumises à un régime alimentaire riche en graisse pour induire une obésité chronique. L’obésité chronique induit une dégradation du comportement maternelle avec une perte d’attention et d’intérêt pour la descendance.
Devenir
les animaux utilisés pour les analyses comportementales et neuronales, avec ou sans injections en période néonatale, seront euthanasiés.
Remplacement
Seule l'expérimentation chez l'animal permettra de remplir les objectifs de ce projet. Il n'est actuellement pas possible pour les méthodes in vitro (non animales) de reproduire les processus physiologiques complexes de la consommation de nutriments et en particulier l'impact que peut avoir la prise d'un régime alimentaire riche en graisse sur le développement neuronal et comportementale de la descendance. L’organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux et l'obésité maternelle ne peuvent être reproduits dans des modèles de lignées cellulaires ou de cultures neuronales.
Réduction
Des calculs statistiques utilisant les données d'études antérieures ont été utilisés pour calculer le nombre minimum d'animaux requis tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement significatifs. Les tâches proposées permettent d’évaluer les animaux sur plusieurs paramètres (comportementaux et électrophysiologiques ou biochimiques ou histologiques), réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Pour les enregistrements électrophysiologiques, 3 chercheurs seront mobilisés. Pour les analyses biochimiques et histologiques plusieurs protéines et/ou marqueurs moleculaires seront étudiés par échantillons prélevés et par animal. La litière des cages sera changée
Raffinement
La litière des cages sera changée fréquemment (et autant de fois que nécessaire) pour réduire les risques de graissage de la fourrure des animaux et limiter les risques d'irritation de leur peau. La santé et le poids des animaux seront également surveillés de près afin de s'assurer que le régime alimentaire n'a pas d'impact négatif sur eux. Dans le cas improbable où les animaux auraient subi un impact négatif, ils reprendront un régime alimentaire standard pour rongeurs. L'équipe continuera à examiner les dernières découvertes afin d'identifier toute nouvelle possibilité d'affiner l'expérience de ces animaux, tout en atteignant les objectifs de l'étude.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale. Elle présente de nombreux intérêts : sa taille, son rythme rapide de reproduction et une gestation courte par rapport à d’autres organismes-modèles. De nombreux animaux transgéniques existent permettant par exemple de déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans différentes pathologies. Enfin, les souris sont susceptibles de contracter certaines maladies humaines telles que certains troubles neurologiques. Les souris sont fréquemment utilisées pour modéliser l'obésité humaine car, comme les humains, elles prennent du poids lorsqu'elles consomment des régimes riches en calories. Elles stockent également les graisses alimentaires dans leur corps de manière similaire et peuvent développer l'obésité . Pour ce projet nous utiliserons des souriceaux de 1 à 2 semaines de vie postnatale, pour étudier les conséquences de l’obésité maternelle sur le développement du cerveau, et des animaux adultes (2 à 4 mois de vie) pour étudier les conséquences à long terme sur les capacité cognitive, sociale et émotionnelle.
Effet curatif de deux plantes médicinales, MA et AA, issues de la tradithérapie tunisienne, sur l’amélioration des paramètres métaboliques chez le rongeur présentant un diabète de type 2.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Rats : 72
442 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont rendus diabétiques puis gavés quotidiennement pendant cinq semaines, avec une quinzaine de prélèvements sanguins, avant prélèvement des tissus. L'objectif est de tester deux plantes de la tradithérapie tunisienne comme antidiabétiques. Le porteur affirme que l'équilibre énergétique et le dialogue entre organes ne sont pas modélisables in vitro et que le rongeur reste un "modèle de référence".
Objectifs
Le diabète de type 2 (DT2) touche 90% des personnes diabétiques, principalement au-delà de 40 ans, souvent en surpoids ou obèse, qui ont un régime alimentaire déséquilibré (trop riche en gras et en sucres) et/ou dont l’activité physique est insuffisante. Cette maladie métabolique est caractérisée par un excès chronique de sucre dans le sang Parmi les nouveaux axes de recherche pour traiter le DT2, émergent des alternatives thérapeutiques, préventives et curatives. Parmi ces alternatives thérapeutiques, la tradithérapie offre un panel de substances naturelles méconnues dont les effets n’ont été que très peu caractérisés de façon préclinique et clinique, bien qu’elles soient, localement, couramment utilisées par l’Homme. Ainsi, deux plantes médicinales ont été identifiées comme ayant des caractéristiques phytochimiques intéressantes pour prévenir et traiter le DT2 (ces plantes sont nommées ici MA et AA pour des raisons confidentielles). Spécifiquement, le but du projet sera d’établir chez l’animal diabétique: 1) Si le traitement par MA ou AA présente un effet-dose sur l’amélioration de la glycémie et de comparer ce traitement chronique à des anti-diabétiques déjà sur le marché. 2) Si une unique dose de la plante est suffisante pour améliorer la tolérance au glucose 3) Si les fractionnements successifs des composés de la plante reproduisent les effets anti-diabétiques observés, en vue d’isoler le(s) principe(s) actif(s).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser un nouvel antidiabétique issu de plantes pris par voie orale et d’isoler le (les) principe(s) actif(s)
Procédures
Les animaux seront soumis au traitement antidiabétique par gavage : un par jour pendant 5 semaines, avec un volume de 250 µl/souris ou un volume de 1,5 ml chez le rat. des prélèvements de sang seront effectués : un par semaine afin d'évaluer l'effet du traitement, 5 les jours de test : soit 15 prélèvements au total pour 3 tests.
Impact sur les animaux
Les nuisances dues aux déifférents traitements seront : Au début du traitement par gavage : du stress, Une douleur locale et passagère lors de l'injection intrapéritonéale ainsi que lors des prélèvements sanguins.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort car les tissus gluco-sensibles seront prélevés pour divers dosages
Remplacement
L’étude des variations de la glycémie, de l’insulinémie ne peut être réalisée que sur des animaux vivants, ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. L’étape de caractérisation des effets sur la sécrétion d’insuline a déjà été faite sur des lignées de cellules pancréatiques mais les effets sur les autres organes insulino-sensibles sont indispensables à caractériser. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. L’étude du métabolisme implique plusieurs organes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ce projet sera réalisé chez la souris mais aussi chez le rat, qui constituent des modèles de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques.
Réduction
Nous utiliserons des tests statistiques permettant de détecter les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques permettant de calculer le nombre minimum d’animaux pour calculer l’échantillon représentant la population, et suffisant pour détecter des différences. Chaque fois que ce nombre pourra être réduit, le nombre d’animaux utilisé sera diminué. Chaque fois que cela est possible, les mêmes animaux seront utilisés afin de réduire le nombre d’animaux : tous les tests métaboliques sont faits chez les mêmes animaux après un temps de repos et de récupération.
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et carré de coton pour les souris ou des bâtonnets de bois et rouleaux de carton pour les rats qui permettent l’expression de comportements innés. Ils seront répartis à quatre par cage pour les souris et à deux pour les rats. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux. Les différentes manipulations des animaux et injections seront effectuées par du personnel compétent, conformément à la législation. Les animaux seront manipulés quotidiennement avant les expériences de manière à diminuer leur stress et inconfort au moment des expériences. Le poids corporel et la prise alimentaire seront également contrôlés quotidiennement de manière à s’assurer du bon état de santé des animaux. Douleur et/ou souffrance des animaux sont rendues tolérables lors des prélèvements de sang en effectuant une application d’anesthésique local avant une incision minimale puis désinfection à l’eau oxygénée qui a un fort pouvoir coagulant (en plus d’être un antiseptique). Un animal présentant une perte de poids (
Choix des espèces
Le rongeur est l’animal le plus fréquemment étudié dans les études métaboliques précliniques avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisé. Les animaux, rats et souris spontanément diabétiques et ceux au régime gras et sucré seront âgés de 14 semaines.