Système nerveux
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Etude de l’effet du toucher social pendant l’enfance sur la résilience au stress: implication de la voie PVNOT-VTA
- Recherche fondamentale
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- Oncologie
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496 souris vont être utilisées dans une étude sur le toucher social pendant l'enfance, 320 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles subissent un isolement social de quatorze jours après le sevrage, une chirurgie du cerveau, puis jusqu'à six heures d'électrophysiologie sous anesthésie et des séances de contention. Toutes sont tuées à la fin pour vérifier les injections et analyser le cerveau, hormis les souris démonstratrices, réutilisées jusqu'à deux fois puis gardées pour d'autres expériences. Le projet cherche à comprendre comment une caresse sur la peau au stade juvénile modifie les circuits de l'anxiété.
Objectifs
Les troubles anxieux touchent entre 15 et 20% de la population, les femmes plus que les hommes, et peuvent avoir des conséquences parfois invalidantes pour les personnes qui en souffrent. La qualité de l’environnement psychosocial (présence d’une cellule familiale solide sans violence physique/psychologique/sexuelle) et émotionnel (relation parents/enfant, cercle familial et amical) dans lequel un individu grandit et évolue constitue un des éléments clés favorisant sa capacité à faire face à un épisode de stress, sans développer de troubles anxieux en réponse à cet épisode. Ce phénomène de « résistance » au stress est appelé résilience. De l’enfance à l'adolescence, chaque individu traverse une période charnière permettant la maturation et le bon fonctionnement des régions du cerveau participant à la régulation émotionnelle. Des recherches récentes menées chez l’humain ont montré que les thérapies basées sur le toucher donnaient des résultats encourageant sur la diminution du sentiment d’anxiété, suggérant un rôle important, bien que très peu compris, du toucher dit social/affectif (TS/A) dans la régulation émotionnelle. En stimulant les neurones à ocytocine, une molécule clé de la régulation émotionnelle, le TS/A entraîne l’activation de l’aire tegmentale ventrale, une région dopaminergique régulatrice de l’anxiété. Ce projet de recherche, conduit sur un modèle murin, vise ainsi à comprendre les mécanismes neurobiologiques par lesquels le TS/A, via l’activation des neurones ocytocinergiques, régule la réponse au stress de l'aire tegmentale ventrale et favorise la résilience. Les régions cérébrales ciblées dans ce projet étant connues pour montrer des différences en fonction du sexe des individus, la prise en compte de ce paramètre est un point central de ce projet, et apportera de nouvelles connaissances qui permettront de mieux comprendre la surreprésentation des femmes parmi la population de personnes affectées par des troubles anxieux.
Bénéfices attendus
Les troubles anxieux font partis des troubles psychiatriques les plus communs mais leurs causes complexes et variées rendent ces troubles encore difficiles à soigner. Les approches thérapeutiques actuelles (psychothérapie couplée ou non à traitement pharmacologique de type anxiolytiques/antidépresseurs) imposent une mise au point longue et fastidieuse pour trouver une approche adaptée aux besoins de chaque patient, et nécessite donc une prise en charge de longue durée, aux résultats variables. Bien que les études chez l’humain apportent des connaissances essentielles quant à l’importance des liens sociaux dans la santé mentale et la résilience, l’essentiel des recherches se sont plutôt concentrées sur les effets délétères de l’absence de lien social (notamment les interactions parents/enfants), et ont laissé de côté l’étude des effets bénéfiques et protecteurs des liens sociaux sur la santé mentale. En identifiant les mécanismes biologiques de l’anxiété sensibles au TS/A, ce projet de recherche ouvrira de nouvelles perspectives aussi bien préventives que thérapeutiques sur la prise en charge des troubles anxieux.
Procédures
Protocole d'isolement social : 14 jours consécutifs - Chirurgie stéréotaxique : 1h30-2h - Electrophysiologie in vivo sur animal anesthésié: 4-6h - Stress de contention : 30 min - Tests comportementaux: 20 min répétés 7 fois maximum
Impact sur les animaux
Plusieurs types d’effets indésirables pourraient être observés chez les animaux de cette étude. Ces effets comprennent : 1) un risque de douleur au moment de la chirurgie et dans les jours post-opératoire ; 2) un risque d’infection lié aux chirurgies ; 3) un stress induit par les tests de comportements choisi ; 4) un stress induit par le protocole d’isolement social; 5) le stress de contention.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort, soit pour vérifier la qualité des injections stéréotaxiques/pose d'implant, soit pour procéder à des analyses post-mortem de type immunohistochimie ou quantification des projections neuronales. Les animaux démonstrateurs seront en partis utilisés à plusieurs reprises (2 fois maximum) lors des tests. Les animaux démonstrateurs pourront être réutilisés ultérieurement.
Remplacement
Ce projet se base sur une approche intégrative développementale, permettant de comprendre comment un stimulus périphérique tel que le TS/A (qui correspond à une caresse sur la peau) au stade juvénile peut remodeler à long terme les circuits neuronaux en charge de la régulation du stress et de l’anxiété sur le long-terme. Ainsi, cet objectif et les techniques nécessaires pour y répondre (injections pour du traçage neuronal/marqueur de population neuronale/biocapteur ; comportement ; enregistrements électrophysiologique) ne peuvent se faire que sur animal se comportant, à plusieurs stades de sa vie, et ne peut donc pas être remplacé par un modèle « in vitro ».
Réduction
L’essentiel des protocoles expérimentaux nécessaires à la réalisation de ce projet reposent sur des techniques utilisées en routine dans l’équipe. Cette expérience permet une estimation précise de la taille des échantillons nécessaires pour l’obtention de résultats fiables, et d’analyses statitisques robustes sans surestimation. Par ailleurs, la taille des groupes a été confirmé grâce à des analyses statistiques basées sur des calculs de puissance. Par ailleurs, pour chaque expérience l’échantillon d’animaux prévu sera divisé en plusieurs lots. Les résultats obtenus à partir de chaque lot seront analysés dans la foulée, ce qui permettra d’ajuster à la baisse la taille du lot suivant (et donc le nombre d’animaux nécessaires) si besoin. Par ailleurs, les femelles et les mâles seront utilisés, limitant la production d’animaux non-utilisés. Si les résultats préliminaires ne montraient aucun différence entre les mâles et les femelles, ce facteur d'analyse serait alors abandonné, entrainant une reduction drastique du nombre d'animaux nécessaires à l'étude.
Raffinement
Plusieurs procédures de raffinement seront mis en place pour maximiser le bien-être des animaux, dans le cadre des contraintes de ce projet : 1) l’établissement de points limites précis et de procédures de prises en charge associés misent en place dès que les points limites sont atteints ; 2) chaque animal bénéficiera de suivi post-opératoire pour assurer la mise en place de soins adéquats pendant et après les opérations et chaque interventions invasives sera réalisée sous anesthésies/analgésie ; 3) l’hébergement en cage collective sera privilégié, sauf pour les animaux soumis au protocole d’isolement social ; 4) ; la mise a disposition systématique d’enrichissement (tube en carton) et de matériel pour le nid dans chaque cage ; 5) afin de diminuer le stress lié à chaque manipulation, les animaux seront habitués à être sorti de la cage et posé dans la main de l’expérimentateur avant chaque procédure comportementale ; 6) un temps de repos de minimum une semaine sera assuré après intervention chirurgicale avant de poursuivre le protocole expérimental afin de laisser les animaux se reposer et minimiser le stress ; 7) un délai de 24h sera établi entre chaque tests comportementaux afin de maximiser le temps passer chaque jour par les souris dans leur cage d’hébergement et de minimiser le temps de solicitation afin de réduire le stress. Par ailleurs, les souris seront hébergées en cycle inversé de façon à ce que chaque étape des protocoles soient réalisées en phase nocturne, c’est-à-dire pendant la phase naturelle active des animaux. L’utilisation du cycle inversé permettra donc d’éviter de perturber les animaux pendant leur phase de sommeil. Les animaux bénéficieront du suivi journalier par les zootechniciens ce qui permettra de détecter rapidement l’apparition de symptômes négatifs, et donc une prise en charge rapide. Ce suivi sera encore plus poussé pendant la période péri-opératoire, lors de laquelle des analgésiques pourront être administrés en cas de douleur, et renouveller 24h plus tard si besoin. Si au bout de 3 jours, malgré l’administration répétée d’analgésiques, les signes de douleurs persistent, l’animal sera euthanasié. Par ailleurs, avant le début de chaque procédure, le poids et la taille des animaux sera contrôlé : tout animal qui trop petit ou trop faible sera exclu de facto de l’échantillon.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré une grande convergence anatomique et fonctionnelle du système nerveux à l’origine de la détection cutanée du TS/A, et des zones cérébrales activées suite au TS/A chez l’humain et la souris. Par ailleurs, le système ocytocinergique, qui est au coeur de notre étude, montre un niveau de conservation très important chez les mammifères. Ces similarités entre la souris et l’humain assureront la validité translationnelle des résultats obtenus dans notre étude et apporteront donc des connaissances nouvelles bénéfiques aux améliorations de la prise en charges des troubles anxieux. Par ailleurs, la souris est un modèle animal permettant la mise en place de méthodes invasives bien maitrisées par l’équipe. Ce projet se concentre sur le rôle du TS/A pendant l'enfance sur la capacité, à l'adolescence, de développer une résilience au stress. En effet, l'enfance et l'adolescence/début de l’âge adulte sont des périodes clé dans le développement cérébral et sont donc particulièrement sensibles au stress. Cette sensibilité au stress et donc au développement de troubles anxieux est vrai aussi bien chez la souris que l'humain. Ce projet cherche se concentre donc sur ces deux périodes développementales. Le protocole de TS/A, selon le protocole préalablement établi et publié, est effectué chez des souris juvéniles (P15-P19). Quant au protocole d’isolement social, il intervient au premier jour de sevrage des souris juvéniles (P21), et ce pour une durée de 14 jours. Les procédures de chirurgie stéréotaxique nécessitent d'être réalisées avant les tests comportementaux, et sont donc réalisées chez des souris de 6-10 semaines. Les tests comportementaux sont quant à eux faits chez des souris de 8-12 semaines.
Cartographie 3D de l’innervation des cancers du pancréas et de leurs métastases hépatiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
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Les souris porteuses de tumeurs sont tuées avant l'apparition des signes cliniques terminaux. 160 souris génétiquement modifiées, qui développent spontanément un cancer du pancréas, sont utilisées dans ce projet, 133 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et les autres tuées sous anesthésie sans réveil. Leurs organes sont prélevés pour reconstituer en 3D les réseaux nerveux de la tumeur et de ses métastases dans le foie. L'équipe affirme qu'aucune méthode sans animal ne recrée un environnement tumoral complet ni la dissémination spontanée des métastases.
Objectifs
L’adénocarcinome canalaire du pancréas est un cancer particulièrement agressif, pour lequel les chances de survie restent faibles. Il se développe dans un environnement tumoral complexe, composé de nombreuses cellules et structures non cancéreuses. Parmi celles-ci, la présence de fibres nerveuses est fréquemment observée et associée à une évolution défavorable de la maladie, suggérant que les nerfs jouent un rôle actif dans sa progression. Les méthodes actuellement utilisées pour étudier les tissus tumoraux reposent principalement sur l’observation de fines coupes au microscope. Elles permettent de détecter la présence de fibres nerveuses, mais ne donnent pas une vision globale de l’organisation des réseaux nerveux à l’échelle de la tumeur entière et ne permettent pas de déterminer avec quelles structures et cellules ces fibres interagissent. Pour dépasser ces limites, nous avons développé une méthode d’imagerie tridimensionnelle (3D) appliquée à des pancréas entiers rendus transparents. Cette approche permet de visualiser les structures internes du tissu sans le découper et d’obtenir une reconstruction complète et détaillée des réseaux nerveux et de leurs connexions. Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées qui développent spontanément des cancers du pancréas. Le premier objectif est de dresser une carte 3D précise des différents types de fibres nerveuses présentes dans les tumeurs pancréatiques et d’identifier leurs contacts avec les cellules cancéreuses et les autres composants de l’environnement tumoral. Le second objectif est d’adapter ces techniques d’imagerie 3D à d’autres organes, en particulier le foie, afin de visualiser les métastases issues du cancer du pancréas et de déterminer si elles sont, elles aussi, associées à des fibres nerveuses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, pour la première fois, une visualisation en 3D des réseaux nerveux présents dans les tumeurs du pancréas et dans leurs métastases au niveau du foie. Ces résultats contribueront à une meilleure compréhension du rôle des nerfs dans le développement et la dissémination du cancer du pancréas. À plus long terme, ces connaissances pourront favoriser le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les interactions entre les nerfs et les tumeurs, dans le but d’améliorer la prise en charge des patients.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux sont d’abord entièrement endormis grâce à une anesthésie générale, afin qu’ils ne ressentent ni douleur ni stress. Une fois profondément endormis, ils sont euthanasiés de manière contrôlée, ce qui permet de prélever et de préserver correctement leurs organes pour les analyses en microscopie 3D.
Impact sur les animaux
Ce projet utilise des souris qui développent spontanément des tumeurs pancréatiques. Durant les premières phases de développement tumoral, aucun signe clinique de douleur ou de détresse n’est observé, bien qu’une gêne localisée au niveau de la tumeur puisse apparaître. En phase terminale, l’état général des animaux se dégrade rapidement. Dans ce projet, les animaux porteurs de tumeurs seront étudiés avant l’apparition de ces signes cliniques associés aux stades terminaux de la maladie.
Devenir
Les animaux seront endormis puis euthanasiés afin de prélever leurs organes
Remplacement
Il n’existe actuellement aucun moyen de remplacer l’utilisation des animaux pour ce projet. Pour comprendre comment les nerfs s’organisent à l’intérieur des tumeurs du pancréas et des métastases qui se développent dans le foie, il est indispensable d’étudier des organes entiers dans leur environnement naturel. Les méthodes alternatives, telles que les cultures cellulaires, les mini-tumeurs en 3D ou les systèmes artificiels, ne permettent ni de recréer l’ensemble de l’environnement tumoral, ni de former des réseaux nerveux matures, ni d’observer la dissémination spontanée des cellules cancéreuses d’un organe à l’autre, comme cela se produit lors de la formation de métastases.
Réduction
Chaque organe prélevé sera analysé pour plusieurs marqueurs simultanément, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires a été estimé à l’aide de méthodes statistiques adaptées aux études exploratoires et descriptives.
Raffinement
Les souris développant des tumeurs sont générées uniquement en nombre strictement nécessaire aux besoins de l’expérimentation. Les animaux sont élevés en petits groupes dans des cages enrichies avec des tunnels, du coton et des dômes afin de favoriser leur bien-être. Une attention particulière est portée à la détection des signes cliniques de douleur. Dès l’apparition de tels signes, une surveillance renforcée est mise en place et les seuils de points limites prédéfinis sont strictement respectés. Lors de la procédure finale destinée au prélèvement des organes, les animaux reçoivent d’abord un traitement antidouleur, puis un anesthésique. La procédure est réalisée uniquement lorsque l’animal est complètement endormi et ne présente plus de réaction. Elle est effectuée dans une salle dédiée, séparée de la zone d’hébergement des animaux.
Choix des espèces
Les modèles animaux utilisés dans ce projet ont été largement étudiés et reproduisent de manière fiable les principales étapes du développement du cancer du pancréas chez l’humain. Ils sont couramment utilisés en recherche préclinique. Les organes seront prélevés à des stades précisément définis de la maladie, caractérisés par la présence de tumeurs et d’éventuelles métastases, mais avant l’apparition de signes cliniques de douleur. Ces stades ont été déterminés sur la base de nos données préliminaires.
Étude électrophysiologique et comportementale de la modulation de l’activité des neurones dopaminergiques de l’Aire Tegmentale Ventrale et du cortex chez la souris vigile.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Après une à deux craniotomies de deux heures, 440 souris subissent des auto-microstimulations du circuit de la récompense pendant trois semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le projet étudie comment le cerveau apprend à rechercher des récompenses et adapte ses décisions. Les chirurgies peuvent provoquer douleurs et infections aux sutures, la stimulation des troubles locomoteurs. Le porteur annonce des tests comportementaux sur trois semaines sans préciser lesquels, et les cerveaux sont prélevés après mise à mort.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment le cerveau apprend à rechercher des récompenses et à adapter ses décisions en fonction de l’expérience. Il s’intéresse à la manière dont les régions impliquées dans la motivation et la réflexion travaillent ensemble pour guider nos comportements. En étudiant ces interactions, ce travail vise à mieux comprendre comment nous planifions nos actions, changeons de stratégie et nous adaptons aux situations nouvelles.
Bénéfices attendus
Ce projet nous apportera des informations concernant le rôle des structures cibles du système de la récompense dans les comportements de prise de décision et d’apprentissage d’association.
Procédures
Les souris seront soumises à un maximum de 2 opérations chirurgicales sous anesthésie (de durée de 2h maximum chacune). Le temps de récupération entre 2 chirurgies sera de 4 semaines (220 souris seront soumises à 1 opération et un maximum de 220 souris seront soumises à 2 opérations). Les animaux passeront ensuite des tests comportementaux pendant 3 semaines environ, (10 minutes par jour pour chaque animal) où ils recevront des auto-microstimulations du circuit de la récompense (au maximum 440 animaux seront donc étudiés). Des enregistrements in vivo pourront aussi être mis en place pour étudier l'activité des neurones pendant le comportement. Enfin, une modulation de leur activité neuronale pourra être effectuée pendant le test comportemental.
Impact sur les animaux
Les animaux qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures (modérée, quelques jours). Certaines infections au niveau des sutures pourraient éventuellement survenir (moderée, quelques jours). Certains effets indésirables liés à la microstimulation électrique ou modulation des neurones peuvent survenir et troubler l'activité locomotrice (modérée, pendnat quelques minutes).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l’issue de toutes les procédures pour permettre le prélèvement des cerveaux à des fins d’études histologiques.
Remplacement
Notre projet vise à étudier la complexité́ du comportement de la souris. Le découplage et la corrélation entre comportement et neurophysiologie est aussi une composante majeure de ce projet. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux vigiles.
Réduction
Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec les tests statistiques adaptés. Les procédures ont été conçues pour qu'une même souris puisse participer à un maximum d'expériences, limitant ainsi le recours à de nouveaux animaux pour chaque expérimentation.
Raffinement
Ces protocoles sont conçus pour minimiser l’inconfort et garantir le bien-être des animaux tout en assurant des conditions optimales pour l’étude scientifique. Les animaux sont régulièrement manipulés pour réduire leur anxiété lors des tests de comportements. Enfin, afin de définir des points limites précoces permettant la mise en œuvre rapide de mesures adaptées en cas de douleur ou de mal-être, une grille de suivi graduée sera utilisée.
Choix des espèces
Le système dopaminergique mesocorticolimbique des rongeurs est relativement bien conservé par rapport à l’Homme, anatomiquement et fonctionnellement. Ce n’est pas le cas chez les invertébrés, poissons et oiseaux. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d’autres modèles. Des modèles de mammifères (rat, singe) ne se justifient pas non plus car les outils génétiques nécessaires pour disséquer les mécanismes sous-jacents n’existent pas chez ces espèces. Les modèles rongeurs sont donc des modèles de choix pour l’étude du comportement et de ses bases physiologiques, et présentent des mécanismes cognitifs complexes et une grande rapidité d’adaptation. Les animaux utilisés seront à l'âge jeune adulte. En effet, la procédure de stéréotaxie nécessite d’utiliser des animaux dont la croissance du crâne est stabilisée, et le stade adulte permet l'analyse de régions neuronales mâtures.
Influence à long terme d’une infection fœtale au cytomegalovirus sur le devenir d’une tumeur cérébrale ultérieure chez le rat
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Des femelles gestantes sont opérées pour injecter le cytomégalovirus dans le cerveau de leurs embryons, les ratons nés subissent des tests sensorimoteurs quotidiens, puis une tumeur cérébrale leur est implantée à deux mois. 1 274 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance majoritairement sévère, tous tués à l'issue. Le porteur décrit chez les ratons des crises d'épilepsie généralisées corrélées à des morts subites. Les femelles sont tuées faute de pouvoir être réutilisées, la descendance pour analyse post-mortem.
Objectifs
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du développement cérébral, pouvant notamment causer surdité, paralysie cérébrale, épilepsie, déficience intellectuelle, etc. Une influence sur la survenue ultérieure d'autisme ou de schizophrénie a aussi été évoquée. En dépit de leur fréquence et de leurs conséquences médicales et socio-économiques, les mécanismes des troubles neurologiques liés aux infections congénitales au CMV restent peu étudiés et mal connus. Ainsi, les options préventives et thérapeutiques restent limitées. L’étude de modèles animaux pertinents, notamment chez le rongeur, et utilisant les CMVs spécifiques de ces espèces, représente une approche indispensable pour appréhender ces mécanismes évolutifs, liés aux développements respectifs du système immunitaire cérébral et des réseaux neuronaux, et à leurs interactions réciproques, dans un contexte ou gestation et statut immunitaire maternel doivent aussi être pris en compte. L'objectif principal de ce projet est d'explorer chez le rat l'impact d’une infection précoce anténatale par le CMV sur le développement futur d’une tumeur cérébrale ultérieure, aux niveaux moléculaire et cellulaire, en nous intéressant particulièrement aux cellules immunitaires du cerveau.
Bénéfices attendus
Les infections congénitales par le cytomégalovirus (CMV) sont fréquentes (0.7 à 1% des naissances) et représentent une cause majeure de pathologie neuro-développementale, avec des conséquences médicales sévères et un impact socio-économique important. Cependant, les mécanismes restent mal compris et peu abordés. De ce point de vue, notre projet doit apporter des informations importantes pour apprécier ces mécanismes, en abordant les relations entre infection cérébrale fœtale par le CMV, immunité cérébrale retardée, et développement de tumeur cérébrale.
Procédures
Des femelles gestantes sont opérées sous anesthésie générale, afin d’accéder aux embryons et d’injecter le cytomegalovirus (CMV) dans les cerveaux embryonnaires. Dépendant du nombre d’embryons, la chirurgie dure de 30 à 45 minutes ; le muscle et la peau sont suturés. Au premier jour postnatal, les ratons d’une même portée sont tatoués au niveau des pattes avant et/ou arrière, et suivis quotidiennement pendant les deux premières semaines de vie postnatale (mesures de masse corporelle, réalisation de tests sensorimoteurs (test du réflexe de retournement lorsque l’animal est placé sur le dos, test du réflexe d’éloignement du vide lorsque la tête de l’animal est dans le vide, l’animal étant posé sur une plateforme élevée d’environ 8 cm), observation de la survenue de crises généralisées d’épilepsie) ; chaque session de tests dure environ 2-3 minutes. Après le 60eme jour de vie postnatale (P60), certains animaux sont opérés sous anesthésie générale (durée d’environ 30 minutes) pour implanter des cellules qui provoqueront l’apparition d’une tumeur cérébrale dans le cortex. Les animaux sont euthanasiés à la fin des expérimentations.
Impact sur les animaux
Les femelles gestantes sont opérées sous anesthésie générale pour accéder aux embryons et réaliser des injections dans les cerveaux embryonnaires. L'anesthésie des femelles gestantes peut engendrer des dépressions respiratoires, une hypothermie, une déshydratation. La chirurgie elle-même peut engendrer en post-opératoire sur des temps courts (1 à 3 jours maximum) de rares et faibles hémorragies vaginales, des avortements partiels, des douleurs abdominales, une diminution de la mobilité / inactivité, une perte de poids, une inflammation des sutures Les femelles gestantes sont isolées lors de la période post-opératoire jusqu’à la mise bas. Leur bien-être après chirurgie est évalué quotidiennement par des mesures de paramètres cliniques et comportementaux. La majorité des femelles gestantes (de plus de 97%) récupèrent très bien après la chirurgie et la gestation se poursuit jusqu’à la mise bas. Chez les ratons nés après l’infection cérébrale au CMV in utero, un ensemble de signes cliniques sont attendus. Leur suivi quotidien au cours des deux premières semaines de vie postnatale a mis en évidence la survenue : d'hyperextension des membres inférieurs ; de crises d'épilepsie généralisées tonico-cloniques déclenchées par la manipulation, et correlée à la survenue de mort subite (sudden unexpected death in epilepsy, SUDEP) ; d’un défaut de développement de réflexes sensorimoteurs évalués par le test d'éloignement du vide (cliff aversion test) et le test de retournement (rigthing reflex). Le développement d’une tumeur cérébrale dans le cortex de rat adulte est associé à une dégradation de l’état général des animaux, notamment une perte d’appétit, une perte de masse corporelle, et une diminution de l’activité.
Devenir
Les femelles sont euthanasiés car elles ne peuvent pas être réutilisées. La descendance est mise à mort pour analyses post mortem.
Remplacement
Les mécanismes neurophysiopathologiques des infections congénitales par le CMV reposent de manière inhérente sur des interactions développementales multiples, entre la dynamique de l'infection virale elle-même, celle des réseaux neuronaux, et celle des systèmes immunitaires cérébral foetal et maternel. Il est évident que certains de ces évènements, ainsi que leur complexité, et leurs relations réciproques, ainsi que leurs conséquences à long terme comme envisagé dans le projet, ne peuvent être modélisés in vitro y compris en utilisant des organoïdes cérébraux, et encore moins par bio-informatique. Une partie de nos expériences d'enregistrements des activités épileptiques sera réalisée in vitro (tranches aigues de cerveau), afin de réduire l’expérimentation sur l’animal vivant.
Réduction
Nous avons basé le nombre minimal d'animaux nécessaires sur la base de nos résultats antérieurs, et sur des calculs classiques de puissance statistique pour les tests les plus usuels. Nous optimisons la réduction des animaux utilisés de plusieurs manières : - chaque gestation et tous les embryons injectés in utero sont utilisés. - par ailleurs, le principe de réduction sera appliqué, car les animaux seront suivis au cours de notre projet, depuis les tests neurologiques néonataux, jusqu’aux enregistrements in vitro et aux analyses immunohistopathologiques réalisées chez l’adulte. Ceci aura l'avantage de permettre d'établir d'éventuelles corrélations entre plusieurs anomalies chez les mêmes animaux ayant passé l'ensemble des tests.
Raffinement
Chaque rate et sa portée sont hébergées dans une cage avec nourriture et eau à volonté. Après sevrage (vers le 28e jour), les rats mâles et femelles sont séparés et hébergés à 2-4 par cage. L’environnement est systématiquement enrichi avec du papier foisonnant et un tunnel en carton permettant la confection d’un nid ; les rats adultes auront en plus une buchette à ronger. Avant les chirurgies (gestantes et rats adultes), réalisées sous anesthésie générale, la douleur est systématiquement prise en charge par l’injection sous-cutanée d’analgésique et d’anti-inflammatoire, et par l’application d’analgésiques locaux. Pendant la chirurgie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant, leur rythme respiratoire est surveillé en permanence. Une injection ip de sérum physiologique à 38°C est réalisée en fin d’intervention pour réhydrater les animaux. Après leur réveil, ils sont placés sur un tapis chauffant pendant au moins 30 minutes. Les rats adultes ayant reçu l’injection stéréotaxique sont replacés avec leurs congénères. Un suivi post-chirurgical est réalisé afin de détecter des points-limites précoce et adaptés. Seront surveillés chez les rates gestantes l’absence d'hémorragie vaginale et la date de la mise bas (euthanasie si retard de plus de 24 heures), et chez tous les animaux, la cicatrisation (nettoyage de la plaie et nouvelles sutures si besoin), la perte de poids (euthanasie si plus de 20%), l'hypothermie (froid au touché), l’apparition de signes de douleur (prostration, agressivité, absence de réaction aux stimuli). Si un score de points-limites est supérieur à 3, une injection d'analgésique sera pratiquée : buprénorphine ou anti-inflammatoire non stéroïdien en sous-cutanée toutes les 8 à 12 heures (doses utilisées dans l’ensemble de notre projet). Les ratons sont également suivis, avec une surveillance de la prise de poids, et l’observation de phénotypes caractéristiques de notre modèle (échec aux tests sensorimoteurs, hyperextension des membres inférieurs, crises généralisées tonico-cloniques). Ces mesures seront quotidiennes du 1er au 14eme jour de vie postnatale (P14). Après P14, seul le poids sera mesuré, une fois par semaine jusqu’au sevrage et au-delà.
Choix des espèces
Les animaux que nous utilisons, en l'occurrence les rats, sont des rongeurs de petite taille et d’élevage facile, avec une gestation d'une durée adaptée aux exigences des travaux de recherche. Ils possèdent un système nerveux central dont le développement présente de nombreuses similitudes avec celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est cependant suffisamment complexe pour être représentative. D'une manière générale, ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes pathologiques du développement cérébral. Le rat est particulièrement adapté à des études des propriétés et activités électriques des cellules nerveuses, cognitives et comportementales. Dans le projet présenté ici, le choix de l'espèce est aussi orienté par l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus de rat recombinante, car les cytomégalovirus, y compris ceux de rat, sont spécifiques d'espèce. Les rates gestantes seront âgées d'environ 10 semaines à 6 mois. Les infections in utero seront réalisées au 15e jour de développement embryonnaire, donc au début du dernier tiers de gestation, ce stade d'infection tenant compte de l'état de développement cérébral, d'impératifs méthodologiques, et conduisant à reproduire les conséquences neurologiques postnatales rappelant la pathologie humaine modélisée ici. L’étude des activités épileptiformes in vitro et des cellules immunitaires cérébrales sera réalisée entre le 75e et le 90e jour postnatal, période où la tumeur est susceptible d’altérer le fonctionnement cérébral pour déclencher des activités épileptiques et où les cellules immunitaires sont abondantes dans le microenvironnement tumoral.
Caractérisation d’un modèle murin d’une maladie génétique rare avec des malformations cranio-faciales
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
Tous tués, y compris des embryons et des souriceaux à quelques heures de vie, 82 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie sous anesthésie sans réveil. Elles portent la mutation d'un syndrome génétique rare qui provoque des apnées sévères, et leur respiration est mesurée pendant une heure dans les huit heures suivant la naissance. Des femelles gestantes sont isolées jusqu'à la mise bas puis tuées avec leur portée, d'autres subissent une césarienne létale pour prélever les embryons. Le porteur affirme que seule l'approche in vivo évalue les conséquences de la mutation à l'échelle d'un "organisme entier".
Objectifs
Le syndrome auriculo-condylaire (SAC) est une malade génétique très rare qui touche principalement le visage et la machoire. Les personnes qui en sont atteintes présentent des oreilles en forme de point d'interrogation, une machoire inférieure petite et étroite et une transformation en partie de cette machoire inférieure comme une machoire supérieure. Les patients peuvent présenter d'autres anomalies comme un tonus musculaire faible, un retard de développement, une perte d'audition et parfois des troubles du contrôle respiratoire notamment une détresse respiratoire à la naissance. Pour mieux comprendre la maladie, une lignée murine a été créée portant la mutation génétique la plus observée chez les patients et qui est impliquée dans le développment de la machoire. Sur le plan respiratoire, la mutation perturbe la réponse ventilatoire à une augmentation du dioxyde de carbone (CO2) et provoque des apnées sévères. Le projet vise à caractériser la nature de ces apnées et d'identifier les structures du cerveaux atteintes et le mécanismes qui conduisent à ces anomalies.
Bénéfices attendus
Dans le cadre d'une maladie extrêmement rare, la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la maladie permet d'affiner la prise en charge des malades. Elle contribue notamment à améliorer la reconnaissance des complications respiratoires associées, permettant ainsi d'adopter les stratégies de prise en charge plus ciblées.
Procédures
1/ Entre 0 et 8h de vie, la respiration de chaque souriceau est mesurée une fois. La mesure dure une heure. A l'issue de la mesure, les souriceaux sont euthanasiés par un personnel compétent et un petit fragement de la queue (2-3 mm) est ensuite prélevé (prélèvement post-mortem) pour en identifier le statut génétique. 2/ Pour les femelles gestantes dont les portées seront mesurées à la naissance : isolement en hébergement individuel du 15 ème jour de gestation jusqu'à la mise bas et l'euthanasie de la portée (au maximum 9h après la mise bas). Les femelles seront ensuite regroupées. 3/Cesarienne sur des femelles gestantes à différents âges gestationnel. Césarienne réalisée après anesthésie létale et en statut post-mortem puis extraction des embryons. 4/ Embryons prélevés en post-mortem
Impact sur les animaux
1/ Séparation maternelle d'une heure pour la mesure cardio-respiratoire pouvant générer du stress 2/ Détresse respiratoire causée par la mutation et le stress engendré par cette situation
Devenir
Tous les animaux (embryons, foetus, souriceaux et femelles gestantes pour la procédure 2) sont euthanasiés en fin de procédure.
Remplacement
L'approche in vivo permet d'évaluer de façon intégrée les conséquences fonctionnelles d'une mutation à l'échelle d'un organisme entier. Dans le cas du syndrome auriculo-condylaire, les atteintes des populations neuronales impliquées dans le contrôle autonome de la respiration influencent directement l'activité des autres organes. Ces interactions fonctionnelles ne peuvent être reproduites fidèlement sur les modèles cellulaires. L'utilisation de l'animal ne peut alors être évitée
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Nous avons déterminé un lot expérimental réduit de 15 animaux par génotype. Cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires un effectif plus faible permet de tester les hypothèses. Pour l'étude moléculaire et tissulaire, un effectif réduit de 6 animaux par génotype est suffisant selon la recommandation de la plateforme qui effectue les analyses.
Raffinement
Les femelles gestantes sont isolées à 15 jours de gestation ce qui est bon compromis pour l'habituer et réduire ainsi l'angoisse à l'isolement pour une espèce grégaire. La cage d'hébergement est enrichie en cellulose doux pour le nid.
Choix des espèces
Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques d'une maladie génétique. Dans notre cas, le modèle murin transgénique permet d'étudier les conséquences de la mutation fréquemment observée chez l’Homme, notamment sur le développement cranio-facial et les troubles respiratoires associés. Des mesures respiratoires sont réalisées entre 0h et 8h après la naissance afin de caractériser les anomalies ventilatoires précoces. Pour analyser la mise en place des structures cranio-faciales et des substrats neuroanatomiques impliqués dans le contrôle respiratoire, des prélèvements seront réalisés à différents stades embryonnaires.
Etude d’une nouvelle technique d’imagerie à résonance magnetique (irm) visant à detecter les changements de myeline dans un modèle murin de sclerose en plaques . EU2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux à quatre anesthésies générales de deux heures chacune pour des examens d'IRM : 18 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. La cuprizone incorporée à leur nourriture détruit la myéline et provoque des troubles moteurs, une perte de poids et des comportements anxieux, réversibles à l'arrêt du produit. Le projet compare une nouvelle méthode d'IRM à la technique de référence pour mesurer la myéline. Leur mise à mort sert à vérifier que les images correspondent à la réalité du cerveau.
Objectifs
De nombreuses maladies du cerveau et de la moelle épinière s’accompagnent d’une atteinte de la myéline, une structure agissant comme une couche isolante autour des neurones, permettant aux messages du cerveau de circuler plus vite et efficacement. Parmi ces maladies, nous retrouvons la sclérose en plaques (SEP), dont l'incidence est en augmentation depuis plusieurs années. Ainsi, pour mieux traiter ces patients, il est nécessaire de disposer d'outils en pratique clinique permettant de quantifier cette atteinte, et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet cela de façon non-invasive. Néanmoins, les techniques d’IRM actuellement utilisées en pratique clinique ne permettent pas de voir directement la myéline mais seulement les dégâts infligés au cerveau lors de l’atteinte de cette myéline. Depuis plusieurs années, des techniques d’IRM sont développées pour essayer de mesurer directement l’atteinte de la myéline, et il en existe aujourd’hui une qui est considérée comme la référence. Néanmoins, cette technique est complexe et nécessite une longue durée d’acquisition, rendant son utilisation en pratique clinique impossible en l’état. Nous avons donc développé une nouvelle technique d’IRM ciblant la myéline, plus simple dans sa mise en œuvre. Ce projet vise à tester cette nouvelle méthode d’imagerie, en la comparant à la technique de référence, à l’aide d’un modèle murin imitant la sclérose en plaques humaine : le modèle cuprizone. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d'établir une nouvelle méthode d'IRM fiable, non invasive et applicable en conditions cliniques pour quantifier la myéline in vivo, ce qui fait actuellement défaut pour le suivi des patients atteints de SEP. Cette nouvelle approche sera aussi utile dans le cadre d’autres pathologies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer. Ceci est d'autant plus important que le développement de thérapies innovantes visant à favoriser la remyélinisation (c’est-à-dire visant la réparation de la myéline atteinte, et donc la protection des neurones), devient une priorité depuis quelques années.
Procédures
Le traitement par cuprizone sera administré per os, directement incorporé au sein de la nourriture habituelle des souris, à la concentration de 0,2%. Les animaux bénéficieront de 2 à 4 sessions d’anesthésie générale gazeuse, afin de permettre leur immobilité et de réduire leur stress lors des examens par IRM. Chaque session aura une durée maximale de 2 heures.
Impact sur les animaux
L’administration du traitement par cuprizone peut entraîner chez la souris des troubles moteurs légers, à savoir principalement des troubles de la coordination et locomotion. Elle peut aussi entraîner des troubles comportementaux liés à des problèmes de mémoire et d’apprentissage, pouvant être à l’origine de comportements anxieux ou dépressifs. La cuprizone peut également avoir des effets physiologiques généraux avec une perte de poids et une baisse de l’activité. Toutefois, dès que l'on arrête de donner le produit à la 6ème semaine, le cerveau cesse d'être attaqué. Cela marque le début d'une phase de guérison où l'animal retrouve progressivement sa forme et son comportement normal. Par ailleurs, il peut y avoir un stress lié aux transports des souris entre les animaleries et la plateforme d'imagerie.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de prélever et analyser leur cerveau. Cette étape est indispensable pour vérifier que les images obtenues en IRM reflètent bien la réalité biologique observée dans le cerveau.
Remplacement
Dans le cadre de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est obligatoire pour valider la robustesse de nouveaux paramètres IRM dans des conditions biologiques réelles. Ces validations constituent une étape incontournable avant toute transposition en clinique. A ce jour, malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, aucune alternative non animale ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des mécanismes de démyélinisation et de remyélinisation in vivo.
Réduction
Le nombre de 18 souris est nécessaire et suffisant pour analyser la perte de myéline induite par le traitement à la cuprizone, la reconstitution de la myéline tout en considérant les variabilités inter-individus, aux 3 points temporels de notre étude. Le suivi longitudinal permet de réduire la variabilité inter-individuelle et le nombre total d’animaux utilisés, tout en évaluant la nouvelle technique IRM.
Raffinement
Des mesures de raffinement seront prises au cours du suivi afin de réduire le stress engendré par les examens IRM répétés,les transports et les contentions multiples et les troubles induits par l'ingestion du médicament pour induire une démyélinisation . Ces mesures seront réalisées sous anesthésie générale, afin que l’animal ne bouge pas et permettra de diminuer le stress induit par le bruit des machines. L’hypothermie, induite par le passage dans la machine IRM sera prévenue par un maintien d’une température stable pendant toute la durée de l’anesthésie. Des points limites seront appliqués, conduisant selon la situation, à l’arrêt de la procédure et/ou à la mise à mort humanitaire conformément aux procédures en vigueur.
Choix des espèces
Le modèle cuprizone est le modèle de choix pour l'étude des changements du contenu en myéline dans le cerveau de souris. Il s’agira de souris femelles adultes ayant un développement cérébral achevé (âgées de 6 à 8 semaines) car la sclérose en plaques est une maladie du jeune adulte, touchant de façon prédominante les femmes.
Rôle du tronc cérébral dans le traitement des signaux sensoriels
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une partie des 220 souris subit une chirurgie terminale de une heure trente à quatre heures, opérée puis tuée sans réveil, uniquement pour la formation du personnel. Les autres sont opérées pour implanter une fibre optique dans le tronc cérébral, puis exposées à des sons, des lumières, des odeurs et des stimulations chaudes ou froides destinées à distinguer l'alerte de ce qui est perçu comme douloureux. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont tuées pour prélever leurs tissus. Le protocole exige des souris génétiquement modifiées ciblant les neurones étudiés, une ressource que le porteur décrit comme sans équivalent dans d'autres espèces.
Objectifs
Objectifs. Le projet étudie une zone spécifique du tronc cérébral qui freine l’activité de neurones produisant de la dopamine, un neurotransmetteur impliqué dans la motivation et la prise de décision. Nous voulons savoir comment cette zone réagit à différents signaux sensoriels (sons, lumières, odeurs, toucher, chaud/froid), présentés à plusieurs intensités. L’objectif est de distinguer une simple mise en alerte (saillance) de ce qui est perçu comme désagréable ou potentiellement douloureux. Approche. Chez la souris, nous suivons l’activité globale de cette zone grâce à un enregistrement optique via une fibre très fine implantée de façon ciblée (chirurgie sous anesthésie et analgésie), pendant de courtes stimulations standardisées. Les protocoles sont calibrés pour éviter toute lésion (seuils d’arrêt stricts, périodes de repos entre sessions). Intérêt scientifique. On sait que cette zone inhibe les neurones qui produisent la dopamine et s’active face à des signaux désagréables, mais on ignore comment l’ensemble de ses neurones code l’intensité et la nature des signaux. Ce projet apportera des données inédites sur la dynamique de cette région, et précisera si elle encode surtout la valence négative (désagréable/douloureux) ou plus largement la saillance Retombées potentielles. Mieux comprendre ces circuits pourrait orienter des recherches futures sur les troubles liés à la douleur persistante et certaines altérations de l’humeur. Il s’agit de recherche fondamentale : aucune thérapie n’est testée, l’objectif est de comprendre le fonctionnement normal de ces circuits.
Bénéfices attendus
Le projet précisera le rôle d’une zone spécifique du tronc cérébral qui freine l’activité de neurones produisant la dopamine, lorsqu’un organisme est exposé à des signaux sensoriels présentés à différentes intensités. Grâce à un enregistrement optique via une fibre très fine, il fournira des données inédites sur la dynamique d’activité globale de cette zone et permettra de distinguer ce qui relève de la simple alerte (saillance) de ce qui est agréable, désagréable ou potentiellement douloureux. Au-delà de l’avancée conceptuelle, l’étude pourra dégager des profils d’activité (selon la modalité et l’intensité des signaux) utiles comme références expérimentales pour de futurs travaux. À terme, une meilleure compréhension de ces circuits pourra orienter des recherches sur les troubles liés à la douleur persistante et certaines altérations de l’humeur. Il s’agit de recherche fondamentale : aucune intervention thérapeutique n’est testée, l’objectif est de mieux comprendre le fonctionnement normal du cerveau.
Procédures
Une partie des animaux subira une chirurgie terminale d’une durée comprise entre 1h30 et 4h, destinée à la formation du personnel. Les autres animaux subiront une chirurgie sous anesthésie profonde (durée maximale 2H) nécessaire à l'enregistrement de l'activité des cellules cérébrales d'intérêt puis des tests comportementaux sur animal vigile d’une durée inférieure à 30 minutes, espacés d’au moins 2 jours. Chaque animal réalisera au maximum 6 tests sur 80 jours de durée du projet. Tous les animaux subiront une procédure terminale sous anesthésie profonde pour prélèvements de tissus d’une durée d’environ 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont limités au stress des manipulations, à une possible inflammation locale temporaire après chirurgie, et à une perte de poids passagère. Ces effets sont réversibles et font l’objet d’une surveillance.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus. Les animaux sont euthanasiés sous anesthésie profonde pour permettre les analyses de tissus nécessaires (vérification du ciblage, analyses histologiques). Ces vérifications sont indispensables à l’interprétation scientifique des données et ne disposent pas d’alternatives fiables sans prélèvement.
Remplacement
Les objectifs nécessitent de relier activité cérébrale et comportement dans un organisme intact. Les approches in vitro/in silico ne permettent pas de reproduire cette intégration ni de tester la dynamique d’une zone spécifique du tronc cérébral en situation réelle.
Réduction
Les expériences sont conçues de façon à utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour répondre aux questions scientifiques. Plan séquentiel par cohortes avec analyses intermédiaires pour n’inclure que le strict nécessaire. Les mêmes animaux sont testés sur plusieurs modalités (limite à 6/11) avec calendrier adapté aux tests et jours de repos, ce qui diminue le nombre total d’animaux. Les animaux pour la formation/validation proviennent en priorité de réutilisations, réformes ou génotypes non conformes.
Raffinement
Les souris sont hébergées en petits groupes dans des cages enrichies, contenant des tunnels, du coton, des bâtonnets à ronger et du matériel de nidification, afin qu’elles puissent se reposer, explorer et exprimer des comportements naturels. Avant toute expérience, les animaux sont habitués progressivement à l’expérimentateur, aux salles et aux dispositifs de test utilisés, dans le but de diminuer le stress pouvant être associé à un environnement nouveau. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie et analgésie, et l’état des souris est surveillé attentivement après l’intervention pour vérifier leur bonne récupération et leur bien-être. Les sessions expérimentales sont courtes et espacées de périodes de repos afin d’éviter la fatigue et la sensibilisation. Pour les tests comportementaux, des points-limites sont mis en place afin d’éviter que les animaux ne soient exposés à une stimulation trop longue ou trop intense. À tout moment, si un animal présente des signes de douleur ou de détresse, les expériences sont interrompues et une prise en charge vétérinaire est assurée. A la fin du projet, la procédure terminale est réalisée sous anesthésie profonde afin que l’animal ne puisse pas ressentir de stress ni de douleur. Toute nouvelle méthode validée permettant d’améliorer le confort ou de réduire la douleur sera intégrée au projet.
Choix des espèces
Le protocole requiert des souris génétiquement modifiées permettant de cibler spécifiquement les neurones de la zone étudiée ; cette ressource n’existe pas de façon équivalente dans d’autres espèces utilisables. Les études exigent des systèmes nerveux matures : les animaux seront adultes (en général ≥ 8 semaines et ≤ 12 mois), afin d’éviter les effets liés au développement ou au vieillissement.
Profil et circuits socio-émotionnels de deux lignées de souris exprimant des mutations du récepteur nicotinique α5 impliquées dans l’alcoolisme MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Exposées à l'alcool, opérées pour implanter un dispositif dans le cerveau, soumises à l'optogénétique, à des tests sociaux, à un stress de contention répété et à un isolement de dix jours, 756 souris enchaînent ces procédures dans des travaux impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour conserver leur cerveau. Ces souris portent une mutation liée à la dépendance à l'alcool chez l'humain. Une modification récente ajoute une pompe implantée sous la peau diffusant de la nicotine en continu. Le même animal traverse plusieurs de ces étapes successivement, ce qui réduit, selon le porteur, le nombre total d'animaux utilisés.
Objectifs
Les problèmes liés à la consommation d'alcool sont très courants et dangereux dans notre société. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS), 5 % des décès dans le monde sont causés par une consommation excessive d'alcool. Pour mieux comprendre ce problème et trouver des solutions, il est important de savoir comment notre corps et notre environnement influencent cette dépendance. Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Toutefois, il reste difficile d'étudier ce lien chez les humains. Pour mieux comprendre, des chercheurs ont utilisé des rats qui avaient cette différence génétique. Ces rats avaient un risque plus élevé de rechute dans l’alcool après une période d’abstinence. De plus, ce gène joue un rôle important dans certaines parties du cerveau qui sont liées à la mémoire et aux relations avec les autres. Et les connexions entre ces zones du cerveau sont aussi liées à l’anxiété et au comportement social. L’objectif de cette recherche est d’étudier comment cette différence génétique affecte les émotions et les comportements sociaux, ainsi que la communication entre certaines parties du cerveau. Pour cela, nous utiliseront des souris spéciales qui ont cette même différence génétique, et les compareront à des souris normales. Nous observerons comment cela influence leurs comportements et leur consommation d'alcool, en étudiant aussi les différences entre les mâles et les femelles. Ensuite, nous enregistreront l’activité du cerveau des souris pour comprendre comment cette différence génétique change la manière dont les parties du cerveau communiquent entre elles. Puis nous essayeront de manipuler cette communication pour voir comment cela affecte les comportements sociaux des souris. Enfin, nous tenteront de remettre en place la version normale du gène dans le cerveau des souris pour voir si cela améliore leur comportement.
Bénéfices attendus
Des études ont montré qu'une petite différence dans un gène, appelé CHRNA5, peut augmenter le risque de devenir dépendant à l'alcool. Mais on ne sait toujours pas vraiment comment cela fonctionne. Malgré les graves conséquences de la dépendance à l'alcool sur la société, il existe très peu de traitements qui fonctionnent bien, et la plupart des personnes dépendantes rechutent après avoir essayé d'arrêter de boire. Les personnes qui souffrent de dépendance à l'alcool peuvent avoir des comportements très différents. Par exemple, certaines peuvent être anxieuses ou avoir des comportements antisociaux. Il est cependant compliqué de savoir si ces comportements sont causés par la consommation d'alcool ou s'ils étaient déjà présents avant. Notre projet a pour but de mieux comprendre comment les émotions et les comportements sociaux sont liés à la consommation d'alcool. Nous voulons savoir si ces comportements viennent de la consommation ou s'ils existaient avant. De plus, nous voulons prendre en compte les différences entre les sexes, car les réactions des hommes et des femmes peuvent être différentes. Ce projet pourrait nous aider à plusieurs niveaux. En tenant compte des émotions et pas seulement de la quantité d'alcool consommée, nous espérons comprendre comment cette différence génétique augmente le risque de dépendance. Si nous découvrons des comportements chez les animaux qui ressemblent à ceux observés chez les humains, cela pourrait nous aider à tester des traitements adaptés aux différents types de dépendance. Cela pourrait aussi conduire à des soins plus personnalisés, qui prendraient en compte la personnalité, le type de consommation d’alcool et le sexe de chaque personne, pour une meilleure efficacité. Enfin, nous cherchons à comprendre quelles parties du cerveau sont affectées par l'alcool et comment cela influence les comportements sociaux et émotionnels. Cela pourrait permettre de créer de nouveaux médicaments pour aider les personnes à arrêter de boire et à éviter les rechutes, en fonction de leur profil émotionnel et social.
Procédures
Les animaux passeront par plusieurs étapes dans cette étude : Ils auront accès à un biberon avec une solution d'alcool, une fois par jour, pendant 6 à 12 semaines (144 animaux). Ils subiront une petite opération sous anesthésie, d'environ 30 à 45 minutes, pour implanter un dispositif dans le cerveau (468 animaux). L’activité de leur cerveau sera mesurée sous anesthésie profonde pendant environ 1 heure après avoir stimulé une région spécifique du cerveau (144 animaux). Une technique utilisant la lumière permettra d'activer ou de désactiver certaines parties du cerveau chez des animaux éveillés, pendant 3 minutes (180 animaux, dont 90 pour l'activation et 90 pour la désactivation). Ils participeront à un test pour observer leur comportement social pendant 10 minutes par jour, sur une période de 5 jours (612 animaux). Ils seront soumis à un léger stress de restriction de leurs mouvements pendant 15 minutes, jusqu’à 4 fois au total, avec au moins une semaine de repos entre chaque session (144 animaux). Un petit échantillon de sang sera prélevé sous leur mâchoire. Certains animaux auront ce prélèvement une fois (288 animaux), d'autres deux fois, avec au moins une semaine d'écart entre les deux prélèvements (252 animaux). Certains animaux seront places en isolement social dans une cage contenant une roue d'activite pendant une periode de 10 jours avant d'etre replaces en cage collective (72 animaux). MODIFICATION: CERTAINS ANIMAUX RECEVRONT UN PETIT IMPLANT SOUS LA PEAU POUR DIFFUSER UNE PETITE QUANTITE D'UNE SUBSTANCE (NICOTINE) EN CONTINU (n=24).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs types de procédures expérimentales pouvant entraîner des nuisances de sévérité variable. Certains seront exposés de manière volontaire à une solution contenant de l’alcool sur plusieurs semaines. Cette consommation, laissée au choix de l’animal, peut induire des effets relaxants et une modification transitoire de l’état émotionnel. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale visant à accéder à des structures cérébrales. Cette procédure peut entraîner une douleur modérée et une légère perte de poids pendant quelques jours après l’intervention. Des complications peuvent survenir, telles qu’un saignement, une infection locale ou une perte du dispositif implanté, pouvant conduire à une décision de mise à mort. MODIFICATION: UNE AUTRE INTERVENTION CONSISTE A IMPLANTER SOUS LA PEAU UN DISPOSITIF PERMETTANT L’ADMINISTRATION CONTINUE D’UNE SUBSTANCE. CETTE PROCEDURE PEUT PROVOQUER UNE DOULEUR LOCALE MODEREE ET TRANSITOIRE AINSI QU’UNE LEGERE PERTE DE POIDS. ELLE PEUT EGALEMENT ENTRAINER DES MODIFICATIONS TEMPORAIRES DE L’ACTIVITE ET DE LA PRISE ALIMENTAIRE. Certains animaux feront l’objet de manipulations permettant de moduler l’activité de circuits cérébraux à l’aide de lumière. Ces manipulations peuvent induire un état anxieux léger et transitoire. D’autres procédures incluent la réalisation de tests comportementaux, pouvant générer un stress léger et de courte durée, ainsi que l’application ponctuelle d’un stress modéré. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés, entraînant une douleur brève au moment du geste. Enfin, certains animaux seront maintenus en isolement social pendant plusieurs jours, ce qui peut induire un stress modéré persistant durant toute la période d’isolement (10 jours maximum).
Devenir
A la fin des procédures les animaux sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde pour la conservation des tissus (cerveau), qui seront analysés ultérieurement.
Remplacement
Ce projet étudie la manière dont les souris reconnaissent les émotions et comment cela est lié à la consommation d'alcool. À ce jour, il n'existe pas d'autres méthodes pour faire ces recherches sans utiliser des animaux. De plus, nous voulons comprendre comment certaines mutations génétiques influencent ces comportements. C'est pourquoi nous devons utiliser des souris spéciales qui ont les mêmes mutations que celles que l'on retrouve chez l'humain
Réduction
Nous optimisons le nombre d'animaux utilisés en réalisant plusieurs tests sur chaque animal au lieu de multiplier les groupes. Ainsi, les animaux passeront par différentes étapes de manière séquentielle (comme des opérations, des prélèvements, ou des tests de comportement). Avant de lancer un protocole complet, nous faisons d'abord des essais sur un petit groupe de 4 à 5 animaux pour voir si cela vaut la peine de poursuivre. Cela nous aide à éviter d'utiliser trop d'animaux. Si les résultats sont prometteurs, nous passons à un groupe de 12 animaux, qui est le nombre minimum que l’on estime nécessaire pour avoir des résultats fiables. Nous vérifions également que les données sont bien réparties avant de les analyser avec des méthodes statistiques appropriées. MODIFICATION: ON AJOUTE UNE PETITE CHIRURGIE POUR PLACER SOUS LA PEAU UNE MINI POMPE QUI DIFFUSE EN CONTINU DE LA NICOTINE OU DU SERUM PHYSIOLOGIQUE, CELA LIMITE LES VARIATIONS DE CONCENTRATION DU PRODUIT DANS LE SANG ET PEUT AINSI REDUIRE LE NOMBRE DE SOURIS NECESSAIRES POUR OBTENIR DES RESULTATS FIABLES.
Raffinement
Nous ferons tout pour garantir le bien-être des animaux pendant l'étude. Lors des opérations, ils recevront une anesthésie pour les endormir et des médicaments pour soulager la douleur. Si l'opération dure longtemps, nous les hydraterons avec une injection pour qu'ils ne soient pas deshydratés au reveil. Tous les animaux vivront dans un environnement confortable, avec des matériaux pour construire des nids et des endroits où se cacher. Ils seront gardés ensemble pour maintenir leurs liens sociaux, et des techniciens vérifieront leur état chaque jour. Si un animal montre des signes de douleur, les techniciens préviendront immédiatement le responsable de l'étude pour prendre des mesures. Si nécessaire, nous donnerons des médicaments ou des crèmes pour les aider à guérir. Nous pouvons aussi leur fournir de la nourriture spéciale pour les aider à manger. Après certaines opérations, nous utiliserons des matériaux doux pour éviter d’endommager les implants. Les tests qui leur permettent d’interagir chaque jour contribuent aussi à leur bien-être. Tous ceux qui s’occupent des animaux sont formés pour le faire correctement. Enfin, si un animal doit être euthanasié, cela se fera de manière douce, sans douleur, pour minimiser ses souffrances. MODIFICATION: ON AJOUTE UNE PETITE CHIRURGIE POUR PLACER SOUS LA PEAU UNE MINI POMPE QUI DIFFUSE EN CONTINU DE LA NICOTINE OU DU SERUM PHYSIOLOGIQUE. CELA EVITE DE FAIRE DE NOMBREUSES INJECTIONS CHAQUE JOUR.
Choix des espèces
La souris est un animal souvent utilisé pour étudier le cerveau chez les vertébrés. Son système nerveux est organisé de manière similaire à celui des humains, et elle partage environ 95% de ses gènes avec nous, ce qui permet de transposer les résultats obtenus chez la souris à l'humain de manière assez fiable. De plus, la souris peut être génétiquement modifiée, ce qui nous aide à comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans de nombreuses maladies. Par exemple, grâce à des modèles de souris génétiquement modifiées, nous pouvons étudier comment certaines mutations génétiques humaines affectent des molécules ou des récepteurs spécifiques dans le cerveau. Les souris adultes ont été choisies pour cette étude car elles présentent une maturation complète des systèmes physiologique et neurologique, nécessaire à l’analyse des processus socio-emotionnels. Plus spécifiquement, nous utiliserons des souris modifiées pour exprimer des mutations des récepteurs nicotiniques, liées à la dépendance à l'alcool chez l'humain. Les souris montrent également une variété de comportements sociaux et de réponses émotionnelles, ce qui en fait un modèle pertinent pour notre recherche sur les émotions et la consommation d'alcool.
SubDOPA : Étude du rôle des récepteurs dopaminergiques D2 dans l’hippocampe chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Pour comprendre le rôle de récepteurs à la dopamine dans la mémoire de la peur, 2 417 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal subit une chirurgie de 30 à 45 minutes destinée à inactiver des zones précises du cerveau, des injections sur animal éveillé et une série de tests comportementaux. Le porteur décrit des stimulations électriques provoquant un stress ponctuel et une chirurgie suivie de tiraillements pendant 48 heures. Les retombées évoquées pour des maladies comme la schizophrénie restent renvoyées à de futures stratégies thérapeutiques, l'objet immédiat étant de cartographier des circuits cérébraux.
Objectifs
Le but de cette étude est de mieux comprendre comment certaines cellules du cerveau participent à la mémoire et aux émotions, en particulier à la mémoire de peur. Le projet vise à étudier précisément quelles cellules sont impliquées dans une région appelée l’hippocampe, connue pour son rôle dans la mémoire. L’étude cherchera ensuite à comprendre comment ces cellules contribuent au bon fonctionnement des circuits cérébraux et à la formation des souvenirs émotionnels, en utilisant des modèles animaux permettant d’étudier ces mécanismes de manière ciblée.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle des récepteurs neuronaux appelés « récepteurs D2 » dans la mémoire émotionnelle. Elle permettra de comprendre comment ces récepteurs peuvent influencer le fonctionnement du cerveau et le comportement, notamment dans le cadre de certaines maladies neuropsychiatriques, comme la schizophrénie. Ces découvertes nous permettront de contribuer à la mise au point de stratégies thérapeutiques plus ciblées pour ces maladies.
Procédures
Les animaux sont soumis à une intervention chirurgicale (d’une durée d’environ 30 à 45 minutes, sous anesthésie générale) permettant d’inactiver des zones précises du cerveau afin d’évaluer leur fonction dans la mémoire des émotions. Après une période de récupération complète, certains animaux participeront à des tests comportementaux. Ces tests se déroulent sur une semaine, avec des séances courtes chaque jour.
Impact sur les animaux
Les stimulations électriques peuvent entrainer un stress ponctuel, sans atteinte tissulaire ou douleur persistante. La chirurgie peut provoquer, dans les 48 heures suivant l’intervention, des tiraillements ou des démangeaisons au niveau du site opératoire. De plus, l’injection de substances chez des animaux éveillés peut provoquer un léger inconfort ou une douleur brève au point de piqûre, ainsi qu’un stress lié à leur manipulation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, car il est nécessaire de prélever les cerveaux pour des analyses. Les analyses visent à mieux comprendre comment les manipulations expérimentales modifient le fonctionnement du cerveau.
Remplacement
La réalisation de ce projet repose sur l’utilisation d’animaux pour mieux comprendre le fonctionnement du cerveau et son lien avec le comportement. Certaines méthodes alternatives, comme les cultures cellulaires ou les organoïdes, permettent d’étudier des cellules isolées, mais ne reproduisent pas encore la complexité d’un organisme vivant et ses interactions neuronales. Dans ce contexte, l’utilisation d’animaux reste nécessaire pour combiner ces approches et obtenir des résultats fiables, tout en cherchant systématiquement à réduire leur nombre et à privilégier des méthodes moins invasives lorsque cela est possible. À ce jour, la souris reste l’organisme le plus adapté pour combiner ces approches génétiques avec des analyses comportementales et fonctionnelles.
Réduction
Nous avons cherché à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, tout en conservant un effectif suffisant pour obtenir des résultats fiables. Le nombre d’animaux a été déterminé à l’aide d’outils statistiques couramment utilisés en recherche, afin d’éviter toute utilisation excessive. Pour les études sur le comportement, chaque groupe comprendra 12 animaux. Une partie d’entre eux sera utilisée pour des analyses d’anatomie, tandis que les autres serviront à compléter des mesures réalisées sur des cellules, ce qui permet de limiter le nombre total d’animaux nécessaires au projet. Dans toutes les expériences, nous travaillerons avec des femelles et des mâles issus des mêmes portées, afin de limiter les différences liées à l’origine des animaux.
Raffinement
Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l'apparition de signes cliniques. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expérimentations. Des soins post-opératoires adaptés seront assurés pour tous les animaux ayant subi une chirurgie. Un complément alimentaire humide sera fourni pendant les 48 premières heures afin de favoriser la récupération, accompagné d’un suivi attentif du poids et du comportement. Pour les animaux devant être hébergés individuellement, un enrichissement supplémentaire (paille, igloo ou maison en carton) sera mis en place, tout en maintenant une proximité visuelle et olfactive avec leurs congénères afin de limiter le stress et préserver le bien-être animal.
Choix des espèces
Les souris fournissent des excellents modèles pour l'étude des réseaux neuronaux, au cœur de notre projet. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes sur un point de vue médical. Ce modèle est parfaitement maîtrisé pour ce type d’expérimentation, tant sur le plan des techniques utilisées que sur celui des conditions d’hébergement et de bien-être animal. Toutes les souris seront transférées depuis la zone d’élevage vers la zone expérimentale à l’âge de 11 semaines. Il est admis qu’à 12 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures concernant la chirurgie prévue dans le projet. Les souris ne seront plus utilisées au-delà de 11 mois, afin de limiter l’apparition de facteurs liés au vieillissement pouvant interférer avec les analyses.
Étude de l’influence du contexte d’administration sur les effets pharmacologiques (comportementaux et neurobiologiques) induits par substances psychédéliques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
920 souris sont soumises à un modèle expérimental de dépression puis à l'administration de substances psychédéliques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Certaines subissent une chirurgie cérébrale pour des micro-injections ou l'implantation d'un dispositif laissé une semaine. Le RNT évoque des "tests comportementaux non invasifs" et un contexte "négatif" induisant un stress "modéré", sans détailler les substances employées ni nommer précisément les tests. Vingt souris relèvent d'un niveau de souffrance sévère, un chiffre laissé sans explication au regard des 900 autres classées en souffrance modérée.
Objectifs
La dépression constitue l’un des troubles mentaux les plus répandus dans le monde touchant près de 300 millions de personnes. En France, il est estimé qu’entre 15 et 20% de la population sera touchée au cours de sa vie. Aujourd’hui, les médicaments antidépresseurs présentent plusieurs limites, telles qu’une inefficacité chez 30% des patients, un délai d’action de plusieurs semaines et de nombreux effets indésirables. De nouvelle approches thérapeutiques sont donc nécessaires pour améliorer la prise en charge et le bien-être de millions de personnes. Certaines substances agissant sur le fonctionnement du cerveau suscitent aujourd’hui un fort intérêt scientifique en raison de leurs effets rapides et durables observés dans des études cliniques récentes. Toutefois, leurs mécanismes d’action restent encore mal compris, et des recherches précliniques sont indispensables pour mieux caractériser leurs effets, déterminer les conditions d’utilisation optimales et en évaluer la sécurité. L’un des objectifs de ce projet est d’étudier comment ces substances peuvent modifier la plasticité cérébrale, c’est-à-dire la capacité du cerveau à se réorganiser. En particulier, nous nous intéressons à des structures appelées matrice périneuronale, qui participent à la stabilité et à la flexibilité des circuits neuronaux. Des résultats préliminaires suggèrent que ces matrices pourraient être modifiées, permettant une réorganisation des circuits cérébraux impliqués dans la régulation des émotions. Le projet vise également à mieux comprendre pourquoi les effets observés peuvent varier d’un individu à l’autre et selon le contexte. Pour cela, nous développons un modèle expérimental chez la souris permettant d’étudier l’influence de facteurs individuels et environnementaux sur les effets de ces substances, de manière standardisée et reproductible. À terme, ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués, d’optimiser l’efficacité des futures stratégies thérapeutiques et de limiter leurs effets indésirables. Ces recherches pourraient ainsi contribuer au développement de nouveaux candidats médicaments pour le traitement de la dépression.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines substances peuvent avoir un effet antidépresseur. Il permettra de préciser les conditions d’utilisation et les mécanismes biologiques iencore insuffisamment connus. Le projet développera également un modèle expérimental permettant d’étudier l’influence de facteurs individuels et environnementaux sur ces effets, afin de mieux comprendre la variabilité des réponses observées. Enfin, l’étude des interactions avec un traitement de référence, l’antidépresseur fluoxétine, contribuera à anticiper d’éventuels risques et à améliorer la sécurité d’un usage futur. À terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de traitements antidépresseurs plus rapides et plus efficaces que ceux actuellement disponibles.
Procédures
Les animaux seront soumis à des tests comportementaux non invasifs, d’une durée de 5 à 10 minutes, réalisés sur une période limitée. Les manipulations liées au contexte expérimental (environnement et état de l’animal) sont plus durables, pouvant s’étendre jusqu’à 2h30. Le contexte négatif induit un stress modéré mais a été validée pour ne pas induire de stress majeur. Un modèle expérimental de dépression sera mis en place pour une durée maximale de 13 jours. Certains animaux subiront une seule intervention chirurgicale, d’une durée d’environ 10 à 20 minutes selon le groupe, réalisée sous anesthésie générale. Soit des micro-injections locales seront effectuées, soit un dispositif sera implanté et restera en place pendant une semaine.
Impact sur les animaux
Les animaux soumis au modèle de dépression pourront présenter des signes légers et temporaires de mal-être, comme un pelage moins soigné, une activité réduite ou une diminution de l’intérêt pour la nourriture ou l’environnement. Ces effets sont réversibles et disparaissent généralement en quelques semaines. L’administration de psychédéliques peut provoquer des mouvements brusques de la tête, une activité réduite temporairement ou une anxiété légère, toujours de courte durée et sans séquelle. Les injections nécessaires pour l’administration des substances peuvent causer une douleur très légère, comparable à une piqûre, mais transitoire. Les interventions chirurgicales entraînent un inconfort local limité pendant 24 à 48 heures. Un risque de troubles de la coordination ou une baisse d'activité peut survenir temporairement. Les manipulations comportementales ou les variations de l’environnement peuvent induire un stress léger et temporaire, sans effet durable. Enfin, l’association d’un antidépresseur classique avec un psychédélique ne devrait pas provoquer d’effets indésirables majeurs en conditions contrôlées, si ce n’est une légère anxiété ou réduction de l’activité locomotrice dans les heures suivant l’administration.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour réaliser des analyses.
Remplacement
Le recours au modèle murin est indispensable pour ce projet, les réponses comportementales complexes (évaluation phénotypes anxio-dépressifs), les effets neurochimiques de certaines régions cérébrales, l’analyse de l’activité neuronale et cérébrale, ne peuvent être réalisés in vitro. De plus l’objectif est de valider des stratégies thérapeutiques dans un modèle préclinique en vue de développer un protocole clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables tout en respectant le principe de réduction. Les effectifs par groupe (10 individus) ont été déterminés à partir de nos données antérieures et de calculs statistiques pour assurer une puissance suffisante. Les animaux seront répartis de manière aléatoire entre les groupes expérimentaux. Dans certaines expériences, plusieurs groupes seront comparés pour étudier l’effet de différentes doses. Dans ce cas, des analyses statistiques adaptées seront réalisées pour identifier les différences significatives entre les groupes. Pour les mesures nécessitant des techniques plus spécialisées (par exemple le suivi de certains marqueurs cérébraux ou la validation de doses expérimentales), 5 animaux par groupe suffisent, grâce à la comparaison des résultats avant et après l’intervention chez le même animal. Certains groupes de contrôle pourront être utilisés pour plusieurs expériences afin de réduire le nombre total d’animaux.
Raffinement
Deux situations spécifiques ont été identifiées comme particulièrement sensibles : les chirurgies et l’exposition à un modèle de dépression. Chirurgies : les animaux recevront une anesthésie et une prise en charge pour limiter la douleur et l’inconfort. Une surveillance post-opératoire renforcée sera mise en place, incluant un suivi rapproché de l’état général et des soins adaptés si nécessaire. Seuls les animaux ne présentant aucun signe de complication seront utilisés pour les expériences suivantes. Modèle de dépression : ce protocole peut induire des comportements liés à l’anxiété ou à la dépression, mais la procédure choisie génère des effets relativement subtils. Les animaux seront observés attentivement et toute manifestation de souffrance excessive entraînera une prise en charge immédiate adaptée.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car elle permet d’étudier de manière fiable les effets des antidépresseurs sur le cerveau. Chez la souris, le système cérébral est bien connu et présente de nombreuses similitudes avec celui de l’humain. Il est possible de mesurer des comportements liés à l’anxiété et à la dépression, ainsi que les adaptations du cerveau à différentes conditions expérimentales et au sein de différents contextes. Les expériences seront réalisées sur des souris âgées d’environ 10 semaines, correspondant à l’âge adulte chez l’animal. Ce choix permet d’étudier des comportements et des mécanismes cérébraux comparables à ceux d’un adulte humain, tout en évitant les variations liées à l’adolescence.
Etude chez la souris des effets neurophysiologiques d’une maladie causée par une mutation d’un canal calcique (EU1/2)-MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
408 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau et du cervelet. Les souris porteuses de la mutation peuvent développer une ataxie et des crises d'épilepsie, et 81 d'entre elles subissent une chirurgie crânienne pour la pose d'électrodes, enregistrées six heures par semaine pendant un mois. Quarante autres reçoivent une pompe osmotique et sont isolées trois semaines pour l'administration d'une molécule test. Le projet vise à créer le premier modèle animal de cette maladie cérébelleuse infantile, dont le porteur affirme que "l'attente des patients et cliniciens est considérable".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact physiopathologique d’une mutation gain de fonction d’un canal calcique décrite dans une maladie cérébelleuse infantile. Seules les études in vivo et ex vivo peuvent permettre de déterminer l’impact de cette mutation sur le(s) dysfonctionnement(s) neurologique(s) observé chez les patients atteints de cette maladie. Pour ce projet, nous utiliserons un modèle murin chez lequel l'expression de la mutation causale pourra être induite. Il s’agit du premier modèle animal de cette maladie et l’attente des patients et cliniciens est considérable, d’une part pour mieux comprendre cette pathologie, et d’autre part pour évaluer les traitements possibles.
Bénéfices attendus
Identifier les mécanismes pathogéniques dans l'atrophie cérébelleuse infantile. Préciser le rôle du canal calcique dans le développement du cerveau, du cervelet en particulier. Valider le modèle murin en tant que modèle préclinique de la maladie permettant d'évaluer des pistes thérapeutiques dans l'atrophie cérébelleuse infantile.
Procédures
Pour ce projet, 264 animaux seront évalués pour leurs capacités motrices et cognitives dans des tests standards. PARMI CEUX-CI, 24 SERONT ISOLES POUR LE TEST DE ROUE LIBRE. 40 AURONT UNE POMPE OSMOTIQUE IMPLANTEE SUR LE DOS ET SERONT ISOLES PENDANT 3 SEMAINES POUR ADMINISTRER UNE MOLECULE THERAPEUTIQUE TEST. Les autres animaux évalués dans cette 'procédure comportementale' sont issus de croisements permettant une expression conditionnelle de la mutation du canal. Ces différents tests, potentiellement générateurs de stress, se dérouleront sur une période d'environ 1 mois. 81 animaux subiront une chirurgie pour l'implantation crânienne d'électrodes pour l'enregistrement d’électroencéphalogramme (EEG). Sur ces animaux, l'EEG sera enregistré sur une période d'environ 1 mois, à raison d'une séance de 6 heures par semaine. 63 animaux participeront à une étude longitudinale des paramètres anatomofonctionnels par échographie photoacoustique du cerveau et du cervelet. Les mesures seront réalisées lors de courtes séances (15 min) d'acquisition sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, on peut s'attendre à des défauts neurologiques précoces qui vont résulter en une atrophie cérébelleuse et des troubles fonctionnels cérébelleux de type ataxie, ainsi que des crises épileptiques de type généralisée (absence). Nos procédures expérimentales pourront conduire à des effets indésirables. (i) les études comportementales du suivi locomoteur de l'ataxie pourront résulter en un stress des animaux lié à la préhension manuelle et la découverte de l'environnement expérimental que nous atténuerons par une habituation de ces animaux aux dites procédures. (ii) le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution des éventuelles dysmorphies cérébrales et cérébelleuses est une approche non invasive et non douloureuse. Comme en (i), le stress subi par les animaux se limite à la préhension par l'expérimentateur pour une courte période (15 min/animal). (iii) Le suivi du phénotype épileptique par enregistrement électroencéphalographique (EEG) ET LE TEST DE L'EFFET THERAPEUTIQUE D'UNE MOLECULE peuVENt induire une douleur modérée puisqu'il implique une chirurgie pour la pose d'électrodes intracraniennes OU D'UNE POMPE OSMOTIQUE EN SOUS-CUTANE.
Devenir
L'ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau et le cervelet, seront prélevés pour des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Le développement et la caractérisation d'un modèle souris est incontournable pour l'analyse physio/pathophysiologique de l'ataxie cérébelleuse. Son utilisation sera toutefois strictement limitée aux expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) ne pouvant être réalisées sur les modèles in vitro et in silico de la pathologie. Les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur l'activité du canal calcique seront étudiées dans des expériences d'électrophysiologie sur lignées cellulaires et des approches in silico seront développées pour modéliser les conséquences de cette mutation sur l'excitabilité neuronale. Ces stratégies in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact du canal muté à l'échelle cellulaire mais pas à l'échelle de l'organe entier, à savoir le cerveau, puisque les réseaux de neurones mis en place lors du neurodéveloppement ne peuvent pas être obtenus en culture ni par modélisation informatique. Quant aux études phénotypiques, par exemple les conséquences motrices d'anomalies du cervelet, elles nécessitent encore aujourd'hui de réaliser des expériences sur l'animal vivant.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 408) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement relevant. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire. Nous réaliserons dans la mesure du possible l'expérimentation comportementale (in vivo), et les analyses anatomique, tissulaire, cellulaire, sur les mêmes animaux. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille de score pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésiqueS et pour les scores les plus important, la mise à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal le mieux adapté pour i) modéliser de manière inductible la maladie neurologique étudiée et ii) développer l'ensemble des investigations anatomomorphologiques et fonctionnelles des atteintes cérébelleuses associées à la pathologie. La possibilité de contrôler l'expression de la mutation par la recombinase Cre (lignées de souris driver, injection de virus codant pour la recombinase Cre) est également un atout majeur justifiant l'intérêt de modéliser cette pathologie dans l'espèce souris. Les connaissances actuelles sur ce modèle permettent de répondre au mieux à la règle des 3 R. Utilisation de jeunes adultes et d'adultes pour étudier les conséquences neurodéveloppementales de l'expression de la mutation p.A961T, en particulier les conséquences sur le développement et la physiologie du cervelet.
Organisation anatomique et fonctionnelle des circuits moteurs cérébraux_ MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des chirurgies cérébrales pouvant durer trois heures, des lésions par neurotoxine et une eau de boisson acidifiée pour induire une déshydratation : 1 264 souris vont être utilisées, dont 768 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever le tissu nerveux. Le projet cherche à comprendre l'organisation des circuits moteurs du cerveau et leur atteinte dans la maladie de Parkinson. Le porteur décrit pourtant des atteintes "transitoires", une déshydratation "légère" et un stress "léger", alors que plus de la moitié des animaux relèvent de la gravité la plus élevée. Cette troisième version ajoute une canule implantée dans la cavité nasale, source d'une douleur post-opératoire que le résumé qualifie de modérée.
Objectifs
Le contrôle de nos mouvements repose sur des réseaux complexes de neurones dont le fonctionnement reste en grande partie mystérieux. Cela s'explique par le fait que chaque niveau du système nerveux central, du cortex cérébral à la moelle épinière, joue un rôle dans nos mouvements. Des études récentes montrent que certaines zones du cerveau, situées dans les régions bulbo-pontiques, sont organisées en modules spécialisés. Ces modules contrôlent différents types de mouvements comme la marche, la préhension, la mastication, et la succion. Ils envoient ensuite des signaux aux neurones moteurs situés dans le tronc cérébral et la moelle épinière pour exécuter ces mouvements. Cependant, nous ne savons pas encore précisément comment le cortex cérébral et les ganglions de la base choisissent et activent ces modules en fonction de nos besoins comportementaux. Notre projet de recherche vise donc à comprendre comment ces structures intermédiaires, situées entre le cortex et les ganglions de la base, contribuent à la sélection des modules de commande du tronc cérébral. Pour ce faire, nous allons étudier l'organisation en réseau des structures motrices du cerveau et déterminer le rôle de chaque composant dans la réalisation et la modulation des mouvements. En parallèle, nous allons examiner comment ces circuits sont affectés par la maladie de Parkinson. Notre objectif est de développer et tester des stratégies pour restaurer des mouvements adaptés en intervenant sur le fonctionnement des réseaux moteurs du cerveau. Nous espérons que ce projet, en plus de son intérêt scientifique, apportera des résultats pré-cliniques importants pour la compréhension et le traitement des maladies humaines, notamment dans le cadre des soins pour les patients.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de comprendre comment certaines structures du cerveau, qui sont connectées entre elles et forment des réseaux moteurs, contribuent à différents types de mouvements. Ces mouvements incluent atteindre un objet, le saisir, le manipuler, ainsi que marcher. Nous nous concentrons particulièrement sur des structures cérébrales qui pourraient être contrôlées par le cortex et les ganglions de la base, car ces derniers jouent un rôle crucial dans le choix des comportements moteurs.
Procédures
-Nous réaliserons sur des souris une chirurgie de (maximum) 180 minutes durant laquelle ils recevront trois injections. Puis des soins post-opératoires durant lesquels ils recevront une injection -MODIFIE : NOUS REALISERONS SUR D’AUTRES SOURIS UNE AUTRE CHIRURGIE DE (MAXIMUM) 180 MINUTES DURANT LAQUELLE ILS RECEVRONT DEUX INJECTIONS. PUIS DES SOINS POST-OPERATOIRES DURANT LESQUELS ILS RECEVRONT UNE INJECTION -Nous réaliserons sur des animaux une lésion d’une région du cerveau durant laquelle ils recevront deux injections quotidiennes durant 14 jours. -Des animaux réaliseront des tests moteurs d’environ 5-10 minutes répartis sur 4 jours. Ces tests seront réalisés 3 fois avec 14 jours entre chaque répétition. -Des enregistrements des neurones d'une durée de 2h seront réalisés sur des animaux. Les animaux recevront une injection. Chaque injection durera moins de 1 minute. -Pour certains animaux durant les 4 semaines l'eau de boisson sera remplacée par de l'eau citrisée afin d'induire une légère déshydratation de ces derniers.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie les animaux pourront présenter une douleur transitoire. En outre les animaux pourraient présenter une légère déshydration. Suite à l’induction d’un syndrome parkinsonien les animaux seront affectés sur le plan moteur avec pour conséquence une diminution de l’activité et des comportements de rotation sans pour autant altérer leur capacité à se nourrir. En outre les animaux pourront présenter une perte de poids limitée dans le temps pouvant induire un stress transitoire chez les animaux. Enfin, les animaux seront manipulés ce qui pourra générer un léger stress chez ces derniers. MODIFICATION L’IMPLANT DE CANULE DANS LA CAVITE NASALE POURRA ENTRAINER UNE DOULEUR POST-OPERATOIRE MODEREE MINOREE PAR DES ANTALGIQUES.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever le tissu nerveux pour des analyses histologiques.
Remplacement
Il n’y a au jour d’aujourd’hui aucunes méthodes alternatives nous permettant d’aborder notre projet sans passer par l’étude de modèles animaux, les approches in vitro ou in silico ne pouvant pas reproduire ou modéliser la complexité d’un organisme entier.
Réduction
Dans ce projet, des animaux mâles et femelles seront utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet n'excèdera pas 12 à 20 animaux par groupe, c'est à dire le nombre d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine.
Raffinement
Nous sommes particulièrement vigilants en ce qui a trait au bien-être animal et la prise en charge de la douleur. Des points limites précoces et spécifiques de notre étude ont été fixés et des procédures adaptées ont été établies, les mesures analgésiques incluses dans protocoles permettant de garantir à la fois la pertinence des résultats et le bien-être des animaux. Les chercheurs participant au projet ont une solide expérience dans la manipulation de rongeurs et l'ensemble des compétences requises à sa réalisation (notamment chirurgicales). À ce titre, il convient de préciser d'une part que le chercheur par ailleurs référant en matière de bien-être animal au laboratoire prend part au présent projet et d'autre part que le projet est bâti en accord avec les recommandations et conseils de la vétérinaire de l’établissement. Cette dernière sera sollicitée chaque fois que nécessaire par le coordinateur du projet qui lui permettra en outre de suivre, bien que de façon externe, le déroulement du projet et de proposer des procédures de raffinement bénéfiques à tous les égards. Les procédures mises en place suivent également les normes en matière de raffinement des pratiques expérimentales. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésies générale et locale et sont associées à des traitements analgésiques qui seront maintenus tant que nécessaire en fonction de l'état des animaux par ailleurs suivis quotidiennement. La mise en place des points limites et des mesures analgésiques notamment chez l'animal repose sur une méthode de scoring comprenant 4 niveaux : normal, modérée, sévère, mise à mort. Cette méthode prend en considération la douleur et l'état général de l'animal (poids, hydratation, soin au pelage etc.). Un animal classé modéré ou sévère recevra un traitement adapté aux symptômes exprimés. L'ajustement des traitements sera évalué sur une base quotidienne.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser des souris pour étudier les circuits moteurs et leurs altérations dans le cadre de la maladie de Parkinson. La maladie peut être reproduite expérimentalement chez la souris grâce à une neurotoxine. De plus, les souris transgéniques, combinées à l'injection de vecteurs viraux pour cibler des populations neuronales spécifiques, permettent d'explorer de manière précise l'organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux. Ces méthodes ne peuvent pas être appliquées chez l'homme. Les souris adultes seront utilisées pour ce projet, car elles correspondent aux objectifs scientifiques et méthodologiques, notamment pour les tests moteurs, les procédures chirurgicales et l'induction de la maladie de Parkinson.