Système nerveux

110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies cérébrales d'environ une heure, puis des tâches comportementales de locomotion fine. Le porteur utilise une lignée porteuse d'une mutation humaine reproduisant la sclérose latérale amyotrophique, qui développe une paralysie progressive du train arrière, et vise à enregistrer l'activité de certains neurones avant l'apparition des symptômes. Il indique que ces neurones, parmi les plus longs de l'organisme, sont impossibles à reconstituer en culture ou à modéliser, d'où le recours à l'animal.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie affectant le système moteur, qui se caractérise par la dégénérescence de plusieurs populations de neurones : ceux contrôlant l’activité des muscles (les motoneurones, situés dans la moelle épinière), ainsi que ceux transmettant l’information provenant du cerveau vers la moelle épinière (les neurones corticospinaux). Notre projet a pour but d’étudier l’activité fonctionnelle des neurones corticospinaux afin de mieux comprendre leur rôle dans l’évolution de la pathologie, dans un modèle murin de sclérose latérale amyotrophique. Plus précisément, nous avons pour objectif de : 1) identifier les neurones corticospinaux sur les enregistrements électrophysiologiques 2) comparer l’activité de ces neurones chez l’animal sain vs. dans un modèle de sclérose latérale amyotrophique, et 3) évaluer le rôle de cette voie dans divers comportements locomoteurs, à un stade peu avancé de la pathologie.

Bénéfices attendus

Chez certains patients SLA, une activité électrique anormale a été détectée dans le cortex moteur. Celle-ci est susceptible de nuire à la communication neuronale vers la moelle épinière, et d’endommager par conséquent les neurones qui, en bout de circuit, contrôlent l’activité des muscles. Grâce à l’analyse de l’activité électrique de neurones dans le cortex moteur d’animaux éveillés libres de leurs mouvements, notre projet va nous informer, avec un degré de détail jamais encore égalé, sur les propriétés électriques de ces neurones et leurs éventuels changements anormaux dus à la sclérose latérale amyotrophique. Notre objectif est de quantifier ces changements internes avant l’apparition des symptômes moteurs. Il est attendu que ce projet améliore de façon significative la compréhension des mécanismes de la sclérose latérale amyotrophique.

Procédures

Les animaux subiront soit une chirurgie unique durant environ 1,5 heure, soit deux chirurgies à 2 semaine d'écart, chacune durant au plus 1 heure. Au minimum une semaine après la dernière chirurgie, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours. La lignée SOD1 G93A développe un phénotype dommageable avec des premiers signes cliniques (non invalidants, membre postérieur partiellement affaissé dans le test de suspension de la queue) à P90, puis avec une partie du pied arrière qui traine à partir de P110. Si les animaux seront utilisés avant l’apparition de ces signes dans les procédures 2 et 3, ils seront maintenus au-delà dans la procédure 1 d’élevage, jusqu’à l’apparition d’une atteinte sévère (paralysie du train arrière à P120, âge médian).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Les expériences de ce projet ont pour but d'étudier l’atteinte des circuits locomoteurs chez la souris dans un modèle pathologique. Les neurones étudiés sont parmi les plus longs de l’organisme, allant du cortex à la partie lombaire de la moelle épinière. Ils sont impossibles à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doivent être intacts pour pouvoir être étudiés. Ils sont impossibles à modéliser numériquement car leur évolution au cours de la pathologie est encore méconnue. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisé a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre. Afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés, les procédures regroupent un ensemble de tests comportementaux dont l'enchaînement est compatible avec le bien-être de l'animal, ce qui permet de réduire grandement l’effectif.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce çà un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. L’âge médian d’apparition des premiers signes de la pathologie est de 90 jours après la naissance, mais il existe toutefois une variabilité individuelle autour de cette date. Nous prévoyons donc un suivi avec observation bi-hebdomadaire des animaux à partir de 76 jours après la naissance. De plus, à partir de cette date, des croquettes alimentaires seront placées dans le fond de la cage, ainsi que de l’aliment gélifié et un biberon à tétine longue afin de faciliter la prise d’eau et d’aliment.

Choix des espèces

Le modèle choisi est basé sur une forme familiale de la SLA chez l’homme, due à une mutation de la protéine SOD1 (G93A). Cette mutation (gène humain), introduite chez la souris entraîne une série de symptômes proches de la SLA. Il s’agit donc d’un modèle pré-clinique bien documenté de la sclérose latérale amyotrophique. Animaux utilisés à partir de 30 jours après la naissance, car c’est l’âge à partir duquel la voie de communication entre le cortex et la moelle a fini son développement

1260 jeunes souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Irradiées au cerveau dès l'âge de dix jours sous anesthésie, elles subissent des imageries et des prélèvements de sang, puis sont euthanasiées à différents délais pour prélever le cerveau. Le porteur indique attendre surtout une hypothermie et un stress liés à l'anesthésie et à l'irradiation. Il justifie l'étude par l'évaluation du risque des scanners et opérations sous rayons X pratiqués chez les enfants, un bénéfice présenté comme lointain.

Objectifs

Des millions de scanners de la tête sont pratiqués chaque année chez des enfants. De même des opérations de chirurgie de la tête sous radio sont réalisées chez des enfants. Ces pratiques apportent un bénéfice considérable en termes de santé publique. Néanmoins, le risque lié à ces actes, nécessitant l’utilisation de rayons X, chez des enfants nécessite d’être évalué. D’un point de vue épidémiologique, les conséquences au niveau du développement du cerveau de l’exposition cérébrale d’enfants à des doses de rayonnements ionisants inférieures à 2 Gy ne sont pas clairement établies et sont peu documentées. En ce qui concerne les connaissances scientifiques dans ce domaine, elles restent limitées. Dans ce contexte, nous avons développé des modèles d’irradiation du cerveau ou de structures cérébrales chez la souris âgée de 10 jours afin d’évaluer : (i) les seuils d’apparition des troubles du comportement chez les souris adultes, (ii) les mécanismes liés à ces effets et (iii) la manière dont l’irradiation impacte le cerveau en développement selon la zone irradiée. Des troubles (comportement, mémoire) ont pu être observés à l’âge adulte par suite de ces irradiations dans des projets précédents. Afin d’évaluer les mécanismes liés à ces effets, la formation de nouveaux neurones au niveau de certaines parties du cerveau a été étudié ainsi que l’inflammation au niveau du cerveau chez les souris adultes. Pour compléter nos résultats, nous souhaiterions étudier, dans le temps, l’effet de l’irradiation (dans des doses faibles à modérées) du cerveau ou d’une partie du cerveau de jeunes souris sur la vascularisation et l’inflammation du cerveau.

Bénéfices attendus

Tout d’abord, l’étude des vaisseaux et de l’inflammation après irradiation permettra d’améliorer notre compréhension sur les mécanismes d’action de l’irradiation pouvant avoir des effets sur les fonctions cérébrales. Ce projet est un complément de projets déjà réalisés avec ces mêmes modèles expérimentaux. Ensuite, ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances scientifiques sur les effets de l’irradiation sur la vascularisation cerveau dans le cadre d’exposition à des stades jeunes. Ainsi à plus long terme nos résultats pourraient contribuer à une meilleure évaluation du risque encouru par les enfants ayant été exposés à des dans des procédures médicales.

Procédures

Les jeunes souris mâles seront anesthésiées pour l’irradiation, les imageries éventuelles, le prélèvement de sang et les perfusions au moment de l’euthanasie (solution pour fixer les tissus et/ou pour colorer certains tissus).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables de l’anesthésie et de l’irradiation peuvent être une hypothermie, un réveil plus long de l’anesthésie ou un stress lors de la journée d’irradiation. Aux doses d’irradiation utilisées, il n’est pas attendu et il n’a pas été observé de lésions de brulure pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de réaliser les prélèvements de cerveaux et des imageries.

Remplacement

L’impact de l’irradiation sur la mise en place de la vascularisation cérébrale ainsi que sur la réponse inflammatoire du cerveau et les conséquences potentielles à l’âge adulte nécessite d’être étudiés in vivo au sein d’un système complexe intégré qui évolue dans le temps. Ce type d’études n’est pas actuellement possible avec des méthodes non animales.

Réduction

Nous utiliserons des tests statistiques. D’après nos études précédentes, il est nécessaire d’avoir 8 ou 10 animaux pour chaque groupe selon les analyses réalisées afin d’obtenir des résultats exploitables et robustes.

Raffinement

Avant la mise bas, les femelles gestantes seront mises une par cage afin d’éviter tout stress avec du papier kraft et du coton pour qu’elles puissent faire un nid et également une petite maison. Le jour de l’irradiation, les souriceaux sont mis ensemble dans une cage à 37°C, puis anesthésiés pour l’irradiation. Au réveil, ils sont remis dans leurs cages avec leurs mères. Puis, les petits resteront avec leurs mères jusqu’au moment du sevrage. Les animaux seront ensuite hébergés par groupe de 5 maximum dans des cages adaptées avec un enrichissement. Un suivi strict des animaux sera réalisé au quotidien. Leur comportement, leur poids, et tout signe clinique seront évalués afin d’identifier les points limites qui nécessiteront leur euthanasie anticipée.

Choix des espèces

Nous souhaitons utiliser des souris dans ce projet. Elles ont été notamment choisies car elles ont déjà été largement étudiées en neurobiologie. De plus, nos modèles d’irradiation ont déjà été développés et validés dans ce modèle au sein de notre laboratoire. Les animaux seront irradiés 10 jours après leur naissance. Cet âge correspond à une période critique de sensibilité du cerveau aux effets de l’irradiation et autres chimiques. Les euthanasies seront réalisées pour plusieurs temps post-irradiation : 6 heures, 3 jours, 1 semaine, 4 semaines et 3 mois. Les effets préalablement observés l’ont été majoritairement au temps 3 mois post-exposition. D’une part, ce projet complétera les données pour ce temps. D’autre part, l’étude à différents temps post-irradiation permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de l’irradiation pouvant conduire aux effets observés à 3 mois post-irradiation.

5 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés à l'issue plutôt que tués. Après plusieurs mois d'habituation, ils subissent une chirurgie possible d'implantation d'un plot de tête, une restriction hydrique, des injections d'un agent de contraste à base de fer et des séances d'IRM fonctionnelle vigile avec prélèvements sanguins. Le porteur reconnaît un stress lié à l'immobilité, au bruit et à la restriction hydrique, et un risque de troubles hépatiques dû au fer. Il affirme que le modèle primate est "essentiel" pour cette recherche fondamentale et évoque un sanctuaire, la mise à mort restant le dernier recours.

Objectifs

La perception de l'environnement construite par le cerveau est fondamentalement multi sensorielle et basée sur la combinaison de l'information sensorielle allocentrique (prend sa source en dehors du sujet, e.g. visuelle, auditive, olfactive) et égocentrique (prend sa source en référence au sujet lui-même, e.g. tactile, vestibulaire). Afin d’au mieux refléter le monde, le cerveau doit intégrer les informations multi sensorielles associées à une même source tout en séparant celles provenant de sources différentes ou encore les associer sur la base du contexte (ainsi un groupe qui s’enfuit prédit un cri ou une explosion, et un objet qui s’approche de nous à grande vitesse prédit un impact sur le corps). La combinaison des différents sens permet d’améliorer notre perception en réduisant les ambigüités notamment lorsqu’une modalité sensorielle ne donne pas suffisamment d’information (ex : pour se déplacer dans le noir). Comprendre les mécanismes neuronaux sous-jacents à ces processus cognitifs est essentiel pour mieux comprendre la compensation sensorielle et cognitive qui se mettent en place lors du vieillissement normal (compensation adaptative) ou encore les hallucinations ou les difficultés sensorielles qui s’expriment lors de troubles psychiatrique (compensation mal-adaptative; e.g. schizophrénie, autisme). Par ailleurs, ce projet s’inscrit dans le cadre d’une étude plus large, comparant les bases neurales de la cognition chez différentes espèces : l’homme, le macaque, le marmouset et le chien.Ici, nous utiliserons l’IRM fonctionnelle (IRMf) pour étudier les mécanismes neuronaux sous-jacents au traitement de stimuli sensoriels à connotation sociale (e.g. pour la modalité visuelle : une scène de grooming) en comparaison avec le traitement de stimuli socialement neutres (e.g. pour la modalité visuelle : un objet). Dans la modalité visuelle, nous nous intéresserons au traitement des scènes sociales complexes. Nous nous intéresserons également à la façon dont les animaux intègrent une information de récompense pour modifier la façon dont ils explorent une scène visuelle dynamique. Dans la modalité auditive, nous nous intéresserons au traitement des vocalisations y compris entre espèces. Enfin, dans la modalité olfactive, nous intéresserons à la spécificité du traitement des phéromones. Ce projet s’inscrit dans un projet comparatif plus large impliquant des sujets humains (bases de données accessibles), des macaques et des chiens.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et son évolution à travers les espèces. Grâce à ce projet, nous pourrons comprendre comment les macaques interprètent des scènes sociales dynamiques et comment leur cerveau traite ce type d’informations, en comparaison à l’homme. Par ailleurs, nous serons en position de comparer le traitement de vocalises entre trois espèces : homme, macaque et chien, permettant ainsi de mieux comprendre d’une part la spécificité du traitement auditif dans chaque espèce à l’histoire évolutive différente. Enfin, nous seront en position de comparer les bases neuro-cognitives du traitement olfactif d’odeurs et de phéromones entre ces trois espèces. Cette comparaison est rendue possible grâce à l’utilisation de l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle chez des sujets éveillés chez ces trois espèces, permettant ainsi la comparaison directe entre les activations cérébrales obtenues. Il est à noter ici que les aspects éthiques de l’imagerie chez le chien sont traités à part. Ces questions relèvent clairement du domaine des neurosciences fondamentales, et notre principale ambition est de mieux comprendre comment le cerveau met en œuvre ces fonctions cognitives chez l'homme et les primates non humains et d’autres espèces plus éloignées phylogénétiquement. Cependant, nous pensons que les réponses que nous apporterons pourront alimenter de nombreux domaines des sciences appliquées, des neurosciences cliniques, des sciences vétérinaires à l'intelligence artificielle. A titre d’exemple, ce projet pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes à l’origine d’hallucinations ou de déficits sensoriels et sociaux chez des patients atteints de maladies psychiatriques et définir des cibles de traitement de maladies comme la schizophrénie ou l’autisme.

Procédures

Habituation à la sortie de cage (3 mois) ; 1 Chirurgie potentielle sur deux animaux maximum, sous anesthésie générale (3h); Habituation aux tâche comportementales (6 mois); Habituation à l’injection d’agent de contraste (2 mois) comprenant 1 injection vigile; Campagnes d’acquisitions IRMf vigile comprenant (3 semaines, 1 session par jour, maximum de 3 campagnes d’acquisition par an): 1 injection pour chaque session, 3 prélèvements sanguins pour chaque campagne d’acquisitions IRM pour contrôler les niveaux de fer circulants. La procédure dans son ensemble est considérée comme modérée.

Impact sur les animaux

L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. Les animaux peuvent toutefois subir un stress de par l’immobilité imposée ainsi que de par le bruit important généré par la machine. La restriction hydrique peut s’avérer stressante. Des injections de produit de contraste seront effectuées en vigile (Molday Ion®). Ce produit de contraste est un oxyde de fer supra-magnétique, qui peut induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives. Les animaux ayant un plot implanté seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches IRMf. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques. Si la décision est prise d’une sortie de protocole, le plot de tête sera désimplanté. A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes pourront être réutilisés pour une autre étude, ou un replacement dans un sanctuaire sera envisagé. En dernier recours, si aucune solution alternative n’est possible, les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

L’utilisation du macaque s’inscrit dans un projet comparatif plus large impliquant plusieurs espèces (humain, macaque, marmouset, chien) dont le but est d’étudier l’évolution des différentes fonctions cognitives. Le macaque possède une place phylogénétique cruciale pour la compréhension de processus évolutif des modalités sensorielles humaines et non-humaines. L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude de recherche fondamentale et comparative, utilisant des approches d’imagerie IRMf. Nous cherchons à comprendre le fonctionnement cérébral dans des taches comportementales variées ne pouvant être réalisées que par des animaux (aucun model in silico, in vitro ou ex vivo ne permet pour l’instant de reproduire le fonctionnement d’un cerveau de mammifère dans des situations comportementales). La connaissance produite par ce projet participera à la construction de modèles in silico des fonctions cérébrales. Nous privilégions l’utilisation du macaque car phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables (approche évolutive) transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, le projet scientifique porte spécifiquement sur la comparaison des fonctions cognitives chez l’homme et le macaque. A terme, cela permettra donc de préciser les circonstances expérimentales et cliniques dans lesquelles le macaque peut être utilisé comme un modèle de la cognition humaine, et les conditions où il ne le peut pas.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations. Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 5 animaux dans le protocole (3 en réutilisation et deux en nouvelle inclusion). Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=3) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques comportementales avec des méthodes d’imagerie chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2). Tous les protocoles seront lancés sur les mêmes animaux ce qui nous permettra de comparer différentes acquisitions sur les mêmes sujets et ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les animaux en réutilisation, pour cette étude, suite à des recherches peu invasives, sont déjà entrainés à l’IRM et hébergé dans le laboratoire. Cette réutilisation est d’autant plus importante que ces animaux doivent être entraînés sur une longue durée de temps, avec renforcement positif, pour arriver à un comportement stable, avant de pouvoir passer à la phase de collecte de données. Nous prévoyons de lancer 9 campagnes d’acquisitions par animal (15 sessions par animal, chaque sessions incluant de 2 à 15 scans en fonction de la motivation des animaux).

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bienêtre des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. L’implantation du plot, réalisée chirurgicalement sera réalisée avec les meilleures techniques d’asepsie possible, par un neurochirurgien, afin de réduire le risque d’infection ou de désimplantation. En dehors des sessions d’imagerie qui seront réduites le plus possible sans compromettre les résultats scientifiques, les animaux seront hébergés dans un environnement social, incluant du matériel de fourrageage et de multiples formes d’enrichissement (selon un protocole défini en SBEA et implémenté par les chercheurs et les techniciens animaliers). Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire. Une sortie de cage vers la chaise sans canne est également à l’étude dans notre structure. Les points limites gradés, précis et adaptés ont été défini et permettrons en fonction des observations la prise de décisions selon un arbre décisionnel. Les critères d’arrêts sont définis et appliqués selon les mêmes critères que les points limites.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Cette étude s’intéresse à des mécanismes neurobiologiques chez le macaque pour des raisons de connaissance fondamentale. - Phylogénétiquement, ce modèle animal est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle la rendant notamment plus « facilement » comparable pour des études évolutives - Cette étude s’inscrit explicitement dans une perspective comparative entre espèces, la comparaison homme macaque étant un point clé de cette étude. En plus des connaissances fondamentales générées cela va permettre de préciser l’opportunité d’utiliser le macaque comme un modèle de la cognitive humaine et de ses dysfonctions. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes du point de vue des neurosciences fondamentales. -Toutes informations physiologiques ou physiopathologiques obtenues chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les trois animaux réutilisés sont des animaux matures. Les animaux reçus de nos fournisseurs sont de jeunes adultes (3.5-4 ans). Ils arrivent généralement déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. L’étude portant sur des sujets adultes, les variations de maturation ou de vieillissement au sein de cette tranche d’âge restes minimes et ne devrait pas engendrer de variations significatives des réponses neuronales dans les taches étudiées. Les données recueillies abonderont PrimeDRE, une initiative de partage de données d’imagerie fonctionnelle de primates non-humains. A terme, des analyses portant sur un possible effet âge sur les traitements cognitifs qui nous intéressent pourront être entreprises à plus large échelle.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique créant une lésion cérébrale, un test comportemental du cylindre, puis des injections quotidiennes de lévodopa pendant trois à quatre semaines qui provoquent des mouvements involontaires. Le porteur décrit ces dyskinésies, rotations, mouvements excessifs des pattes et de la langue, toilettage excessif, ainsi qu'une perte de poids et de poils. Il justifie le modèle par l'impossibilité de reproduire in vitro la complexité du réseau neuronal en jeu.

Objectifs

La maladie de Parkinson est causée par la mort progressive des neurones dopaminergiques, qui se manifeste par des tremblements et la perte progressive de la mobilité du patient. Le traitement le plus courant consiste à administrer un précurseur de la dopamine, la lévodopa (L-DOPA), qui compense dans un premier temps le manque de dopamine. Malheureusement, au fil des années de traitement, l’administration de la lévodopa, nécessaire au patient pour son activité motrice, déclenche également des mouvements involontaires (dyskinésies). Ces dyskinésies s’amplifient progressivement au point d’amener à l’arrêt du traitement. Des études récentes sur des modèles animaux ont permis de mieux comprendre comment la répétition du traitement lévodopa génère ces dyskinésies. Ces travaux indiquent que, au fil du traitement, certains neurones développent une hypersensibilité à la levodopa, qui est directement la cause des dyskinésies. Nous proposons une nouvelle approche pour modérer la réponse neuronale à la dopamine en modifiant l’action d’une enzyme, ce qui pourrait prévenir les dyskinésies chez les patients. L’objectif de ce projet est d’établir la preuve de concept de cette nouvelle stratégie thérapeutique, et comporte deux volets. D’une part, nous validerons le mécanisme d’action thérapeutique sur des préparations de neurones in vitro ; d’autre part, nous testerons l’effet thérapeutique in vivo. Ces deux volets seront réalisés à partir de souris parkinsoniennes, traitées par la lévodopa pour l’induction de dyskinésies. L’effet thérapeutique sera validé in vivo en administrant des activateurs ou inhibiteurs de l’enzyme ciblée, et en mesurant l’effet de ces molécules sur la production de dyskinésies chez la souris. L’imagerie de biosenseurs permet de mesurer in vitro la réponse des neurones à la dopamine. Nous mesurerons avec cette méthode, sur des neurones provenant des mêmes animaux, l’efficacité des molécules thérapeutiques pour réduire la réponse à la dopamine.

Bénéfices attendus

Alors que l’administration de lévodopa plusieurs fois par jour reste la thérapie la plus courante, il reste malheureusement peu d’option thérapeutique lorsqu’un patient parkinsonien développe des dyskinésies trop invalidantes. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques apparaît donc comme un impératif de santé publique. Sur la base d’études fondamentales d’une part, et de données obtenues sur des modèles animaux de la maladie, nous mettons en avant une hypothèse tout à fait originale pour modérer la réponse neuronale excessive à la dopamine qui survient lors de l’administration de lévodopa, et qui est la cause des dyskinésies. Ce projet vise à tester cette hypothèse in vitro et in vivo : si elle se vérifie, notre travail apportera des arguments solides qui motiveront le lancement de nouvelles recherches pharmacologiques pour développer de nouveaux médicaments. Si notre hypothèse est invalidée, cela forcera à reconsidérer nos connaissances dans ce domaine et à affiner nos modèles théoriques, ce qui pourra alors orienter les recherches vers d’autres cibles thérapeutiques. Par ailleurs, la partie imagerie in vitro de notre étude apportera des données tout à fait nouvelles quant à la réponse à la dopamine dans les neurones provenant de souris parkinsoniennes. Ce nouveau jeu de données, avec une précision spatiale et temporelle encore jamais atteinte, amènera des nouvelles connaissances sur les changements subis par les neurones au cours des différentes phases de la maladie de Parkinson et de son traitement par la lévodopa. Enfin, ces mesures seront extrêmement utiles pour établir des modèles numériques de neurones, ce qui permettra d’avancer dans la direction d’études physiologiques «in silico».

Procédures

Tous les animaux seront impliqués dans les actes suivants : - une chirurgie stéréotaxique afin d’induire le modèle hémi-parkinsonien ; effectué sous anesthésie/analgésie (1h). - 3 semaines après la chirurgie : l’étendue de la lésion est évaluée par le test comportemental du cylindre réalisé 1 fois pendant 3 minutes (l’animal est placé dans un cylindre en verre transparent pendant 3 minutes et un expérimentateur compte le nombre de fois où l’animal touche la paroi du cylindre avec sa patte avant droite ou gauche) - Traitement quotidien sur animal vigile pendant 3 à 4 semaines par injection intra-péritonéale, avec ou sans les molécules pharmacologiques à tester (quelques secondes par souris) - Une euthanasie en vue des différents prélèvement et analyses sous anesthésie Une partie des animaux subira une étape supplémentaire juste avant l’euthanasie : - une deuxième chirurgie sous anesthésie/analgésie (1h20) pour injecter un virus nécessaire pour de l’imagerie de biosenseurs. L’animal est euthanasié le lendemain.

Impact sur les animaux

A l’inverse du patient parkinsonien, chez qui la perte de dopamine a lieu dans l’ensemble du cerveau, le modèle animal utilisé dans ce projet présente une lésion seulement dans l’hémisphère droit. Des symptômes moteurs sont visibles dans les jours suivant la chirurgie, ce qui se manifeste par une activité motrice amoindrie, associée à une perte de poids. L’hémisphère cérébral gauche non lésé compense progressivement et après une à deux semaines, seuls des tests spécifiques peuvent révéler l’existence de la lésion. Le traitement répété par la lévodopa induit progressivement l’apparition de dyskinésies. Celles-ci peuvent apparaître entre 10 min et 3 h après injection de la lévodopa. La lésion étant effectuée à droite, les mouvements anormaux se produisent uniquement du côté opposé à la lésion. Ces mouvement anormaux apparaissent sous diverses formes : rotation à gauche, rotation du buste de l’animal vers la gauche, mouvement excessif des pattes, sortie excessive de la langue, toilettage excessif. Ce traitement quotidien peut mener chez certains animaux à une faible perte de poids ainsi qu’une perte de poils au niveau du flanc gauche suite aux mouvements et toilettages répétés à gauche.

Devenir

L'objectif étant d'effectuer des mesures par imagerie sur des neurones ou bien des analyses biochimiques sur le cerveau, tous les animaux sont nécessairement euthanasiés à l'issue de la procédure, pour le prélèvement du cerveau.

Remplacement

Ce projet vise à analyser les mécanismes neuronaux à l’origine des dyskinésies induites par le traitement à la lévodopa, et à tester une nouvelle stratégie thérapeutique pour limiter ces mouvements involontaires. L’effet de la lévodopa et le développement des dyskinésies impliquent de nombreuses adaptations au sein d’un réseau de neurones impliquant diverses régions du cerveau. Il est à notre connaissance impossible de reproduire la complexité des effets du lévodopa sur des cultures de neurones. Les études par modélisation «in silico» ne sont pas non plus possibles pour étudier les dyskinésies induites par la lévodopa car le fonctionnement de neurones n’est pas encore connu avec suffisamment de précision pour pouvoir développer des modèles numériques fiables. Un des objectifs de notre projet est justement de produire des données qui permettront ensuite de concevoir des modèles numériques plus fiables et représentatifs de la maladie. Enfin, ni des observations sur cultures cellulaires, ni des modélisations numériques, ne prédisent avec une fiabilité suffisante l’efficacité éventuelle d’un traitement pour des patients. Pour que la nouvelle stratégie thérapeutique que nous suggérons puisse déclencher des recherches pharmaceutiques ultérieures, il est indispensable de démontrer cet effet dans une situation expérimentale qui reproduit les aspects critiques du phénomène, ce qui, à ce jour, ne peut être obtenu que dans un modèle animal. C’est pourquoi nous proposons d’utiliser des souris avec une lésion d’un seul hémisphère, une situation dans laquelle cette moitié lésée du cerveau reproduit de nombreux aspects des dyskinésies induites par la lévodopa.

Réduction

Les souris seront utilisées pour l’étude comportementale in vivo ainsi que pour l’étude mécanistique ex vivo par l’approche d’imagerie de biosenseurs. Cette double utilisation permet de valoriser au mieux les animaux utilisés dans ce projet. De plus, pour l’étude mécanistique, nous avons optimisé la méthode d’imagerie afin d’effectuer en moyenne deux enregistrements à partir d’une même souris. Les mesures effectuées à l’aide des biosenseurs sont comparées entre animaux test et contrôles, et les différences sont validées par des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. La taille des effectifs est établie grâce à un calcul de puissance et permet d’estimer le nombre de répétitions de chaque mesure à 6. Ce projet utilisera un total de 320 souris. Les résultats issus de cette étude seront partagés avec la communauté scientifique par une ou plusieurs publications. Par ailleurs, l’ensemble des données obtenues à partir de ces expériences sera mis à disposition de la communauté scientifique sur un site d’archivage en ligne. Cela évitera de répliquer l’expérimentation dans d’autres laboratoires. Ces données pourront être analysées par d’autres chercheurs pour répondre à d’autres questions scientifiques.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans une animalerie adaptée avec nourriture et eau à volonté, matériel pour édifier le nid. L’animal est suivi quotidiennement pendant toute la procédure par un personnel compétent. La lésion des neurones dopaminergiques est réalisée uniquement dans un hémisphère du cerveau ce qui induit peu de perturbations motrices après récupération. Pour contrôler la douleur : injection sous-cutanée d’un anti-douleur opiacé le matin et le soir de la chirurgie. Avant le début de la chirurgie : injection sous-cutanée d’un produit protégeant les neurones non dopaminergiques. Pour la chirurgie, l’animal est anesthésié et placé sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Il reçoit une injection locale d’un anti-douleur au niveau de la peau du crâne et une injection sous cutanée de sérum physiologique glucosé pour prévenir la déshydratation. Les yeux sont protégés du dessèchement par un gel oculaire. Le lendemain de la chirurgie, l’animal reçoit une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pendant trois jours, l’animal est pesé et reçoit des injections sous-cutanées quotidiennes de sérum physiologique sucré. Pendant toute la durée de récupération, l’animal est placé sur un tapis chauffant et une nourriture enrichie est à sa disposition. Au delà des trois premiers jours, le poids de l’animal et la présence de signe de douleur sont évalués. Des points limités sont définis au préalable et un suivi quotidien permet de garantir le bien être des animaux. Dans le cas contraire, des mesures sont mises en œuvre pour y remédier (utilisation d’analgésique, d’anti-inflammatoire non stéroïdien ou euthanasie).

Choix des espèces

Notre projet doit faire appel à un modèle animal qui représente avec un maximum de fidélité les aspects de la maladie de Parkinson que nous souhaitons étudier. En particulier, notre modèle doit reproduire les dyskinésies produites par l’administration de L-DOPA, ce qui est le cas avec le modèle murin hémiparkinsonien. Ce modèle animal présente une lésion d’un seul côté du cerveau, ce qui minimise les dommages infligés à l’animal. De plus, les symptômes parkinsoniens et dyskinésies sont obtenus sur un laps de temps de quelques semaines, ce qui est court par-rapport à d’autres modèles de maladie de Parkinson : la durée des procédures est donc réduite. Ce modèle animal est bien décrit pour des souris mâles de 8 à 12 semaines au début du protocole, ce qui détermine notre choix.

1750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection de virus dans le cerveau et l'implantation d'une fenêtre crânienne, puis une tâche de détection tactile la tête fixée, avant la mise à mort en fin de projet. Le porteur décrit un risque de douleur postopératoire et d'infection lié aux chirurgies et aux implants. Il présente les retombées pour la santé humaine comme lointaines et justifie le recours à l'animal vivant éveillé par la nécessité d'un cerveau intact.

Objectifs

L'attention spatiale régule la réactivité sensorielle et la perception, agissant comme un "projecteur" qui rend le stimulus plus significatif et plus visible. L’attention facilite galement les processus d'apprentissage. L'activité neuronale est modulée par l’attention dès les premières étapes du traitement sensoriel au niveau cortical. Il a été proposé que le substrat neuronal véhiculant l’information attentionnelle serait porté par des connexions descendantes (top-down), c’est-à-dire depuis des aires corticales secondaires ou associatives vers le cortex sensoriel primaire. Dans le cas de la perception tactile, ces informations attentionnelles descendantes seraient projetées sélectivement vers l’aire du cortex somatosensoriel primaire (S1) traitant des informations de la partie du corps concernée. Bien qu’il existe des données appuyant cette hypothèse, aucune démonstration directe de la transmission des signaux attentionnels par ces connexions descendantes n’a été faite. De même, les mécanismes permettant à ces connexions descendantes de moduler la perception et l'apprentissage sensoriel restent inconnus. Je propose de tester cette hypothèse chez des souris effectuant une tâche de détection tactile guidée par l'attention.

Bénéfices attendus

Dans nos sociétés vieillissantes, les problèmes d’attention liés à des conditions pathologiques ou à l’âge prennent une place grandissante. Il devient donc crucial de comprendre les mécanismes de l’attention pour améliorer les diagnostics médicaux et développer de futurs traitements. Les résultats issus de nos travaux auront donc des implications importantes dans le domaine de la santé, pour l’amélioration des conditions de vie humaine.

Procédures

- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus :sur des animaux P0 et animaux adultes entre 10 et 20 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H

Impact sur les animaux

Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte.

Devenir

Les animaux seront maintenus en vie après les protocoles de chirurgie et comportement ensuite ils seront mis à mort à la fin du projet

Remplacement

Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent une fonction cognitive complexe : l’attention tactile. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions les mécanismes neuronaux qui sont engagés au moment précis de l’attention. Le projet ne peut donc se faire que sur des animaux vivants éveillés. Cependant, la tâche comportementale est totalement non douloureuse et non stressante, et la chirurgie sera réalisée sur des souris anesthésiées dont le niveau de souffrance est contrôlé pharmacologiquement.

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production: en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement (matériel de nidification et tunnels) et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires à l'échelle comportementale. Les propriétés du néocortex de la souris ont de nombreuses similitudes avec le néocortex des autres mammifères, y compris les humains. Cela rend les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris largement transférables à l’homme. Les injections de virus seront réalisées sur des animaux de 1 semaines à 6 mois. Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux de de plus de 5 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'une lignée qui répond à 100 % par une crise convulsive, elles reçoivent une injection d'un médicament anti-épileptique puis une stimulation sonore pouvant déclencher une crise potentiellement mortelle. Le porteur indique que ce modèle sert à mesurer si trois molécules réduisent le risque de mort subite lié à l'épilepsie, et que les souris sont ensuite tuées car le médicament reçu interférerait avec toute autre étude. Le stress provoqué par la stimulation sonore est reconnu, que l'animal réponde ou non par une crise.

Objectifs

Le risque de mort subite chez les patients épileptiques (SUDEP pour SUdden Death in Epileptic Patients ou mort subite chez les patients épileptiques) est trois fois plus élevé que chez les personnes saines. Le meilleur modèle de SUDEP actuel chez la souris correspond à une crise épileptique induite par un stimulus sonore et possiblement suivi du décès. L'objectif du projet vise à évaluer si trois molécules connues pour leurs effets anti-épileptiques et couramment employées chez des patients présentant des épilepsies à fort risque de décès, ont aussi des effets bénéfiques pour directement réduire les risques de décès.

Bénéfices attendus

Une validation d'un bénéfice de ces molécules pour réduire la mortalité devrait permettre d'obtenir une extension de l'AMM (autorisation de mise sur le marché) de ces médicaments pour d'autres formes d'épilepsies à fort risque de décès.

Procédures

Une injection d'un médicament anti-épileptique pratiquées aux 240 souris du projet. Une stimulation auditive d'une durée maximale de 60 sec pratiquées aux 240 souris du projet.

Impact sur les animaux

Un stress induit par la stimulation sonore pour les animaux, qu'ils répondent à la stimulation sonore par une crise ou qu'ils ne répondent pas.

Devenir

Les animaux seront mise à mort puisqu'ils ne peuvent pas être réutilisés pour une autre étude, puisqu'ils ont reçu une injection d'un médicament pouvant interférer avec une quelconque étude.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer la capacité de certaines médications avec AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) ou de certaines molécules innovantes en développement, à bloquer ou réduire les risques de décès lors d'une crise d'épilepsie humaine. Les procédures de validation d'une efficacité attendue sont légalement très contraintes et elles reposent sur la capacité objective à supprimer ou réduire le risque de décès mesurée sur un animal vivant modélisant une situation homologue chez l'Humain.

Réduction

Ce projet sera réalisé sur une lignée qui présente 100 % de souris répondeuses au test de la crise audiogène létale. Cette situation permet de minimiser le nombre (n=20) de sujets expérimentés par groupe. Il n’est pas envisageable de descendre en dessous de 20 sujets par groupe car les scores analysés statistiquement sont des moyennes et des pourcentages ; ce dernier représentant le facteur limitant. Enfin, un effet dose à 3 points (puisque 3 doses par AED) correspond au nombre minimal possible de doses, sachant que les laboratoires ont une bonne connaissance des doses à envisager pour évaluer un effet anti-épileptique mais pas pour évaluer un effet ant-létal.

Raffinement

Notre protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser le stress et toute souffrance des animaux avec une détermination précise des points limites. Sur le plan de l'élevage et du maintien des souris à l'animalerie, ceci se traduit par une visite quotidienne pour contrôler le bien-être des animaux, l’enrichissement des cages autant que faire se peut, le respect des normes liées aux surfaces/volumes des cages pour éviter la surpopulation ainsi que celles liées aux plages acceptables pour la température et l’hygrométrie. Sur le plan du test lui-même, ceci se traduit par une durée limitée de stimulation auditive (max 60 sec), une utilisation d'une arène circulaire pour éviter des cognements dans les angles. Il faut aussi mentionner que la convulsion en elle-même ne dure pas plus de 8 sec dans 99 % des cas.

Choix des espèces

Les travaux sur l'évitement des décès dans l'épilepsie ne peuvent pas, par essence, s'affranchir de l'expérimentation animale qui nécessitent d'expérimenter l'animal et d'observer possiblement son décès. L'AGS est un modèle de choix pour l'étude de la SUDEP car aucun facteur systémique (chimique ou électrique) n'est pas l'origine de la crise létale, pouvant être co-responsable du décès de l'animal. L'AGS n'est pas létale chez le rat, rendant impossible l'emploi de ce modèle. Enfin il n’est pas envisageable d’instrumenter (ECG, EEG, respiration) sur des animaux plus petits que l’espèce souris. Ces approches ne sont pas envisagées dans ce projet mais elles ne seront dans des projets ultérieurs visant à comprendre comment les AED pourraient réduire les décès dans les modèles expérimentaux. Les animaux seront testés à 30-40 jours d'âge, au moment où ils devraient être sevrés.