Système nerveux

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux interventions chirurgicales cérébrales sous anesthésie, une restriction alimentaire de sept jours et des injections pendant cinq jours, avant une tâche d'apprentissage récompensée par de la nourriture. Le porteur étudie la consolidation de la mémoire dans une zone du cerveau qu'il relie à des maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, des retombées présentées comme lointaines. Il affirme avoir "besoin" d'un modèle intact et génétiquement modifiable et conclut que seule la souris convient.

Objectifs

L’objectif global de notre projet est de contribuer à la compréhension des processus d’encodage et de stockage des mémoires chez les mammifères. Plus spécifiquement, nous souhaitons étudier les mécanismes sous-jacents la formation de la mémoire à long terme dans une zone spécifique du cerveau. Cette zone de cerveau a été impliquée dans plusieurs maladies humaines. Une meilleure compréhension de son fonctionnement en conditions normales est nécessaire afin d’identifier et de comprendre les altérations, qui se manifestent en conditions ‘anormales’, telles queles maladies neuro-développementales ou neuro-dégénératives.

Bénéfices attendus

La zone de cerveau ciblé par notre étude a été impliquée à plusieurs maladies humaines. Une meilleure compréhension de son fonctionnement en conditions normales est nécessaire afin d'identifier et de comprendre les altérations, qui se manifestent en conditions 'anormales', telles que les maladies touchant le système nerveux central. Les connaissances obtenues grâce à ce travail nous permettront de renseigner d'autres projets en cours dans l'équipe, explorant le rôle de cette région du cerveau dans les altérations pathophysiologiques présentent, par exemple, lors des maladies neuro-développementales ou neuro-dégénératives. La réorganisation structurelle des circuits neuronaux est également un domaine de recherche largement négligé par les études préclinique et notre travail apportera des nouvelles connaissance dans le domaine des mécanismes de plasticité.

Procédures

Les animaux sont nourris avec un régime alimentaire modifié. Ils subissent deux brèves interventions chirurgicales (< 45 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale nécessitant une motivation appétitive pour laquelle ils reçoivent une récompense nutritive. Cette tâche nécessite que la quantité de nourriture disponible soit limitée pendant 7 jours. Ils reçoivent également des injections pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent deux brèves interventions chirurgicales sous anesthésie. Cependant, l'utilisation appropriée d'analgésiques, l'utilisation d'outils et de matériels stériles, ainsi qu'une surveillance et des soins post-chirurgicaux optimaux nous permettent de limiter les conséquences indésirables subies par les animaux. Une période de récupération (4-7 jours) est prévue avant toute nouvelle manipulation. Les animaux sont soumis à une restriction alimentaire. Celle-ci peut être stressante pour les souris car elle ne leur permet pas d'exprimer certains de leurs comportements naturels tels que cacher de la nourriture dans la cage. Pour compenser ce stress, nous manipulons les souris au préalable et nous nous efforçons de les nourrir à la même heure de la journée afin qu'elles apprennent à associer la présence de l'expérimentateur à la fourniture de nourriture. En adaptant le programme d'entraînement, nous maintenons la période de restriction alimentaire aussi courte que possible (maximum 7 jours consécutifs). Le paradigme de la restriction alimentaire nous oblige également à héberger les souris individuellement, afin d'éviter la compétition pour la nourriture et l'agression entre congénères. Pour pallier cette contrainte, nous maintenons les souris en hébergement collectif le plus longtemps possible avant cette étape. Nous augmentons la quantité de matériaux disponibles pour la construction de nids et augmentons l'enrichissement en manipulant les souris avant l'expérimentation. Tout au long des expériences, à l'exception des deux jours précédant le « retrieval 1 », les souris sont nourries avec un régime contenant une très faible concentration d'antibiotique. Pour compléter la dose d'antibiotique pendant la période de restriction alimentaire, nous sommes obligés d'administrer cette molecule par injection intra peritonéale. Pour pallier les conséquences de cette injection répétée, nous utilisons une aiguille de très petite taille, ce qui minimise l'inconfort pour l'animall. La solution d'antibiotique est de faible concentration et l’injection est sans conséquences négatives pour l'animal. Toutes les manipulations sont effectuées par des expérimentateurs formés et habilités, ayant plus de 8 ans d'expérience dans la manipulation des animaux.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet porte sur l'étude des mécanismes qui sous-tendent la formation et le stockage de la mémoire dans le néocortex. Pour mener à bien notre étude, nous aurions besoin d'un modèle : i) complexe et intact, ii) adapté à la réalisation de tests cognitif, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) qui se prête facilement à la modification de son génome, v) possédant un néocortex, vi) adapté aux approches expérimentales invasives. Conformément à la directive européenne et au principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer des approches alternatives lorsque cela était possible. A notre connaissance, seuls les modèles de mammifères, notamment les souris, répondent à l'ensemble de ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et ne sont donc pas adaptés à l'objectif de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones associés au stockage de la mémoire et les analyses de connectivité possibles au niveau clinique n'ont pas la résolution nécessaire pour répondre à la question scientifique posée. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas de modéliser le cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, l'utilisation d'animaux est malheureusement nécessaire.

Réduction

Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : selon les caractéristiques de nos données nous appliquons les tests statistiques appropriés à notre question scientifique et à nos données.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant et après chaque manipulation/étape) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Intervention immédiate et appropriée (en cas de besoin) - mesures conservatoires à privilégier. iv) Raffinement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques (pré- et post-op) pour chaque procédure chirurgicale v) Application de soins préventifs après la chirurgie; stratégie de nursing si nécessaire vi) Manipulation quotidienne des animaux avant les sessions comportementales pour réduire le niveau de stress lié à l'interaction avec l'expérimentateur vii) Optimisation de notre tâche comportementale pour minimiser la durée de la restriction alimentaire viii) Entraînement progressif de l'animal (séances d'habituation) intégré à la tâche afin de minimiser le stresse ix) Utilisation d’aiguilles de petite taille pour minimiser l'inconfort associé à l'injection i.p. x) Utilisation, dans la mesure du possible, de méthodes non invasives (par exemple, l'administration dans la nourriture) pour l'administration des médicaments afin d'éviter les contraintes associées aux autres méthodes d'administration. xi) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs proposants les méthodes de raffinement. xii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus le plus longtemps possible dans des cages collectives.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquants, par exemple, le marquage permanent des cellules activées lors de l’apprentissage, ou l'expression d'un sonde calcique. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier la génome et pour laquelle les modèles crés ont été caracterisés au niveau comportemental et moléculaire. Le choix d'utiliser la souris est également motivé par nos données précédentes et la disponibilité de paradigmes expérimentaux déjà élaborés qui garantissent le succès de notre étude.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant quatre à six semaines une alimentation à la cuprizone reproduisant une sclérose en plaques, qui peut provoquer crises d'épilepsie induites, perte de poids et difficultés locomotrices, avant euthanasie pour études post mortem de l'hippocampe. Le porteur fixe des points limites, dont une perte de poids de 20 % et l'apparition de crises spontanées, déclenchant la mise à mort. Les pistes thérapeutiques pour les patients épileptiques atteints de sclérose en plaques sont renvoyées au long terme.

Objectifs

L’épilepsie chez les personnes atteintes de sclérose en plaque est un véritable enjeu de santé publique, comprendre ses mécanismes neurophysiologiques aiderait à mieux traiter cette pathologie. Ce projet durerait 3 ans.

Bénéfices attendus

La sclérose en plaques est une maladie auto-immune très invalidante qui atteint généralement de jeunes adultes (20 à 40 ans). Elle se caractérise par la destruction progressive, par les cellules du système immunitaire, de la gaine de myéline des axones, ce qui aboutit à une dégénérescence neuronale provoquant des perturbations à la fois motrices, sensitives et cognitives. Les patients atteints de sclérose en plaques ont 3 à 6 fois plus de risque de développer de l’épilepsie. Le lien entre sclérose en plaques et épilepsie n’ayant été que peu étudié, l’épilepsie en cas de sclérose en plaques n’a pas de traitement de premier choix clairement établi et son pronostic est souvent défavorable. L’objectif de cette étude à court terme est de définir les mécanismes neuronaux sous-jacents à cette propension à l’épilepsie en cas de sclérose en plaques. L’objectif à long terme de ce projet est d’obtenir des pistes de traitements thérapeutiques de l’épilepsie chez les personnes atteintes de sclérose en plaques.

Procédures

Pour reproduire la sclérose en plaques, un régime alimentaire à la cuprizone sera donné aux animaux pendant 4 à 6 semaines. Les animaux seront pesés une fois par semaine. Le cerveau des animaux est utilisé après leur euthanasie pour des études post mortem.

Impact sur les animaux

Nous nourrirons les souris à la cuprizone pendant moins de 7 semaines. La souris peut développer des crises d’épilepsie induites et non spontanées si la durée du régime à la cuprizone est inférieure à 7 semaines ce qui est le cas dans notre étude. Ces crises induites sont des crises tonico-cloniques se caractérisant par une perte des réflexes de redressement. Le régime alimentaire à la cuprizone peut entraîner une perte de poids. Les souris nourries à la cuprizone sont moins sujettes à la douleur que des souris exposées à un régime normal. Cependant, elles peuvent développer des difficultés locomotrices et de l’anxiété.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour des études post mortem.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant la compréhension des mécanismes complexes mis en jeu dans cette pathologie humaine invalidante. En effet, les organoïdes présentent de nombreuses limites telles que : - le manque d'une haute fidélité pour chaque type cellulaire, alors que dans ce projet nous voulons étudier des neurones avec des caractéristiques spécifiques très prononcées - une maturation limitée, alors que dans ce projet nous voulons étudier une pathologie qui se déclare quand le cerveau est mature - une physiologie atypique et des problèmes de développement d'aires neuronales adéquates, alors que dans ce projet nous voulons étudier une partie cérébrale spécifique, l'hippocampe, dont la structure neuronale est extrêmement organisée.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, différentes expériences seront effectuées à partir de tranches d’hippocampe provenant d’une même souris. Le nombre estimé de souris nécessaires à cette étude en fonction des conditions expérimentales et des tests statistiques est de 120 souris dont la moitié nourrie à la cuprizone. Les souris mâles et femelles présentant le même degré de dégradation cérébrale à la suite d’un régime à la cuprizone, nous utiliserons des mâles et des femelles indifféremment ce qui nous permettra de réduire le nombre d’animaux (pas de tri négatif dans les portées). Les données seront traitées avec des tests statistiques non paramétriques afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. 20 neurones par condition seront nécessaires. Nous prévoyons 4 conditions expérimentales (a,b, c, d) à tester pour 2 temps de nourriture (4 et 6 semaines) avec et sans cuprizone. Chaque condition expérimentale nécessitera 15 souris pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Afin de réduire le nombre d’animaux, 2 conditions expérimentales seront testées sur le même animal. Seront ainsi nécessaires : expériences a/b ; 15 souris cuprizone-4sem + 15 souris cuprizone-6sem + 15 souris contrôle-4sem + 15 souris contrôle-6sem = 60 ; expériences c/d ; 15 souris cuprizone-4sem + 15 souris cuprizone-6sem + 15 souris contrôle-4sem + 15 souris contrôle-6sem =60. Total 120 souris.

Raffinement

Nous nourrirons les souris à la cuprizone pendant moins de 7 semaines afin d’éviter que les animaux ne développent des crises d’épilepsie spontanées. Un examen quotidien permettra de suivre la progression des signes cliniques. La présence de crises d’épilepsie spontanées constitue un point limite : tout animal développant des crises d’épilepsie spontanées sera euthanasié. Ces souris peuvent développer des crises d’épilepsie induites et non spontanées. Il faudra donc impérativement veiller à un silence environnant, à manipuler les souris le moins possible à partir du début du régime à la cuprizone et, au contraire, les manipuler le plus souvent possible avant le début du régime pour qu’une certaine habituation de la manipulation par le même expérimentateur puisse être établie. Un deuxième point limite déterminé est le poids : ce régime alimentaire peut entraîner une perte de poids. Une pesée hebdomadaire sera effectuée. Les animaux présentant une perte de poids supérieure à 20% de leurs poids initiaux seront euthanasiés. Il est possible que certains animaux développent des crises d’épilepsie lors de cette manipulation. Si cette crise tonico-clonique (avec une perte des réflexes de redressement) dure plus de 15 secondes, l’animal sera euthanasié. Les souris nourries à la cuprizone sont moins sujettes à la douleur que des souris exposées à un régime normal. Cependant, elles peuvent développer des difficultés locomotrices et de l’anxiété. Nous surveillerons donc les souris tous les jours. Si elles sont prostrées et que leur score de « mouse grimace scale » du NC3R est de 2, nous les euthanasierons. Les euthanasies se feront par décapitation après anesthésie à l'isoflurane 5% pendant 5 minutes.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus utilisé actuellement dans la littérature pour l’étude des mécanismes neuronaux en cas de sclérose en plaques. L’objectif de l’étude est de déterminer le rôle d’interneurones de l’hippocampe dans l’épilepsie de modèles de sclérose en plaques. L’induction de la sclérose en plaques se fera via un régime de croquettes contenant de la cuprizone. Présentant une propension au développement des crises d’épilepsie, ce modèle constitue un sujet d’étude concordant. Intéressés par les mécanismes cérébraux expliquant le développement futur de crises, nous avons choisi d’utilisé ce modèle avant le développement de crises d’épilepsie spontanées afin d’éviter une souffrance animale. Ce modèle a déjà été détaillé dans la littérature antérieure ce qui nous a permis de cibler des fenêtres de temps d’étude précises en fonction du taux de dégradation de l’hippocampe caractérisées par différentes études. Le laboratoire UNIS a acquis depuis plusieurs années une grande expertise dans le domaine de l’électrophysiologie neuronale, en particulier chez les souris au travers des différents projets. De plus, cette équipe de recherche a l’habitude, depuis quelques années, de travailler sur des modèles épileptiques telles que les souris KO Lgi1. Des souris de 8 semaines seront nourries pendant 4 ou 6 semaines à la cuprizone (0.3%). Les animaux présentent à ces stades une dégradation partielle et totale de l’hippocampe selon des études antérieures.

10 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation des ovaires avec pose d'un implant d'œstradiol, puis une injection de colchicine directement dans le cerveau, pour identifier les neurones impliqués dans le déclenchement de l'ovulation. Le porteur indique que la colchicine peut provoquer diarrhée et douleurs abdominales, les souris étant mises à mort vingt-quatre à vingt-sept heures après l'injection, avant l'apparition de ces effets, pour prélever leur cerveau. Il affirme que la reproduction "ne peut s'observer" que sur un organisme entier et renonce à toute analyse statistique, l'objectif déclaré étant de pouvoir publier des données descriptives.

Objectifs

Les mammifères présentent soit une ovulation spontanée soit une ovulation induite. L’ovulation dépend de la sécrétion de deux hormones la gonadolibérine ou GnRH et l’hormone lutéinisante ou LH. Les mécanismes permettant la sécrétion de la GnRH et de la LH sont encore mal connus. Chez les espèces à ovulation induite, un facteur de croissance (βNGF) semble être une molécule clé dans le déclenchement de l’ovulation, rôle qui semble tenu dans les espèces à ovulation spontanée par un autre neurotransmetteur, la kisspeptine. Nos données suggèrent l’implication du facteur de croissance aussi pour induire l’ovulation chez les espèces à ovulation spontanée via une action sur la sécrétion de la kisspeptine. Nous souhaitons établir si cette action est directe ou indirecte. Cette information est essentielle pour pouvoir publier nos données. Nous envisageons de réaliser des marquages multiples pour détecter la kisspeptine et le récepteur du facteur de croissance. Les données obtenues permettront de déterminer si le récepteur est exprimé ou non sur les cellules à kisspeptine. Dans le cas où il n’y aurait pas de co-localisation entre la kisspeptine et le récepteur, nous établirons la possibilité d’une action indirecte via des neurones à catécholamines. Nous allons donc utiliser des souris femelles et des marquages multiples pour vérifier ces hypothèses.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet nous permettra de comprendre si les mécanismes qui déclenche l’ovulation après la stimulation avec le βNGF comportent une stimulation directe des neurones à kisspeptine ou nécessitent d’un interneurone. Cette information nous permettra de vérifier si du point vu évolutive les mécanismes d’induction de l’ovulation sont conservés entre ovulations induites et spontanées. Ceci représente une information très importante pour la compréhension de l’évolution des modalités d’ovulation chez les mammifères.

Procédures

Les animaux seront soumis a des procédures chirururgicales pour enlever les ovaires et positionner un implant sous-cutanée d'oestradiol. Cette procedure durera environ 15 minutes. Entre 7 et 10 jours plus tard les animaux seront soumis à une deuxième intervention pour réaliser une injection intracerebroventriculaire de colchicine. Cette procédure aussi aura une durée d'environ 15 minutes.

Impact sur les animaux

L’ovariectomie avec implant d’oestradiol est une technique largement utilisée dans les recherches en neuroendocrinologie de la reproduction et des douleurs peropératoires au site d’opération et de suture sont envisagées. Toute neurochirurgie peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies, ainsi qu'une douleur localisée en post-opératoire au niveau du site d'incision de la peau du crâne. Les effets indirects peuvent découler de la chirurgie (trouble comportemental, baisse d'activité locomotrice) et du produit injecté (diarrhée). Les effets directs sont de courte durée (de quelques heures à quelques jours). Les effets indirects peuvent survenir après quelques heures mais se poursuivre sur plusieurs jours. L’administration de colchicine sera effectuée par injection intracerebroventriculaire. L'injection de colchicine peut induire des effets indésirables tel que la diarrhée, des douleurs abdominales, des troubles du système nerveux. L’euthanasie des animaux sera effectuée dans les 24-27 heures après l’injection de colchicine et donc préalablement à la manifestation de ces effets.

Devenir

Dans la première partie de l'expérience toutes les souris (10) seront soumis aux chirugies indiquées dans le protocole détaillé. Par la suite toutes les souris (10) seront euthanasiées pour prélever le cerveau et rélaiser l'immunocytochimie.

Remplacement

La fonction de reproduction étant une fonction intégrée (sous influence de facteurs environnementaux et hormonaux endogènes) contrôlée par l'hypothalamus, elle ne peut s'observer que sur des organes entiers provenant d’un organisme vivant. Nous ne pouvons donc pas remplacer l’utilisation d’animaux pour notre expérience.

Réduction

Notre étude ce base sur l'analyse des données descriptives : coexistence ou non de marquage et éventuelle pourcentage de cellules marques par rapport à l’ensemble de la population. Nous n’avons donc pas besoin de réaliser des analyses statistiques pour cette expérience. Le choix du nombre d’individus par lot s'appuie sur les données de la littérature et notre expérience antérieure. Les souris utilisées seront ovariectomisées. Les ovaires produisent les hormones stéroïdes qui rétroagissent au niveau cérébral pour moduler le cycle ovarien. Ces hormones présentent des fluctuations endogènes de leurs taux au cours du cycle, l'ovariectomie (suivie d'un traitement substitutif : implant d’estradiol) va permettre de standardiser les taux endogènes circulants et donc de réduire l'effectif d'animaux à inclure dans l’expérimentation. Pour établir le nombre d’animaux à utiliser nous avons prix en considération le fait que les animaux seront soumis à deux chirurgies, à une perfusion intracardiaque et aux aléas de la coupe après congélation. Nous estimons que pour pouvoir obtenir 6-7 échantillons exploitables de la région d’intérêt, nombre que nous permettra d’avoir des données solides, nous devons partir d’un groupe de 10 animaux. L’utilisation d’un nombre moindre d’animaux pourrait être suffisant, mais vu le risque d’avoir à répéter l’expérience, suite aux aléas liés aux différentes manipulations, et donc augmenter ultérieurement le nombre de souris, ce choix nous semble le plus pertinent pour réduire aux minimum le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Les souris seront hébergées par trois ou cinq par cage en présence d'objets en carton (boites à œufs, frisottis en papier). Une semaine d' habituation à la manipulation par l'expérimentateur est prévue pour réduire le stress lors des différentes manipulations prévues par le protocole. Les souris seront anesthésiées lors des chirurgies et recevront un traitement antalgique consécutivement à la neurochirurgie. Les yeux de l'animal seront protégés au moyen d'une pommade ophtalmique pendant la neurochirurgie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de référence utilisée en routine par de nombreux laboratoires est aussi l'espèce sur la quelle nous avons obtenu les résultats d'induction de l'ovulation avec le beta-NGF. Pour étudier l'ovulation nous avons besoin de souris femelles adultes.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles reçoivent par chirurgie stéréotaxique une inoculation cérébrale de trois formes d'alpha-synucléine agrégée, dont des extraits de cerveau de patient, pour comparer la maladie induite dans un modèle de Parkinson. Le porteur indique que l'inoculation conduit à une démarche saccadée et une perte d'équilibre, et que les souris sont mises à mort dès ces premiers signes pour éviter une paralysie du train postérieur. Il affirme que le projet "ne peut être réalisé qu'in vivo" et qu'aucune méthode alternative n'existe aujourd'hui.

Objectifs

Le but du projet est de comparer les caractéristiques de la maladie induite par trois formes d’alpha-synucléine de structures différentes au cours de passages successifs par inoculations dans un modèle de souris modifiées génétiquement. L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions des maladies humaines associées (maladie de Parkinson et démence à corps de Lewy, atrophie multisystématisée), au sein desquelles elle se présente sous une forme agrégée. L’étude implique la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine agrégée, ainsi que la localisation et l’étude morphologique des dépôts de cette protéine dans le cerveau des souris.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et des caractéristiques moléculaires observées lors de la maladie chez les souris.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris modifiées génétiquement (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 84 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation d’extraits cérébraux des souris malades contenant l’alpha-synucléine agrégée, de trois origines distinctes (fibre synthétique, cerveau de souris modifiée génétiquement malade, cerveau de patient humain), est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie. Leur mise à mort est ainsi réalisée dès l’apparition des premiers symptômes, permettant de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition de signes cliniques neurologiques et à décrire l’extension et les caractéristiques des lésions du cerveau, ainsi que les altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les lots expérimentaux sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d’incubation de la maladie par un test Log-Rank, permettant de mesurer une différence de survie de l’ordre de 20-25%, de la distribution des différents types d’immunomarquages cellulaires et de la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine pathologique. Un lot de 14 souris permet de disposer d’au moins 6 souris, pour les analyses biochimiques et d’au moins 6 souris pour les analyses des lésions du cerveau, prélevés lorsque la maladie apparaît chez la souris. Ces effectifs permettent de déterminer par un test unilatéral si la moyenne des valeurs observées dans une situation est égale ou différente de la moyenne observée dans une autre condition. Les autres prélèvements (yeux, intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire sur les marqueurs périphériques de la maladie dans ce modèle de souris.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. L’analgésie est prolongée par une injection sous-cutanée de buprenorphine. Les animaux sont maintenus en groupe et dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris, dans lesquelles l’expression de l’alpha-synucléine humaine mutée A53T permet les comparaisons des durées de survie et de la neuropathologie, en particulier suite à l’inoculation d’AMS. Les souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines, permettent l’inoculation des extraits cérébraux dans une région précise du cerveau, et celles-ci qui sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie caractéristique de cette lignée de souris, lors de laquelle elles sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.

192 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie stéréotaxique pour implanter une minipompe diffusant des inhibiteurs dans le cerveau, puis des tests répétés de tolérance au glucose et à l'insuline, pour étudier un lien entre diabète et marqueurs de la maladie d'Alzheimer. Le porteur indique que l'isolement en cage individuelle peut induire un stress chronique et que tous les rats sont mis à mort au bout de cinq semaines pour des études post-mortem. Il affirme que l'étude d'un organisme vivant "dans son intégralité" est "indispensable" et que des approches in vitro ne renseigneraient que sur les cibles moléculaires.

Objectifs

Le diabète de type 2 (DT2) est associé à la maladie d’Alzheimer (MA). Réciproquement, le DT2 est fréquent chez les patients atteints de la MA. Des marqueurs moléculaires associés à la MA sont présents chez le rat Goto-Kakizaki (GK) spontanément diabétique. La surexpression de ces marqueurs est associée à la MA et au diabète. L’objectif de notre projet sera de rechercher si l’inhibition de ces marqueurs, directement au niveau du cerveau, peut améliorer l’état diabétique du rat GK. Pour cela, nous allons administrer des inhibiteurs de ces marqueurs pendant 14 jours, dans le cerveau de rats diabétiques (GK) et contrôles Wistar (W) de 3 mois. Cette étude nécessitera au total 96 rats mâles et 96 rats femelles et sera réalisée sur une durée de 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mettre en avant le rôle de ces marqueurs dans le cerveau sur la régulation du métabolisme du glucose et son implication dans le diabète du rat GK. La modulation de ces cibles moléculaires pourrait ouvrir la voie à un traitement du diabète.

Procédures

Les 192 animaux subiront une procédure chirurgicale, par stéréotaxie, pour l'implantation de la canule équipant la minipompe osmotique. Cette chirurgie dure 60 minutes. Des prélèvements de sang seront effectués sur tous les animaux dans le cadre de tests métaboliques de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline et lors du suivi de la glycémie. Chacun de ces tests dure 2h. Pour le test de tolérance au glucose, des prélèvements de sang de 30 microlitres aux temps 0, 15, 30 et 90 minutes sont réalisés afin de mesurer la glycémie et l'insulinémie. Pour le test de tolérance à l'insuline, une goutte de sang (10 microlitres) sera prélevée pour lecture de la glycémie sur lecteur Accuchek aux temps 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes. Les 2 tests seront séparés de 2 jours pour permettre la récupération.

Impact sur les animaux

L’isolement des animaux en cage individuelle après l'implantation de la minipompe reliée à une canule dans le cerveau pourrait induire un état d’anxiété tel qu’un stress chronique qui pourrait se manifester par une modification de la réactivité comportementale des rats. La pose de la minipompe entraîne une gêne et une possible douleur pour l'animal. L'injection en intrapéritonéal dans le cadre des tests métaboliques de tolérance au glucose et de sensibilité à l'insuline est à l'origine d'une petite douleur liée à la piqûre. Une éventuelle hypoglycémie peut arriver dans le cadre du test de tolérance à l'insuline, mais cela est très rare chez le rat.

Devenir

A l’issue de notre procédure, au bout des 5 semaines, tous les animaux seront mis à mort pour des études post-mortem.

Remplacement

Le métabolisme glucidique dont nous cherchons à mettre en évidence la régulation suite à la modulation de cibles dans le cerveau nous conduit à devoir travailler sur un organisme vivant dans son intégralité. Des approches in silico et in vitro, notamment sur des neurones en culture, ou ex vivo, sur une structure cérébrale spécifique isolée telle que l’hypothalamus, nous permettraient uniquement de mettre en évidence la modulation de nos cibles d’intérêt (DYRK1A et GSK3β) par les traitements pharmacologiques (EMD92 et LiCl respectivement), mais pas d’étudier la réponse physiologique globale de l’organisme aux traitements suite au dialogue entre le cerveau et les tissus périphériques. Ainsi pour atteindre les objectifs spécifiques de notre projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum grâce à l’utilisation de tests statistiques paramétriques et non paramétriques montrant au mieux la différence entre les groupes, et il permet de prendre en compte la variabilité individuelle de la réponse au traitement.

Raffinement

Afin de réduire au mieux l’apparition d’une éventuelle douleur, angoisse et stress chez les animaux nous prendrons toutes les précautions nécessaires (recours à l’analgésie, l’anesthésie, maintien de l’enrichissement (morceau de bois et sopalin), habituation, récupération). Pendant la chirurgie, la respiration, l'obstruction des voies respiratoires, le pouls et la température corporelle seront surveillés. Une injection en sous cutané d'anesthésique local, sera effectuée 15 à 20 minutes avant incision de la peau du crâne. De plus tout au long de la chirugie, les animaux seront placés sur tapis chauffant pour éviter l'hypothermie due à l'anesthésie. Des points limites adaptés d’évaluation de la douleur et des critères d'arrêt de souffrance seront déterminés. Pour les rats diabétiques GK une litière adaptée sera mise dans les cages et renouvelée 2 fois par semaine pour éviter l'inconfort des animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce animale pertinente dans le cas de notre étude parce que les processus physiologiques sont similaires chez le rat et chez l’Homme. De plus, le rat est suffisamment grand pour des mesures physiologiques pratiques et pour des manipulations neurochirurgicales/stéréotaxiques. Enfin le modèle animal sur lequel nous conduisons nos recherches sur le diabète dans l'équipe est le rat. Nous utiliserons des animaux jeunes adultes de 3 mois. A cet âge, le diabète s’est bien développé et stabilisé chez les rats GK.

1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Issues d'une lignée qui devient aveugle par dégénérescence de la rétine, elles sont exposées à une lumière bleue jusqu'à huit heures par jour pendant une à quatre semaines et soumises à un test de préférence entre compartiment éclairé et compartiment sombre, pour étudier la photophobie. Le porteur indique que les souris adoptent un comportement de fuite face à la lumière bleue, et qu'elles sont mises à mort pour prélever la rétine et des structures cérébrales. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ni in silico ne peut reproduire la complexité des circuits neuronaux en jeu.

Objectifs

Les rétinopathies pigmentaires affectent environ 1,5 million de personnes dans le monde et se traduisent par une diminution progressive de la vue aboutissant à la cécité. Les patients perdent les bâtonnets puis les cônes dans un second temps avec l’apparition fréquente d’une photophobie. L’exposition chronique à la lumière artificielle de type LEDs pourrait jouer un rôle délétère dans l'épidémiologie et l'évolution des symptômes de la photophobie. Les cellules ganglionnaires rétiniennes photosensibles (ipRGCs) seraient capables de transmettre l’information douleureuse avec le complexe trigéminé via le peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP). Bien que la découverte des cellules ganglionnaires rétiniennes semble aider à la compréhension de la photophobie, les mécanismes physiopathologiques de la photophobie liée à la rétinopathie pigmentaire restent encore de nos jours largement méconnus. Nous proposons donc dans ce projet d’élucider par quels mécanismes ce peptide lié au gène de la calcitonine et les cellules ganglionnaires rétiniennes photosensibles participeraient à la photophobie associée à une rétinopathie pigmentaire. Ainsi, nous proposons de combiner des études anatomiques et comportementales d’exposition des souris mâles à diverses bandes spectrales afin mieux comprendre ces mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans la photophobie liée à une dégénérescence rétinienne et d’évaluer la participation du peptide lié au gène de la calcitonine et des cellules ganglionnaires rétiniennes. Ces résultats pourraient conduire au développement de nouvelles évaluations d’étude de la prise en charge thérapeutique de la photophobie.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’élucider par quels mécanismes le peptide lié au gène de la calcitonie et des cellules ganglionnaires rétiniennes participerait à la photophobie associée à une dégénérescence de la rétine. Pour ce faire nous disposerons d’un modèle murin qui développe naturellement une cécité par la perte progressive des cellules dela rétine, que l’on comparera à un modèle sain. Nous souhaitons montrer que ces animaux pathologiques présentent 1/un comportement aversif lorsqu’ils sont exposés à une lumière bleue. 2/ Quel(s) rôle(s) le peptide lié au gène de la calcitonie et les cellules ganglionnaires rétiniennes joue dans la réponse à l’exposition à une lumière bleue et 3/ mettre en évidence comment le le peptide lié au gène de la calcitonine et les cellules ganglionnaires rétiniennes modulent des marqueurs d’activation et souffrance neuronales ainsi que des marqueurs d’inflammation chez la souris aveugle. En retraçant les différentes voies impliquées dans la photophobie depuis la rétine jusqu’au cerveau, nous espérons ainsi pouvoir non seulement mieux comprendre et décrire ce phénomène pathologique mais également identifier de potentiels marqueurs/voies à visée thérapeutique pour la prise en charge de la photophobie.

Procédures

Dans le cadre de ce projet les animaux développant la pathologie de dégénérescence rétinienne ou leur contrôle seront exposés à différentes conditions de lumière (jaune ou bleu) durant des périodes de 8h/jour durant 7 jours (exposition aigue) ou 28 jours (exposition chronique). Certains groupes seront injectés avec différentes molécules/agents par injection intra-péritonéale sur animal vigile : 3 fois pour les groupes « exposition aiguë » (J5 à J7) ou 3 x 3 jours pour les groupes « exposition chronique » (de J5 à J7, de J12 à J14, de J19 à J21) Les animaux seront ensuite euthanasiés pour réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.

Impact sur les animaux

Exposition à la lumière bleue : Les souris pathologique et sauvage devront être exposées individuellement à la source lumineuse afin d’éviter toute interaction avec leur congénaires. Elles adoptent un comportement d’isolation/fuite face à la lumière bleue. L’injection des antagonistes et anesthésiques sera réalisée en intraperitoénale et l’analgésique en sous cutannée, cela induira une douleur mineure au niveau du site d’injection.

Devenir

Les animaux seront analgésiés et anesthésiés puis euthanasiés en fin d’expérimentation comportementale afin de récolter les différents tissus qui serviront aux études neuroanatomiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro ne peut 1) mimer la pathologie de dégénérescence rétinienne et la photophobie qui lui est liée. 2) la complexité et l’intéraction des circuits neuronaux mis en jeu (rétine, ganglions trigéminés et système nerveux central) ne peuvent être étudiées et remplacées par un modèle in vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques de la photophobie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à l’aide d’un modèle experimental realisé sur les rongeurs (souris). De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, notre étude étude sera longitudinale et utilisera plusieurs structures (rétine, ganglions trigéminés, tronc cérébrale, hypothalamus) de chaque animal soit les 1280 animaux compris dans cette étude. Nous avons également estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace grâce aux données des résultats obtenus dans une étude précédente. Le nombre d’animaux sera gardé le plus petit possible tenant compte de 1/ la variabilité préssentie des résultats expérimentaux et 2/ de la nécessité de valider statistiquement les résultats obtenus afin de les publier dans des journaux scientifiques. Pour chaque étude et test réalisés, nous comparerons statistiquement les lots de souris de taille raisonable entre eux.

Raffinement

Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : enrichissement dans les cages (maison, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 21°C et suit un cycle d’éclairage non inversé (12h /12h). Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur, qui seront évalués à l’aide de points limites validés en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie, nous permettant de modifier la procédure en cours en procédant à l’euthanasie de l’animal. Pour les sessions d’illuminations, afin de minimiser le stress et la variabilité lors du test de boite illuminée/noir les animaux suivront une session d’habituation au test durant 5 jours avant le début de l’exposition à la lumière bleue ou jaune. L’animal aura libre accès à l’ensemble du complexe dans une période de 5 minutes, c’est-à-dire les deux compartiments (illuminé ou sombre) et le couloir central reliant les deux compartiements. Dans sa globalité le projet ne présente pas de gestes très invasifs, seulement une injection en i.p pour l’administration des traitements (antagonistes) et l’analgésie/anesthésie en sous cutanné avec une douleur minime ressentie au site d’injection. Enfin les points limites suivant seront suivis de près afin de déterminer l’état général de l’animal et des traitements/mesures à appliquer : Apparence physique, comportement, changement du poids corporel.

Choix des espèces

La souche Rd1 est un choix privilégié car ces souris développent naturellement une cécité par la perte progressive de leurs photorécepteurs, ce qui fait de cette souche un modèle parfait pour mimer la pathologie de rétinodégénérescence avec photophobie induite. La souche Rd1 étant naturellement mutante, nous somme contraint de la comparer à une souche sauvage comme les souris C57BL/6. De plus, le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Les deux souches de souris seront utilisées aux stades de développement à 30 et 90 jours car les souris pathologiques Rd1 sont complètement aveugles à 90 jours et nous souhaitons voir l’effet du vieillissement dans la réponse aux traitements effectués.