Système nerveux

1 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent une injection pour activer leur système immunitaire, leur descendance est isolée trois semaines puis reçoit une injection stéréotaxique dans le cerveau, avant une batterie de tests de locomotion, d'anxiété, de sociabilité, de dépression et de cognition dont le RNT ne précise pas le détail. Le porteur étudie comment l'infection pendant la grossesse et l'isolement précoce affectent le cerveau et le comportement. Il affirme que ces effets dépendent du développement cérébral de l'embryon à l'adulte et ne peuvent être reproduits in vitro.

Objectifs

L'infection virale pendant la grossesse et l'isolement chronique pendant l'enfance ont un impact sur le développement du cerveau et peuvent entraîner des problèmes de comportement à long terme. Ce projet vise à mesurer l'impact de l'activation immunitaire maternelle couplé à l’isolement social juvénile sur l'expression génétique dans les plexus choroïdes et le cortex préfrontal chez la souris adolescente et adulte. Ce projet vise également à analyser les différences liées au sexe et à la résilience. Le profilage des cytokines dans le sérum des souris juvéniles et adultes permettra d'établir une corrélation entre le stress et le comportement. L'analyse du comportement des souris adultes permettra d'évaluer la socialisation, la stéréotypie, la régulation sensorimotrice, la cognition et les phénotypes liés à l'anxiété. Afin de réparer les effets négatives de ces stress, nous allons modifier des facteurs provenant du plexus choroide pour induire de la plasticité cérébrale chez l’adolescent et permettre un ajustement positif du cortex préfrontal en réponse à l'expérience sociale. La réussite de la réparation sera évaluée par le comportement et l'expression génétique chez l’adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l'origine des symptômes liés à l'anxiété, le stress et les infections virales subis pendant le dévelopement embryonaire et la petite enfance. Il fournira de nouvelles cibles moléculaires pour le traitement des troubles du développement neurologique caractérisés par une maturation et un fonctionnement défectueux des interneurones corticaux.

Procédures

Une injection intrapéritoneale sera réalisée sur animaux gestantes et vigiles; la procédure dure environ 1 minute en moyenne et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront hébergés en isolement pendant 3 semaines. Une prise de sang sera effectuée sur des animaux anesthésiés; la procédure dure environ 1 minute en moyenne et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront soumis à un seul test de locomotion qui dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau d'anxiété et dure 10 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test d’interaction social qui dure 20 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau de dépression et dure 8 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de stéréotypie qui dure 20 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test cognitif qui dure 6 minutes. Une injection stéréotaxique intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés; cette procédure chirurgicale dure environ 1 heure et sera effectuée une seule fois.

Impact sur les animaux

Les injections intrapérioneales d’acides nucléiques sur des femelles gestantes entraînent généralement une perte de poids qui dure 24 heures. Les animaux reprennent un poids normal par la suite. Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale. Les animaux issus d'une mère soumise à une activation immunitaire peuvent présenter des effets [attendus] sur leur comportement adult (anxiété, dépression, stéréotypie, troubles de la perception sensori-motrice). L’isolement des animaux peut avoir des effets [attendus] tel que la néophobie, des troubles de la perception sensori-motrice, l’agressivité, et des troubles de socialization.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau et sang seront collectés afin de permettre des analyses histochimiques et biochimiques.

Remplacement

Nos recherches sur les effets du stress sur la plasticité du cerveau nécessitent des modèles de souris pour comprendre comment l'environnement juvénile affecte le comportement adulte. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent du développement du cerveau de l’embryon jusqu’à l'âge adulte.

Réduction

Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de démontrer qu'un nombre de 12 souris par condition expérimentale est nécessaire. Ceci nous permet d'obtenir une puissance statistique satisfaisante même si 1 ou 2 souris sont perdues lors de la chirurgie. Pour les procédures avec analyses comportementales mais sans chirurgie, nous utiliserons 10 souris par condition. Nous allons faire plusieurs analyses (sang, comportement, histologie, biochimie) sur chaque souris afin de minimiser le limiter le nombre d’animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée avec un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine pour éviter le stress de l'isolement, puis observés et pesés quotidiennement pendant 2 jours. Pour évaluer les points limites, les souris seront inspectées quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciales), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront un régime alimentaire enrichi. Les animaux seront euthanasiés si aucune amélioration n'est constatée après 2 jours de traitement ou si la perte de poids dépasse 20% du poids de départ.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la plasticité cérébrale et des effets du stress en début de vie. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet implique un stress postnatal précoce, un sauvetage moléculaire pendant l'adolescence et l'analyse des phénotypes adolescentes et adultes. Des injections stéréotaxiques dans les ventricules cérébraux seront effectuées sur des souris agées de 45 à 50 jours, lorsque cette région du cerveau est plastique. Le comportement sera évalué chez l’adolescent (agées de 45 à 55 jours) et chez l’adulte (agées de 70 à 110 jours), lorsque les phénotypes se manifestent.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection quotidienne de D-galactose pendant dix semaines pour provoquer un vieillissement accéléré avec déficits de mémoire et anxiété, puis passent cinq tests comportementaux dont un test de peur conditionnée. Le porteur étudie le rôle des exosomes et d'un régime enrichi en oméga-3 dans la protection des fonctions cognitives liées à l'âge. Il affirme que le comportement et les régimes ne s'étudient que sur animal vivant, avant prélèvement du cerveau.

Objectifs

Le vieillissement s’accompagne d’une inflammation chronique à bas bruit, c’est-à-dire qu’elle est silencieuse, le mécanisme inflammatoire se situe alors sous le seuil de la douleur et cause des dégâts dans l’organisme sans qu’il y ait de foyer inflammatoire précis. Cette inflammation impliquent notamment la communication entre les neurones et les cellules microgliales, les principales cellules du système immunitaire cérébral. Cette communication repose sur des vésicules extracellulaires, les exosomes, qui participent à la fois aux fonctions physiologiques et aux réponses inflammatoires dans le cerveau. L’alimentation est clé dans le bon fonctionnement cérébral et le vieillissement cognitif. Les acides gras polyinsaturés n-3 (AGPI n-3) ou oméga 3, ont un rôle bénéfique sur les fonctions cognitives. Leurs mécanismes d’action restent à ce jour méconnus. Ce projet consiste à identifier les biomarqueurs du cerveau du risque de déclin cognitif accéléré par l'étude des exosomes, et de déterminer le rôle des exosomes dans la protection par la nutrition des fonctions cognitives dans un modèle de vieillissement murin accéléré. Ce projet a pour objectif d’identifier des biomarqueurs cérébraux associés au déclin cognitif, de déterminer leur rôle fonctionnel dans le déclin cognitif et de développer des approches nutritionnelles ciblant la neuroinflammation pour restaurer les capacités cognitives du sujet âgé afin de promouvoir le bien vieillir cérébral. Nous allons utiliser un modèle de vieillissement accéléré déjà établi, reposant sur l'utilisation du D-galactose, et soumettre une partie des animaux à un régime enrichi en Oméga-3 afin de protéger des effets cognitifs. Nous étudierons alors les capacités de mémoire, la neuroinflammation et les exosomes.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la protection des effets du vieillissement par les oméga-3. Il permettra également de déterminer des marqueurs du vieillissement cérébral au niveau sub-cellulaire (exosomes) et ceci dans le cerveau mais également dans le sang.

Procédures

Injection quotidienne de D-galactose ou Saline chez les souris pendant 10 semaines. Tests comportementaux à la fin du modèle D-galactose (10 semaines) (5 tests par animal) – quelques minutes par test.

Impact sur les animaux

Le modèle D-galactose peut impacter le bien être de l'animal par l'injection SC journalière durant les 10 semaines. Ce modèle étant un modèle de vieillissement accéléré, il est attendu que les animaux présentent des déficits de mémoire ainsi qu'une augmentation de leur anxiété. Le modèle D-galactose peut entrainer un comportement de maladie, un suivi des animaux est prévu avec la grille de score bien être. Le régime supplémenté en oméga 3 n'impacte en rien le bien-être de l'animal. Les tests comportementaux ne durent que quelques minutes et n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Le test de peur conditionné peut induire un gêne passagère des animaux durant la phase d'acquisition du comportement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou exosomes nécessaires pour les études biochimiques et moléculaires.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier le rôle des exosomes dans les déficits cognitifs liés à l'âge et la protection de ces déficits par un réfime enrichi en oméga-3. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de biologie cellulaire, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique. Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire au projet sur la base de nos résultats antérieurs permettant d'obtenir des résultats comportementaux ou biochimique/biologie cellulaire robustes. Nous nous sommes également basés sur le nombre d'animaux nécessaire à l'obtention d'une quantité de matériel suffisante pour l'étude des vésicules extra cellulaires, fort de nos résultats préliminaires au laboratoire.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

L’objectif général du projet vise d’identifier des biomarqueurs mécanistiques cérébraux associés au déclin cognitif, de déterminer leur rôle fonctionnel dans le déclin cognitif et de développer des approches nutritionnelles pour restaurer les capacités cognitives du sujet âgé afin de promouvoir le bien vieillir cérébral. Pour ce faire, nous utilisons des modèles souris. Une partie de nos hypothèses ont été formulées sur la base de données obtenues in vivo chez la souris par l'utilisation de régimes imitant les statuts nutritionnels humains. Ce projet s'appuie également sur les données issues d'un article utilisant ce modèle et des régimes enrichis en lipides chez la souris. Dans la cadre de cette étude, le recours à ce modèle murin est donc pertinent et adapté aux objectifs fixés dans l'étude. Le modèle D-galactose est introduit à l'âge adulte. Nous utiliserons donc des animaux contrôles adultes dans ce projet.

540 souris, 270 mâles et 270 femelles, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des tests de sensibilité à la douleur pouvant brûler la peau de la queue, des injections de codéine et jusqu'à seize prélèvements sanguins à la queue. Le porteur cherche à savoir si l'effet analgésique et le métabolisme de la codéine diffèrent entre mâles et femelles, en vue d'adapter les doses chez l'humain. Il affirme que la douleur ne se détecte que par un test comportemental sur animal vivant et justifie ainsi le recours à la souris.

Objectifs

La codéine est un analgésique utilisé pour traiter les douleurs modérées. Une fois administrée, celle-ci est transformée (métabolisée) en morphine, puis en morphine-3-glucuronide (M3G) qui provoque de la douleur et qui est rapidement éliminée dans l’urine. De la codéine-6-glucuronide, qui est un produit de dégradation de la codéine est également formée et pourrait être anti-douleur. Des différences de sensibilités face à la douleur et aux traitements analgésiques sont décrits chez l’homme et la femme, ainsi que chez les rongeurs. Ainsi, les rongeurs femelles sont plus sensibles à la douleur et les médicaments analgésiques sont moins efficaces. Nous avons récemment montré que le métabolisme de la morphine est différent en fonction du sexe. Ainsi, nous avons observé une diminution des effets analgésiques de la morphine chez la souris femelle et une apparition plus rapide de ses effets secondaires. Cette découverte pose la question de la bonne prise en charge de la douleur chez les femmes par les opiacés, et dans notre cas, la codéine. Le but de cette étude est de déterminer s’il existe une différence d’analgésie et de métabolisation de la codéine entre les souris mâles et femelles. Ces résultats permettraient de développer par la suite des prises en charge de la douleur chez l’être Humain différentes en fonction du sexe, avec des posologies adaptées aux sexes. D’autre part, ce projet vise aussi à caractériser l’activité analgésique de la C6G qui pourrait être, par la suite, utilisée comme nouvel analgésique.

Bénéfices attendus

Il existe des différences entre les effets analgésiques de la morphine entre les hommes et les femmes. Chez la souris, Les femelles nécessitent 30% de morphine en plus comparé aux mâles pour avoir une analgésie identique. Notre équipe a démontré que les souris femelles dégradent la morphine 2 fois plus en M3G qui est proalgique que les mâles. Or, la codéine possède un effet analgésique via sa transformation en morphine et potentiellement en C6G. L’étude proposée vise à définir s’il existe des différences sexe-spécifiques d’analgésie à la codéine et à la C6G chez la souris. Si des différences existent, cela signifierait qu’il existe potentiellement une mauvaise prise en charge de la douleur des femmes douloureuses du fait d’une posologie non adaptée. Si des différences sont observées lors de notre étude, une étude clinique sera mise en place pour vérifier si c’est également le cas chez l’être humain. D’autre part, ce projet vise à caractériser l’activité analgésique de la C6G qui pourrait être par la suite être utilisée comme nouvel analgésique.

Procédures

Un groupe de souris subira un test de sensibilité à la douleur (durée 30sec) pendant 7 jours, puis une injection sur animal vigile (durée 30sec) ou une injection sur animal anesthésié (durée 3 minutes) suivie d’un test de sensibilité à la douleur (durée 30sec) 30 minutes après injection. Un autre groupe subira une injection sur animal vigile (durée 30 sec) et 16 prélèvements sanguins à la queue sous analgésie locale seront réalisés. Un dernier groupe subira une injection sur animal vigile (durée 30sec).

Impact sur les animaux

- Une injection de codéine dans un organe peut provoquer un changement de comportement des animaux (prostration, dos arqué, réticence au déplacement, léthargie, agressivité). - Une injections d’une dose élevée de codéine peut provoquer une constipation. - Une injections peuvent induire une inflammation locale. - Concernant les prises de sang à la queue de l’animal des saignements peuvent se produire après le retour en cage. - Le test de sensibilité à la douleur peut induire une brulure du tissu de la queue des animaux. - La contention du test de sensibilité à la douleur peut induire un stress.

Devenir

Procédure 1 à 4 : Les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements sanguins et tissulaires

Remplacement

Les modèles de culture cellulaire se heurtent à une transposition dans des modèles intégrés. En effet, les notions de nociception (correspondant au mécanisme de perception) et de douleur (correspondant à l’interprétation du message) sont uniquement visibles et détectables chez l’animal par un test de comportement spécifique. C’est pour cette raison qu’une approche in vivo sur des souris est nécessaire.

Réduction

Un minimum de 270 souris mâles et 270 femelles (540 au total) est nécessaire à la réalisation des études statistiques. En effet, nos études antérieures ont montré que des effectifs de 8-12 animaux par groupe étaient suffisants pour obtenir la significativité statistique de l’effet d’un traitement antidouleur. Les effectifs de 10 animaux tiennent également compte de la possibilité de devoir écarter un animal en cours de procédure ou de la possibilité d’un problème technique. Si ces éléments ne sont pas anticipés, une nouvelle cohorte devra être ajoutée, ce qui va à l’encontre de la réduction du nombre d’animaux. Les expériences sont réalisées en plusieurs lots successifs avec un maximum de 40 animaux répartis sur les différentes conditions à tester dans chaque lot. les résultats obtenus seront comparés grâce à des tests statistiques adaptés pour répondre aux objectifs du projet.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes de 5 animaux du même sexe pour respecter leurs besoins d'interactions sociales. Leur cage est enrichie avec des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation. Le changement de litière se fait avec des tunnels pour éviter la prise par la queue et réduire le stress des animaux. Les blessures superficielles sont désinfectées avec une solution de chlorhexidine. Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur et au contexte du test (i.e. poche de confinement) est réalisée. Dans les tests comportementaux où l’on évalue la sensibilité à un stimulus nociceptif (c’est-à-dire provoquant potentiellement une douleur), un seuil maximal de stimulation est déterminé (point limite afin d'éviter une souffrance à l'animal ou des dommages tissulaires), même en absence de réaction de l'animal. Une veille de la littérature et la participation à des séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer aux procédures tout nouvel élément contribuant au bien-être animal.

Choix des espèces

Dans notre cas, l’utilisation du modèle de la souris permet une comparaison avec les autres études précédemment effectuées. En effet, 70% des études portant sur l’analgésie aux opiacés sont réalisées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de cette souche est cohérente avec nos derniers travaux sur l’effet de la morphine et de son métabolisme. Le modèle de souris reste la référence dans les études pré-cliniques pour réaliser des expériences. De plus, en plus d'avoir la possibilité de tester la sensibilité nociceptive chez la souris, dans le cadre de notre étude métabolique, la physiologie de cette espèce s'apparente facilement à celle de l'homme (biotransformation majoritaire de la morphine en M3G). Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines. En effet, les prises de codéine en tant qu’analgésique concernent principalement les populations adultes.

164 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un gavage oral quotidien pendant 19 jours, geste pouvant causer un stress, une irritation de l'œsophage et un risque de fausse route, avant analyse de leur cerveau. Le porteur teste des doses plus élevées d'un composé censé améliorer les capacités cognitives dans un modèle rat du syndrome de Down, une étude précédente n'ayant donné qu'un effet très limité. Il affirme qu'aucune alternative n'existe pour étudier le cerveau et espère à terme relever le quotient intellectuel des patients.

Objectifs

Le syndrome de Down (SD) représente la forme la plus fréquente de retard mental. Parmi les gènes candidats jouant un rôle majeur dans le développement des déficits cognitifs associés au SD, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les personnes atteintes du SD a été identifié. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent une altération de leurs capacités d’apprentissage et un déficit de mémoire similaire à ceux observés dans le SD. Ce gène est aujourd’hui une cible privilégiée pour le développement de stratégies thérapeutiques. Des collaborateurs ont ainsi identifié et synthétisé un composé ayant les propriétés d’améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans le SD en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Ce composé a déjà été testé sur des modèles souris du SD permettant une amélioration de leurs fonctions cognitives sans aucun effet toxique observé. Il a également été testé sur des modèles de rat lors d’un projet précédent, cependant la dose utilisée n’a eu qu’un effet très limité avec seulement une très légère amélioration de la mémoire chez l’un des modèles testés. Cette absence d’effet peut s’expliquer de deux façons, la dose administrée au rat est probablement insuffisante. Cette dernière a été déterminée par rapport aux études faites chez les modèles souris, hors nous savons maintenant que le composé n’est pas métabolisé de la même façon entre le rat et la souris. Par ailleurs, la durée de traitement reçu par les rats avant le début de l’étude comportementale est probablement insuffisante. En effet, en utilisant une durée de traitement similaire à celle utilisée dans les études souris, le nombre de doses de traitement reçu avant le début de l’étude comportementale est plus faible chez le rat du fait d’un test comportemental plus long. Nous pensons donc que la durée de traitement devrait être adaptée en fonction de la durée de l’étude comportementale. De ce fait, nous souhaitons tester des doses plus élevées de ce composé chez nos modèles rats afin de déterminer laquelle permettra une amélioration de leurs performances cognitives. Ces doses restent bien inférieures à celles testées lors des études toxicologiques et seront donc bien supportées par les animaux. Une étude préliminaire sera d'abord mise en oeuvre sur un petit nombre d'animaux afin d'identifier la dose efficace. Une fois cette dose identifiée, une nouvelle étude sera réalisée sur un plus grand nombre d'animaux.

Bénéfices attendus

Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints du SD leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée. Cela constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur le SD est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. De plus, dans le cadre de cette étude, réussir à reproduire sur des modèles rat, les résultats obtenus sur les modèles souris du SD, nous permettra une généralisation des résultats avant le passage en phase clinique du candidat-médicament.

Procédures

Dans le cadre de cette étude, un gavage oral répété sera effectué sur un total de 164 rats. Ce gavage sera réalisé sur 19 jours consécutifs à raison d’un gavage par jour. La réalisation du gavage prend 1 à 2 mins par rat par jour.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette étude, un gavage oral répété sera réalisé. Ce geste technique peut entraîner un stress non négligeable, une irritation de l’œsophage et il existe un risque de fausse route.

Devenir

L’ensemble des animaux prévu dans ce projet seront mis à mort afin de pouvoir réaliser des analyses moléculaires et histologiques sur le cerveau.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucune alternative à l’utilisation des animaux pour les études concernant le cerveau. La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques ainsi que les essais de traitement de ces pathologies requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, une étude préliminaire sera réalisée sur un petit nombre d’animaux afin de déterminer la dose optimale de molécule à administrer aux animaux afin d’avoir une amélioration de leurs capacités cognitives. Cette étude préliminaire se base sur une analyse moléculaire post-mortem chez des animaux traités/non traités qui nécessite un nombre bien moins important d’animaux qu’une étude comportementale pour avoir des résultats scientifiquement interprétables. Cette étude nécessite ainsi 3 animaux/groupe/sexe contre 14 animaux/groupe/sexe pour une étude comportementale. C’est seulement lorsque la dose optimale à administrer sera identifiée qu’une étude comportementale sera réalisée sur un nombre plus important d’animaux. Les effectifs ont été déterminé sur la base de nos connaissances et du recul que nous avons sur ces procédures. Par ailleurs, ces études seront réalisées sur des mâles et des femelles afin d’utiliser l’ensemble des animaux produits et de vérifier qu’il n’y a pas de différence d’effet de la molécule testée en fonction du sexe.

Raffinement

Des études pré-tox ont préalablement été réalisées par nos collaborateurs afin de s’assurer que la molécule testée n’a pas d’impact majeur sur les animaux après administration. L’administration de la molécule sera réalisée par gavage oral pendant 19 jours. Le gavage n’est pas une technique douloureuse, cependant l’animal sera surveillé après l’administration du composé. Par ailleurs, avant de débuter le gavage, une phase d’habituation à l’expérimentateur sera réalisée à raison d’une manipulation par jour pendant 5 jours pour éviter tout stress de l’animal. Les points limites seront déterminés en fonction des observations faites après le gavage de l’animal (fausse route, changement du comportement (prostration, difficultés respiratoires)). La procédure de gavage sera arrêtée si ces points limites sont atteints. Par ailleurs, les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien permettant de s’assurer de leur bien-être et de leur santé. Les animaux présentant des signes de mal être ou de douleur (plaies, hérissement du poil, attitude voûtée, perte de poids) seront présentés au vétérinaire. Selon l’état de l’animal, la mise en place d’un traitement pourra être envisagée (antiseptiques, antibiotiques, analgésiques), s’il n’interfère pas avec l’administration de la molécule testée et avec l’analyse comportementale. Les animaux seront ainsi évalués pour des signes de douleur suivant l’échelle de l’expression faciale. Le point limite est atteint quand l’animal présente une expression faciale indiquant une douleur sévère dans 3 des items de douleur considérés, dans ce cas l’animal sera mis à mort. Tout au long de leur vie, les animaux seront hébergés par deux, le rat étant une espèce très sociable, et disposeront d’un bâton à ronger en guise d’enrichissement.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires des pathologies génétiques requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité. Le rat est physiologiquement et génétiquement plus proche de l’Homme que ne l’est la souris. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique du rat sont bien connues. Par ailleurs, l’évolution de l’ingénierie génétique permet maintenant de réaliser facilement des modifications génétiques chez le rat. L’intérêt d’utiliser le rat est de comparer les résultats obtenus à ceux de la souris. En effet, sachant qu’il existe des différences inter-espèces, il est important de comparer les résultats entre deux espèces afin de généraliser les résultats si ces derniers sont similaires. Enfin, les meilleures capacités d’apprentissage et d’adaptation du rat comparées à la souris en font un meilleur modèle pour l’étude des déficiences cognitives associées au SD. L’étude sera réalisée chez des rats âgés de 3-4 mois, car c’est un âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes d’apprentissage et de mémorisation sont présents. Par ailleurs, cela correspond à l’âge auquel a été identifié un déficit d’apprentissage et de mémoire chez nos modèles rats du SD.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau de 45 minutes, jusqu'à six passages en chambre de mesure respiratoire et un test de tolérance au glucose de deux heures, avec un régime hypercalorique de huit semaines. Le porteur qualifie l'exposition aux odeurs d'"inoffensive" et affirme que la prise de poids ne cause pas de souffrance. L'étude, menée sur des souris transgéniques, cherche comment les odeurs modulent des neurones du contrôle de la faim, les pistes contre l'obésité restant hypothétiques.

Objectifs

Dans ce projet nous nous intéressons à la régulation de la prise alimentaire. Cette régulation implique notamment un réseau de neurones situé dans le noyau arqué de l’hypothalamus. Les expériences porteront sur 2 populations de neurones ayant un rôle clé dans le contrôle de la prise alimentaire. Il s’agit d’une part, des neurones POMC ayant pour action supposée de limiter la prise alimentaire et d’autre part, des neurones AgRP stimulant la prise alimentaire. De précédentes études réalisées sur des souris ont révélé la capacité de ces neurones à répondre non seulement lorsque le cerveau détecte la présence de nutriments en quantités mais également à des signaux sensoriels issus notamment de la nourriture. Ainsi les neurones POMC et AgRP peuvent être modulés par l’odeur de nourriture avant même qu’un aliment ne soit ingéré. Le présent projet propose de caractériser les mécanismes à l’origine de cette modulation des neurones du noyau arqué par les odeurs de nourriture chez la souris. Différentes odeurs présentes dans des nourritures palatables seront utilisées pour tester leur effet sur la physiologie des neurones POMC et AgRP.

Bénéfices attendus

Les expériences proposées permettront une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques de la régulation de la prise alimentaire. Dans le contexte de l’augmentation forte du nombre de personnes en surpoids ou obèses dans le monde, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour le contrôle de la prise alimentaire s’appuyant sur l’utilisation d’odeurs modulatrices des circuits neuronaux régulant la prise alimentaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une durée d'environ 45 minutes. Toutes les précautions seront prises pour éviter une douleur de l'animal. Ils seront ensuite testés 6 fois maximum en chambre pléthysmographique (animal libre de ses mouvements) pour une durée d'environ 15min par session. Les animaux seront testés pour leur tolérance au glucose (effets métaboliques potentiels des régimes alimentaires administrés) une seule fois à la fin des expérimentations pour une durée de 2h.

Impact sur les animaux

Les odeurs utilisées proviennent d’aliments ou d’arômes alimentaires et seront utilisées à des doses faibles (les doses nécessaires à leur détection par les souris) et sur des durées inférieures à 2h. Cette exposition est donc inoffensive pour les animaux. Le régime hypercalorique entrainera une prise de poids qui sera mesurée une fois par semaine. Durant les 8 semaines d’administration du régime hypercalorique, la prise de poids sera limitée et ne causera pas de souffrance à l’animal. Les perfusions intracardiaques seront réalisées sur animal en cours d’euthanasie à la suite de l’administration d’un antalgique 30min avant.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des expérimentations pour vérifier la bonne implantation des fibres optiques. Si un animal atteint les points limites avant la fin de la procédure, il sera euthanasié.

Remplacement

L’objectif général du projet vise à comprendre les mécanismes à l’origine de la modulation de la prise alimentaire par les odeurs. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des neurones impliqués dans le contrôle de la prise alimentaire reste donc une nécessité expérimentale pour fairre avancer notre compréhension de ces processus modulateurs. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.

Réduction

Plusieurs éléments permettent de répondre au principe de réduction tout en évitant de compromettre l’obtention de résultats interprétables : i) les tests statistiques envisagés, ii) la variabilité couramment observée permettant d’avoir au maximum n=15, iii) la réalisation de plusieurs tests différents sur le même animal.

Raffinement

En accord avec la structure chargée du bien-être animal au sein du laboratoire, nous avons défini les meilleures conditions d'hébergement possibles ainsi que les points limites précoces. Dans ce projet, nous avons 5 à 10 souris par cage, présence de différents enrichissements (batonnet de bois, dôme en carton et bandelettes de papier pour former un nid), surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Nous appliquons les méthodes recommandées pour l’analgésie, l’anesthésie et l’euthanasie. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience.

Choix des espèces

Le projet proposé porte sur l’étude de populations particulières de neurones hypothalamiques ayant un rôle clé dans le contrôle de la prise alimentaire. Les expérimentations seront réalisées sur des souris transgéniques nous permettant de cibler ces populations neuronales afin d’en comprendre le fonctionnement. La souris est le seul modèle animal permettant les modifications transgéniques nécessaires à la transformation ou à la visualisation de la population neuronale étudiée dans ce projet. D’autre part, la souris est un animal à l’odorat très développé qui utilise les odeurs dans son comportement alimentaire. Enfin, sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues servent les explorations thérapeutiques chez l’humain. Les procédures expérimentales débuteront à l’âge de 5 semaines (mise sous régime modifié). Les mesures neurophysiologiques seront réalisées chez l'adulte au cours de la 13ème semaine de vie.

234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèle de trisomie 21, elles reçoivent des injections dans l'abdomen chaque jour pendant jusqu'à 23 jours, puis passent des tests d'apprentissage et de mémoire. Le porteur indique une douleur accentuée par la répétition des injections et un stress lié à l'isolement et à l'appauvrissement du milieu. L'objectif affiché est de tester trois molécules censées améliorer les performances cognitives, les souris étant tuées pour prélever les cerveaux.

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) aussi appelé Trisomie 21 (T21), est dû à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement crânio-facial et le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent des anomalies crânio-faciales ainsi qu’une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observée dans la T21. Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la T21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. Des collaborateurs proposent 3 nouveaux composés ayant la propriété d’améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons déterminer le composé parmi ces 3 candidats (composés 1,2 et 3) qui se révélera le plus efficace en termes de restauration des fonctions intellectuelles. Ces composés ont été synthétisés et testés pour l’ADME pharmacologique (administration, distribution, métabolisation et excrétion) par nos collaborateurs. Ces composés seront ainsi administrés par notre équipe à des souris modèles de T21. Les souris traitées feront l’objet de différents tests comportementaux afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir une amélioration significative des performances cognitives (notamment dans 2 types de mémoire, mémoire de travail et mémoire explicite) dans un modèle souris de trisomie 21, qui montre de faibles résultats dans ces 2 tests.

Procédures

Les animaux seront injectés quotidienement par voie intraperitonéale avec des molécules à visée thérapeutique pour une durée maximale de 23 jours. Le temps de l'injection dure 20 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une aiguille pour l'injection en intraperitoneale. Cette douleur sera accentuée à cause de la repetition des injections, 23 au total, soit 1 par jour. L'isolement des animaux et l'appauvrissement du milieu peut entrainer un stress.

Devenir

Pour la phase 1 (validation de l'activité de la proteine d'intérêt), tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des 12 jours de traitement. Les cerveaux seront prelevés pour réaliser un dosage de l'effet des molécules à visée thérapeuthique. Pour la phase 2 (test d'apprentissage et de mémoire), tous les animaux seront euthanasiés 24 heures après la fin du test permettant d'evaluer les effets des molécules à visée thérapeuthique sur la mémoire et l'apprentissage. Les cerveaux seront prélevés pour des analyses moléculaires.

Remplacement

L’utilisation de la souris dans cette étude est justifiée par le fait que les anomalies à observer (altération des capacités d’apprentissage et déficit de la mémoire) nécessitent un modèle vivant et suffisamment proche de l’homme pour pouvoir être transposé à l’espèce humaine.

Réduction

Pour ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées à partir de 12 semaines, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons les 3 composés sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. Une première phase visant a s’assurer de l’effet des inhibiteurs sur l’activité kinase de Dyrk1a sera effectuée. Dans le cas où les molécules testées ne montrent pas l’effet inhibiteur attendu, la phase 2 ne sera pas menée. Pour cette 1ère phase, nous utiliserons 90 souris, réparties en 10 souris sauvages non traitées, 10 souris trisomiques non traitées et 10 souris trisomiques traitées, soit 30 souris x 3 composés évalués, soit 90 souris. Pour cette 1ère phase, notre expérience dans ce domaine nous indique que 10 individus sont suffisant pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Pour la 2ème phase de projet, nous allons utiliser un total de 144 souris. L'étude se déroulera en 3 groupes d’expériences (1 groupe par composé) comme détaillée ci-dessous : Pour chacun des différents composés nous aurons besoin de 3 lots d’animaux : - 16 Souris contrôles sauvages non traitées - 16 Souris contrôles trisomiques non traitées - 16 Souris trisomiques traitées, pour 3 molécules différentes. Notre experience dans ce domaine nous montre que 13 animaux par groupe sont nécessaires pour avoir une puissance statistique suffisante. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne reponderont pas, c'est pourquoi nous testeront 3 animaux de plus dans chaque groupe.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi quotidien à partir du début de leur traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Et dans le cas où les animaux présenteraient des signes de souffrance, de mal-être, ou de douleur, ils seront exclus des analyses et soignés ou euthanasiés selon leur état. Pour la manipulation des animaux, et afin de limiter le stress, nous utiliserons des tubes de contention, ce qui évite la manipulation par la queue. Les tubes seront laissés dans les cages d'élevage pour palier à l'absence de nid, comme enrichissement du milieu. Les animaux seront elevés en groupe de 2 animaux minimum pour éviter l'isolement, sauf au moment du test du nouvel objet, pour augmenter le niveau d'exploration des souris. Le point d'injection sera alterné droite gauche tous les jours pour limiter la douleur et surveillé quotidiennement. Si des plaies apparaissent au site d'injection, elles seront désinfectées par un antiseptique local + crème cicatrisante (Betadine + Vetramil). Si la plaie devient importante et/ou profonde avec développement d’une infection ou une aggravation à 48h malgré les soins, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement. En outre, le génome de la souris étant manipulable, cela permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du Syndrome de Down. Les souris seront étudiées à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 3 mois, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présents. Dans cette étude, les deux sexes seront utilisés. Nous voulons être sûre que les hormones et donc le sexe n’impactent pas sur l’effet des produits testés.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux interventions chirurgicales au cerveau sous anesthésie, une restriction alimentaire pouvant durer sept jours et des injections cinq jours de suite, avant une tâche de mémoire récompensée par de la nourriture. Le porteur indique que la restriction alimentaire peut être stressante car elle empêche certains comportements naturels, comme cacher de la nourriture. L'objectif est de comprendre le fonctionnement d'une région du cerveau impliquée dans la mémoire, les bénéfices pour les maladies humaines restant renvoyés à d'autres projets de l'équipe.

Objectifs

L’objectif global de notre projet est de contribuer à la compréhension des processus d’encodage et de stockage des mémoires chez les mammifères. Plus spécifiquement, nous souhaitons étudier les mécanismes sous-jacents la formation de la mémoire à long terme dans une zone spécifique du cerveau. Cette zone de cerveau a été impliquée dans plusieurs maladies humaines. Une meilleure compréhension de son fonctionnement en conditions normales est nécessaire afin d’identifier et de comprendre les altérations, qui se manifestent en conditions ‘anormales’, telles queles maladies neuro-développementales ou neuro-dégénératives

Bénéfices attendus

La zone de cerveau ciblé par notre étude a été impliquée à plusieurs maladies humaines. Une meilleure compréhension de son fonctionnement en conditions normales est nécessaire afin d'identifier et de comprendre les altérations, qui se manifestent en conditions 'anormales', telles que les maladies touchant le système nerveux central. Les connaissances obtenues grâce à ce travail nous permettront de renseigner d'autres projets en cours dans l'équipe, explorant le rôle de cette région du cerveau dans les altérations pathophysiologiques présentent, par exemple, lors des maladies neuro-développementales ou neuro-dégénératives. La réorganisation structurelle des circuits neuronaux est également un domaine de recherche largement négligé par les études précliniques et notre travail apportera des nouvelles connaissances dans le domaine des mécanismes de plasticité.

Procédures

Les animaux sont nourris avec un régime alimentaire modifié. Ils subissent deux brèves interventions chirurgicales (< 45 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale nécessitant une motivation appétitive pour laquelle ils reçoivent une récompense nutritive. Cette tâche nécessite que la quantité de nourriture disponible soit limitée pendant 7 jours. Ils reçoivent également des injections pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent deux brèves interventions chirurgicales sous anesthésie. Cependant, grâce à l'utilisation appropriée d'analgésiques, d'outils et de matériels stériles, et à une surveillance et des soins post-chirurgicaux adaptés, les conséquences négatives pour les animaux sont minimisées. Une période de rétablissement (4-7 jours) est prévue avant toute autre manipulation. Les animaux sont soumis à une restriction alimentaire. Cela peut être stressant pour les souris car cela ne leur permet pas d'exprimer certains de leurs comportements naturels, comme cacher de la nourriture dans la cage. Pour compenser ce stress, nous manipulons les souris préalablement et nous essayons également de les nourrir à la même heure de la journée afin qu'elles apprennent à associer la présence de l'expérimentateur à l'apport de nourriture. En adaptant le programme d'entraînement, nous maintenons la période de restriction alimentaire aussi courte que possible (maximum 7 jours consécutifs). Le paradigme de la restriction alimentaire nous oblige également à loger les souris individuellement, afin d'éviter la compétition pour la nourriture et l'agression entre congénères. Pour pallier cette contrainte, nous maintenons les souris en hébergement collectif le plus longtemps possible avant cette étape. Nous augmentons la quantité de matériel disponible pour la construction du nid et nous augmentons l'enrichissement en manipulant les souris avant l'expérience. Tout au long des expériences, les souris sont nourries avec un régime spécial (sans effets délétères pour l'animal). Elles reçoivent également des injections intrapéritonéales, qui provoquent un léger inconfort. Pour atténuer les conséquences de cette injection répétée, nous utilisons des aiguilles de très petite taille, ce qui minimise l'inconfort pour l'animal. La solution injectée elle-même n'a aucune conséquence négative pour l'animal. Toutes les manipulations sont effectuées par un expérimentateur formé et compétent ayant plus de 8 ans d'expérience dans la manipulation des animaux.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet porte sur l’étude des mécanismes sous-jacents la formation et stockage de la mémoire dans une zone spécifique de cerveau. Pour mener notre étude, nous aurions besoin d’un modèle : i) complexe et intacte, ii) adapté à la réalisation des tests cognitifs, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) disposé facilement à la modification de son génome, v) possédant la structure cérébrale ciblée, vi) adapté aux approches expérimentales invasive. Conformément à la Directive Européenne et au principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer des approches alternatives lorsque cela était possible. A notre connaissance, seuls les modèles de mammifères, notamment les souris, répondent à l'ensemble de ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et ne sont donc pas adaptés à l'objectif de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones associés au stockage de la mémoire et les analyses de connectivité possibles au niveau clinique n'ont pas la résolution nécessaire pour répondre à la question scientifique posée. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas de modéliser le cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, l'utilisation d'animaux est malheureusement nécessaire.

Réduction

Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : selon les caractéristiques de nos données nous appliquons les tests statistiques appropriés à notre question scientifique et à nos données.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant et après chaque manipulation/étape) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Intervention immédiate et appropriée (en cas de besoin) - mesures conservatoires à privilégier. iv) Raffinement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques (pré- et post-op) pour chaque procédure chirurgicale v) Application de soins préventifs après la chirurgie; stratégie de nursing si nécessaire vi) Manipulation quotidienne des animaux avant les sessions comportementales pour réduire le niveau de stress lié à l'interaction avec l'expérimentateur vii) Optimisation de notre tâche comportementale pour minimiser la durée de la restriction alimentaire viii) Entraînement progressif de l'animal (séances d'habituation) intégré à la tâche afin de minimiser le stresse ix) Utilisation d’aiguilles de petite taille pour minimiser l'inconfort associé à l'injection i.p. x) Utilisation, dans la mesure du possible, de méthodes non invasives (par exemple, l'administration dans la nourriture) pour l'administration des médicaments afin d'éviter les contraintes associées aux autres méthodes d'administration. xi) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs proposants les méthodes de raffinement. xii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus le plus longtemps possible dans des cages collectives.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquant, par exemple, le marquage permanent des cellules activées lors de l’apprentissage, ou l'expression d'une sonde calcique. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier le génome et pour laquelle les modèles créés ont été caracterisés au niveau comportemental et moléculaire. Le choix d'utiliser la souris est également motivé par nos données précédentes et la disponibilité de paradigmes expérimentaux déjà élaborés qui garantissent le succès de notre étude.