Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
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- Multisystémique
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Effets de l’exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques sur le lien entre lésions cérébrales et hépatiques en cas de surcharge en lipides : rôle des vésicules extracellulaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal reçoit par gavage un mélange de polluants un jour sur deux, avec pour certains un régime gras, puis passe isolé 24 heures en cage métabolique, subit un test de nage forcée de Porsolt et un test de tolérance au glucose avec sonde rectale, avant d'être tué pour prélever les tissus. Le porteur détaille le stress lié au gavage, à l'isolement et à la contention, et prévoit une surveillance renforcée pendant le test de Porsolt. Il affirme qu'aucun système alternatif ne reproduit la complexité de l'"organisme entier" nécessaire à l'étude.
Objectifs
L'accumulation de graisses dans le foie en dehors de toute consommation élevée d'alcool induit une maladie chronique au niveau de cet organe qui concernerait plus de 200 000 personnes en France chaque année. Cette maladie qui peut être associée à une inflammation peut aussi être reliée à des troubles fonctionnels du cerveau. De nombreux polluants sont présents dans l’environnement et l’alimentation est la principale source d’exposition à ces polluants. En raison de leur forte persistance, ils s’accumulent dans le foie et le cerveau. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons les effets induits sur le foie et le cerveau par une exposition répétée à un mélange de polluants chez le rat adulte consommant un aliment riche en graisses, et réaliserons un ensemble d’analyses comportementales et physiologiques.
Bénéfices attendus
Nous espérons ainsi identifier de nouveaux biomarqueurs d’exposition et/ou d’effets des polluants et de nouvelles cibles thérapeutiques en décryptant le rôle des vésicules dans les mécanismes mises en jeux par l'accumulation de graisses dans le foie et le lien avec de possibles atteintes cérébrales. Cette étude devrait nous permettre : 1) d’évaluer les effets d’une exposition aux polluants dans un contexte enrichi en lipide ou pas, sur le niveau de production et les caractéristiques des vésicules et l’impact de ces changements sur les maladies du foie et du cerveau, 2) de comprendre si les vésicules libérées par les cellules du foie et du cerveau, suite à l’exposition aux polluants peuvent provoquer une toxicité pour les cellules réceptrices, 3) de déterminer la fiabilité de la caractérisation ces vésicules en tant que biomarqueurs d’exposition et/ou de toxicité précoces, modèle facilement transposable chez l’humain, 4) d’évaluer l’interaction avec un stress de nature différente et d’identifier des comorbidités (la libération de vésicules et l’inflammation dues à une surcharge en graisse au niveau du sang pouvant être considérée comme un stress supplémentaire venant s’ajouter aux polluants).
Procédures
Ce projet inclura 3 lots regroupant 6 groupes d'animaux : 3 groupes nourris avec la nourriture standard de l'animalerie et 3 groupes alimentés avec un régime riche en lipides. Dans chaque bras, un groupe sera utilisé comme contrôle en étant administré avec l'huile végétale analysée comme servant de véhicule pour la solution de polluant, les 2 autres lots recevant la solution de polluants à 2 doses différentes (80 ou 800 µg/kg de poids corporel). Les animaux seront nourris avec l'une ou l'autre nourriture pendant 30, 60 ou 90 jours et recevront de façon simultanée une administration de la solution de polluants ou d'huile à raison d'une administrations par gavage (une minute par animal) quotidienne un jour sur deux au cours de la semaine (n'est pas prévu d'administration le week-end). Les animaux du lot 1 d’un total de 48 rats (8 par groupe) se verront prélever des poils, du sang (à J0, J28 et J58) et de l’urine (à J30 et J60) pour une mise à mort à J60. Les animaux du lot 2 d’un total de 96 rats (16 par groupe) se verront prélever des poils, du sang (à J0 et J88) et de l’urine (à J90) pour une mise à mort à J90. De plus, ce lot servira à explorer les performances comportementales au plan de l'anxiété (mesurée pendant 5 minutes), de l'activité (mesurée pendant 24h), des performances cognitives (mesurée pendant 2 séances de 10 minutes chacunes) et de la résignation (mesurée pendant 5 minutes) entre J60 et J90. Enfin, Les animaux du lot 3 d’un total de 36 rats (6 par groupe) se verront prélever des poils, du sang (à J0 et J88) et de l’urine (à J90) pour une mise à mort à J90. Ce lot sera dédié à l’étude de la réactivité à un stress psychologique (exposition à un stress pendant une heure) et la tolérance au glucose. Ces 6 animaux seront réutilisés au 3 stades (J30, J60 et J90) pour pouvoir suivre chez les mêmes individus l'évolution de la tolérance au glucose (test d'une durée de 180 minutes) en lien avec l'évolution de la maladie hépatique. Une fois les mises à mort effectuées, les tissus d’intérêts seront prélevés pour analyses.
Impact sur les animaux
Les nuisances/effets indésirables identifiés attendus tout au long du projet que suivront les animaux sont les suivants : stress lié à l'administration par gavage des polluants, l'inconfort qui pourrait etre lié à la prise de poids du fait des régimes alimentaires qui seront utilisés, le stress généré par le passage en cage à métabolisme pour une durée de 24h pendant laquelle l'animal sera isolé, l'isolement de l'animal lors de son passage pendant 24h dans le test d'actvité avec une roue d'activité, le stress/mal-être généré par le passage dans le test de Porsolt, le stress liés à l'épreuve de réponse au stress et le test de tolérance au glucose (stress lié à la contention, aux prises de sang à la veine de la queue, pose et maintien de sonde rectale pour prise de temperature pendant une heure).
Devenir
La mise à mort des animaux se fera 24h après le prélèvement des urines en cage à métabolisme pour 48 rats à J60 et 96 rats à J90 après passage dans les tests de comportement. La mise à mort des 36 derniers animaux se fera 24h après l'étude de la réactivité au stress induite par une contention à J90. Après chaque mise à mort, les tissus d’intérêts à l’étude seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
L'objectif du projet étant d'étudier le rôle des vésicules produites au niveau du foie dans un contexte d'exposition à un régime enrichi en lipides ou pas, associé à une exposition répétée aux polluants dans le dialogue entre le foie et le cerveau, il n'est pas possible de procéder au remplacement des animaux par un système alternatif. Aucun système alternatif ne permet de simuler le niveau de complexité de l'organisme entier nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
Le nombre total d'animaux est le nombre estimé juste et nécessaire pour pouvoir atteindre les objectifs du projet dans des conditions de réalisation acceptables garantissant ainsi le bon déroulement de l'expérimentation, la prise en charge adaptée des animaux de façon à garantir au mieux leur bien-être et une exploitation statistique satisfaisante des résultats. Le nombre de 180 animaux prévu a été déterminé pour un calcul de puissance statistique de 80%, des effectifs égaux dans les 6 groupes expérimentaux (n=30/groupes) et la variation estimée la plus sensible dans l'ensemble des mesures effectuées. Par ailleurs ce nombre de 180 animaux est réparti en 3 lots de respectivement, 48, 96, et 36 rats destinés à des mesures à un stade déterminé pour chaque lot plutôt que d'avoir un seul lot nécessitant de répéter à chaque stade d'investigation un nombre conséquent de procédures contraignantes avec pour conséquence un risque en terme de mal-être des animaux tout au long de l'expérimentation et une prise en charge inadaptée compte-tenu d'un volume de travail trop important.
Raffinement
Les points limites récurrents à toutes les procédures qui seront surveillés chez les animaux adultes seront : 1) la diminution ou l'arrêt de consommation alimentaire ou hydrique, le ralentissement de la prise de poids avec rupture de la linéarité de la courbe de poids au regard des courbes de poids fournies dans des abaques publics, 2) la modification de l’apparence externe (pelage ébouriffé et/ou terne, absence de toilettage), 3) un état de prostration, 4) des signes respiratoires de mal- être (éternuements, râles, toux, respiration pénible) caractéristiques d’une fausse route liée à la procédure de gavage. Enfin pour le Porsolt, une surveillance accrue sera mise en place par des manipulateurs et neurocomportementalistes expérimentés détenteurs du DU d’expérimentation niveau 1. De plus, au moindre signe de détresse non attendu de l’animal lors de ce test, celui-ci sera sorti immédiatement puis séché, réchauffé et remis dans sa cage. En cas d’atteinte de l’un de ces points, l'animal sera d'abord isolé, la surveillance poursuivie et si l'état général de l'animal est jugé apte, le traitement sera maintenu. Dans le cas contraire, le traitement sera stoppé et l'animal exclu du groupe. En dernier recours, le rat pourra être mis à mort par injection i.p. d'Exagon (pentobarbital 180 mg/kg) après sédation profonde sous isoflurane 4% si les signes et l'état de mal-être ne se résorbent pas.
Choix des espèces
Le projet de recherche nécessite le recours à des analyses physiologiques, cellulaires, biochimiques et moléculaires en lien avec des régimes nutritionnels spécifiques induisant une maladie du foie dont l’origine n’est pas liée à une surconsommation d’alcool . Les rats SpragueDawley sont utilisés pour la recherche sur la physiologie et le métabolisme. De plus, il a été montré dans la littérature que les rats Sprague-Dawley constitue un meilleur modèle d’étude d’induction de maladies hépatiques que la souche Wistar. Les animaux entreront dans l’étude à l’âge de 6 semaines et seront acclimatés à leur nouvel environnement pendant 8 à 10 jours. A ce stade ils auront atteint leur maturité sexuelle et sont donc considérés comme jeune adulte, ce qui est représentatif du profil de la population atteinte.
Evaluation et traitement par neurostimulation ultrasonore du profil autistique dans un modèle murin de l’autisme : la souris Oprm1-/-
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
246 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit cinq séances de stimulation ultrasonore transcrânienne sous anesthésie, seize tests comportementaux répartis sur quarante jours, puis une perfusion intracardiaque létale pour prélever le cerveau. Le porteur qualifie les tests de tests classiques d'évaluation cognitive, sociale et d'exploration, sans en détailler le contenu, et n'attend qu'un stress léger de manipulation. Il affirme qu'aucune méthode in vitro n'étudie la réponse comportementale à cette stimulation, testée sur un modèle génétique d'autisme avant un éventuel passage chez l'humain.
Objectifs
→ L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de la stimulation transcrânienne ultrasonore focalisée (tFUS) dans un modèle génétique de souris de profil autistique. Nous évaluerons les symptômes comportementaux associés à ce modèle et aux effets thérpeutiques éventuelles de la tFUS. Notre approche expérimentale permettra d’évaluer les effets comportementaux et neurobiologiques de la tFUS et donc d’estimer son potentiel thérapeutique. Afin d’éliminer les biais sexuels en recherche, nous suivrons les recommandations en incluant mâles et femelles à part égale dans notre design expérimental. Le projet comprendra 2 étapes : (a) Mise en place du protocole de neurostimulation (tFUS) dans la lignée utilisée. Cette étape sera réalisée dans le but de trouver les paramètres optimaux de stimulations cérébrales pour la lignée de souris utilisée. (b) Evaluation du trouble autistique des souris Oprm1-/- et des effets thérapeutiques du tFUS Cette étape correspondra à l’étude des symptômes induits par le modèle en lui-même et à l’évaluation des éventuels effets thérapeutique du traitement par tFUS sur les symptômes de type autistique. Pour une caractérisation la plus complète, les souris passeront une batterie de test comportementaux qui permettront d’évaluer les différentes dimensions symptomatiques du trouble du spectre de l’autisme et de déterminer ensuite si les eventuels effets thérapeutiques du tFUS se concentrent plus fortement sur certaines dimensions particulières ou sur la globalité du trouble.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra permettre de caractériser précisément les effets de la neurostimulation ultrasonore trancrânienne in vivo. Ceci est essentiel pour une meilleure évaluation des potentialités thérapeutiques de cette technique dans les modèles puis dans le futur chez les sujets humains.
Procédures
Mise en place du protocole de neurostimulation (tFUS) :Chaque souris sera soumise à une séance de stimulation transcrânienne ultrasonore (tFUS) sous anesthésie générale (1 fois, 30 minutes) et enfin à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil soit après injection létale. Evaluation du modèle et des effets thérapeutiques du tFUS : Chaque souris sera exposée à 5 séances de stimulations ultrasonores réels ou simulées (témoin) de 30 minutes chacune sur 5 jours. Chaque souris sera soumise à 16 tests comportementaux répartis sur 40 jours (et de durée maximum de 30 minutes par session et un seul par jour maximum). Aucun de ces tests n’induit des douleurs ou du stress excessif autre qu’être brièvement exposé à un nouvel environnement, un nouveau congénère ou un nouvel objet. Enfin, chaque souris sera soumise à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil soit après injection létale.
Impact sur les animaux
→ La stimulation ultrasonore est une approche innovante, non invasive et indolore pour stimuler des zones cérébrales. L’animal sera installé sur le dispositif et testé lors de chaque session à la suite d’une anesthésie gazeuse, limitant ainsi tout stress de manipalution de l’animal lors de l’installation dans le dispositif de stimulation. Les tests comportementaux utilisés sont des tests classiques d’évaluation cognitive, sociale ou d’exploration et bien caractérisés dans la littérature. Bien que ces tests comportementaux puissent générer du stress (stress léger de manipulation), il est bien établi qu’ils n’induisent pas d’autres types d’effets indésirables.
Devenir
Tous les animaux seront mis à morts en fin de procédure et les cerveaux sont récupérés afin d’effectuer des analyses histologiques et d’expertiser d’eventuels effets des stimulations ultrasonores.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le modèle des troubles du spectre de l’autisme chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux.
Réduction
→ Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique solide. Le choix d’une puissance statistique solide est justifié par le fait qu’il est recommandé d’un point de vue éthique de construire des plans expérimentaux suffisamment puissants pour éviter d’utiliser des animaux sans pouvoir en tirer des conclusions suffisamment solides notamment en cas de résultats négatifs (ce que ne permet pas des plans expérimentaux à faible puissance). C’est particulièrement critique dans cette expérience car nous testons ici une nouvelle technique de neurostimulation dont nous ne savons pas si elle sera efficace contre l’autisme ; notamment si elle le sera pour quelques ou pour la totalité des symptômes. Il est essentiel et nécessaire dans ce projet de délimiter précisément quels pourraient être les champs d’application potentiels d’une telle technique dans le futur grace à une puissance statistique solide..
Raffinement
→ La neurostimulation ultrasonore est une technologie actuellement en développement dans notre laboratoire, nous possédons donc le matériel le plus récent et le plus adapté pour ce type d’intervention. Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Les animaux ne reçoivent aucun traitement qui pourrait interférer avec l’étude. Les animaux sont hébergés en cage avec enrichissement du milieu (cabanes, smarthome® et tubes). Les procédures d’anesthésie seront réalisées sous anesthesie gazeuse qui représente une méthode optimale et recommandée, le débit et la concentration pouvant être contrôlés en temps réel, réduisant fortement tout risque de complication lié à l’anesthésie et permettant le réveil étant très rapide (quelques secondes ou minutes). Les procédures de ce projet n’induisent pas de douleurs ou d’inconvenance particulière. Toutefois, si une perte de poids ou des signes d’inconfort ou de douleurs apparaissent chez une souris, un traitement d’analgésie sera fourni à la souris. Les points limites sont précisément définis : une perte de poids supérieure à 15%, ou une chute de température (diminution de 2°C ou < 35°C). Ces paramètres seront évalués quotidiennement. Dès qu’un problème minime est détecté, la souris est traitée avec un analgesique et on passe à deux évaluations par jour. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration en 48 heures.
Choix des espèces
→Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée (Autisme). Le modèle du trouble du spectre de l’autisme chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux notamment pour déterminer ses mecanismes d’action et ses effets et pour sa validation avant toute faisabilité chez l’homme. Dans cette perspective, nous utiliserons la souris car il existe une forte similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris. Celle-ci constitue un modèle de laboratoire efficace et validée. L’âge des animaux en début d’expérience sera d’environ 28 jours postnatal (= P28). Il s’agit d’un stade prépubère ou pubère (début de maturité sexuelle) qui se justifie d’un point de vue clinique. En effet, l’autisme étant un trouble du développement, il est préférable qu’un potentiel traitement intervienne le plus tôt possible lors du développement pour augmenter les chances de succès et son impact à long-terme. Nous avons donc choisi de soumettre les animaux à la neurostimulation après une semaine d’habituation à la suite du sevrage (correspondant à P28), puis d’éxaminer le comportement dans les semaines suivantes afin d’évaluer les éventuels effets thérapeutiques du tFUS à court terme et leur maintien (ou non) à plus long terme.
Etude de l’inhibition génétique de la phosphodiesterase 2A
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
1 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la plupart tuées à l'issue, 320 issues de la création de lignée pouvant être gardées pour la reproduction. Certaines reçoivent l'injection de composés inflammatoires dans la patte, provoquant une douleur de 45 minutes à 4 heures, et 240 subissent une perfusion intracardiaque létale sous anesthésie. Les souris passent des tests sociaux et cognitifs du stade de souriceau à l'âge adulte, dont des tests d'anxiété et d'interaction sociale précédés de deux heures d'isolement. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace la souris et présente ce modèle génétique comme un "nouveau modèle de maladie du cerveau" pour l'autisme et le syndrome de l'X fragile.
Objectifs
Des mutations du gène PDE2A ont été découvertes chez des patients atteints d’autisme et de déficience intellectuelle, qui sont des maladies du développement du cerveau . La protéine PDE2A est très fortement exprimée dans le cerveau et a un rôle clé dans le développement des neurones, leur morphologie et fonctionnement. Ceci explique que des altérations de son niveau d’expression (trop ou trop peu de protéine) puissent avoir un impact négatif sur le fonctionnement neuronal et induire des maladies du cerveau. L'étude de la souris Pde2a +/- qui, comme les patients, a une quantité diminuée de PDE2A est donc une nécessité du point de vue comportemental puisqu’elle devrait représenter un nouveau modèle de maladie du cerveau. Le syndrome de l'X Fragile est une autre forme très fréquente de déficience intellectuelle et d’autisme . Ce syndrome est dû à l'absence de la protéine FMRP qui est fortement exprimée dans le cerveau. Elle module l’expression de plusieurs protéines qui sont donc déréglées (trop ou trop peu) dans le cerveau des patients X Fragile . Néanmoins, nous ne connaissons pas laquelle ou lesquelles parmi ces protéines est/sont responsable/s majoritairement de la maladie chez les patients X Fragile. En conséquence, il n'existe aucun traitement pour les malades X Fragile. Les souris qui n’ont pas FMRP sont le modèle animal du syndrome de l’X Fragile. Dans le cerveau de ces souris, la quantité de PDE2A est augmenté de 50%. Nous proposons de croiser les souris modèle du X Fragile ayant trop de PDE2A avec la lignée de souris qui ont moins de PDE2A dans le but d'obtenir une souris ayant un niveau de PDE2A normalisé . Si nous retrouvons une normalisation de la mémoire et du comportement social chez les souris que nous avons générées avec un niveau normalisé de PDE2A, nous pourrons conclure que l’augmentation de PDE2A est la cause principale de déficience intellectuelle et autisme chez les patients atteints du Syndrome de l’X Fragile. Des drogues qui permettront de réduire l’activité de PDE2A pourront donc être utile pour traiter les patients X Fragile. Une autre conclusion de ce travail sera aussi de prouver qu’une augmentation ou une réduction d’une protéine clé (comme PDE2A) dans la fonction du cerveau peut induire la même maladie du développement du cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de : 1) Caractériser d’un point de vue comportemental les souris ayant moins de PDE2A et de mettre à disposition de la communauté scientifique ce potentiel nouveau modèle de maladie du développement du cerveau. 2) Comprendre le rôle de l’augmentation de PDE2A dans la manifestation de la déficience intellectuelle et de l'autisme associé au syndrome de l'X Fragile. 3) Valider l’inhibition chronique de PDE2A comme traitement pour le syndrome de l'X Fragile.
Procédures
Différents tests sociaux et cognitifs seront réalisés ponctuellement et qui dureront, selon les tests, de 3 minutes à 2 heures. Ces tests se feront chez les souriceaux, à l'adolescence (un mois) et à l'âge adulte (dès deux mois) Pour les tests sur la douleur inflammatoire, des composés inflammatoires seront injectés en sous-cutané dans la patte de la souris. L'animal sera testé pendant 45 minutes. En terme de procédures chirugicales, certains animaux seront soumis à une perfusion intra-cardiaque, et une injection d'anesthésique et une d'antalgique seront effectuées sur chaque animal.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des contentions manuelles plusieurs fois au cours de leur vie, que ce soit pour des pesées ou pendant les différents tests. Les tests comportementaux réalisés sont classiques et indolores, à l'exception des tests sur la douleur inflammatoire. Une douleur résulte de l'inflammation induite dans ces tests, mais sa durée est de 45 minutes à 4 heures selon le type de test. Concernant les autres tests, de l'anxiété peut être attendue lors des différents tests liée à un nouvel environnement notamment pour les tests d'anxiété ou lors de l'isolement dans l'actimètre ou pendant le test d'interaction sociale avec 2h d'isolement auparavant.
Devenir
Si les souris de la lignée nouvellement créée ne montrent aucune altération physique préjudiciable à l’animal (ce qui est attendu), les 320 animaux de cette création de lignée seront gardés en vie pour la reproduction. Dans le cas contraire, il seront mis à mort, nous récupérerons différents organes afin de déterminer les causes de cette altération, et les procédures comportementales ne seront pas réalisées. L'ensemble des animaux seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales. Nous récupérerons différents organes (cerveau, moelle épinière, surrénales, testicules et ovaires) afin de réaliser des études moléculaires. 240 de ces animaux subiront une perfusion intra-cardiaque, sous anesthésie générale, au cours de laquelle ils décèderont afin de pouvoir réaliser une étude sur les coupes de cerveau.
Remplacement
Avant de réaliser cette étude, nous avons préalablement travaillé sur des lignées cellulaires, ce qui nous a permis de confirmer le rôle de Pde2A et l'intérêt thérapeutique de son inhibition. Notre étude portant globalement sur des maladies du neurodéveloppement et sur le déficit intellectuel et les troubles du spectre de l'autisme, nous devons poursuivre ce projet directement chez la souris pour étudier les différents comportements associés à ces maladies afin de valider le rôle de PDE2A dans ce contexte et l'intérêt de son inhibition dans le syndrome de l'X fragile.
Réduction
Dans un objectif de réduction, nous analyserons nos résultats après chaque groupe expérimental. Si les résultats des 2 premiers groupes expérimentaux sont significatifs et identiques, nous n'utiliserons pas le 3ème groupe. De plus, les organes de tous les animaux utilisés au cours de ce projet seront récupérés pour réaliser des études moléculaires, ce qui évitera l'emploi d'animaux supplémentaires.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des portoirs ventilés en groupes sociaux avec des congénères du même âge, et disposerons de plusieurs enrichissements (ouate, cabanes, bâtonnets à ronger). De plus, du personnel qualifié (zootechniciens) les surveillera et prendra les mesures nécessaire en accord avec des points limites établis et adaptés à chaque test. Lors des procédures chirurgicales, les animaux seront au préalable anesthésiés, accompagné d'un analgésique et d'un antalgique afin de réduire la douleur de l'animal.
Choix des espèces
Travailler avec des souris permet de comparer des individus dits « sauvages » dont l’ensemble des caractéristiques est connu, avec des modèles transgéniques disponibles, comme le modèle du syndrome de l'X fragile, aussi modèle d'autisme. De plus, le modèle murin permet d'étudier à la fois les comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensori-moteurs que l'on peut retrouver chez les patients atteints de troubles du neurodéveloppement. Le syndrome de l'X Fragile est une maladie neurodéveloppementale, et les patients atteints d'une mutation sur le gène Pde2a présentent également des troubles du développement. Les animaux seront donc étudiés à différents stades du développement. Des tests seront réalisés au 7ème, 10ème et 14ème jour après la naissance, ce qui correspond à l'enfance chez l'humain. Puis nous réaliserons d'autres tests à 1 mois, ce qui correspond à l'adolescence. Enfin, nous réaliserons des tests à l'âge adulte d'une souris (à partir de 8 semaines). Cela permettra d'évaluer l'impact de l'extinction partielle du gène Pde2a au cours du développement, et d'identifier les moments clefs où la protéine PDE2A est impliquée dans la pathologie et où l'inhibition de Pde2 permettrait d'agir sur la pathologie.
Etude du rôle d’un récepteur dans un modèle de traumatisme crânien chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 716 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traumatisme crânien leur est provoqué sous anesthésie, certaines recevant en plus une injection intracisternale, suivi d'injections répétées et de prélèvements sanguins, pour étudier le rôle d'un récepteur dans les lésions de la substance blanche. Le porteur indique que le traumatisme peut réduire temporairement la prise de nourriture et provoquer une légère perte de poids récupérée en quelques jours. Il affirme que les mécanismes en jeu ne peuvent être reproduits in vitro et qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, les cerveaux étant prélevés après la mise à mort.
Objectifs
Le traumatisme crânien est un problème majeur de santé publique lourd de conséquences neurologiques et lésionnelles à court et long terme pour lequel il n’existe aujourd’hui aucun traitement. Ces conséquences tardives sont en grande partie reliées aux lésions de la substance blanche jusqu’ici largement sous-estimées et méconnues. La substance blanche contient essentiellement des cellules nerveuses entourées d'une gaine de myéline permettant la transmission des informations dans le cerveau. L'espoir d'améliorer le pronostic du traumatisme crânien repose sur la découverte des mécanismes impliqués dans les lésions de la substance blanche et les désordres neurocomportementaux conséquents. Parmi ces mécanismes, des études suggèrent le rôle de la neuro-inflammation dans les lésions de la substance blanche après un traumatisme crânien. La microglie est une cellule immunitaire du cerveau qui joue un rôle majeur dans la neuro-inflammation. Des études suggèrent que les débris de myéline induits par le traumatisme crânien pourraient activer à leur tour la microglie. Une fois activée, la microglie peut adopter 2 phénotypes distincts, c'est-à-dire qu'elle peut exercer des effets délétères, mais aussi des effets bénéfiques, et ceci, selon son environnement. Ainsi, des études ont rapporté aussi bien des effets pro- ou anti-inflammatoires des débris de myéline, mais à ce jour, aucun lien entre débris de myéline et activation microgliale n’a pu être mis en évidence dans le traumatisme crânien. De plus, la protéine étudiée, qui est notamment exprimée par les microglies, pourrait être impliquée dans la modulation des phénotypes microgliaux. Cependant, à ce jour, il n’existe aucune donnée sur l’implication de cette protéine dans les phénotypes microgliaux induits par les débris de myéline produits à la suite du traumatisme crânien. L'objectif de ce projet est donc d’étudier le rôle de la protéine d’intérêt dans la neuro-inflammation microgliale induite par des débris de myéline produits et les lésions de la substance blanche à la suite d’un traumatisme crânien chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intègre dans un projet plus large qui permettra (1) une meilleure caractérisation de la neuroinflammation et des lésions de la substance blanche induites par le traumatisme crânien et (2) de proposer une stratégie thérapeutique pour la réparation et la prévention des lésions de la substance blanche induites par le traumatisme crânien.
Procédures
• Un traumatisme crânien sera induit sous anesthésie générale. La réalisation de ce modèle de traumatisme crânien nécessite 10 minutes. L’anesthésie générale sera précédée de l’administration d’un analgésique 30 minutes avant par voie sous-cutanée. Cette injection sera réalisée sur animal vigile et prendra moins d’1 minute. Certaines souris recevront en plus une injection intracisternale tout de suite après le traumatisme crânien. Cette injection sera réalisée sous anesthésie générale et prendra moins d’1 minute. Toutes les souris soumises à un traumatisme crânien recevront 5 injections par voie sous-cutanée de sérum physiologique (2 fois par jour pendant 2 jours à compter du jour du traumatisme crânien) et 5 injections par voie sous-cutanée d’analgésique (2 fois par jour pendant 2 jours à compter du jour du traumatisme crânien). Ces injections seront réalisées sur animal vigile et prendront chacune moins d’1 minute. • Des prélèvements de sang seront réalisés chez toutes les souris du projet, soit 1 seule fois, soit 5 fois sur une période de 3 mois. Chaque prélèvement sera réalisé sur animal vigile en moins d’1 minute. • Des tests comportementaux seront réalisés 3 jours (score neurologique), 60 jours (tests de l’open-field et du labyrinthe de Barnes) et 90 jours (test du labyrinthe de Barnes) après le traumatisme crânien, mais également chez les souris contrôles n’ayant pas subi de traumatisme crânien. Le score neurologique, qui évalue les réflexes des souris, dure 2 minutes. Le test de l’open-field, qui évalue les comportements exploratoires des souris, dure 9 minutes. Le test du labyrinthe de Barnes, qui évalue l’apprentissage et la mémoire spatiale des souris, comprend une phase d'apprentissage durant 3 jours consécutifs (3 essais de 3 minutes maximum/jour ; le délai entre 2 essais est de 1 à 2 heures) avant de réaliser le test le 4e jour (une minute). • A la fin du projet toutes les souris seront mises à mort par exsanguination par perfusion intracardiaque de sérum physiologique sous anesthésie générale. La réalisation de cette perfusion nécessite 7-8 minutes. L’anesthésique sera administré sur animal vigile par voie intrapéritonéale en moins d’une minute et cette injection sera précédée 30 minutes avant de l’administration par voie sous-cutanée d’un analgésique en moins d’1 minute.
Impact sur les animaux
L'induction du traumatisme crânien peut entraîner une diminution temporaire de la prise alimentaire et d'eau (légère perte de poids durant les premières 48 h après le traumatisme crânien avec une récupération du poids initial au bout de 4 jours) . La contention des souris pour réaliser les injections sous-cutanées ou intrapéritonéales peut induire un stress correspondant à la durée du geste, c’est-à-dire moins d’1 minute.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux seront prélevés pour réaliser différentes analyses.
Remplacement
Les mécanismes impliqués dans les lésions cérébrales induites par le traumatisme crânien mettent en jeu plusieurs types cellulaires dans différentes structures cérébrales qu’il est impossible de reproduire in vitro. Il est donc indispensable d’avoir recours à l’animal, afin de reproduire la pathologie humaine. De plus, les déficits comportementaux et les lésions cérébrales ne peuvent être évalués chez l'animal entier.
Réduction
Le faible taux d'échec (10%) des gestes pour réaliser le traumatisme crânien, ainsi que la bonne connaissance de la temporalité des mécanismes induits après le traumatisme crânien (activation microgliale, démyélinisation, détection des débris de myéline, déficits comportementaux, lésions de la substance blache) permettront de réduire le nombre d'animaux au minimum. Notre recul sur le modèle de traumatisme crânine nous permettant de déterminer au plus juste la taille des groupes d’animaux à utiliser, aucun test statistique ne sera utilisé pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Ce nombre d'animaux sera suffisant pour appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions pour analyser les résulats obtenus.
Raffinement
L'eau et la nourriture seront fournies à volonté et le milieu sera enrichi par des cotons compactés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables, afin de limiter tout stress et modification de hiérarchie. Afin de s'assurer du bien-être animal, l'intervention chirurgicale permettant de réaliser le traumatisme crânien sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera donné en pré- et post-opératoire, afin de limiter la souffrance des animaux. La mise en place de points limites et l'observation du comportement des animaux permettront d'identifier toute souffrance et douleur, et d'entraîner une mise à mort anticipée, si nécessaire. Pour pallier la déshydratation pouvant survenir à la suite du traumatisme crânien, les souris recevront une injection de sérum physiologique par voie sous-cutanée, matin et soir, durant 2 jours, à compter du jour du traumatisme crânien. . De plus, afin de faciliter l’accès à la nourriture, quelques croquettes seront déposées directement sur le fond de la cage des souris durant 2 jours, à compter du jour du traumatisme crânien.
Choix des espèces
Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles de traumatisme crânien et offre un large répertoire d’évaluation comportementale. De plus, cette espèce nous permet d’évaluer le rôle de notre protéine d'intérêt grâce à l'utilisation de souris transgéniques. Le traumatisme crânien sera réalisé chez des souris jeunes (6-8 semaines), puisque c'est un évènement fréquent dans cette tranche d'âge chez l'Homme. Les déficits comportementaux seront évalués 3 jours, 2 mois et 3 mois après le traumatisme crânien.
Imagerie de l’activation vasculaire dans les modèles de neuroinflammation
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection déclenchant une maladie proche de la sclérose en plaques, responsable d'une paralysie de la queue et des membres postérieurs, avant une imagerie de l'inflammation cérébrale. Le porteur indique suivre la douleur par une grille et un "grimace scale", et retirer les animaux perdant plus de 15 % de leur poids. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux vivants n'apporterait le même niveau d'information et qu'il n'existe pas de modèle fiable sur des espèces jugées moins sensibles.
Objectifs
L’imagerie médicale est couramment utilisée en clinique dans le diagnostic et le suivi des patients atteints de pathologies cérébrales. L'objectif de ce projet est d'utiliser un nouveau type d'imagerie médicale afin de détecter de manière précise l'inflammation cérébrale. Notre laboratoire est spécialisé dans l’étude de l’inflammation du cerveau. Cettenouvelle technique d'imagerie consiste en l’injection intraveineuse d'un agent de contraste spécifique de la protéine vasculaire étudiée. Ici, les protéines étudiées sont celles impliquées dans l’infiltration des cellules immunitaires à travers la paroi des vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
L'inflamamtion du cerveau est présente dans de nombreuse pathologies, comme la sclérose en plaques, les accidents vasculaires cérébraux et la maladie d'Alzheimer. Le développement de l'imagerie de l'inflammation cérébrale permettrait une meilleure prise en charge des patients atteints de ces différentes maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux types d'interventions: (1) Induction d'un modèle de sclérose en plaques. (2) Imagerie de l'inflammation cérébrale.
Impact sur les animaux
L’induction du modèle de slcérose en plaques s’effectue via l’injection d’un cocktail induisant l’apparition d’une réaction auto-immune, responsable à terme d'une paralysie de la queue et des membres postérieurs. Un score clinique neurologique sera effectué tous les jours (dès le 1er jour jusqu’au jour de l’euthanasie) afin d’évaluer la douleur et l’atteinte neurologique des souris. Les animaux seront également pesés tous les jours pour surveillance du poids et retrait de l’étude si une perte de plus de 15% est observée par rapport au poids initial. Les mesures pour réduire au maximum toute forme d’inconfort et de douleur sont également le suivi basé sur le "grimace scale", une couverture analgésique suffisante en période pre et post induction, l'hébergement en petits groupes sociaux stables avec un enrichissement minimum (un carré de coton, dôme en carton, paillettes). Les animaux seront maintenus dans des conditions optimales d’hébergement, dans un environnement stabilisé en température, hygrométrie, luminosité, et durée du cycle de lumière.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses de microscopie.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. En effet, la souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans la l'inflammation cérébrale, grâce à différents modèles bien caractérisés comme celui de la sclérose en plaques utilisée dans ce projet. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables de l'inflammation rencontrée chez les patients. Enfin, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera à volonté. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post induction et un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires desvaisseaux cérébraux sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l'efficacité de l'imagerie dans la détection de l'activation vasculaire dans les modèles d'inflamamtion cérébrale. Le stade de développement des animaux est de 2 à 3 mois. Il est classiquement décrit que le modèle de sclérose en plaques ne peut-être induit que dans cette fenêtre de temps, qui correspond à la pathologie humaine qui touche de jeunes adultes.
Implication fonctionnelle de diverses structures cérébrales dans les troubles anxio-dépressifs liés à une douleur chronique par constriction du nerf sciatique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une constriction du nerf sciatique et des chirurgies cérébrales avec implantation d'une fibre optique, puis des tests de douleur et des tests anxio-dépressifs, pour étudier les structures cérébrales liées à la douleur chronique. Le porteur indique que cette douleur ne peut pas être soulagée "car c'est l'objet de l'étude" et que les animaux vont développer des troubles anxio-dépressifs. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation comportementale sur l'animal vigile.
Objectifs
La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux responsable des sensations somatiques. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur (anxiété, dépression). En effet, environ 50% des patients présentent ces deux symptômes associés : douleur chronique et troubles de l’humeur. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de ce lien entre ces 2 pathologies (douleur et troubles de l’humeur) restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Chez la souris mâle des données de la littérature suggèrent que plusieurs structures cérébrales clés seraient impliquées dans les conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique. Les données clinique chez l’homme mais également préclinique chez l’animal montrent que non seulement la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures cérébrales bien précises. Mais de nombreuses données de la littérature montrent également d’importantes différences dans la sensibilité à la douleur entre les hommes et les femmes ; données également observées chez les rongeurs. De plus, la prévalence des troubles anxieux et dépressifs, dans la population ainsi que chez les patients douloureux chronique, présente également des différences intersexuelles. De telles différences suggèrent très probablement des mécanismes spécifiques à chaque sexe. Ainsi, bien que les régions cérébrales impliquées dans les troubles de l’humeur provoqués par la douleur chronique soient sans doute les mêmes, les altérations des réseaux que ces structures forment sont sans doute différentes chez des individus mâles et femelles. Le but de ce projet est donc de comparer les changements anatomo-physiologiques éventuels entre mâles et femelles dans un modèle spécifique de douleur neuropathique.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est d'étudier les modifications d’activité et d’interaction dans trois régions cérébrales pouvant être à l’origine du lien entre la douleur chronique et les troubles de l’humeur. A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de détailler pour la première fois les adaptations d’activité cérébrale liées au développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques (structures cérébrales d'intérêts) spécifiques au sexe et donc potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.
Procédures
Les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Ils subiront une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 10 min environ et pour certains à 2 chirurgies stéréotaxiques avec injection de virus puis implantation de fibre optique d’une durée de 45 min environ. Ces 3 chirurgies se dérouleront sous anesthésie, soit 3 anesthésies générales. Les animaux subiront 3x le test de douleur d'une durée de 20 minutes environ avec 10 min d'habituation) avant la chirurgie neuropathique puis deux fois par semaine (délai d’1 semaine minimum après les chirurgies avant la reprise des tests) jusqu’à la fin du protocole expérimental soit un total de 15 tests maximum. Ils subiront également 1 semaine après la 2ème chirurgie stéréotaxique, 5 tests anxio-dépressifs d'une durée de 5 à 10 min selon le test (avec 24h minimum entre chaque test).
Impact sur les animaux
Il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies neuropathique et d’injection cérébrales peuvent induire une inflammation et/ou infection et/ou une perte de poids de l’animal qui seront suivi et pris en charge. Les animaux vont développer des troubles anxio-dépressifs, objectifs de l'étude.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses anatomiques des structures cérébrales impliquées.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse fonctionnelle du développement des troubles anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique nécessite une observation comportementale réalisée sur l’animal vigile.
Réduction
Afin d’obtenir des résultats fiables et robustes à l’issue de l’étude tout en tenant compte des variabilités entre individus, le nombre d’animaux utilisé a été déterminé statistiquement. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Pour cette raison une même cohorte d’animaux sera étudiée et caractérisée au niveau comportemental et émotionnel, puis fera l’objet d’investigations anatomiques.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des enrichissements sont placés dans la cage pour favoriser le bien-être animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Des points limites ont été établis pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Etude des conséquences des troubles métaboliques dans le contexte de l’accident vasculaire cérébral dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
1 188 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après trois mois de régime enrichi en graisses, elles subissent une chirurgie provoquant un accident vasculaire cérébral, puis des tests de comportement et de l'imagerie, pour étudier la réparation cérébrale liée à l'âge et aux troubles métaboliques. Le porteur indique que le modèle induit une douleur peropératoire, une perte sensorimotrice, une prise de poids importante et une possible déshydratation. Les bénéfices pour l'être humain restent au conditionnel, tandis que le porteur affirme que l'étude ne s'envisage que dans un "organisme entier" et juge le passage à l'animal "indispensable".
Objectifs
Cette étude a pour objectif de caractériser le rôle de l’âge et des perturbations métaboliques qui font partie des facteurs de risque bien identifiés dans les pathologies cardiovasculaires, première cause de mortalité dans le monde dont l’accident vasculaire cérébral (AVC) fait partie. L’étude s’intéressera particulièrement à comprendre les mécanismes impliqués dans la réponse et la réparation cérébrale et vasculaire suite à un AVC, en prenant en compte ces facteurs de risques. A terme, l’objectif est d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour offrir des possibilités adaptées d’améliorer les résultats cliniques suite à un AVC.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités). Il pourra en découler l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Après 3 mois d'alimentation enrichie en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (1 injection de glucose et prélèvement de 5 gouttes de sang pour mesure de la glycémie toutes les 30 min pendant 2h). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique en utilisant un modèle in vivo d'ischémie cérébrale (chirurgie sous analgésie et anesthésie gazeuse d'une durée de 15+5 min, suivie de 2 injections d'analgésiques 2 fois par jour pendant 3 jours). Les effets du régime sur la réponse à l’ischémie seront analysés 48h, 7 et 21 jours après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement (3 tests d'une durée de moins d'1 min par test) et de l’imagerie (méthode non invasive).
Impact sur les animaux
L’âge et le changement de l’alimentation induit une prise de poids qui est conséquente (animaux de 35 – 60g). La douleur induite par l’injection dans l'abdomen de glucose peut également être une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire une étude protéique, moléculaire et de tri cellulaire.
Remplacement
Le projet a pour but d’étudier l’ischémie cérébrale, qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques dons le calcul de puissance est effectué en utilisant le logiciel in vivoStat. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu de vieillissement vasculaire et un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC. De plus, le plus grand nombre de tissus et organes d’un animal mis à mort sera systématiquement prélevé et stocké pour l’utilisation de projets futurs sur les rôles de ces perturbations métaboliques.
Raffinement
Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique (buprénorphine) en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 72h. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse par isoflurane). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score.
Choix des espèces
Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle murin pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Après une étude in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions angiogéniques et sécrétoires des cellules endothéliales, le projet a pour but maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale, représentant un enjeu majeur de santé publique, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il est donc indispensable de passer à des études chez l’animal. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’AVC et du vieillissement vasculaire. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte avec des facteurs métaboliques aggravant comme le diabète, les animaux seront utilisés au stade adulte après un régime conduisant à des perturbations métaboliques systémiques en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime (âge nécessaire pour avoir un vaisseau mature et qui peut subir un vieillissement vasculaire semblable au vieillissement vasculaire humain).
Rôle de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale dans le contrôle de la prise alimentaire, étude nutritionnelle.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
258 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale unique d'un agent modifiant les lipides sanguins puis d'un anesthésique, avant la mise à mort pour prélever le cerveau et analyser une réaction inflammatoire survenant après un repas gras. Le porteur limite les nuisances à la contention et à cette injection unique. Le bénéfice annoncé, mieux comprendre l'appétit et des troubles comme la boulimie ou l'anorexie, reste éloigné de ce protocole mécanistique.
Objectifs
L’existence de la réaction inflammatoire postprandiale (PIR) systémique est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme et les mécanismes biologiques sous-jacents induisant la PIR sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Récemment, l’équipe a montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules spécifiques chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas, et elle se produit dans une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. Les médiateurs biologiques qui déclenchent la PIR cérébrale ne sont pas identifiés. Une hypothèse serait que les lipides nutritionnels qui se retrouvent dans la circulation générale après digestion et absorption soient capables de stimuler la réponse des cellules du cerveau. La stratégie consistera à manipuler l’hypertriglycéridémie postprandiale et à mesurer la réponse cellulaire cérébrale. L’hypertriglycéridémie sera suivie par analyse biochimique sanguine, et la réponse cellulaire cérébrale sera mesurée par microscopie sur coupes de cerveau. Nous utiliserons : 1) une solution de nutrition parentérale à base d’huile de soja, qui permettra d’élever artificiellement les triglycérides plasmatiques en l’absence de prise de repas, 2) un agent pharmacologique qui permettra d’élever les lipides sanguins en l’absence de prise de repas, et 3) un agent pharmacologique qui limitera l’hypertriglycéridémie postprandiale. Ces agents pharmacologiques seront administrés par voie intrapéritonéale, qui constitue une voie d’administration adaptée pour ces études mécanistiques. Une étude dose-réponse au cours du temps sera réalisée aux temps : T0, T1h, T2h, et T3h. Les cerveaux de ces animaux seront étudiés après mise à mort afin d’analyser la réponse cellulaire cérébrale dans différentes conditions. 258 souris C57Bl6J seront utilisées dans ce projet.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de mieux comprendre les caractéristiques de la PIR cérébrale et donnera des informations nouvelles sur l’intégration cérébrale de l’état métabolique chez l’individu obèse. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des contentions et des injections intrapéritonéales d’agent pharmacologique et d’anesthésique avant la mise à mort. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal. Les effets des traitements seront mesurés trois heures après injection.
Impact sur les animaux
Les expériences pharmacologiques durent 3 heures au maximum et ne génèrent pas de souffrance chronique. La contention des animaux et les injections intrapéritonéales d’agent pharmacologique et d’anesthésique avant la mise à mort représentent les seules nuisances sur les animaux dans ce projet. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal.
Devenir
Les 258 souris seront toutes mises à mort afin de prélever le cerveau en vue d’analyses histologiques.
Remplacement
Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.
Réduction
La procédure décrite (mise en place de conditions prandiales définies) a été optimisée, standardisée et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet de mener des études conformes sur des effectifs réduits. Dans ce projet nous avons réduit à 1 au lieu de 2, les lots expérimentaux contrôles en condition préprandiale, sans exposition ultérieure à la nourriture. En effet ce groupe peut être mis en commun pour les expériences 2 et 3 (détaillées dans les procédures 2 et 3). Bien que les procédures 2 et 3 soient similaires d’un point de vue technique, elles sont dissociées pour des raisons pratiques (gestion et traçabilité des individus plus facile dans le projet global).
Raffinement
Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les animaliers, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes mâles, âgées de 8 semaines. Cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé
Étude de l’efficacité de vecteurs viraux (AAV) sur un modèle d’épilepsie du lobe temporal (ELT) chez la souris SWISS
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une épilepsie chronique leur est provoquée par des injections répétées, suivies d'une évaluation comportementale non précisée, d'une chirurgie d'injection intracérébrale, de l'implantation d'électrodes puis d'une perfusion terminale pour prélever l'encéphale, afin de tester une thérapie génique par vecteurs viraux. Le porteur décrit les crises comme "dommageables au bien-être animal" et prévoit une mise à mort dès l'atteinte d'un point limite. Les bénéfices annoncés pour les patients pharmacorésistants restent au stade de la preuve de concept préclinique.
Objectifs
L’épilepsie chronique représente une des causes majeures de troubles neurologiques dans le monde, dont le type le plus répandu est l’épilepsie du lobe temporal (ELT). Elle se caractérise par des crises récurrentes et spontanées provoquées par une hypersynchronie excessive et incontrôlée de l’activité neuronale. Les molécules pharmacologiques antiépileptiques actuellement utilisées visent essentiellement à soulager les symptômes associés à l'épilepsie chronique en réajustant l'équilibre entre excitation et inhibition de l'activité neuronale. Cependant, ces traitements n'agissent pas directement sur les processus sous-jacents responsables de la progression de la pathologie, dont l'origine provient souvent de gènes défaillants. Le projet a pour objectif de tester l'effet de nouveaux traitement basé sur la thérapie génique dans un modèle in vivo de souris reproduisant fidèlement les manifestations histologiques et comportementales d'ELT observés chez les patients. Le projet est focalisé sur l'une des structures du lobe temporal, l'hippocampe et/ou le cortex, qui jouent un rôle central dans la génération des crises d'épilepsie et les troubles du comportement associés. Ainsi, l'analyse des effets bénéfiques de la thérapie génique sur les souris épileptiques seront réalisés à partir d’analyse comportementales, électroencéphalographiques et histologiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements basés sur la thérapie génique sur les troubles électroencéphalographiques, les troubles comportementaux associés et les altérations histologiques dans un modèle rongeur d'épilepsie du lobe temporal. Une fois la preuve de concept validée à partir de ces études pré-cliniques, ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être proposées pour des essais cliniques chez des patients pharmacorésistants souffrant d'épilepsie chronique.
Procédures
Au cours de ce projet, les animaux subissent 4 types d’intervention. Durant la 1ère intervention du protocole, les souris subissent une série d'injections (4-6) par voie intrapéritonéale de plusieurs molécules afin d'induire un état d'épilepsie chronique (durée de l'intervention: 2h30-3h30 environ). Les animaux sont ensuite immédiatement hébergés dans les cages enrichies de manière individuelle pour toute la durée du protocole expérimental (i.e. 4 mois). Après une période de 2 mois, la seconde intervention consiste à effectuer l'évaluation comportementale des souris par des tests simples, spontanés, non-invasifs et non associés à une privation d'eau ou de nourriture (durée d’intervention : 20 min environ). Une semaine après, durant la 3ème intervention, ces mêmes souris subissent une chirurgie dans le but de réaliser des injections intracérébrales du composé thérapeutique à tester. Deux à trois semaines plus tard, les souris sont implantées avec une électrode afin de réaliser des enregistrements électroencéphalographiques. A la dernière étape du protocole expérimental, l'animal est euthanasié par une anesthésie profonde terminale (par perfusion transcardiaque : durée de 30 à 60 min) afin de prélever l'encéphale.
Impact sur les animaux
L’ensemble des nuisances ou effets indésirables attendus peuvent être résumés selon les points suivants: - Le maintien des souris de manière individuelle pour observation durant de 2h30 à 3h30 pouvant générer de l'inconfort et du stress – Des injections répétées en intrapéritonéal pouvant induire du stress et de la douleur ; afin de réduire la souffrance, la zone injectée est préalablement traitée en topique avec une crème anesthésiante de type emla® - L'expression de crises d'épilepsie, condition dommageable au bien-être animal - Des anesthésies et interventions chirurgicales (craniotomie) afin de réaliser des injections intracérébrales et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux – Les sutures de la peau du crâne pouvant provoquer des démangeaisons lors de la cicatrisation.
Devenir
Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.
Remplacement
L'objectif du projet étant de tester l'efficacité du candidat médicament sur une échelle multidimensionnelle et notamment sur les mécanismes pathologiques handicapants (crises, altérations du comportement) de l'épilepsie du lobe temporal afin d'améliorer la qualité de vie des patients ainsi que sur les caractéristiques histologiques, il n'est donc pas possible de substituer les souris par des modèles alternatifs (e.g. modèles in vitro). De plus, les rongeurs sont un excellent outil pour l'analyse comportementale (mesures des performances cognitives, de l'humeur et sensorimotrices), et sont un très bon modèle animal pour analyser les mécanismes physiopathologiques à la base de maladies neurologiques humaines, en l'occurrence l'épilepsie du lobe temporal. En ce qui concerne cette dernière pathologie, les rongeurs reproduisent fidèlement les caractéristiques cardinales de ce type d'épilepsie chez l'homme.
Réduction
Le protocole choisi pour induire une épilepsie chronique est basé sur une méthodologie récemment raffinée et publiée ayant permis une forte diminution du taux de mortalité lors de l’induction de la pathologie. Cela permet donc d'augmenter très significativement le taux de réussite et de limiter de façon importante le nombre d'animaux utilisé. Par ailleurs, chaque lot de souris utilisé pour ce projet subit toutes les étapes expérimentales à savoir l'induction de l'épilepsie chronique, l'évaluation comportementale, les injections intracérébrales, les enregistrements électroencéphalographiques, ainsi que les prélèvements de l'encéphale. Cela permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire et d'optimiser l'utilisation de chaque souris. Par ailleurs, le calcul du nombre de sujets nécessaires (calcul de N) est basé sur les données antérieures obtenues en prenant en compte les moyennes et déviations standards mesurées pour chaque paramètre. Ainsi, l'utilisation d'un design expérimental optimisé incluant des analyses statistiques appropriées permette de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
La planification séquentielle du travail avec réévaluation constante de la stratégie en fonction des résultats. L’utilisation d’un nombre minimal d’animaux par groupe en s’appuyant sur des données statistiques. L’analgésie locale et anesthésie générale au moment des chirurgies et mesures particulières pour en minimiser l’impact (administration d’anti-douleurs, réveil sous source de chaleur, réhydratation, gel hyper-nourrissant mélangé avec des croquettes accessibles à hauteur de souris, pesée, enrichissement de l’environnement…). Après l’induction de la crise, l'état de récupération dans les jours qui suivent est étroitement surveillé (récupération sous source de chaleur, réhydratation, gel hyper-nourrissant mélangé avec des croquettes accessibles à hauteur de souris, pesée et récupération comportementale, enrichissement de l’environnement…). Les animaux ayant subi une chirurgie et/ou présentant une épilepsie chronique sont maintenus dans des cages individuelles enrichies afin de diminuer le risque de blessures inter individus et les souffrances associées. La formation continue du personnel scientifique et de soin permet de repérer immédiatement les premiers signes cliniques d’inconfort chez les animaux. La mise en place d’une grille de suivi, ainsi que la prévision d’actions spécifiques dès les premiers signes d’inconfort ou de douleur (voire l’euthanasie, selon leur gravité) complètent le dispositif. Les animaux sont conservés le minimum de temps nécessaire au projet et des points limites spécifiques à chaque procédure sont appliqués tout au long du projet.
Choix des espèces
Les souris modèles d'épilepsie manifestent des symptômes comparables à ceux des patients souffrant d'épilepsie du lobe temporal (génération de crises, troubles cognitifs et de l'humeur) mais reproduisent également des manifestations histologiques d'épilepsie du lobe temporal (mort neuronale, remodelage anormal du réseau, etc.). Ils sont donc un excellent modèle pour cette pathologie humaine. En outre, l'utilisation spécifique de souris permet de tirer avantage de nombreuses lignées transgéniques ouvrant de nombreuses possibilités pour la poursuite du projet.
Etude comportementale dans un modèle de lésions cérébrales associées à la prématurité chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
64 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de lésions cérébrales reproduisant l'encéphalopathie du prématuré, elles subissent des tests d'activité circadienne, d'anxiété, de mémoire et de capacités cognitives, avec isolement, eau acidifiée et prélèvement sanguin, avant la mise à mort pour analyser le cerveau en IRM. Le porteur étudie deux âges, 7 et 16 mois, pour observer un vieillissement précoce. Les retombées annoncées, prévention et pistes thérapeutiques, restent renvoyées au long terme.
Objectifs
La prématurité est la principale cause de décès et de handicaps chez les nouveau-nés. Dans les pays industrialisés, en raison de l'amélioration des soins intensifs néonataux, le nombre des nourrissons de très faible poids de naissance qui ne survivent pas au-delà de l’enfance est en baisse. Cependant, le cerveau de ces prématurés reste extrêmement vulnérable et peut ainsi présenter des lésions. L’inflammation périnatale que subissent dans 20 à 40% des cas les enfants prématurés, et la grande vulnérabilité des cellules cérébrales en développement à ce stress inflammatoire est à l’origine de l’apparition de la plupart de ces lésions. Elles induisent des handicaps moteurs, des déficits cognitifs et des troubles comportementaux qui persistent à l’âge adulte qui sont regroupées sous le terme d' "Encéphalopathie du Prématuré". Certaines cellules cérébrales, appelées cellules gliales, sont les relais majeurs des modifications environnementales dans le cerveau, dont les réponses inflammatoires. Ces cellules résidentes du système nerveux central, analysent de manière continue leur environnement et participent à la stabilisation de ce dernier. On sait aujourd’hui que les mécanismes qui permettent la maturation cérébrale sont les mêmes que ceux qui sont perturbés au cours du vieillissement. Nous cherchons donc à comprendre l’impact de l’inflammation périnatale sur le vieillissement en émettant l'hypothèse que celle-ci peut être à l'origine d'un vieillissement prématuré. Dans ce projet nous allons donc caractériser le comportement des souris à 7 mois ce qui correspond à un temps dit de « milieu de vie » auquel on peut s’attendre à l’apparition de premiers signes de vieillissement prématurés et à un âge avancé, c’est-à-dire à 16 mois où un phénotype clair de vieillissement est attendu. Nous étudierons à ces deux âges l’activité circadienne des animaux, leur comportement de type « anxieux », leurs capacités mnésiques et cognitives. Des prélévements sanguins seront réalisés et envoyés au partenaire pour des dosages complémentaires. A la fin de ce projet les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir analyser leurs cerveaux en IRM.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra la caractérisation des conséquences à long terme de l'encéphalopathie du prématuré et ainsi la mise en place d'outils de prévention chez les individus concernés. A long terme, nous pouvons penser que ce projet permettra l’amélioration du pronostic de cette pathologie et la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients.
Procédures
Les tests comportementaux auront les durées suivantes : -Activité circadienne des animaux durée du test : 32h - Test d’anxiété durée du test : 5 minutes - Test de mémoire : 15 +10 + 10 minutes - Test capacités cognitives : 21 jours Un prélèvement sanguin sera effectué en fin d’étude pour analyser des paramètres biochimiques. Ces prélèvements, un par souris, se font en quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances seront les suivantes : pour le test des capacités cognitives les animaux auront des conditions d’hébergements non standards avec un accès à de l’eau acidifiée pendant 21 jours. Pour connaitre l’activité circadienne des animaux, ils seront isolés pour une période de 32h. Enfin, les animaux auront un stress léger lié à l’anesthésie qui précédera le prélèvement sanguin.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses IRM.
Remplacement
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'implication de la neuro-inflammation dans le développement d'un vieillissement précoce. Cela suppose des interactions complexes entre différentes cellules du système nerveux central. Il n'est pas possible de reproduire ces interactions complexes in vitro ou dans un système de cellules en culture, et il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal pour reproduire ces interactions complexes. A cet égard la souris est un modèle pertinent, car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme.
Réduction
Dans un souci de réduction, le nombre d'animaux pour chaque expérience sera limité à celui nécessaire à la validation d'un effet significatif. Nos études antérieures nous montrent qu’un nombre minimal de 32 animaux par groupe est nécessaire pour obtenir une réponse significative et peu de variabilité. En fonction de la répartition des données nous utiliserons un test paramétrique ou non paramétrique pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (Avec inflammation et Contrôles sans inflammation) : activité circadienne, niveau d’anxiété, capacités mnésiques et cognitives.
Raffinement
Afin de réduire l'inconfort des animaux et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupération, d’au minimum une semaine, entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Chaque animal sera ainsi suivi avant les expériences afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation voire l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Afin d'étudier les interactions entre les cellules du système nerveux, il est nécessaire d'utiliser une espèce animale qui présente un système nerveux central proche de celui de l'homme. La souris remplit très bien cette condition. Dans ce modèle d'inflammation périnatale un vieillissement précoce est attendu. Nous nous intéressons ainsi à 2 temps de vie chez les animaux : 7 et 16 mois de vie. Le temps de 7 mois est ainsi communément admis comme étant un temps de "milieu de vie" (40-45 ans). Alors que le temps 16 mois correspond à un âge déjà avancé (80 ans).
Rôle de la néoglucogenèse intestinale dans le renforcement comportemental de l’anorexie mentale dans un modèle de souris en restriction alimentaire avec activité physique volontaire.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
240 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Soumises à une restriction alimentaire allant jusqu'à 50 % de leur ration pendant trois semaines avec accès à une roue d'exercice, elles subissent des injections intrapéritonéales et des prélèvements de glycémie, avant une mise à mort par perfusion d'un fixateur sous anesthésie pour prélever les organes. Le porteur reconnaît que la restriction induit une sensation de faim et choisit des femelles jeunes pour mimer l'anorexie mentale humaine. Le bénéfice annoncé, mieux prendre en charge la maladie, reste hypothétique face à ce modèle de privation alimentaire imposée.
Objectifs
L’anorexie mentale (AM) est une maladie qui touche majoritairement les jeunes filles et les femmes, et se caractérise par une prise alimentaire très diminuée, souvent associée à une activité physique exagérée et une préférence pour une alimentation riche en protéines. Beaucoup d’études se focalisent sur les aspects psychiatriques de la maladie, mais il est également intéressant d’en explorer les aspects métaboliques afin de mieux traiter, voire prévenir, cette maladie. En particulier, les patients atteints d’AM maintiennent une glycémie proche de la normale et un poids faible mais constant, malgré un très faible apport calorique et une forte dépense énergétique, ce qui suggère une forte adaptation de leur métabolisme vers la conservation de l’énergie. Nous proposons dans cette étude que la production endogène de glucose par la voie de la néoglucogénèse joue un rôle fondamental dans cette adaptation : il s’agit de la formation de glucose à partir de substrats non glucidiques (phénomène qui entre normalement en jeu au cours d’un jeûne) par le foie essentiellement, mais aussi par les reins et l’intestin. Nous testerons l’hypothèse du rôle « renforçateur comportemental » de la néoglucogénèse intestinale (NGI) dans un modèle de souris femelles qui réplique les aspects métaboliques de l’AM : faible prise alimentaire et exercice physique volontaire, en imposant une restriction alimentaire aux souris et en leur laissant un libre accès à une roue d’exercice.
Bénéfices attendus
Une meilleure compréhension des mécanismes qui permettent de maintenir le poids et la glycémie de personnes en situation d'anorexie mentale pourrait déboucher sur une meilleure prise en charge tant sur le plan médicamenteux que sur les recommandations nutritionnelles et d'hygiène de vie. En effet un régime riche en protéines stimule la production intestinale de glucose, et nous pensons mettre en évidence également que l'exercice physique stimule cette voie.
Procédures
Procédures 1 à 4 : les animaux subiront une restriction alimentaire, pendant 3 semaines. Procédure 3 : les souris seront mises à mort par perfusion transcardique d'un produit fixateur, le paraformaldéhyde 4%, sous anesthésie générale (le décès survient en 1 à 2 minutes). Procédure 4 : les souris subissent 3 tests fin d 'évaluer l'homéostasie glucidique, ces tests consistent à un suivi de la glycémie (prélèvements sur animaux vigiles) après une injection intrapéritonéale de pyruvate, glycérol ou glutamine, ces différents tests seront réalisés avec au minimum quatre jours d'intervalle. Les tests durent 120 minutes entre l'injection du produit et le dernier prélèvement de sang pour la glycémie.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont essentiellement liées à la restriction alimentaire susceptible de conduire à une sensation de faim. Cependant la restriction se fera de manière progressive avec une restriction de 30% de leur ration calorique pendant 3 jours, puis passage à 50% pendant 3 semaines. Les animaux subiront également des injections intrapéritonéales qui provoqueront une douleur légère et de faible durée, sans conséquences indirectes du produit injecté, puis des prélèvements de sang (microgouttes) pour mesurer la glycémie.
Devenir
mise à mort pour prélèvements d'organes.
Remplacement
Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôlent les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiables et robustes, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible. Nous réaliserons des ANOVA à 2 facteurs pour les tests avec mesures répétées au cours du temps, avec une analyse post-hoc (Bonferroni). Lorsque les statistiques concerneront 2 moyennes (le poids par exemple, ou la prise alimentaire), nous utiliserons un test de Student après vérification de la normalité de nos échantillons.
Raffinement
Les animaux seront maintenus dans des milieux enrichis (nids végétaux, tubes) ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement afin d'identifier les animaux en souffrance.
Choix des espèces
Les modèles précliniques de rats et de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l’humain de fortes homologies dans les régulations physiologiques, en particulier le contrôle de l’homéostasie glucidique. Npus utiliserons ici des souris femelles "jeunes adultes" (8 semaines au début des procédures) afin de mimer la pathologie humaine de l'anorexie mentale qui touche essentiellement des jeunes filles.
Le cervelet comme cible thérapeutique pour la maladie de Charcot
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une neurochirurgie d'injection dans le cervelet, un suivi moteur par deux exercices, puis un prélèvement de tissus nerveux après une dose létale d'anesthésique, pour évaluer une thérapie génique dans la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur emploie trois lignées transgéniques et affirme que ce réseau neuronal ne peut être reproduit in vitro dans une boîte de Petri, concluant que le modèle vivant reste une étape "requise" vers la clinique. Les retombées diagnostiques et thérapeutiques annoncées sont renvoyées au conditionnel et au long terme.
Objectifs
La maladie de Charcot ou sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable causée par la perte des motoneurones du cerveau et de la moelle épinière. Chaque année, environ 3 nouveaux cas pour 100 000 personnes sont touchés par la maladie. La maladie de Charcot débute généralement entre 50 et 70 ans par une faiblesse musculaire, évoluant rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire qui conduit au décès dans les 3 ans suivant l'apparition des symptômes. Malgré l'explosion des connaissances sur les processus pathologiques centrés autour du motoneurone, d’autres faisceaux d’évidences suggèrent que la maladie est multi-systémique et mettrait en jeu d’autres régions du système nerveux. Des études d’imagerie clinique chez les patients ont révélé des défauts de structure dans le cervelet. Cette structure cérébrale intègre les informations sensorielles et motrices provenant de la moelle épinière et différentes aires du cerveau pour réguler finement les commandes motrices. Curieusement, l’implication du cervelet a été largement sous-estimée dans la Maladie de Charcot alors que ses fonctions sont centrales dans les traits cardinaux de la maladie. Notre objectif est de comprendre le rôle du cervelet dans la pathologie et d’évaluer son potentiel comme cible thérapeutique. A cette fin, nous aborderons cette problématique par une description précise des défauts de connections entre le cervelet et les zones motrices dans deux modèles murins de la maladie. Nous compléterons cette étude neuroanatomique par une étude fonctionnelle pour mieux comprendre quels sont les défaut de communication électrique entre le cervelet et les zones motrices de la moelle épinière. Notre dernier objectif est d’évaluer par une approche de thérapie génique l’effet bénéfique de cibler le cervelet dans la maladie de Charcot. Le but de ce projet est donc de fournir un nouvel éclairage sur la maladie en identifiant un nouveau système de communication neuronal dont les défauts peuvent expliquer certains traits de la pathologie et donc offrir de nouvelles perspectives aussi bien diagnostics que thérapeutiques.
Bénéfices attendus
L’identification de nouveaux réseaux de communication neuronale qui participent aux dysfonctionnements moteurs dans la maladie de Charcot offre des possibilités pour améliorer le diagnostic et/ou le pronostic de la maladie chez l’homme. Cibler par imagerie ou conduire des tests fonctionnels chez les patients qui visent des liens entre le cervelet et les zones motrices affectées directement dans la maladie de Charcot permettra d’avoir un tableau plus complet de la maladie. Les bénéfices de cette étude présentent donc un potentiel clinique. Ce projet propose de faire progresser nos connaissances scientifiques sur cette pathologie qui se révèle particulièrement complexe. Notre connaissance encore incomplète de la pathologie explique pour une grande part les nombreux échecs thérapeutiques rencontrés chez le patient jusqu’à présent. Notre projet propose d’explorer un réseau neuronal jusque-là sous-estimé. Mieux comprendre la pathologie dans ses interactions à longue distance entre différentes zones cérébrales signifie également offrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre projet explore une approche de thérapie génique, qui a un fort potentiel clinique comme l’illustre l’efficacité de la thérapie génique appliquée à l’amyotrophie spinale, une maladie infantile du motoneurone. L’utilisation de deux modèles génétiques différents de la maladie est un point fort de cette étude en mimant l’hétérogénéité étiologique, histopathologique et clinique de la maladie de Chacot. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et potentielles applications dans deux contextes génétiques différents. Notre projet s’inscrit dans un consortium composé également de cliniciens qui mènent en parallèle une étude sur le cervelet chez les patients. La mise en commun des connaissances fondamentales et cliniques est un atout pour faire progresser dans les prochaines années les aspects diagnostics, pronostics et à plus long terme thérapeutiques. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et potentiellement un/des dépôts de brevet.
Procédures
Le projet propose de délivrer des informations thérapeutiques dans une zone du cerveau, le cervelet. Les procédures nécessitent une neurochirurgie qui permet de délivrer des agents thérapeutiques dans le cervelet. Nous délivrons alors des anesthésiques et analgésiques chimiques, ou encore une solution de réhydratation aux animaux. Pour cela des injections sont réalisées à l’aide d’une seringue et d’une aiguille, avec au préalable un traitement avec d’un analgésique cutané local. Ces procédures sont rapides et nécessitent de l’endormissement au réveil de l’animal entre 10 et 15 min. Afin de déterminer un effet thérapeutique du traitement, les capacités motrices des souris atteinte de la maladie de Charcot, sont suivies par des tests de comportements simples, non invasifs, non douloureux, ne nécessitant pas de privation de nourriture. Deux exercices moteurs seront ici réalisés pour définir les capacités à effectuer des activités motrices. Chaque test prend moins de 5 min par souris. Notre étudions dans notre approche l’état des réseaux de neurones qui contrôlent ces activités motrices. Nous avons besoin de réaliser des études de localisation des neurones. A cette fin, nous devons réaliser des prélèvements de tissus sur des animaux ayant au préalable reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique chimique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal. Des souris pourront se trouver hébergées individuellement, dans un environnement enrichie amplifié pour une durée de 21 jours.
Impact sur les animaux
La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable dont l’issue est inexorablement fatale. Les modèles murins que nous utilisons ont été très bien caractérisés dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation de la règle des 3Rs. Le trait commun de la pathologie chez ces 3 lignées de souris modèles de la maladie est la diminution sélective des capacités motrices. Ces trois modèles présentent donc un phénotype avec une atteinte motrice variable. Les modèles de la maladie de Charcot ont été particulièrement bien décrits quant au tableau et à la chronologie clinique de la pathologie. Deux des modèles présentent une réduction progressive de la masse musculaire commençant par les membres inférieurs mais ont des débuts de la maladie différents. Cette amyotrophie se traduit par une perte de poids et des difficultés déambulatoires. Le troisième modèle a été également très bien phénotypé dans la littérature : ces souris perdent très lentement leur capacité à effectuer une tache motrice et présentent une posture anormale (dandinement) qui est stable pour suivre un déclin normal lié à l’âge et à la prise poids. Ce modèle présentent une atteinte motrice plus légère qui n’est pas associée à une espérance de vie plus courte. Les souris, comme les patients, ne présentent pas de signes de douleurs. Notre objectif est d’améliorer les symptômes moteurs par une approche de thérapie génique. Le choix du transfert par virus recombinants non-pathogènes est dicté le fait que les vecteurs viraux qui peuvent être administrés avec sécurité pour l’animal sans causer de dommages et complications. Les virus seront délivrés dans les régions d’intérêts du système nerveux des souris par des méthodes standardisées et maitrisées. Les animaux qui rentrent dans l’évaluation thérapeutique sont impliqués dans du comportement moteur consistant à évaluer de façon non-invasive, non-douloureuse, très peu contraignante et de courte durée la capacité à effectuer une activité motrice simple.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier les défauts de connexion entre différentes aires du système nerveux central et déterminer les paramètres histologiques en liens avec des caractéristiques cliniques et un effet thérapeutique. L’autre nécessité est liée à la pathologie elle-même, qui est fatale chez l’homme et également dans un des modèles murins utilisé ici, et rentre dans le cadre de l’étude de l’approche thérapeutique sur l’espérance de vie des souris qui auront reçu ou non le traitement.
Remplacement
L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul moyen intégrant la complexité des communications entre différentes aires motrices du cerveau, du tronc cérébral et de la moelle épinière. L’existence de neurones dérivés de cellules souches ne peut pas reproduire la circuiterie complexe qui fait intervenir les neurones moteurs qui contrôlent la contraction musculaire, qui en retour informe une structure cérébrale appelé cervelet, qui est lui-même connecté à d’autres aires du cerveau. Une tel réseau d’information entre cerveau, moelle épinière et muscle ne peut donc pas être mimé in vitro dans une boite de pétri. Seuls les modèles expérimentaux mammifères présentent cette organisation complexe faite de contrôles réciproques permanents. Les modèles souris de la maladie de Charcot sont donc les seuls modèles qui permettent d’explorer les défauts de la circuiterie neuronale de longue distance. Notre objectif étant de développer une approche de thérapie génique ciblant cette circuiterie, l’utilisation des modèles animaux de la maladie de Charcot est également nécessaire. La validation d’une approche thérapeutique qui intervient dans la complexité de cette communication entre différentes aires du système nerveux requiert un modèle intégratif, physiologique complet que seul l’animal offre. Le modèle vivant demeure donc une étape requise pour tout transfert thérapeutique potentiel vers la clinique.
Réduction
Nous avons donc déterminé pour une durée du projet de 4 années, un nombre total de 660 souris. Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et limiter les faux-positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Pour un premier modèle de la maladie de Charcot chaque cohorte est composée de 24 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologiques. Pour le second modèle, chaque cohorte est composée de 14 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histopathologiques. Afin de minimiser le nombre d’animaux, un partage des tissus est systématiquement appliqué entre l’équipe spécialiste de la moelle épinière et l’autre spécialiste du cerveau. Notre projet inclus également des études d’enregistrement de l’activité neuronale sur des préparations ex vivo du système nerveux. Cette étude sur des tranches de moelle épinière permet donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. Les données sont analysées avec des tests statistiques paramétriques. Un test de normalité de Shapiro-Wilk suivi d'un test de variance sera effectué afin de conforter l'analyse de variance (ANOVA). Une ANOVA pour échantillons indépendants, mesures répétées (groupe par temps) est effectuée. Un test de comparaison multiple de Newmann-Keuls est ensuite utilisé pour comparer les différents groupes entre eux. Pour les études de survie, nous réaliserons un Log-Rank Test en utilisant, selon les recommandations publiées un seul point uniforme d’interruption.
Raffinement
Une connaissance extensive de ces deux modèles de la maladie de Charcot permet de connaître et donc anticiper les différentes étapes de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, igloo, lanières de papier craft et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Les points limites sont définis par le suivi régulier du poids des souris et leur capacité à effectuer une tache motrice reflexe simple. Pour chaque modèle animal de la maladie de Charcot un arbre décisionnel spécifique est défini et suivi par les expérimentateurs associés au projet. De plus une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. Certains animaux peuvent avoir une anesthésie qui est systématiquement conduite en présence d’analgésique. Les animaux sont ensuite surveillés attentivement après leur réveil. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse ou de douleur est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée. Une grille d’évaluation définit par la structure du bien-être animal nous permet de suivre les animaux ainsi identifiés et de prendre rapidement des mesures adaptées.
Choix des espèces
Les lignées transgéniques de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité des résultats: début précoce/tardif, progression lente/rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. L’exploration neuroanatomique des réseaux complexes de longue distance et le protocole thérapeutique pré-clinique que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la maladie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie de transfert viral. La complexité du réseau de communication du système moteur, et en particulier le cervelet qui est un relai entre différentes aires du cerveau et de la moelle épinière des mammifères requiert le modèle souris. Afin de tracer de façon reproductible les voies neuronales, nos souris seront croisées avec des souris possédant un gène reporteur qui identifiera les neurones en rouge. Les modèles de la maladie de Charcot qui sont utilisés récapitulent les principales étapes de la maladie. Nous utiliserons 3 modèles différents qui permettent de représenter l’hétérogénéité clinique et génétique de la maladie. Afin des suivre la maladie nous utiliserons les lignées à trois stades significatifs de la pathologie. L’âge de chaque stade étant différent en fonction du modèle. Nous utiliserons les souris 1) au stade précédent les premiers signes moteurs, c’est le stade asymptomatique. 2) Le stade de début de la maladie ou les premiers signes moteurs sont quantifiables. 3) Un stade ou la maladie est installée, qui est le stade symptomatique. L’espérance de vie des souris est également étudiée dans une procédure thérapeutique.