Système nerveux

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un peptide amyloïde est injecté dans leur cerveau pour reproduire une perte de mémoire, puis elles reçoivent un composé pendant sept jours et passent des tests de mémoire, dont un test d'évitement où elles reçoivent un choc électrique. Les retombées attendues, l'arrivée en clinique d'un traitement contre des maladies rares, sont renvoyées au long terme. Le porteur affirme que le recours à un modèle murin de la maladie d'Alzheimer est "indispensable".

Objectifs

L’objectif de ce projet de recherche est de déterminer les effets neuroprotecteurs d'un composé. Ce produit à visée thérapeutique cible un mécanisme de neuroprotection novateur et peut permettre le développement de candidats-médicaments pour le traitement de maladies rares.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant une preuve de concept d'efficacité d'un composé sur notre modèle de toxicité amyloïde. Le bénéfice attendu est à terme d'amener en clinique ce composé à visée thérapeutiques pour des pathologies rares / orphelines pour lesquelles il n'y a actuellement pas de traitement.

Procédures

Les animaux auront au cours de leur vie des injections IP (30 minutes avant) et sous cutanée 10 min avant l' inoculation du peptide amyloide 25-35 dans le ventricule cérébral droit sous anesthésie (en moins d'une minute). Ensuite durant 7 jours les animaux recevront une injection intrapéritonéale du traitement combinatoire mis en place (durée de l'injection maximum 1 minute). Suite à ce traitement les performances mnésiques des animaux seront testées, avec 3 tests de mémoire d'une durée de 5 à 8 minutes maximum plus le test d'enfouissement d'une durée de 30 minutes pour tester l'anxiété des souris

Impact sur les animaux

Un certain stress lié aux injections pourra être engendré. Une perte mnésique voulue, et dûe à la diffusion du peptide amyloide dans le cerveau sera également observée. Les tests de comportement peuvent engendrer un léger stress et pour le test d'évitement passif, les animaux recevront un choc électrique léger, (0.3 mA pendant 3 sec) afin d'évaluer leur performance mnésique.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post-mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe fait également références aux études antérieurs réalisées au laboratoire. Une veille bibliographique sera également prise en compte durant l'année du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra plus de 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères.

Choix des espèces

Afin de mimer rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer en vue d'un traitement curatif, la souris reste à ce jour le modèle se rapprochant au plus près de l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines.

646 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une contention forcée de deux heures, une chirurgie d'implantation d'une fibre optique dans le cerveau, des enregistrements électrophysiologiques de trois heures et, pour les femelles, des frottis vaginaux répétés, afin d'observer l'activité de circuits neuronaux après un stress aigu. Les retombées annoncées pour les troubles psychiatriques humains restent renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que ce type d'étude ne peut être mené que sur un animal vivant et conclut qu'il n'est pas envisageable de recourir à des méthodes de substitution à l'"animal entier".

Objectifs

Ce projet a comme but principal de mettre en évidence, après un stress, des changements de l’activité des neurones dans un réseau de structures cérébrales qui participe au fonctionnement de la perception corporelle, émotionnelle et motivationnelle. En particulier, nous étudierons les altérations, induites par un stress, de l’activité des neurones dans le cortex insulaire (ou insula), une structure cérébrale impliquée dans la perception des changements corporels et une de ses cibles, le noyau accumbens, qui joue un rôle important dans l’intégration des informations émotionnelles et motivationnelles. Il est connu que l’insula et le noyau accumbens sont dérégulés dans de nombreuses maladies psychiatriques liées au stress comme l’anxiété et la dépression. Le stress est un facteur de risque important pour le développement de troubles psychiatriques. Afin de développer de nouveaux traitements pour ces troubles liés au stress, il est nécessaire de comprendre les adaptations des neurones induites par un stress. De plus, les hommes et les femmes ont tendance à réagir différemment au stress, à la fois psychologiquement et biologiquement, et des différences entre les sexes sont observées dans de nombreux troubles psychiatriques. C’est pourquoi l’étude chez des rats mâles et femelles est nécessaire à ce projet. Dans ce projet, nous étudierons l’impact d’un stress aigu sur les structures cérébrales d’intérêt immédiatement et un jour après un stress par contention. Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à l’exposition à un stress et pourra avoir un impact sur la prise en charge des maladies psychiatriques chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont premièrement une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à l’exposition à un stress aigu. En effet, le stress étant un facteur important dans le développement de maladies psychiatriques, il est important de comprendre ces mécanismes de dérégulation suite à un stress afin de pouvoir agir sur le développement de ces pathologies. Ce projet nous permettra de mettre en avant des différences inter-sexe, avec un aspect temporel et potentiellement un retour à la normal de l’activité plastique de cette voie 24h après le stress.

Procédures

323 animaux, seront soumis au stress par contention, 1 fois pendant 2 heures. Toutes les femelles (323 animaux) seront soumises à un frottis vaginal avant le début des enregistrements électrophysiologiques (1 seul frottis, 304 femelles) ou après chaque enregistrements en photométrie par fibre optique (3 frottis vaginaux, 19 femelles) (2 secondes par acte). Tous les rats de l’approche éléctrophysiologique (608 animaux) seront enregistrés électrophysiologiquement (3h). Tous les rats de l’approche de photométrie par fibre optique (38 animaux) subiront une chirurgie pour l’injection d’un vecteur viral non pathogène et l’implantation à demeure d’une fibre optique (2h), puis 5 sessions d’apprentissage d’auto-administration d’eau sucrée et enfin 3 sessions de test d’auto-administration d’eau sucrée en enregistrement en photométrie par fibre optique. (1 heure pour chaque session d’auto-administration).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : - stress par contention : peut entrainer une augmentation du rythme respiratoire, attendue dans les premières minutes du test. - frottis vaginal chez les femelles en conditions vigiles : gêne occasionnée. - Casque en ciment dentaire maintenant la fibre optique : gêne occasionnée. - isolement des animaux afin que les animaux ne détériorent pas le système de fixation de la fibre optique. - légère restriction de l’accès à l’eau sera effectuée pour les animaux qui seront enregistré en photométrie chez qui les biberons d’eau seront retirés 3h avant leurs sessions d’auto-administration d’eau sucrée et replacés par la suite.

Devenir

Tous les animaux, à l’issue des enregistrements seront mis à mort afin de procéder à des analyses moléculaires, histologiques et/ou d’expression de protéines.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases d'un processus psychobiologique, peut-être uniquement mené sur un animal vivant. En effet, Nous étudions les bases comportementales et neurobiologiques impliquées dans les émotions et les troubles associés à l’exposition à un stress. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles et en ayant recours à des analyses statistiques qui permettent de calculer le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Nous estimons un ajout de 2 animaux par lot dus à la complexité du geste chirurgical et aux possibles mauvais placements des électrodes d’enregistrement et/ou de stimulation. Ainsi 19 animaux par lots, seront nécessaires à notre étude. 34 lots seront nécessaires pour le projet, soit 646 animaux maximum.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en terme de "mal être" animal. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi de points limites et des critères d’intervention et d’arrêt ; l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu (tunnels, stick en papier) et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, pendant laquelle l’animal sera placé sur un tapis chauffant pour assurer le maintien de sa température corporelle. A leur arrivée à l’animalerie, les animaux auront une période d’habituation à l’animalerie de 5 jours minimum avant toutes manipulations, ils seront d’abord hébergés à deux par cage puis ils seront hébergés individuellement pour éviter l’amplification du stress (304 rats, pendant 24h) et la détérioration du système de fibre optique (38 rats, pendant 5 semaines maximum). Les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les animaux auront une période d’habituation aux cages d’auto-administration lors des sessions d’auto-administration d’eau sucrée pendant 5 jours avant les tests enregistrés en photométrie par fibre optique.

Choix des espèces

Le rat est, avec la souris, l’animal le plus utilisé pour l’étude de la motivation dans les modèles animaux, car ses réponses neuronales sont proches des réponses neuronales observées chez l'Homme. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est à dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus. Dans cette étude, nous utiliserons des rats adultes de 8 semaines ce qui est en conformité avec la majorité des expériences de comportement animal et la littérature, et ce qui limite les risques de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'une heure pour implanter des électrodes, puis des enregistrements de vingt minutes par jour pendant un mois dans un champ ouvert, pour étudier une atrophie du cervelet due à une mutation d'un canal calcique. Le porteur indique que les souris porteuses de la mutation peuvent développer une ataxie et une mort des cellules de Purkinje, et que la chirurgie peut provoquer une douleur modérée pendant la récupération. Il affirme que le modèle murin est "incontournable" et que les réseaux de neurones ne peuvent être obtenus en culture ni par modélisation.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact physiopathologique d’une mutation génétique conduisant à une réduction de la taille du cervelet (une atrophie) dès l'enfance (elle a été nommée atrophie céréelleuse infantile, ChCA). Cette maladie est due à un dysfonctionnement dans une protéine de transport du calcium qui se trouve à la surface de certaines cellules, notamment les cellules de Purkinje du cervelet. La mutation conduit à un plus grand influx de calcium dans les cellules de Purkinje dès l'enfance, ce qui pourrait induire la mort des cellules et donc une atrophie du cervelet. Seules les études in vivo et ex vivo peuvent permettre de déterminer l’impact de cette mutation sur le(s) dysfonctionnement(s) neurologique(s) observé chez les patients atteints de cette maladie. Pour ce projet, nous utiliserons un modèle murin chez lequel l'expression de la mutation pourra être induite sélectivement dans les cellules de Purkinje et ainsi étudier les conséquences de cette mutation dans le cervelet. Il s’agit du premier modèle animal de cette maladie et l’attente des patients et cliniciens est considérable, d’une part pour mieux comprendre cette pathologie, et d’autre part pour évaluer les traitements possibles.

Bénéfices attendus

Identifier les mécanismes pathogéniques dans l'atrophie cérébelleuse infantile. Préciser le rôle de la protéine mutée dans le développement du cervelet et le fonctionnement des cellules de Purkinje. Valider le modèle murin en tant que modèle préclinique de la maladie permettant d'évaluer des pistes thérapeutiques dans l'atrophie cérébelleuse infantile.

Procédures

Pour ce projet, 90 animaux subiront une chirurgie d'une durée de une heure pour l'implantation crânienne d'électrodes pour des enregistrements cellulaires. Sur ces animaux, les enregistrements (branchement d'un cable souple sur les électrodes implantées) dureront 20 minutes par jour pendant 1 mois pendant qu'ils se déplacent dans un champ ouvert.

Impact sur les animaux

Pour les animaux porteurs de la mutation, on peut s'attendre à des modifications précoces du fonctionnement des cellules de Purkinje du cervelet, puis à leur mort, ce qui peut conduire à une ataxie cérébelleuse et une réduction de la taille du cervelet (atrophie). Les chirurgies sous anesthésie destinées à implanter les électrodes peuvent induire une douleur modérée pendant la récupération.

Devenir

L'ensemble des animaux contribuant à la procédure seront mis à mort. Les organes, tout particulièrement le cerveau et le cervelet, seront prélevés pour des expériences sur tranches aigues ou des analyses immunohistologiques.

Remplacement

Le développement et la caractérisation d'un modèle souris est incontournable pour l'analyse pathophysiologique de la ChCA (ataxie cérébelleuse infantile). Son utilisation sera toutefois strictement limitée aux expériences ne pouvant être réalisées via une modélisation sur ordianteur ou des lignées de cellules humaines. Ainsi, les conséquences fonctionnelles de la mutation seront d'abord modélisées sur lignées cellulaires humaines et des approches in silico. Cependant, ces stratégies permettront de faire des prédictions sur l'impact de la mutation à l'échelle cellulaire mais pas à l'échelle de l'organe entier, à savoir le cerveau. En effet, les réseaux de neurones mis en place lors du neurodéveloppement ne peuvent pas être obtenus en culture ni par modélisation informatique. De même, les conséquences motrices des dysfonctionnements du cervelet nécessitent encore aujourd'hui de réaliser des expériences sur l'animal vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet (estimé à 90) a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques de façon fiable et reproductible. Nous avons défini une stratégie de croisement que nous espérons la plus optimale possible. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation de logiciel approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis.

Raffinement

Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué quotidiennement. Des points limites spécifiques ont été définis et le raffinement s’appliquera selon une grille d'observation pour une prise en charge adaptée des animaux. Cette prise en charge comprend l’utilisation d’analgésiques, une adaptation des conditions de vie et lorsqu'une douleur ou un inconfort non reversibles apparaissent, l'euthanasie.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le mieux adapté pour i) modéliser de manière inductible la maladie neurologique étudiée et ii) développer l'ensemble des investigations anatomomorphologiques et fonctionnelles des atteintes cérébelleuses associées à la pathologie. La possibilité de contrôler l'expression de la mutation par une recombinase est également un atout majeur justifiant l'intérêt de modéliser cette pathologie dans l'espèce souris. Les connaissances actuelles sur ce modèle permettent de répondre au mieux à la règle des 3 R. Utilisation d'adultes pour étudier les conséquences neurodéveloppementales de l'expression de la mutation d'intérêt, en particulier les conséquences sur le développement et la physiologie du cervelet.

192 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une électroporation in utero sous anesthésie, puis la moitié des mères et de leurs portées passent huit jours dans un air appauvri en oxygène, pour modéliser l'hypoxie de la grande prématurité. Le porteur indique une mortalité fœtale pouvant atteindre 10 % et des lésions cérébrales diffuses chez les souriceaux, qui sont ensuite tués pour prélèvement du cerveau. Il affirme que l'approche in vivo est "incontournable" car les modèles in vitro ne reconstituent pas la complexité des connexions nerveuses.

Objectifs

La grande prématurité résulte fréquemment en des périodes de manque d'oxygène (appelées périodes d'hypoxie) du fait notamment de l’immaturité des poumons, et aboutit donc à des perturbations profondes de la capacité du cerveau à utiliser et produire de l'énergie (on parle de capacité métabolique), et à des lésions diffuses du cerveau. Bien que le cerveau du nouveau-né présente une capacité à se réparer supérieure à celle du cerveau adulte, des études récentes suggèrent que cette réparation pourrait être imparfaite ou même inadaptée. Ainsi, la probabilité d’apparition de troubles cognitifs est très fortement augmentée à l'adolescence, chez les enfants grands prématurés par rapport à ceux nés à terme, possiblement du fait de la mise en place de réseaux neuronaux anormaux. Objectif du projet : Cette étude a pour but de tester comment les perturbations survenant autour de la naissance et notamment l’hypoxie périnatale entraîne une perturbation durable de l’activité métabolique cérébrale, et notamment de l’activité des mitochondries, qui sont les organelles responsables de l’essentiel de la production d’énergie cellulaire. Ces perturbations métaboliques entraîneraient à long terme des anomalies du développement des réseaux neuronaux qui peuvent expliquer la survenue plus tard dans la vie de troubles neurologiques variés. Ce projet utilisera un modèle murin de naissance très prématurée (hypoxie néonatale chronique), combiné à une méthode chirurgicale permettant d’exprimer des protéines fluorescentes dans des populations ciblées de neurones du cortex cérébral chez la souris. Il permettra de répondre en même temps à deux questions : - Quelles sont les conséquences de l’hypoxie périnatale sur le développement à long terme du cerveau - Est-ce que ces défauts sont associés à un défaut métabolique persistant dans ces neurones.

Bénéfices attendus

Ce projet a une double finalité, à la fois fondamentale et translationnelle (préclinique) : -Sur un plan translationnel, ce projet permettra de mieux prédire les conséquences à long terme de lésions cérébrales survenant tôt dans la vie (pendant la période périnatale). Les données issues de ce projet permettront également de comprendre quels sont les mécanismes qui font que la réparation cérébrale n’est pas totalement efficace, ce qui pourra conduire à l’identification d’indicateurs biologiques ou de pistes thérapeutiques ultérieures. -Sur un plan fondamental, ce projet pourra fournir des hypothèses de recherche et des pistes de mécanismes cellulaires pour les chercheurs travaillant sur l’étude du développement cérébral.

Procédures

Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie péri/post-opératoire, appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes Après la naissance, la moitié des animaux (femelles et portée) seront soumis pendant 8 jours à un environnement appauvri en oxygène Les prélèvements seront réalisés postmortem pour l’étude du cerveau par histologie. La mise à mort sera réalisée par une éthode dérogatoire seule à même de préserver les tissus cérébraux.

Impact sur les animaux

Pour les femelles : La procédure permettant l'expression de marqueurs fluorescents dans les neurones et mitochondries, implique une approche chirurgicale invasive avec réveil. Dans de rares cas, nous pouvons observer une difficulté de mise bas. Les infections sont en théorie possibles, mais en pratique jamais observées suite au respect des règles d’asepsie. Pour les souriceaux : Une mortalité foetale (estimée à 10 pour cent maximum des embryons sur lesquels la procédure est effectuée est constatée, bien qu’il soit difficile de déterminer si la résorption fétale résulte de l’élimination spontanée de fétus surnuméraires pendant la gestation, ou d’une mortalité liée à la procédure chirurgicale. La procédure n’a pas de conséquence sur le développement du souriceau. Une réduction périnatale de l'oxygène ambiant (hypoxie) entraîne un retard de croissance et des lésions cérébrales diffuses. Après la période de réduction de l'oxygène ambiant, les souriceaux rattrapent leur retard de croissance et les lésions cérébrales apparaissent réparées au niveau macroscopique. Des altérations à long terme de la connectivité cérébrale résultant de l’hypoxie périnatale peuvent en théorie entraîner des déficits cognitifs (défauts d’apprentissage, d’activité spontanée et de comportements sociaux) qui peuvent être détectés lors de tests de comportement mais sont généralement impossibles à détecter dans l’observation de comportements spontanés de souris élevées en cage.

Devenir

Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique. Une réutilisation des femelles n'ayant pas subi de procédure chirurgicale sera envisagée, notamment comme souris allaitante pour les expériences suivantes. Une utilisation des souriceaux surnuméraires sera envisagée, notamment pour la collecte de tissus. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements post mortem.

Remplacement

Les hypothèses de travail ont été au préalable validées dans des modèles in vitro et justifient à présent de confirmer par une approche in vivo, incontournable pour ce projet de recherche. En effet, les séquelles neurologiques observées suite à une oxygénation insufisante, dépendent de mécanismes complexes (interactions cellulaires, rôle de la réponse immunitaire, inflammation tissulaire) impossibles à reproduire in vitro d’où la nécessité d’un modèle animal pour étudier la pathologie. De plus les modèles in vitro ne permettent pas de reconstituer totalement la complexité des connections nerveuses entre régions du cerveau, qui est l’objet de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base de notre expérience préalable. Certains animaux devront être exclus de l’analyse à postériori pour des raisons techniques (mauvaise qualité du marquage des neurones et des mitochondries qu'ils contiennent ou de préparation histologique). Les animaux seront traités deux à deux (deux femelles, soit deux portées, en parallèle : groupe expérimental et groupe témoin) et les portées seront analysés au fur et à mesure afin d’atteindre au plus vite le nombre d’animaux cible de l’étude, ce qui permettra de ne pas utiliser d’animaux inutilement. De plus l’étude est prévue sur 4 âges correspondant à 4 stades de développement distincts, mais nous commencerons par les âges J11 et J45 qui correspondent aux effets les plus forts attendus dans notre étude. Dans le cas où les résultats à ces âges invalideraient notre hypothèse (étude négative), nous arrêterions l’étude sans procéder à l’étude des autres âges. L’analyse des projections nerveuses sera réalisée sur des cohortes d’animaux des deux sexes, par un test statistique approprié. Cette analyse permettra de déterminer la part de la condition expérimentale (normoxie/hypoxie), du sexe, de l’environnement, et leur interaction, sur le phénotype observé. Nous tirerons par conséquent un maximum d’information des animaux inclus dans l’étude. La méthode d’échantillonnage utilisée permet non seulement un échantillonnage homogène de notre région d’intérêt, mais aussi l’utilisation des mêmes cerveaux pour des marquages immunohistochimiques variés, permettant de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Enfin, un système de préservation de toutes les séries de coupes non utilisées a été mis en place pour optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Ce projet repose sur des procédures maitrisées. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance, au moyen notamment d’un enrichissement varié stimulant la nidation. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort des animaux. Les femelles seront échangées tous les 2 jours entre les cages normoxiques et hypoxiques, afin de préserver la quantité et la qualité du lait qu’elles produisent pour nourrir leurs souriceaux, et de minimiser au maximum le stress conséquent à la procédure sur les animaux. Une méthode d’imagerie et d’analyse innovante sera utilisée pour tirer encore plus d’information par animal, en permettant d’observer les projections axonales dans l’ensemble des régions du cortex.

Choix des espèces

L’architecture du cerveau de la souris est très proche de l’architecture du cerveau humain dans sa structure et son fonctionnement. Le modèle murin est un modèle animal reconnu dans le cadre des études des pathologies neurodéveloppementales ainsi que dans le développement et le fonctionnement du cortex cérébral. Par ailleurs, les méthodes ont été établies dans cette espèce ce qui nous assure que le projet est faisable et permettra de répondre à la problématique scientifique. Les femelles gestantes seront des adultes entre 8 et 24 semaines, selon la disponibilité des animaux chez le fournisseur agréé. Les souriceaux seront utilisés aux âges suivants afin d'étudier les effets d'une réduction de l'oxygène ambiant à des étapes clés de la mise en place des réseaux de neurones du cerveau: -J(our après la naissance) 11, correspondant à la fin de la période de réduction de l'oxygène ambiant. -J21, correspondant à l’âge ou les connections nerveuses sont établies, mais où elles sont encore immatures -J45, correspondant à un âge où les connections nerveuses maturent. Cet âge est également pertinent car il correspond à la maturité sexuelle chez les souris (adolescence/jeune adulte), qui est un âge auquel plusieurs maladies neuropsychiatriques sont détectées (par exemple schizophrénie) -J90-J120, correspondant à un stade adulte et qui est également le stade où nous observons des déficits comportementaux.

1 820 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une fixation crânienne ou un dispositif optique implanté sous anesthésie, puis un entraînement de plusieurs semaines à des tâches de mémoire spatiale dans un environnement virtuel, crâne immobilisé, avec enregistrement des neurones. Le porteur indique que les souris peuvent être soumises à un contrôle de la consommation de liquide, l'entraînement s'arrêtant si la perte de poids dépasse 20 %, et que tous les animaux sont tués faute de pouvoir être réutilisés ou adoptés. Il revendique le recours à l'animal comme "nécessaire", la modélisation informatique ne suffisant pas à étudier les mécanismes de la mémoire.

Objectifs

Comment le cerveau peut-il distinguer entre des souvenirs qui se ressemblent ? L’hippocampe est censé servir cet objectif en générant des représentations de mémoire qui ne se chevauchent pas. Au cours de la vie adulte, l’hippocampe est constamment alimenté avec de nouveaux neurones, ajoutant de nouveaux éléments qui s’intègrent dans le réseau existant. Comment les activités des neurones nouvellement produits et matures sont reliées au stockage et au rappel des traces mémorielles distinctes n’est pas bien compris. Lors du stockage de traces mémorielles, l’hippocampe est activé par des entrées synaptiques qui sont induites par les événements et les objets de l’environnement actuel. Pour créer une trace mémorielle de cet environnement, l’hippocampe doit sauvegarder ce motif d’activité. La théorie prévalente suggère que ceci est accompli en renforçant la puissance des synapses entre les neurones hippocampiques qui font partie de ce motif d’activité, créant ainsi un ensemble de neurones fortement connectés. Par conséquence, quand la mémoire doit être ravivée, l’activation même d’une petite partie de cet ensemble entrainera tous les neurones de l’ensemble. Une mémoire complète peut être reconstituée même par une petite partie de l’environnement original. Plusieurs niveaux neuronaux sont engagés dans ce processus. Les neurones individuels doivent correctement sélectionner les entrées synaptiques auxquelles ils répondent. Ensuite, les populations de neurones qui répondent à différents motifs synaptiques ne doivent pas se chevaucher. Il n’est pas bien compris comment ces processus sont réalisés à ces niveaux différents. De plus, nous ne savons pas quel rôle est joué par les cellules nouvellement produites lors du stockage et du rappel de traces mémorielles. Pour répondre à ces questions, nous allons combiner des nouvelles méthodes qui nous permettront d’enregistrer et manipuler l’activité neuronale lors de tests comportementaux. Ces expériences ont pour objectifs scientifiques de répondre aux questions suivantes : 1. Quels sont les comportements et les entrées sensorielles qui activent les neurones nouvellement générés et matures ? 2. Comment les souvenirs distincts sont-ils représentés au niveau des entrées synaptiques des neurones ? 3. Peut-on manipuler sélectivement l'activité des neurones nouvellement générés et matures pour établir un lien de causalité avec la formation, la consolidation, et le rappel de souvenirs distincts ?

Bénéfices attendus

Le rôle des circuits neuronaux dans le stockage et le rappel des souvenirs épisodiques a été largement étudié au cours des dernières décennies. Cependant, la manière dont l'activité des neurones et des circuits neuronaux assure une récupération robuste des souvenirs familiers tout en permettant un encodage flexible des informations nouvelles n'est toujours pas claire, en particulier lorsque les informations familières et nouvelles se ressemblent. Nous abordons ici cette question en utilisant une approche expérimentale et computationnelle combinée. L'originalité de notre proposition est que nous n'établirons pas seulement des corrélations entre l'activité neuronale et le comportement, mais que nous fournirons des liens de causalité en manipulant l'activité de populations neuronales fonctionnellement identifiées. Nos résultats fourniront également des prédictions vérifiables pour les études humaines et aideront à mieux comprendre comment le cerveau stocke les souvenirs épisodiques dans la santé et la maladie. La mémoire, élément fondamental de l'être humain, est tragiquement perturbée dans de nombreuses pathologies neurologiques, notamment dans la maladie d'Alzheimer. Les théories sur la façon dont les souvenirs sont formés et rappelés par les circuits neuronaux dans la santé et la maladie sont largement basées sur des preuves corrélatives. Notre projet fournira des preuves causales sur la façon dont l'activité neuronale dans les systèmes de mémoire du cerveau entraîne un comportement guidé par la mémoire. Ces données fondamentales sont essentielles pour comprendre comment ce processus est perturbé dans des états pathologiques tels que la maladie d'Alzheimer, où notre approche mécaniste peut aider à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Après publication, nos données seront mises à disposition dans un dépôt ouvert et publique afin que d'autres chercheurs puissent également bénéficier de nos résultats expérimentaux.

Procédures

Implantation d’une plaque crânienne ou d’un dispositif optique intracrânien d’une durée typique de 1h ; 1–2 gestes chirurgicaux par animal. Ces gestes chirurgicaux sont suivis d’une récupération de 1–2 semaines. Ensuite, entrainement des souris pendant 1—4 semaines dans un espace virtuel, composé de 5–10 séances d’enregistrement ou d’entrainement de typiquement 30–90 minutes (rarement jusqu’à 3 heures) par jour. Après l’entrainement, 1–3 séances d’enregistrement de l’activité neuronale jusqu’à 3 heures par jour pendant une période de 2–5 jours.

Impact sur les animaux

Ce projet peut rarement (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Le recours à l’animal est nécessaire car nous n’avons pas suffisamment d’informations pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de la mémoire avec de la modélisation informatique. Pour obtenir ces informations, il nous faut donc employer des animaux qui effectuent des tâches de mémorisation. Les souris sont un modèle approprié pour ce projet, car elles peuvent être entrainées à des tâches de mémoire spatiale, elles produisent de nouvelles cellules nerveuses dans l'hippocampe, et elles sont accessibles à des techniques avancées d'enregistrement.

Réduction

Nous visons à utiliser le nombre minimal d'animaux qui sera suffisant pour obtenir des résultats expérimentaux valides. Les données d'une expérience peuvent être utilisées pour différents projets, par exemple, les données produites par des expériences d'intégration synaptique peuvent fournir des contraintes pour la construction d'un modèle informatique ; et les expériences électrophysiologiques in vivo peuvent à leur tour être suivies par des analyses morphologiques de la connectivité synaptique dans le même tissu in vitro. Nous allons utiliser des tests statistiques appropriés afin d'utiliser un nombre minimal de points de données pour fournir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux se justifie du fait de la faible taille des effets expérimentaux étudiés (nécessitant donc un nombre d’observations conséquent) et de la difficulté des manipulations réalisées (pertes techniques). L’environnement virtuel nous permet de finement et instantanément contrôler et adapter l’environnement suivant le comportement des animaux, ce qui n’est que difficilement possible dans des environnements réels. En plus, comme le crâne de l’animal est fixé, nous n’aurons pas besoin de miniaturiser les instruments d’enregistrement, ce qui nous permettra d’obtenir des enregistrements de haute définition avec peu de perturbations causées par le mouvement. Cela réduit la variabilité de nos données, nous permettant de réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire. Les approches patch-clamp et l’imagerie calcique nécessitent une excellente stabilité et un mouvement minimal du cerveau pour pouvoir extraire des signaux qui sont près du seuil de bruit. Pour cette raison, la plupart des essais seront effectués sur les animaux à crâne fixé. Cela nous aidera également à réduire le nombre d’animaux, car nous augmenterons la fraction de données utilisables.

Raffinement

Nous avons mis au point des procédures de surveillance accrue, de soins post-opératoires, de mesures de gestion de la douleur, et d’entrainement des animaux qui ont été développées et raffinées pendant plusieurs années. Pendant les procédures chirurgicales, la profondeur de l’anesthésie sera surveillée en testant les réflexes et en enregistrant la fréquence de respiration. Un tapis chauffant sera utilisé tout au long de la chirurgie. Si possible, une chaufferette est positionnée en contact de sa cage d’hébergement pendant les premières 24 heures suivant la chirurgie. Des analgésiques pré-opératoires seront administrés. Du gel ophtalmique est appliqué. Des anti-inflammatoires oraux sont mélangés à du gel alimentaire et placés dans la cage de l’animal durant au moins 3 jours après la chirurgie. Pour les souris montrant des signes de douleur après la chirurgie, l’administration de l’analgésique sera renouvelée. Selon notre expérience, nous n’observons pas de douleurs au-delà de 3 jours après la chirurgie. Le comportement des animaux sera surveillé régulièrement après la chirurgie, en faisant attention à une activité réduite, une posture voûtée, une démarche anormale, ou une agressivité accrue. Les animaux seront observés durant les 48h qui suivent l’opération. Si les animaux sont soumis à un contrôle de la consommation de liquide, ils seront pesés régulièrement, et la restriction sera interrompue si la perte de poids dépasse 20% par rapport au poids pré-chirurgical. Les souris seront hébergées avec une litière appropriée et des matériaux de nidification dans un environnement enrichi avec des roues, des tunnels et des maisonnettes. Bien que les réponses sensorielles puissent être testées sous anesthésie, les médicaments d'anesthésie affectent l'activité dans les circuits neuronaux et peuvent fournir des résultats trompeurs. De plus, la majorité des expériences nécessite que l’animal effectue une tâche. Pour cette raison, les expériences se feront sur l’animal éveillé.

Choix des espèces

Les rongeurs sont probablement les espèces les plus éloignées phylogénétiquement pour lesquels une comparaison directe peut être faite avec la structure et le fonctionnement du cerveau humain. Notre modèle expérimental est la souris (C57B/6J wild type), qui est actuellement l'espèce de choix dans la plupart des domaines de la recherche biomédicale, car elle permet l'utilisation de techniques moléculaires puissantes. Cela a permis l'expression sélective de molécules, telles que des protéines fluorescentes, pour identifier des populations de neurones spécifiques au lieu d’enregistrer l’activité de neurones choisis au hasard. Ceci est un raffinement de nos méthodes qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Souris adultes, parce que nous nous intéressons à la neurogenèse dans l’organisme adulte, et au comportement dans l’organisme adulte. La croissance du crâne est alors largement terminée.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une fenêtre d'observation implantée dans le crâne sous anesthésie, puis jusqu'à neuf séances d'habituation à la contention et cinq à sept séances d'imagerie maintenues de une à trois heures, pour former une quinzaine d'étudiants par an à la technique. Le porteur revendique qu'il n'existe pas d'alternative non animale et qu'il est "essentiel" que la formation implique des animaux vivants. Les bénéfices évoqués contre les pertes sensorielles restent lointains, l'objet réel du projet étant l'apprentissage d'un outil d'imagerie.

Objectifs

Le but général du projet est d’entrainer annuellement une quinzaine d’étudiants, sous supervision d’un spécialiste, à mesurer de manière extensive et précise les représentations sensorielles de stimuli complexes dans le cerveau de souris vigiles. Ces mesures extensives sont rendues possibles par l’utilisation de techniques d’imagerie à haute densité permettant l’enregistrement simultané de plus de 1000 neurones par expérience. La formation d’étudiants dans ce domaine permettra la généralisation de cette méthodologie qui permet d’obtenir beaucoup plus de données cruciales pour la compréhension des circuits neuronaux du cerveau pour un nombre réduit d’animaux utilisées. Dans ce projet, nous mettons en place une procédure expérimentale permettant aux étudiants, sous la supervision d’un spécialiste de prendre en main les instruments nécessaires à la réalisation de l’expérience en situation réelle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’acquisition par une quinzaine d’étudiant annuellement d’une méthode qui représente une nouveauté technologique pour l’observation de l’activité cérébrale à la résolution neuronale. Le développement de cette méthode permettra de progresser dans la compréhension des mécanismes de la perception sensorielle et ainsi de pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques dans le domaine des pertes sensorielles.

Procédures

Les animaux sont soumis à 1 chirurgie d’implantation d’une fenêtre d’observation permanente sous anesthésie et analgésie puis à 9 séances maximum d’habituation à la contention (0.5 à 3h par séance). Enfin 5 à 7 séances d’imagerie en contention de 1 à 3 heures sont réalisés.

Impact sur les animaux

Ce projet inclut une préparation chirurgicale des souris occasionnant des douleurs et un inconfort modéré dans la période de récupération de 2 jours. Par la suite les souris sont habituées à la contention ce qui entraine un stress et un inconfort qui s’amenuisent après 3 jours d’habituation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale pour accéder à l’activité de milliers de neurones opérant le traitement de l’information sensorielle. Dans ce projet l’utilisation d’animaux est nécessaire pour permettre aux étudiants d’apprendre la méthodologie d’imagerie et la manipulation de l’équipement en conditions réelles. Cela permet d’éviter par la suite de nombreuses erreurs qui peuvent se faire parfois au détriment du bien-être animal. Il est donc essentiel que la formation à cette méthode implique des animaux vivants.

Réduction

Grâce à l’utilisation des méthodes d’imagerie optiques modernes permettant d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, le nombre d’animaux utilisés est minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal, et ainsi atteindre des échantillons de plusieurs milliers de neurones, permettant une précision statistique jamais atteinte. Il est donc important de développer ces techniques pour améliorer la réduction des nombres d’animaux utilisés en neuroscience. 20 animaux sont nécessaires par ans pour obtenir les dix animaux nécessaires pour le cours (4 à 5 animaux utilisés par jours et repos de 2 jour) en comptant 50% d’animaux non utilisables du fait d’aléas expérimentaux, soit 100 animaux par an.

Raffinement

La procédure expérimentale de ce projet implique une antalgie et des temps de repos appropriés pour minimiser la souffrance, un suivi quotidien des animaux, et la définition de points limites précis basés sur des indicateurs de poids, (toute perte de poids >20% est un point limite), d’aspect général et de comportement, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort s’il n’est pas possible de pallier immédiatement la souffrance de l’animal.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle animal en raison de l’ensemble des outils génétiques (souris transgéniques, injections virales AAV) qui sont bien établies chez cet animal, et qui permettent d’une part de manipuler différents éléments du système nerveux de manière ciblée, d’autre part de garantir une expression large et stable de certaines protéines, comme des senseurs calciques fluorescents ou des opsines (par ex. channelrhodopsin). Dans ce projet nous utiliserons les lignées GAD2-Cre, AI14D-TDT et leur croisement qui permet le marquage spécifique des interneurones dans le cortex. Pour toutes les expériences, nous utiliserons des souris adultes (de 3 à 6 mois) afin d’étudier la perception sensorielle dans un système nerveux mature.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris transgéniques reçoivent pendant 6 à 12 mois une alimentation enrichie d'un mélange de six pesticides, avec suivi de la glycémie, séjours en cage métabolique, tests de tolérance au glucose et à l'insuline par injection puis prélèvements sanguins répétés, pour explorer un lien entre pesticides, maladie de Parkinson et diabète. Seuls des mâles sont exposés, et les animaux sont tués pour prélever cerveau, pancréas et autres organes. Le porteur affirme que ces liens n'ont "jamais été explorés" et écarte les modèles cellulaires ou invertébrés comme inadaptés à sa question.

Objectifs

Notre projet vise à apporter des connaissances sur les liens potentiels qui n’ont jamais été explorés à notre connaissance entre exposition alimentaire à des pesticides et des maladies humaines chroniques fréquentes, les maladies de Parkinson (MP) et le diabète, à l’aide d’un modèle « humanisé » développant une maladie neurodégénérative caractérisée par l'accumulation anormale d'agrégats de la protéine alpha-synucléine dans le cerveau. Ce projet s’inscrit dans un contexte ou certaines données épidémiologiques suggèrent que le diabète serait associé à un risque accru de maladie de Parkinson. Par ailleurs, plusieurs méta-analyses confirment le lien entre exposition professionnelle aux pesticides et MP. Dans ces conditions, notre projet envisage l’évaluation de la toxicité d’un mélange de 6 pesticides à des doses individuelles supposées ne pas exercer d’effets sur la santé chez l’homme mais rapportées pour induire en mélange un surpoids et/ou un diabète chez des souris non transgéniques. En utilisant ce mélange, nous étudierons alors le lien entre les perturbations métaboliques observées et les mécanismes qui sous-tendent le développement de la MP dans un modèle de souris transgéniques.

Bénéfices attendus

Le projet vise à apporter des éléments de connaissance concernant le rôle de l’exposition quotidienne à de faibles doses de pesticides en mélange via l’alimentation dans l’incidence des maladies neurodégénératives associées à la protéine alpha-synucléine (comme la maladie de Parkinson) et du diabète. Par ailleurs, ce projet doit permettre d'investiguer le lien entre le diabète et la maladie de Parkinson.

Procédures

Premièrement, 40 souris (10 par lot) feront l'objet d’un suivi périodique de la glycémie sur 6 mois (semaine 9, 17, et 24). Après une période de jeûne de 4-6h des prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre (3 minutes par animal). Deuxièmement, 40 souris (10 par lot) feront l’objet de prélèvements urinaires et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les animaux seront mis individuellement dans des cages métaboliques pour récupérer les urines sur une période de 24h (semaine -1, 6, 27 et 52). Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin, Pour les tests de tolérance au glucose (semaine 16, 36, et 48) après une période de jeûne de 4-6h, une injection intrapéritonéale d’une solution saline de D-Glucose stérile sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués, pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min. Par ailleurs, deux prélèvements sanguins supplémentaires seront réalisés pour un dosage ultérieur de l’insuline plasmatique qui sera mesurée 30 min avant et 15 minutes après l’injection du DGlucose. Troisièmement 20 souris (5 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels et d’un suivi des paramètres métaboliques selon les mêmes modalités que le point 2 (glycémie et test de tolérance au glucose) sur 12 mois. Les tests fonctionnels (semaine 0/1, 12/13, 25/26, 38/39 et 51/52) seront réalisés afin d’évaluer les conséquences fonctionnelles de l’exposition aux pesticides, en comparaison avec le vieillissement normal. Lors de chaque test, les animaux seront évalués pendant 7 minutes. Quatrièmement 40 souris (10 par lot) feront l’objet de tests fonctionnels (selon les mêmes modalités que le point 3) et d’un suivi des paramètres métaboliques (glycémie et test de tolérance à l’insuline) sur 12 mois. Pour le suivi périodique de la glycémie, les modalités du point 1 seront appliquées en semaine 9, 24, 29 et 42. Enfin pour les tests de tolérance à l'insuline intrapéritonéal (semaine 15, 35 et 47) les souris seront mises à jeun pendant 4-6h puis une injection intrapéritonéale d’une solution d'insuline (0,75U insuline/kg de poids corporel) sera réalisée. Huit prélèvements de sang seront effectués pour la lecture de la glycémie avec un glucomètre sur une période de 2h30min.

Impact sur les animaux

L'administration d'aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides a déjà été réalisée chez la souris sans complication observée pour elles-mêmes. Le taux de mortalité lié à ce régime est nul. Les suivis envisagés sont couramment utilisés et n'induisent pas d'effet indésirable particulier en dehors de la douleur ou du stress induit par l'acte lui-même. En cas de souffrance (blessure, absence de prise de poids ou perte de poids supérieure à 20%), les souris seront mises à mort. Concernant les animaux qui seront soumis à un ensemble de tests fonctionnels, la planification des tests est prévue afin de limiter le stress des animaux et garantir un niveau d’activité. En particulier, lors de chaque session, les tests seront étalés sur 2 semaines et aucun suivi des paramètres métaboliques ne sera réalisé durant la période de suivi des capacités motrices des souris.

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure afin de procéder au prélèvement des organes nécessaires à l'exploitation des résultats : cerveau, pancréas, foie, moelle épinière, tissu adipeux, intestin, fèces, yeux et sang.

Remplacement

L'étude des liens entre la maladie de Parkinson et le diabète de type 2 en condition d'exposition chronique à un mélange de faibles doses de pesticides à l'aide de cellules, organoïdes, modèles numériques ou modèles animaux moins sensibles (invertébrés) constituerait des approches différentes qui ne pourraient pas répondre aux questions que nous souhaitons aborder. Par ailleurs, l'étude des mécanismes moléculaires au niveau pancréatique dans un modèle murin de synucléinopathie n’a jamais été réalisée, et encore moins dans des conditions d’exposition alimentaire à un mélange de pesticides à faibles doses, pertinente au regard de l’évaluation des risques de l’alimentation humaine.

Réduction

Les animaux exposés seront tous étudiés dans les différentes expériences (tests fonctionnels, suivi métabolique) et ils seront analysés avec les différentes techniques choisies. Les souris seront mises à mort après 6 mois ou 12 mois afin de mimer une exposition d'un consommateur humain durant 15 et 30 ans. Ces choix de durée d’exposition sont également motivés par les caractéristiques spécifiques de l’évolution de la neuropathologie dans la lignée M83 d’une part et par les données déjà publiées sur l’évolution des troubles métaboliques chez la souris conventionnelle d’autre part. La quantité d'animaux par groupe de 35 animaux/groupe est le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Une fois les données relevées (comparaison de la masse des souris (en g), mesure de la glycémie, réponse au test de tolérance au glucose, réponse au test de tolérance à l’insuline, capacité motrice, étude des perturbations métaboliques et des mécanismes liés au développement de la MP) des tests statistiques sont prévus pour la comparaison des 2 groupes entre eux (exposé, non-exposé). En accord avec les récentes observations publiées, seules les souris mâles seront exposées de façon continue, à l’aliment enrichi (ou non) par le mélange de 6 pesticides pendant 12 ou 6 mois.

Raffinement

Les animaux seront suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière pour le suivi métabolique des animaux (la mesure du poids, la quantité de nourriture ingérée, tests de tolérance au glucose intrapéritonéal, prise d'urine, mesure de la glycémie) et la mise en œuvre des tests fonctionnels. Les souris seront hébergées avec un environnement enrichi. Elles auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. Lors des études précédentes, la tolérance du régime était bonne, aucune sur-mortalité n'avait été enregistrée. En cas de mal être: blessure, poids trop faible (si la perte de poids est de plus de 20%), déshydratation, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La lignée de souris transgéniques (M83) exprimant l’alpha-synucléine humaine sera utilisée et exposée (ou non) au mélange de pesticides via l’alimentation, parallèlement aux souris Bl6/C3H, fond génétique de la lignée M83. Les travaux sont proposés à partir de la lignée de souris transgéniques M83 exprimant l’alpha-synucléine humaine mutée A53T. Ce modèle murin, dont l’agrégation protéique est facilitée par la mutation, permettra d’évaluer l’impact du mélange sur la neuropathologie. Nos résultats préliminaires montrent la présence très précoce d’alpha-synucléine phosphorylée en sérine 129 dans les ilots pancréatiques des souris transgéniques. Les souris seront exposées à l’aliment enrichi avec le mélange de 6 pesticides à partir de l’âge de 4 mois (stade adulte) pour nous conformer à la publication de référence.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, réutilisés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un antipsychotique en injection, une quinzaine d'examens d'imagerie sous anesthésie, puis une craniotomie avec pose d'une chambre d'enregistrement laissée en place pour six mois d'enregistrements et une trentaine d'injections intracérébrales sur animal vigile. Le porteur décrit un risque d'infection au niveau de la chambre et des lésions cérébrales possibles, mais conserve les animaux vivants pour un usage ultérieur en raison de leur "grande valeur scientifique". Il qualifie le modèle primate d'"irremplaçable", notamment pour certains traceurs d'imagerie.

Objectifs

L’aripiprazole est un antipsychotique de troisième génération indiqué dans le traitement de différentes maladies neuropsychiatriques présentant un déséquilibre dopamine-sérotonine, telles que le syndrome de Gilles-de-la-Tourette, la schizophrénie et les troubles bipolaires. Bien que son utilisation s’accroisse, les mécanismes d’action de l’aripiprazole restent peu compris. Les objectifs du présent projet sont d’identifier où et comment ce traitement agit dans les différentes régions cérébrales pour moduler de multiples fonctions cognitives et motrices.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la balance dopamine-sérotonine dans le contrôle comportemental. Ainsi, notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant le mode d’action de l’aripiprazole, désormais traitement de première intention pour de nombreux patients atteints de troubles psychiatriques. Une meilleure compréhension des mécanismes d’action de l’aripiprazole et des effets cognitifs induits par ce traitement ouvrira certainement une meilleure prise en charge thérapeutique de ces patients, avec une approche de plus en plus individualisée. En combinant différentes modalités d’imagerie cérébrale, nous allons avoir l’opportunité de caractériser comment la balance dopamine-sérotonine module l’activité neuronale de repos à l’échelle du cerveau entier. Cette balance étant défectueuse dans de nombreuses pathologies (ex : dépression, anxiété, schizophrénie, Tourette, addictions), nos résultats seront donc d’intérêt pour de nombreuses applications. En complément, l’apport de l’electrophysiologie va nous permettre d’étudier des aspects plus fonctionnels de l’action de l’aripiprazole et de la balance dopamine-sérotonine au niveau des neurones du striatum. Nos résultats devraient ainsi démontrer l’importance de cette structure sous-corticale dans le contrôle de certains biais décisionnels, et définir quels types de troubles émergent lorsque la balance dopamine-sérotonine devient dysfonctionnel dans cette région du cerveau.

Procédures

(i) Traitement pharmacologique systémique par aripiprazole en semi-chronique (plusieurs périodes de 2 semaines, injections en IM). Ces tests s’étendront sur 4 mois, afin de tester comportementalement plusieurs doses de traitement. (ii) Examens d’imagerie cérébrale sous anesthésie générale. L’action de l’aripiprazole sur les systèmes dopaminergiques et sérotoninergiques sera étudiée via 5 traceurs ciblant différents récepteurs (5 traceurs x 3 doses d’aripiprazole = 15 scans par animal). Ces imageries s’étendront sur une période de plus d’un an. (iii) Implantation chirurgicale d’un plot de tête et d'une chambre avec craniotomie sous anesthésie générale (1 fois,

Impact sur les animaux

La partie pharmaceutique du projet impliquant un traitement chronique par aripiprazole ne constitue pas une source potentiel de nuisances importantes. L’aripiprazole est une molécule fréquemment utilisée en clinique humaine avec très peu d’effets secondaires nuisibles, il est rapporté un effet sédatif et orexigène (augmente l’appétit) bien moindre que pour les autres neuroleptiques. Les imageries cérébrales vont nécessiter l’injection d’un produit de contraste pouvant induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques. Pour limiter ces risques, les imageries seront espacées d’au moins deux semaines et des analyses sanguines seront réalisées pour contrôler les enzymes hépatiques. Ainsi, aucun effet nuisible significatif n’est spécifiquement prévu suite à l’accumulation des imageries sur animal anesthésié. La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. La chambre d’enregistrement donnera sur une craniotomie (10 x 10mm) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode au moment des sessions d’expérimentation. La présence de cette chambre d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les phases d’imagerie, de pharmacologie et d’électrophysiologie de l’étude soit délétère pour la santé de l’animal. La partie de l’étude intégrant les examens d’imagerie et le traitement par aripiprazole étant classée en procédure légère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives sur écran tactile. Les animaux ayant une chambre implantée seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches invasives telles que l’électrophysiologie ou des perturbations intracérébrales. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude pré-clinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec de l’électrophysiologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle du cerveau. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, certains radiotraceurs TEP utilisés dans cette étude ne sont disponibles et utilisables que chez le primate non-humain, faisant de ce modèle un élément irremplaçable pour la conduite de cette étude.

Réduction

Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 6 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques pharmacologiques chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2). Nos approches seront réversibles et complémentaires, ce qui permettra de répéter les tests et de comparer différentes doses d’agents pharmacologiques sur les mêmes animaux pour ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les données électrophysiologiques recueillies sur quatre animaux permettront également d’atteindre un échantillon de neurones striataux importants le plus représentatif possible en fonction des différents territoires cérébraux étudiés.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Un suivi quotidien des animaux sera effectué permettant de contrôler différents facteurs tels que le poids, la prise de nourriture, le comportement social et la mobilité. Dépendamment du score des animaux sur notre grille d’évaluation comportementale, un traitement adapté sera fourni et l’étude pourra être suspendue, voir définitivement arrêtée si les points limites sont atteints. L’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité neuronale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. En combinant simultanément différentes modalités d’imagerie grâce à une caméra hybride, nous allons réduire (/2) le nombre de scans pour pouvoir collecter un jeu de données suffisants. Les animaux ne seront implantés qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Des traitements analgésiques seront utilisés en périodes pré-, per- et postopératoires. Notre grille d’évaluation de la douleur permettra d’adapter le traitement et le protocole si nécessaire en fonction de divers points limites. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiqueront comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Phylogénétiquement, ce modèle animal préclinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. -Différents troubles comportementaux ont déjà pu être induits chez le macaque suite a une perturbation d’activité localisée au niveau du striatum antérieur. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. -Toute information physiologique ou physiopathologique obtenue chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les animaux reçus sont généralement des adolescents (3 ans). Ils arrivent souvent déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. Une recommandation sera formulée en ce sens auprès de nos fournisseurs pour favoriser des groupes sociaux compatibles.