Système nerveux

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué par injection de streptozotocine, puis elles subissent des prélèvements de sang hebdomadaires à la queue et des explorations auditives sous anesthésie, par otoémissions acoustiques et potentiels évoqués, pour mesurer l'atteinte de l'audition. Le porteur indique qu'une souris perdant plus de 20 % de son poids ou montrant un mal-être sera tuée, et que toutes seront tuées en fin d'étude pour prélever les os de l'oreille. Il affirme que ces tests fonctionnels sur l'audition ne peuvent se faire que sur l'animal vivant et qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer ce protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche CBA/J Rj (ayant une fonction auditive stable sur près de 2 ans).

Bénéfices attendus

Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.

Procédures

- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives sont effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).

Impact sur les animaux

Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).

Devenir

A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie de tous les animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).

Remplacement

Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez deux souches de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la STZ fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris CBA/J Rj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.

Raffinement

Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. Les explorations fonctionnelles seront effectuées sous anesthésie gazeuse. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, -une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence au document « points limites » (The reporting of clinical signs in laboratory animals), tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2. Les animaux seront habitués à la zone d’expérimentation et aux expérimentateurs la semaine suivant leurs arrivées avant la réalisation des tests et des injections. C’est une procédure habituelle avant toute expérmentation.

Choix des espèces

La souris de souche CBA/J Rj est connue pour posséder une fonction auditive stable sur près de 2 ans. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.

590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau sous anesthésie pour bloquer localement l'expression d'un gène ou implanter une canule, puis des séances d'imagerie fonctionnelle, une partie ayant les vibrisses d'un côté coupées pendant deux semaines. Le porteur indique que le blocage de ces gènes peut provoquer des troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs, et que la privation des vibrisses induit de l'anxiété et une altération de la mémoire à court terme. Il présente ce travail comme un moyen de mieux comprendre des maladies rares comme les syndromes de Rett, d'Angelman ou de l'X fragile, les souris étant tuées pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Les pathologies du système nerveux central ne sont que faiblement couvertes par les molécules thérapeutiques actuelles et l’efficacité des traitements est parfois limitée. Ce constat est d’autant plus flagrant en ce qui concerne les maladies neurologiques rares, qui sont des pathologies très sévères et handicapantes et particulièrement mal comprises. Mieux comprendre les symptômes observés dans ces pathologies constituerait une étape importante afin de guider le développement de nouveaux traitements, adaptés au fort besoin médical chez ces patients. Dans ce contexte, nous nous focalisons ici sur des pathologies orphelines neurologiques liées à la perte de fonction d’un gène, en particulier le syndrome de Rett, le syndrome d’Angelman, le syndrome de l’X fragile et la maladie de Niemann-Pick de type C. Ces maladies se développent dès l’enfance et provoquent des symptômes très invalidants (des troubles cognitifs, moteurs, sensoriels ou épileptiques notamment). Les traitements existants sont extrêmement limités actuellement et ne couvrent que peu de symptômes. Notre objectif est d’étudier par différentes techniques de neuroimagerie l’impact du blocage de l’expression des gènes responsables de ces maladies de manière locale dans le cerveau chez la souris. Cette étude permettra à la fois de répondre à des questions cruciales concernant le rôle respectif des gènes d’intérêt dans ces maladies, et de disposer de modèles animaux ainsi que de biomarqueurs d’imagerie permettant l’évaluation de futurs candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du systeme nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels, en particulier les maladies orphelines génétiques pour lesquelles les rôles des gènes impliqués sont encore mal connus, et les mécanismes cérébraux conduisant aux symptômes sont peu établis. Notre stratégie consiste à étudier quelles sont les altérations de l’activité cérébrale qui sous-tendent les symptômes de ces pathologies. Les bénéfices attendus sont donc une meilleure compréhension de ces pathologies orphelines, et permettront de guider le développement de candidat-médicaments futurs grâce à l’identification des paramètres qui sont altérés de manière significative en imagerie.

Procédures

La quasi-totalité des animaux utilisés dans l’étude auront une unique intervention de chirurgie stéréotaxique, toujours sous anesthésie générale et analgésie d’une durée d’1h30 environ pour permettre : - L’injection stéréotaxique d’un vecteur permettant le blocage de l’expression d’un gène - Et/ou l’implantation stéréotaxique d’une canule pour l’imagerie par photométrie à fibre A la suite de cette intervention de chirurgie stéréotaxique des souris seront utilisées pour un unique examen d’imagerie fonctionnelle ultrasonore qui est non-invasif mais réalisé sous anesthésie générale (durée d’une heure). D’autres souris seront utilisées pour un total de deux examens d’imagerie fonctionnelle ultrasonore, toujours sous anesthésie générale, séparés par deux semaines. Pendant ces deux semaines, ces souris seront anesthésiées tous les deux jours pendant 5 minutes par isoflurane ; des souris auront les vibrisses coupées du côté gauche pendant cette anesthésie. Enfin, les souris implantées avec canule seront utilisées pour un unique examen d’imagerie photométrique, avec pour la plupart un examen de tomographie par émission de positons réalisé dans la foulée. La photométrie et la captation du radiotraceur se font chez la souris éveillée et libre de ses mouvements, puis l’imagerie par tomographie se fait chez la souris anesthésiée (pendant 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le blocage de l’expression des gènes en question sera susceptible de provoquer des symptômes neurologiques (troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs) chez les animaux. Néanmoins, comme ce blocage n’aura lieu que dans une petite zone (contrairement aux patients) nous prévoyons des troubles légers survenant quelques jours après l’injection, similairement à de précédentes études utilisant des approches similaires (par exemple des atteintes transitoires des réflexes, ou encore des troubles de la mémoire et des interactions sociales dans des modèles rongeurs du syndrome de Rett avec déficience localisée du gène). Concernant la privation des vibrisses d’un côté pour une des procédures, il est rapporté qu’une privation chronique des vibrisses droites et gauches produit des symptômes légers d’anxiété et d’altération de la mémoire à court terme. Des symptômes similaires pourraient survenir durant les 2 semaines de privation que nous envisageons. Les chirurgies telles que l’injection stéréotaxique des vecteurs ou l’implantation de la fibre peuvent causer une douleur, elles seront donc réalisées dans un état d’anesthésie générale, et sous analgésie.

Devenir

De part la nécessité de prélever les cerveaux pour des analyses post-mortem, tous les animaux à la fin des procédures seront mis-à-mort.

Remplacement

La complexité des pathologies étudiées ne peut pas être reproduite exclusivement par des modèles in vitro, dont l’utilisation est préalable à cette étude (l’efficacité des séquences shRNA est notamment évaluée au préalable sur des cultures cellulaires). Pour comprendre l’impact du blocage de l’expression des gènes d’intérêt dans le cerveau en conditions réalistes, il nous faut travailler chez l’animal vivant, afin de pouvoir établir des parallèles avec les maladies observées chez les patients et évaluer des processus physiologiques pertinents tels que la connectivité fonctionnelle entre aires cérébrales, ou encore la sensibilité à des stimulations sensorielles extérieures. De plus, ces travaux permettront d’établir des modèles animaux et des biomarqueurs in vivo pour l’évaluation de futurs candidats-médicaments, dont l’efficacité devra être vérifiée chez l’animal avant passage à l’humain.

Réduction

Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, le nombre d’animaux par groupe a été estimé à 8 sur la base d’un calcul de puissance statistique et nous prévoyons 2 animaux supplémentaires en cas d’échec éventuel de la chirurgie. Puis les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests statistiques selon les paramètres évalués. La validation du déficit local d’expression des gènes d’intérêt sera systématiquement effectuée au démarrage de l’étude pour vérifier l’impact des vecteurs sur les gènes d’intérêt avant toute utilisation des animaux en imagerie. Les mêmes animaux effectueront les examens d’imagerie comme la photométrie et la Tomographie par Emission de Positons de manière à réduire le nombre d’animaux final.

Raffinement

L’injection stéréotaxique sera réalisée sous anesthésie générale et locale, et analgésie générale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce a une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés au modèle. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boites ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce pour laquelle l’impact comportemental d’une inactivation des gènes d’intérêt est connu, parfois en lien avec des régions particulières du cerveau, ce qui nous apporte des informations précieuses sur les régions à cibler dans notre approche locale, et permettra une comparaison des données de la littérature avec nos propres résultats. A l’inverse, nos résultats seront intéressants pour la communauté scientifique car ils apporteront des informations spatiales et temporelles plus précises sur le rôle des gènes d’intérêt. De plus, la souris est une espèce idéale pour l’utilisation de notre dispositif d’imagerie cérébrale ultrasonore, car l’épaisseur restreinte du crâne permet un passage des ultrasons et une qualité d’imagerie suffisante dans des conditions non invasives. Des études précliniques ont montré que l’inactivation tardive de certains gènes chez la souris adulte produit un décours de la pathologie similaire à une inactivation embryonnaire. Pour d’autres gènes, plusieurs arguments suggèrent également une importance du maintien à l’âge adulte de ces gènes notamment pour le maintien de la plasticité synaptique. Cette question est cruciale sur le plan clinique étant donné que le diagnostic de ces pathologies survient habituellement tardivement par rapport au stade de développement du cerveau. Il est donc important de savoir si corriger le déficit d’expression du gène après une maturation avancée du cerveau peut suffire à améliorer la qualité de vie des patients. C’est pourquoi nous souhaitons utiliser des souris adultes afin de mieux caractériser le rôle de ces gènes d’intérêt à ce stade. Notre approche par injection locale de vecteurs est particulièrement adaptée à cette problématique puisqu’elle permet de contrôler à la fois la localisation et le moment où le gène devient déficitaire.

40 souris vont être utilisées, gardées vivantes pour être réutilisées ensuite dans d'autres expériences, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant six jours un régime supplémenté en tamoxifène, qui peut leur faire perdre du poids, puis passent un test de mémoire consistant en une tâche motrice d'environ une heure deux jours de suite. Le porteur admet ne pas savoir si la perte de poids tient à l'appétence des aliments ou à des effets métaboliques. Il affirme qu'il n'est "pas possible" d'étudier la mémorisation pendant le sommeil autrement que sur des animaux vivants.

Objectifs

Le TNFα produit par les microglies contrôle l'activité des synapses inhibitrices dans le cortex et de ce fait, modifie certains paramètres du sommeil comme la structure des ondes lentes. Les ondes lentes sont necessaires à la consolidation de la mémoire par le sommeil. L'objectif de ce projet de montrer le TNFα microglial est necessaire à la consolidation de la mémoire par le sommeil

Bénéfices attendus

Quasiment toutes les pathologies du cerveau sont accompagnées de troubles du sommeil. D'autre part, toutes ces pathologies présentent des signes d'inflammation du cerveau, c'est-à-dire d'activation des cellules microgliales. Notre projet propose d'étudier le lien entre l'activation microgliale et les troubles du sommeil.

Procédures

Les souris seront exposées pendant 6 jours à un régime supplémenté en tamoxifen. Il est possible qu'elles perdent du poids pendant cette période. Nous n'avons pas identifié si cette perte de poids est due aux aliments qui seraient moins appétant ou à ses effets métaboliques. Les animaux feront ensuite un test de consolidation de la mémoire qui consiste en une tache motrice pendant environ 1h deux jours de suite

Impact sur les animaux

Il est possible que les animaux perdent du poids de manière transitoire lors du changement de régime. La manipulation des souris et le test d'apprentissage lui même sont susceptibles d'engendrer du stress et de l'inconfort aux souris.

Devenir

À l'issue des tests comportementaux, les animaux seront remis en cage de maintien sans autre manipulation. Aucune euthanasie ou prélèvements ne sera nécessaire dans le cadre de ce projet. Les animaux pourront être réutilisés par la suite dans d’autres expériences.

Remplacement

Il n'est pas possible d'étudier la mémorisation pendant le sommeil autrement que sur des animaux vivants.

Réduction

Nous utiliserons 40 souris soit deux groupes de 20 animaux. C'est selon l'article sur lequel nous fondons notre étude et les expériences précédentes d'apprentissage réalisées dans le laboratoire, le nombre minimal pour arriver à des résultats significatifs. Les resultats seront analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les souris sont stabulées en cages ventilées et leur milieu est enrichi par des copeaux de carton. Elles sont controlées tous les jours par du personnel compétent et seront sorties du protocole si elles atteignent un point limite. Pour réduire au maximum l'inconfort et le stress des souris, elles seront habituées à être manipulées tous les jours de la semaine précédent l'experience. Le jour de l'expérience, elles seront introduites dans la salle d'expérimentation 1h avant le début du test et celui-ci ne dure pas plus d'un heure, pour ne pas perturber trop leur sommeil. Enfin, l'appareil sur lequel se fera le test est concu pour que les souris qui ratent leur essai ne tombent que de quelques centimetres pour diminuer le stress lié à l'essai et les risques de blessures.

Choix des espèces

Travailler sur la souris permet de travailler dans la continuité de nos études précédentes. Puisque notre but est ici d'étudier le role du TNFα produit par la microglie, nous n'avons comme seul outil disponible les outils génétiques chez la souris. Les expériences se feront sur des jeunes adultes entre 2 et 5 mois qui est une période classique d'étude des comportements d'apprentissage liés au sommeil.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit de la lidocaïne et de l'ibuprofène puis est posée sur une plaque chauffée à 55 °C jusqu'à une réaction d'évitement, et reçoit une injection de carraghénane provoquant un œdème, pour tester une libération contrôlée de ces molécules encapsulées. Le porteur reconnaît que les souris témoins, privées d'anesthésique et d'anti-inflammatoire, ressentent une douleur de brûlure plus vive et une gêne à l'oreille. Il affirme que ces systèmes biologiques complexes ne peuvent pas être reproduits in vitro ou in silico.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de concevoir des objets macroscopiques permettant la libération d’une molécule « active » encapsulée dans une matrice de biopolymère mise en forme par un procédé thermomécanique, tel que l’impression 3D, avec une quantité et une vitesse personnalisée à l’utilisateur. L’un des principaux leviers sera la structure poreuse de l’objet qui lui sera attribuée par le procédé. Cette approche ouvre la voie à l’impression -dite 4D- d’objets biopolymères 3D pour une libération de petites molécules en temps contrôlé (4ème dimension), avec des applications possibles dans divers domaines, comme l’ingénierie tissulaire, ou la galénique. En effet, dans le domaine pharmaceutique, la délivrance contrôlée de médicaments constitue un enjeu thérapeutique de première importance. Actuellement, la tendance forte est d’utiliser des polymères naturels pour atteindre ces objectifs

Bénéfices attendus

Les travaux réalisés antérieurement au laboratoire ont montré que des compositions à base de zéine, principale protéine de stockage du maïs, présente un potentiel important, notamment grâce à leur mise en œuvre possible à l’état fondu et aux capacités d’interaction de la zéine avec des molécules d’intérêt thérapeutique. Par ailleurs, les Principes Actifs pharmaceutiques - Liquides Ioniques (PA-LI) sont très prometteurs pour de futurs médicaments, car ils peuvent être facilement dosés et transformés afin d’obtenir des produits pharmaceutiques présentant un franchissement rapide des parois cellulaires et une stabilité importante. L’inclusion d’un PA-LI dans une matrice biopolymère, telle que la zéine plastifiée, permet non seulement de faciliter sa mise en forme, mais aussi d'assurer sa conservation et ensuite sa libération. Parmi eux, le [Lidocaïnium][Ibuprofénate] (LidIbu), présente un triple intérêt : (i) un effet plastifiant sur les biopolymères et deux rôles thérapeutiques, avec (ii) le cation, Lidocaïnium, comme anesthésique local et (iii) l'anion, Ibuprofénate, en tant que composé anti-inflammatoire

Procédures

Pour chacune des souris 2 procédures seront réalisées à deux jours d'intervalle. Pour la première, après injection de la lidocaïne et de l'ibuprofène (soit par gavage soit par voie intrapéritonéale) la souris sera déposée sur un tapis chauffé à 55°C, jusqu'à ce qu'elle manifeste un signe d'évitement à 30min, 60min et 2H. Il y aura donc une injection par souris et puis 3 positionnement sur plaque chauffée à 55°C. Pour la deuxième procédure, après injection de la lidocaïne et de l'ibuprofène (soit par gavage soit par voie intrapéritonéale) la souris est anesthésiée et reçoit une injection de carraghénane avant la mesure de l'oedème à 30 min, 60 min et 2h. Il y aura donc deux injections et une anesthésie sur chaque souris lors de cette procédure.

Impact sur les animaux

Pour les souris contrôles, une douleur plus aigûe de brûlure pourra être ressentie lors du test de la plaque chaude car elles n'auront pas eu l'anti-inflammatoire ni l'anesthésiant. Egalement elle ressentiront une gêne et douleur à l'oreille plus grande que leur congénère lors du test de l'inflammation induite par le carraghénane.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de la deuxième procédure car elles ne peuvent plus être utilisées pour un autre protocole car elles ont reçu en injection des molécules pharmaceutiques.

Remplacement

Impossible de prendre des mesures de remplacement car on ne peut pas reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes uniquement par des systèmes in vitro ou in silico, notamment la réaction à la douleur lors de tests de molécules pharmaceutiques.

Réduction

Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques adaptés.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 4 ou 5 par cage selon les groupes dans un environnement enrichi ( 2 enrichissements) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences

Choix des espèces

Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire uniquement par des systèmes in vitro ou in silico. Ainsi, l'expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Les souris seront au stade de jeunes adultes (6 semaines), âge auquel leur système immunitaire est mature et pleinement fonctionnel

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

130 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 100 d'entre elles tuées à l'issue et 30 remises en élevage pour la reproduction. Chaque souris reçoit une injection d'un produit convulsivant dans la veine de la queue et subit une crise, pour préciser la position d'un gène soupçonné d'être impliqué dans l'épilepsie. Le porteur décrit le stress de la contention et de la crise ainsi que la douleur possible d'une mauvaise pose de l'aiguille. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible, seul le test sur l'animal révélant selon lui la sensibilité aux convulsions.

Objectifs

Une étude réalisée par nos soins a permis de révéler que la partie distale du chromosome 4 de la souris est impliquée dans le contrôle des convulsions liées à l’épilepsie. Ce travail a permis de réaliser qu’il existe probablement un gène, nommé Bis1, dans la partie terminale du chromosome 4 comme impliqué dans les convulsions, sans être pour autant capable de l’identifier ni même connaitre sa position. Dans le but de préciser sa localisation, nous avons développé par croisements élaborés, des souris qui permettront, après tests de convulsions, de renseigner sur cette position aujourd’hui inconnue. Le projet présenté ici recouvre l’ensemble des expériences qui seront menées pour informer sur la position de ce gène. A terme, il est envisagé de rechercher chez l’homme, s’il existe un gène équivalent dans la région homologue à la région chromosomique de la souris.

Bénéfices attendus

Plusieurs études chez l’animal ont montré qu’il existe un gène impliqué dans l’épilepsie dans une région particulière du chromosome 4 de la souris. Il reste maintenant à identifier quel est ce gène. Les stratégies d’identification d’un gène nécessitent que la région chromosomique où on soupçonne la présence du gène soit relativement restreinte. Dans ce but, nous avons créé des lignées de souris particulières qui permettront de réduire la taille de ce fragment chromosomique après que les lignées seront testées pour leur capacité à manifester des crises.

Procédures

Contention et infusion dans la veine de la queue, 1 fois par souris sur d’une durée maximale de 5 min.

Impact sur les animaux

La contention de l’animal ainsi que la crise convulsivante peuvent entraîner un stress. La pose de l’aiguille peut entraîner une douleur.

Devenir

En fin de procédure une partie des animaux sera remise en croisement dans le système d’élevage (30/130) et l'autre (100/130) sera mise à mort ne pouvant pas être réutilisée pour une autre procédure car les effets d’une deuxième injection aurait un effet contraire, protecteur contre les crises d’épilepsie.

Remplacement

Seule une approche empirique et expérimentale en testant l’animal, permettra d’identifier quelles lignées présentent une sensibilité à la convulsion. Il n’y a donc pas de remplacement possible.

Réduction

Par expérience, nous savons que des tailles de groupe de 12 souris permettent d’estimer si ce groupe diffère d’un groupe de référence ou pas. Nous testerons donc 12 souris pour chacune des 4 lignées appelées à permettre un positionnement plus précis du gène. Nous testerons 20 souris pour chacune des 3 lignées de référence auxquelles les 4 lignées précédemment mentionnées seront comparées. Effectivement, une meilleure estimation de la capacité à présenter des crises chez les lignées de référence est nécessaire pour obtenir la puissance statistique requise pour atteindre les objectifs de l’étude. La statistique réalisée reposera sur l’emploi du t de Student.

Raffinement

Dans notre situation, seule de la douleur pourrait être induite durant le test par une mauvaise pose de l’aiguille à ailettes dans la veine de la queue de la souris. Deux techniques expérimentales seront engagées pour minimiser le risque de mauvaise pose de l'aiguille à ailette. D’une part, la veine de la queue sera dilatée par immersion de la queue durant 2 min dans un bain à 45°C. D’autre part, nous utiliserons un illuminateur de queue permettant de mieux visualiser la veine de la queue. L’expérimentation sera arrêtée après 2 tentatives de pose infructueuse de l’aiguille à ailettes. On s’attachera par une observation visuelle attentive, à vérifier qu’aucune boursouflure de la queue n’apparaisse durant le test. Auquel cas, le test serait arrêté et l’animal exclu et mis à mort. Lorsque la pose de l’aiguille à ailettes sera réalisée, le volume disponible pour la mobilité de la souris dans le tube de contention sera augmenté pour favoriser le confort de l’animal. Enfin les expériences seront réalisées par des expérimentalistes aguerris à la technique de l’infusion par la veine de la queue chez la souris. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel et des critères d'arrêt ont été définis en cas d'atteinte des points limites.

Choix des espèces

L’espèce souris est l’espèce retenue pour la raison unique que ce travail prolonge un travail initial réalisé sur la souris. La souris et le rat sont les deux espèces majoritairement retenues pour l’étude des épilepsies et des convulsions car elles représentent un compromis optimal lorsqu’on prend en compte l’homologie avec l’homme, le coût de l’élevage, les aspects éthiques incitant à employer des espèces dites « inférieures », la rapidité de reproduction. L’intérêt supérieur de la souris sur le zebra fish réside dans la faculté de la souris à supporter la consanguinité. Les souris seront testées à l’âge de 11±1 semaines lorsque les souris, mâles comme femelles, auront acquis leur pleine sensibilité au convulsivant utilisé. Fortuitement, cet âge correspond aussi à un stade de développement corporel favorisant le taux de réussite de l’infusion par la veine de la queue.

2 592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès un à deux jours après la naissance, elles reçoivent une injection de virus dans le cerveau ou dans une veine, puis, adultes, subissent des tests de mémoire reposant sur des chocs électriques aux pattes et des tests d'anxiété, pour évaluer une thérapie génique contre le syndrome de Wolfram. Le porteur met à mort tous les animaux pour prélever le cerveau et divers organes. Il affirme que ce modèle murin est "indispensable" car il serait le seul mammifère non humain à reproduire les signes neurologiques de la maladie dans un délai court.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de la maladie n’existe et seul le traitement des symptômes (diabète principalement) permet d’améliorer l’espérance de vie des patients. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique d'une thérapie génique via l'injection de particules virales. Cette injection devrait restorer les déficits de mémoire et d'anxiété chez un modèle souris du syndrome de Wolfram. Cette étude permettra la validation de notre stratégie de thérapie génique chez le modèle murin de la maladie.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Touchant plusieurs organes, le syndrome de Wolfram est une maladie complexe qui nécessite des approches combinées. En développant une thérapie génique unique, qui sera délivrée de manière intra-cérébrale ou via la circulation sanguine, nous espérons arrêter la progression de la maladie. L'efficacité de notre thérapie génique dans notre modèle souris du syndrome de Wolfram permettra, à terme, le développement clinique de la thérapie génique chez les patients.

Procédures

Les nouveaux nés, 1 à 2 jours après la naissance, seront exposés à différentes procédures: anesthésie, administration cérébrale ou intraveineuse de vecteurs viraux. Cette injection sera unique, et n'excèdera pas 15 secondes. Suite à ce traitement, des analyses comportementales de la mémoire et de l'anxiété de ces animaux seront testées (6 à 8 tests de 30min maximum).

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront soit "légers" soit "modérés" suivant les actes. Les animaux auront, 1 à 2 jours après la naissance, une chirurgie, associée à une anesthésie, permettant l'injection de virus dans le cerveau ou dans une veine de la tête. Cette intervention pourra engendrer un léger stress chez l'animal. Afin de tester leur mémoire, les souris, à 3 mois, recevront un choc éléctrique de faible intensité et de courte durée au niveau des pattes pouvant engendrer un léger stress.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de collecter les structures du cerveau ainsi que divers organes. Cela permettra des analyses approfondies pour comprendre l'efficacité de notre traitement.

Remplacement

L'utilisation de modèles souris du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes neurologiques du syndrome de Wolfram dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet, les animaux utilisés en comportement seront ensuite euthanasiés et leurs organes périphériques et centraux collectés, complétant ainsi les groupes de souris pour les analyses tissulaires. Les croisements entre males et femelles seront optimisés afin de limiter le nombre d'animaux générés.

Raffinement

Au quotidien, nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Lors des tests comportementaux, les animaux ne seront pas séparés de leurs congénères et placés 20min avant le début du test dans la pièce d'expérimentation afin de leur permettre une habituation au nouvel environnement. Après les tests comportementaux, les animaux seront directement remis dans la cage d'origine à l'écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Durant les périodes de tests comportementaux, les animaux seront pesés avant chaque test afin de permettre un suivi du poids, toute perte de poids supérieure à 15% entrainant la sortie de l'animal de la procédure. Une grille de scorage définissant les points limites sera mise en place suite à l'injection des particules virales sur nouveau né. Un antalgique sera administré avant toute procédure afin de limiter la douleur des animaux.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie touchant de nombreux organes, pour laquelle les altérations auditives et visuelles s'accompagnent de signes neurologiques et cognitifs. Seul un modèle robuste qui mime la pathologie humaine permet de tester et caractériser, au niveau fonctionnel et biologique, l'efficacité de notre traitement par thérapie génique. Les animaux seront utilisés à différents stades de développement. Les procédures d'injection de particules virales seront effectuées 1 à 2 jous après la naissance afin de garantir une dissémination efficace. Les tests comportementaux ainsi que l'euthanasie des animaux se feront à 1mois, 3 mois et 6 mois pour permettre une vision de l'évolution du traitement dans le temps.

3 778 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent jusqu'à quatre chirurgies, injections dans la moelle ou un nerf et lésions par pincement du nerf sciatique et de la colonne dorsale, suivies de tests comportementaux nommés, test de Von Frey et test de l'autocollant, pour étudier la régénération nerveuse. Le porteur prévoit d'euthanasier les animaux qui s'automutilent ou se paralysent, signes qu'il désigne comme points limites, et met à mort l'ensemble pour prélever les tissus. Il affirme que le recours à des "organismes entiers" est "non remplaçable" et que la souris est le "standard international" du domaine.

Objectifs

Les maladies du système nerveux représentent plus de 35% de la totalité des maladies en Europe et ce chiffre est en augmentation constante en partie dû à l’allongement de la durée de vie. Toute atteinte au système nerveux central, à la différence des neurones du système nerveux périphérique, conduit à des pertes de fonctions vitales. Les patients doivent endurer une perte irréversible de ces fonctions puisqu’aujourd’hui encore aucun traitement ne permet de guérir ces lésions et de permettre la reformation d’un circuit fonctionnel. La compréhension des mécanismes moléculaires des maladies neurodégénératives et des lésions du système nerveux représente donc un défi majeur en biologie dans le but de développer des médicaments et traitements pour les patients. La principale cause de ces maladies l’incapacité des neurones de régénérer leurs axones après une lésion conduisant dans la plupart des cas à la mort des neurones concernés. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération axonale et à la survie neuronale est donc une étape clef dans le traitement de ces maladies. Le projet a pour but d’identifier de nouveaux mécanismes moléculaires qui peuvent expliquer la perte de capacité de croissance des neurones adultes et leurs susceptibilités à la mort neuronale. Ainsi, nous focalisons sur les neurones eux-mêmes et nous proposons de caractériser le rôle d’une nouvelle famille de protéine dans la régénération du système nerveux périphérique et central

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont extrêmement importants d’un point de vue fondamentale et appliqué. En effet, nos travaux vont permettre de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui permettent la survie des neurones et la régénération du système nerveux centrale. Notre projet va permettre de caractériser en détail une nouvelle voie et de définir précisément les acteurs importants pour la régénération du système nerveux. Non seulement nous allons identifier et valider de nouvelles cibles qui permettront de faire régénérer, mais nous allons aussi mettre en évidence la formation de nouveau circuit après une lésion. Ces données seront essentielles dans une optique de développement thérapeutique. En effet, nos travaux permettront le développement de thérapie innovante dans le domaine des maladies neurodégénératives mais aussi en cas d’atteinte traumatique.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à 4 procédures chirurgicales qui sont de classe modérée. Les souris peuvent subir une ou plusieurs chirurgies (selon la procédure). L'accumulation des chirurgies n'induit pas une gravité supplémentaire. Les animaux subiront: -l’injection intra-thécal : les souris sont endormies environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, injection et suture) est de 5 min, l’injection en elle-même durant 5 secondes - l’injection intra-nerveuse : les souris sont endormies pour environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, injection et suture) est de 10 min, l’injection en elle-même durant 5 minutes - la lésion du nerf sciatique : les souris sont endormies environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, lésion et suture) est de 5 min, la lésion correspondant à 2 pincements de 15 et 10 secondes. - la lésion de la colonne dorsale : les souris sont endormies pour environ 30 min. La durée totale de manipulation (ouverture de la peau, lésion et suture) est de 20 min, la lésion correspondant à 3 pincements successifs de 10 secondes. Les animaux subiront les désagréments liés à l’anesthésie et à la plaie qu'implique les injections et/ou les lésion qui se caractérise essentiellement par une douleur modérée. Les souris participeront à deux tests de comportement pour analyser le retour sensitif. Pour le test de Von Frey, les souris sont acclimatées durant 1h dans la pièce et 10min dans la cage pour le test. Les souris sont testées durant 5min. Pour le test de l’autocollant, les souris sont acclimatées durant 1h dans la pièce, 5min dans la nouvelle cage et elles sont testées 2 fois 5min. Elles sont testées durant 6 semaines avec une fréquence de une fois par semaine.

Impact sur les animaux

Toutes les chirurgies pratiquées dans le cadre de ce projet sont de classe modérée. Les souris subiront les désasgrements liés à la présence d'une souture qui sera refermée avec des agrafes, potentielles source de stress. Une legère perte de mobilité est observée dans les premières heures suivant le réveil après la lésion du nerf sciatique et/ou de la moelle. Cette diminution ne doit pas excéder les 6h post traitement sinon elle sera comptée comme point limite de la procédure. Une légère douleur est à prévoir pour les injections et la lésion du nerf sciatique. On anticipe une douleur plus importante immediatement après reveil suivant la lésion de la moelle. Les deux cas sont traités de manière spécifique dans chaque procédure. Les tests de comportement sont des tests sensitives qui n'induisent pas de douleurs. Un léger stress peut etre occasionné lors du changement de pièce ou de cage pour les tests.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de récupérer les structures d'intérêt. De ce fait, les animaux ne peuvent pas être réutiliser.

Remplacement

Pour atteindre nos objectifs, les modèles murins sont essentiels et non remplaçable car i) les paradigmes de lésion chez la souris sont les mêmes que chez l’humain, ii) un très grand nombre de lignées de souris transgéniques sont déjà disponibles pour nos recherches et iii) les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents acteurs (neurones, cellules gliales, environement de la lésion…) et ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Le modèle murin est le standard international reconnu dans le domaine.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : -La validation systématique de toutes nos préparations de matériel biologique pour s’assurer de leur efficacitées avant les manipulations -L’entrainement systématique de toutes personnes qui pratiquent les experiences pour ne pas perdre d’animaux du à de mauvaise chirurgie. -L’utilisation de test statistique optimal pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Enfin, seules les candidats validés dans les procédures in vitro seront testés in vivo.

Raffinement

Les animaux qui auront subi une intervention chirurgicale seront observés quotidiennement et seront pesés aux moins deux fois par semaine. Pour l’ensemble des procédures, le poids des souris sera vérifié dans la phase chronique de la lésion soit pendant une semaine post-chirurgie. Si une perte de poids est constatée ou que les souris explorent peu l’environnement, nous fournirons les croquettes de nourriture, de l’eau gélifiée ainsi que de la nourriture enrichie (boost) directement dans la cage. Si la perte de poids excède les 20% la souris sera alors euthanasiée. Nous serons attentifs à leur comportement : pour l’entretien du poil en cas de doutes, nous en discuterons avec le vétérinaire réfèrent. En cas de prostration des souris, nous euthanasierons les animaux. Nous serons vigilants au bien être des souris : elles recevront du paracétamol (4mg/mL) dans leur eau de boisson 24h avant l’intervention et ce pendant 48h. Dans les expériences de lésion du nerf sciatique, notre protocole expérimental prévoit de sacrifier les animaux 3 jours après la lésion du nerf sciatique. Ce délai court ne permet pas de voir les signes d’allodynie. Néanmoins, nous appliquerons les procédures de prise en charge de la douleur et du bien-être animal décrits ci-dessus. Pour les lésions de moelle épinière (pincement de la colonne dorsal), immédiatement après la chirurgie, les souris recevront une injection sous cutanée de buprenorphine (0.05mg/kg) et les animaux seront placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température au niveau de la cage. Les yeux des souris seront protégés tout au long de la procédure par ajout de gel (ocry-gel). Si l’animal s’automutile (cas rares) au niveau des pattes, l’animal sera euthanasié. Dans le cas où les sutures sont effectuées avec des agrafes, une attention particulière sera apportée au suivi de la suture. Si les animaux arrachent et/ou déplacent les agrafes, les animaux seront endormis, la suture sera nettoyée et désinfectée et de nouvelles agrafes seront mis en place. Les interventions sur la moelle (injection et lésion) sont superficielles. Dans ce contexte, nous n’induisons pas de paralysie des pattes arrière, de la queue ou de l’inhibition des fonctions urinaires. Après chirurgie, si nous constatons une paralysie, cela suggère que nous avons touché la mauvaise partie de la moelle épinière et cela représente un point limite où les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le projet consiste à comprendre les mécanismes liés aux maladies neurodégénratives et aux lésions traumatiques de la moelle épinière chez l'homme dans le but de développer de nouveaux traitement. De nombreuses études ont été menées in-vitro dans des modèles de cultures cellulaires primaires. Ces études ont identifié un certain nombre de facteurs avec un potentiel dans pousse axonale. Malheureusement, la plupart des études basées sur ces données ont été un échec une fois testées in-vivo. Ainsi l’utilisation d’organismes entiers est nécessaire. La souris représente le standard dans la communauté scientifique pour étudier les mécanismes de régénération in-vivo avec une grande similitude par rapport à l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autre modèle telle que le poisson zebre dont le système nerveux central régénère spontanement ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les paradigmes scientifiques que nous utilisons. La souris permet aussi l’utilisation de test de comportement pour analyser le retour fonctionnel. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles telle que le rat.

210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Isolées en cage individuelle dès l'âge de 20 jours, elles subissent une batterie de tests comportementaux dont le détail n'est pas précisé, un placement en obscurité constante pendant deux à trois semaines et des chirurgies cérébrales avec ou sans réveil, injection d'un traceur dans l'œil ou d'un virus dans le cerveau, pour étudier les effets d'une exposition lumineuse à l'adolescence. Le porteur nomme l'isolement, la privation de lumière et la chirurgie comme sources de stress et de douleur. Il affirme que ces tests ne peuvent pas être menés in vitro et exigent des expériences à l'échelle de l'animal entier.

Objectifs

Depuis un siècle, l'éclairage environnemental est passé d'un rythme solaire naturel à un cycle lumineux artificiel et souvent irrégulier. Les sources d'éclairage moderne (LED) sont de plus en plus répandues et sont utilisées dans de nombreux appareils électroniques de notre vie courante (smartphone, tablette, etc...). Selon la fondation nationale du sommeil, 75% des enfants laissent un appareil électronique dans leur chambre quand ils dorment, et 60% des adolescents déclarent interagir avec leur écran durant l’heure précédant leur coucher. L’exposition à la lumière le matin a un effet bénéfique en synchronisant le système circadien avec le cycle environnemental jour/nuit, en augmentant la vigilance et la cognition et dans le traitement de la dépression. A l’inverse, une exposition anormale à la lumière (ALE), la nuit, altère nos rythmes biologiques, la cognition et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'Homme. Cet effet est médié par une cellule photosensible spécifique de la rétine : la cellule ganglionnaire à mélanopsine. Les adolescents sont très sensibles à divers facteurs de l’environnement, y compris la lumière. Ils représentent donc une population particulièrement à risque car 1) l'apparition de la plupart des maladies mentales survient avant l'âge de 25 ans et 2) ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Ce projet propose une analyse multidimensionnelle allant de la cellule au comportement de l’animal. Nous proposons d'étudier si l'exposition anormale à de la lumière, pendant la période de l'adolescence, contribue à l’altération des fonctions circadiennes (rythmiques), affectives et cognitives à l'âge adulte.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet aura des résultats déterminants tant au niveau fondamental que clinique. Il permettra tout d'abord de décortiquer la relation entre une exposition aberrante à la lumière à l’adolescence et le développement des troubles circadiens / affectifs / cognitifs à l’âge adulte. A plus long terme, de nouvelles stratégiespourront être élaborées et proposées pour limiter les effets négatifs d’une surexposition à la lumière chez les adolescents.

Procédures

Les interventions prévues sont listées ci-dessous : 1) Tout d'abord, les animaux seront isolés dans des cages individuelles à partir de 20 jours d’âge et jusqu’à la fin de l’expérimentation (P20 à l'âge adulte, procédures 1-4). 2) Ensuite, à l'âge adulte, les animaux subiront une série de tests comportementaux pour évaluer le système circadien, l'humeur et la cognition. Ces tests seront réalisés d'un degré de sévérité légère à sévère et séparés les uns des autres d'au moins 48 h (procédure 1). 3) Les animaux subiront une chirurgie avec (procédures 2 et 4) ou sans réveil (procédure 3) . Différents groupes d'animaux seront définis. Un groupe d'animaux recevra une injection intraoculaire d’un traceur antérograde (procédure 2) sous anesthésie générale et locale renforcée si besoin et l'expérimentation durera environ 30 min ). Un second groupe d'animaux recevra, sous anesthésie générale, l’injection d’un virus en intracérébral (30 à 45 min) pour activer spécifiquement les neurones d'intérêt (procédure 4). Enfin, un dernier groupe sera anesthésié par voie générale afin de mesurer l’activité neuronale par éléctrophysiologie dans les structures cérébrales d’intérêt. Cette intervention durera entre 2 à 2h30, et est sans réveil (procédure 3).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes nuisances listées ci-dessous : 1) Stress lié à l'isolement des animaux en cage individuelle à partir de 20 jours d'âge et jusqu’à l'âge adulte afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. 2) Stress lié à la réalisation d'une batterie batterie de tests comportementaux permettant d'évaluer le système circadien, l'humeur et la cognition. Ces tests, réalisés chez les souris adultes, seront espacés les uns des autres de 48 h minimum et réalisés d'un degré de sévérité moindre à élevé. 3) Stress lié au placement des animaux adulte à l’obscurité constante pendant 15-20 jours . Le placement de l’animal en condition constante (obscurité constante) est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien (période endogène, décalage de phase comportemental). 3) Douleur éventuelle liée à la réalisation d'une chirurgie avec ou sans réveil et qunatifiée à l'aide d'une grille de score de la douleur.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélévements de tissus post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d'évaluer l'impact d'une exposition aberrante à la lumière durant l'adolescence sur le système circadien, la cognition et l'humeur. Ces études ne pouvant êre reproduites in vitro, le projet nécessite la réalisation d'expériences dans un environnement intégral, à l'échelle de l'animal. De plus, ce projet fait appel à des modèles murins sauvages et transgéniques sélectionnés car ils permettent d'aborder différents aspects scientifiques de notre projet.

Réduction

Pour réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons des approches non invasives (comportement) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Les animaux utilisés lors des approches non-invasives seront utilisés dans le cadre d'une procédure ex-vivo. - Plusieurs prélèvements de tissus sont réalisés chez le même animal, et certaines mises au point techniques seront réalisées en utilisant le même animal.

Raffinement

Durant toute la durée des procédures et afin de mesurer le rythme de l'activité locomotrice, les souris,à partir de 20 jours d'âge, seront placés individuellement dans des cages et mis dans une armoire avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent voir leurs congénères et ont aussi accès à leurs odeurs et bruits. De plus, pour palier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (nid végétal à base de fibres de coton). Un igloo ne peut être mis car il interfère avec le signal enregistré par les capteurs infrarouges pour mesurer l'activité. Les procédures utilisées sont de sévérité légère à sans réveil. Une grille de score de la douleur sera utilisée.

Choix des espèces

L’objectif du projet est d’évaluer les conséquences d’une exposition aberrante à de la lumière bleue chez l’adolescence sur le système circadien, l’humeur et la cognition. Cette période de stimulation lumineuse aura lieu entre 20 à 40 jours d'âge (stades postnataux P20 à P40). L’impact de cette exposition sera ensuite évalué chez des animaux au stade adulte (entre 2 à 4 mois). Ce projet fait appel à un modèle murin sauvage et un modèle murin transgénique déficient en une opsine, la mélanopsine (Opn4-/-). Cette espèce a été sélectionnée car 1) elle est nocturne et sera comparée à une espèce de rongeur diurne et 2) elle permet d'accéder à un modèle transgénique déficient en mélanopsine, photorécepteur connu pour son implication dans le traitement de l'information lumineuse. Elle représente donc un modèle privilégié pour notre projet.