Système nerveux

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit huit injections d'antigène, souvent couplées à l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, un antigène différent empêchant selon lui toute réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable" et qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (20 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des chocs électriques pour induire un état de stress post-traumatique, d’autres subissent une chirurgie du cerveau de plus de trois heures pour implanter une fibre optique, avec un isolement de quatorze jours et des tests de peur et d’anxiété, pour tester une stimulation cérébrale censée accélérer l’extinction de la peur. Le porteur reconnaît que l’isolement prolongé ajoute un stress et que le modèle n’est pas transposable directement à l’humain. Il affirme qu’aucune méthode in vitro ne permet d’étudier ce trouble reposant sur le comportement de l’animal vivant.

Objectifs

Il existe plusieurs modèles murins permettant de mimer différents aspects du trouble de stress post-traumatique (PTSD). Le plus utilisé est basé sur le principe de conditionnement de peur au contexte où un contexte nouveau est associé à un événement aversif (chocs électriques). Les souris se rappelleront que l’évènement aversif a eu lieu spécifiquement dans ce contexte et en auront peur lorsqu’elles y seront réexposées. Dans le cas d’un évènement aversif léger, en réexposant l’animal de façon répétée au contexte sans choc électrique, l’expression de la peur associée devrait diminuer jusqu’à disparaitre. Les souris comprennent qu’il n’y a plus de danger dans ce contexte. Ce processus, nommé extinction de peur, est défaillant dans le cas du PTSD. Il est donc important que, chez la souris, la peur associée au contexte persiste après plusieurs réexpositions au contexte. De plus, des traits caractéristiques du PTSD (anxiété, trouble de la mémoire, évitement, hypervigilance, freezing ou immobilité lié à la peur) peuvent être observés à l’aide de différents tests comportementaux. Pour cette étude, nous voulons montrer qu’en activant le cortex infralimbique (zone du cerveau responsable de l’extinction de peur chez la souris) lors du rappel de l’évènement, nous arrivons à accélérer et accentuer l’extinction et que cette amélioration engendrerait une diminution des symptômes associés au PTSD.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, nous démontrerons que les symptômes du PTSD persistent après plusieurs rappels de l’évènement aversif confirmant la qualité du modèle murin de PTSD. De plus, Le cortex infralimbique a été montré comme responsable de la diminution de l’expression de la peur après l’occurrence d’un évènement aversif léger et que, dans le cas d’un PTSD, son activité est largement diminué. Pourtant un nombre très limité d’étude cherche à rétablir cette activité. La technique de stimulation choisie nous permettra d’être spécifique quant à la région ainsi que les neurones stimulés, à l’inverse d’autres techniques de neurostimulations. La stimulation pouvant être effectuée sur l’animal libre de ses mouvements, nous pourrons montrer son importance au cours du rappel de l’évènement aversif. En clinique, parmi les techniques thérapeutiques utilisées aujourd’hui, les thérapies d’exposition semblent être de plus en plus pratiquées. En mettant le patient dans une situation où il est obligé de se remémorer le traumatisme de façon répété dans le temps tout en étant dans un endroit où il se sent en sécurité, les psychiatres cherchent à diminuer l’expression des émotions négatives associées. Malheureusement ces thérapies peuvent prendre du temps et ne sont pas aussi efficaces pour tous les patients. Nous voulons monter qu’en stimulant la région responsable de l’extinction, nous pouvons accélérer le processus. Même si non transposable chez l’Homme directement, cette étude nous permettra ainsi l’obtention de résultats nécessaires pour montrer l’importance de venir stimuler le cortex infralimbique pendant le rappel de l’évènement. Enfin, à ce jour, on constate qu’aucune étude sur le PTSD chez l’animal n’a pris en compte des animaux femelles, posant un problème majeur dans la mise au point de thérapie chez l’Homme

Procédures

Le projet est composé de 3 expériences ayant des objectifs différents. Au cours de la première expérience, les souris vont être divisées en 3 groupes, en fonction du fait qu’elles sont exposés à un l’administration de chocs électriques (intensité moyenne, intensité faible, pas de choc) dans un lieu donné. Trois semaines plus tard, toutes les souris sont réexposées au même lieu pendant 20min par jour sur 3 jours. Enfin, le comportement des souris est évalué à l’aide de tests évaluant la peur, l’anxiété, la mémoire, l’activité. Les souris effectueront 2 tests comportementaux par jours maximum. Pour les expériences 2 et 3, les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale de 3h-3h30 sous anesthésie gazeuse. Elle consiste en une injection dans le cerveau et la mise en place d’une fibre optique permettant d’activer les neurones à l’aide d’une stimulation lumineuse (LED). Au cours de la chirurgie, les souris recevront une injection d’anesthésique local au niveau du crâne, d’analgésique et d’anti-inflammatoire. Pour la troisième expérience, deux semaines après la chirurgie, les souris suivront un protocole de PTSD puis de 3 réexpositions au contexte 3 semaines plus tard. Les jours de réexpositions, les souris suivront ou non un protocole pour activer les neurones : celui-ci se fera sur l’animal éveillé . Il s’agira d’une session unique de 10 min (expérience 2) ou de 3 sessions de 10min (1 session par jour sur 3 jours ; expériences 2 et 3). Cette stimulation n’est pas ressentie par l’animal et n’aura aucun effet néfaste.

Impact sur les animaux

Le PTSD est caractérisé en psychiatrie par une persistance (au moins un mois) de différents symptômes envahissants comme une peur prolongée lorsque l’individu est confronté au stimulus qui a causé le PTSD. Lors de la mise au point du modèle, nous devrons vérifier ce point, et donc confronter à nouveau les animaux avec la source du stress, ce qui peut générer de l’inconfort. Toutefois, les souris ne devraient pas montrer de perte de poids importante lié à l’induction du PTSD ni de signes de mal-être dans la cage d’hébergement. Le modèle de PTSD a montré son efficacité dans plusieurs études antérieures, en particulier lorsque les souris sont hébergées seules au moins 14 jours. Nous devrons donc reproduire ces conditions d’élevage, ce qui risque d’induire un stress supplémentaire prolongé. Toutefois, les cages seront transparentes, rangées les unes à côté des autres : Les souris pourront donc se voir, s’entendre et se sentir. De plus, cette étude nécessite d’effectuer des chirurgies au niveau du cerveau. Les souris auront besoin de quelques jours pour se remettre de la chirurgie. Le cerveau n’étant pas sensible, la douleur liée à la chirurgie sera due uniquement à des aspects périphériques. Enfin, la stimulation lumineuse ne sera pas ressentie par les animaux et n’aura aucun effet néfaste mais demandera d’établir une connexion avec l’appareil de mesure à l’aide d’un câble, ajoutant une gêne dans les déplacements tant que l’animal n’y est pas habitué. Les souris seront donc habituées à cette technique dans leur cage d’hébergement plusieurs jours avant la stimulation. Cette habituation sera accompagnée d’une récompense alimentaire.

Devenir

Les 210 animaux de l’expérience 1 seront euthanasiés car ils ont été isolées ce qui peut déclencher des comportements agressifs après regroupement des animaux. En fin de d’expérience 2 et 3 tous les animaux seront destinés à l’étude anatomique et cellulaire. Pour cela, nous devons traiter le cerveau avec une solution de préservation des tissus injectée dans la circulation sanguine de l’animal euthanasié. Cette solution est nécessaire pour éviter la dégradation ou les modifications post mortem. Nous pourrons ainsi confirmer le site d’injection lors de la chirurgie et faire d’autres analyses post-mortem. Sans cela nous ne pourrons pas montrer que les résultats obtenus sont une conséquence de l’activation de la zone cérébrale visée.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le PTSD chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.

Réduction

Les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectif suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=35 sujets par groupe). Ne pouvant nous appuyer sur aucune étude conte tenue de la variabilité entre mâle et femelle, nous sommes obligé de les considérer comme des groupes séparés. Les procédures 1 et 2 sont des procédures préliminaires qui nous permettront d’arrêter l’étude si les résultats ne vont pas dans le sens attendu et nécessaire pour la suite.

Raffinement

Les effectifs sont optimisés, les observations comportementales nécessitent une taille d’effectif suffisant compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=35 sujets par groupe). Ne pouvant nous appuyer sur aucune étude conte tenue de la variabilité entre mâle et femelle, nous sommes obligé de les considérer comme des groupes séparés. Les procédures 1 et 2 sont des procédures préliminaires qui nous permettront d’arrêter l’étude si les résultats ne vont pas dans le sens attendu et nécessaire pour la suite. Les souris reçoivent un injection de buprénorphine à 0.1mg/kg en IP en début de chirurgie pour une injection de Métacam à 5mg/kg en sous-cutanée après la chirurgie. Une injection de Métacam en sous-cutanée sera effectué une fois par jour pendant les deux jours qui suivent la chirurgie. Les souris seront monitorée tous les jours pendant la semaine qui suit afin de vérifier que nous n’atteignons pas le point limite.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et la neurobiologie murine, par l’expérience du laboratoire dans l’évaluation comportementale des rongeurs ainsi que dans la mise en application de la stimulation optogénétique. La zone ciblée dans cette étude (cortex infralimbique) est un équivalent fonctionnel du cortex préfrontal ventromédian chez l’Homme. Les souris C57/BL6N seront adultes (âgées de 10 semaines) à J0 de l’expérimentation afin de comparer les effets chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

260 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne pour la pose de canules puis des stimulations cérébrales répétées destinées à provoquer aversion, évitement et troubles anxio-dépressifs, avant divers tests de comportement. Le porteur indique que cette aversion et ces troubles sont attendus et ne peuvent être évités car ils sont l'objet de l'étude. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut remplacer l'observation chez l'"animal entier" vivant.

Objectifs

Les neurones de l'aire tegmentale ventrale (VTA) constituent le point de départ du système de récompense du cerveau. Ils sont donc impliqués dans les processus motivationnels et dans la récompense, mais également dans l’aversion et dans les troubles de l’humeur (anxiété et dépression). Les neurones de la VTA sont régulés différents niveaux et notamment par des structures inhibitrices telles que la "queue de la VTA" (tVTA). Les données pionnières sur la tVTA ont conduit à de premières études fonctionnelles montrant un potentiel rôle de cette région dans les processus aversifs chez le rat. Néanmoins l’absence de marqueur spécifique de la tVTA ne permettait pas de manipuler et d’étudier spécifiquement cette région. Récemment un marqueur spécifique des neurones de la tVTA a été mis en évidence et nous avons à présent des souris permettant de manipuler spécifiquement ce marqueur et donc la tVTA. Ces souris nous permettent de spécifiquement stimuler ou enregistrer l’activité des neurones de la tVTA grâce a des approches virales Le but de ce projet est de définir le(s) rôle(s) de la tVTA dans la réponse à des stimuli aversifs. Pour se faire nous allons 1/définir si des stimulations de la tVTA sont aversive, 2/ enregistrer l’activité des neurones de la tVTA dans des taches aversives 3/définir si une stimulation chronique de la tVTA induit un phénotype anxio-dépressif. Ces expériences seront réalisées chez la souris vigile libre de ses mouvements impliqués dans diverses taches comportementales. Des souris mâles et femelles seront utilisées.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est d'étudier le rôle de la tVTA dans la réponse aux stimuli aversifs ainsi que d’évaluer une potentielle implication de la tVTA dans l’anxiété et la dépression. Le but premier de cette étude est fondamental, mais il amènera également des avancées permettant de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.

Procédures

Les animaux pourront subir une chirurgie de 1h30, et des tests comportementaux d’aversion et d’évaluation des troubles anxieux et dépressifs. Maximum 1 test par jour (allant de 5min à 6h). Des stimulations chroniques de la tVTA (20min par jour pendant 10 jours) seront également effectuées. Les animaux subiront au maximum 7 tests ce qui correspond à 20 jours de procédures. 2 tests de 1 jour de procédure pourront etre répétés 2 fois (inclue dans les 20 jours).

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induire de la douleur post-opératoire et une inflammation locale transitoire autour du dispositif des canules (peau du crane). Les stimulations de la tVTA peuvent induire une aversion (comportement d’évitement et arrêt comportemental) et le développement de troubles anxio-dépressifs. Cela est attendu et ne peut être évité, car c'est l'objet de l'étude. Les tests comportementaux génèrent un stress pendant le test. Cela est inhérent à ces tests qui interrogent le niveau d'anxiété et/ou de dépression des animaux. Cela est attendu et ne peut être évité. Le stress s'arrête dans tous ces cas à l'arrêt du test.

Devenir

les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, le développement des troubles anxio-dépressifs nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal entier vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire le nombre d’animaux, mais en obtenant le maximum d’information scientifique par test. Les effectifs ont été calculés grâce à deux facteurs. A : un calcul statistique pour calculer le nombre de sujets nécessaires pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables de notre étude. B : Les effectifs ont été augmentés de 30% pour prendre en compte la variabilité comportementale interindividuelle des animaux et d'éventuelles mauvaises positions des injections virales et des canules. En effet, la littérature et notre expérience dans le domaine de l’anxiété et de la dépression montrent une forte variabilité (physiologique) dans les niveaux de base d’anxiété et de dépression des animaux naïfs. Certains animaux naïfs peuvent montrer des niveaux d’anxiété et de dépression élevés nécessitant leurs exclusions. Ensuite, comme dans tout modèle d’anxiété et de dépression (conformément à ce qui se passe chez l’homme) tous les animaux ne montrent pas une aversion à un stimulus aversif et ne développent pas de phénotype anxio-dépressif en réponse à des stimuli aversifs répétés. Ces animaux dits résilients nécessitent une augmentation des effectifs. Ces facteurs de variabilités interindividuelles nous amènent à augmenter de 20% nos effectifs. Enfin, nous évaluons a 10 % la perte d’animaux du a des mauvais placements des injections virales et des canules pendant la chirurgie dû à la taille réduite de la structure cible. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux. 20 souris mâles ou femelles sont également ajoutées afin de réaliser des essais de chirurgie et de comportement et de raffiner au mieux les expériences

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie (température, humidité et le cycle jour/nuit contrôlé). Nourriture et boisson sont disponibles à volonté. Les animaux sont hébergés en cohorte de 2 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit inversé (lumière allumée de 21h à 9h), pour éviter les manipulations durant le temps de sommeil des animaux et ainsi diminuer le stress. Les tests comportementaux, à l’exception des tests du labyrinthe en croix surélevé basé sur l’aversion a la lumière) se fond en lumière rouge afin de limité au maximum la perturbation du cycle circadien des animaux. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement suivit afin de déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées. En cas de signes de souffrance de l’animal, des soins (désinfection, suture de plaie), une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire, une séparation (blessures entre congénères) sera réalisée après concertation avec le vétérinaire ou la SBEA. Des points limites adaptés, un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance est sont utilisé tout au long des experiences. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, elle pourrait être intégrée dans nos procédures.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris modifié génétiquement pour cibler spécifiquement la tVTA. Ceci implique l'utilisation de souris spécifique et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces Étant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à partir de 8 semaines, poids supérieur à 20g). La limite d’âge supérieur est de 1an afin d’éviter les facteurs liés au déclin cognitif des animaux âgés

338 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de quatre heures, une privation de sommeil de dix-huit heures et une épreuve d'endurance respiratoire sous contention, pour étudier le lien entre manque de sommeil et fatigue des muscles respiratoires. Le porteur relie ce travail au sevrage de la ventilation en réanimation, une retombée située dans le futur. Il affirme qu'aucune méthode substitutive comme la culture cellulaire ne peut remplacer l'étude du comportement veille-sommeil chez l'animal.

Objectifs

L’un des enjeux majeurs pour les patients en service de réanimation est le sevrage de l’aide artificielle à la respiration (ventilation mécanique). En effet, les patients en échec de sevrage chez qui il est nécessaire de maintenir la ventilation mécanique ont plus de risques de décéder au cours de leur hospitalisation en réanimation. L’endurance des muscles respiratoires joue un rôle essentiel lors du sevrage de la ventilation mécanique, puisqu’elle doit être suffisante pour permettre une respiration spontanée non assistée. Il a été proposé que le manque de sommeil puisse diminuer cette endurance inspiratoire, les patients en réanimation ayant un sommeil diminué et fragmenté. Des études ont effectivement montré chez l’être humain une diminution de l’endurance inspiratoire après une privation d’une nuit de sommeil. Une étude précédemment menée au laboratoire a démontré qu’il existe un lien entre la privation de sommeil et l’endurance inspiratoire chez le rat. Les objectifs de ce projet sont 1) de comprendre les mécanismes cérébraux à l'origine de la fatigue des muscles respiratoires suite à une privation de sommeil et 2) de tenter de limiter la fatigue musculaire en administrant des médicaments qui sont connus pour avoir un effet "éveillant"

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre une meilleure compréhension du fonctionnement du lien entre endurance inspiratoire et sommeil. Le projet devrait aussi permettre dans le futur de proposer de nouveaux médicaments pour faciliter le sevrage à la ventilation assistée pour les patients en réanimation. D'un point de plus large, ce projet ouvre la voie à des pistes thérapeutiques pour soulager les patients atteints de maladies respiratoires chroniques très souvent associées à des troubles du sommeil.

Procédures

chirurgie (4h), injection intrapéritonéale de molécules (moins de 1 min), enregistrement de l'activité de l'animal +/- privation de sommeil (18h), épreuve d'endurance respritoire (1h)

Impact sur les animaux

Stress lié à l'isolement des animaux en post chirurgie, à la privation de sommeil et à la contention lors de l'épreuve d'endurance respiratoire

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de prélever leur cerveau pour les analyses post-mortem.

Remplacement

Ces approches nécessitant des expériences comportementales avec interaction entre différents organes (système respiratoire et système nerveux) et ce en fonction de deux états très différents de l’organisme (la veille et le sommeil), il n’est pas envisageable d’utiliser des méthodes substitutives à l’expérimentation animale telles que la culture cellulaire ou les analyses informatiques.

Réduction

Des études statistiques préalables nous ont permis de définir les effectifs nécessaires à la réalisation de ce projet de façon à mettre en évidence des différences significatives tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Un calcul de puissance statistique a été utilisé pour minimiser le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des données significatives. Pour satisfaire à ces critères, ceci implique d'utiliser des groupes expérimentaux composés de 13 rats. De plus, le nombre d'animaux contrôles sera réduit en utilisant un même lot contrôle pour plusieurs molécules médicaments ayant le même solvant, il a été possible de réduire le nombre d’animaux pour ces groupes contrôles. Des tests statistiques seront utilisés pour l’analyse des résultats.

Raffinement

Nous avons planifié ce projet en gardant à l'esprit la nécessité de réduire, sinon de soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse des animaux, et dans le but d'obtenir plus d'informations pertinentes à moindre coût en termes de "mal être" animal. L’évaluation et la prise en charge de la douleur, la souffrance et l’angoisse seront effectuées lors du suivi quotidien des animaux. Des critères de points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal…). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, une pesée 2 fois par semaine, l’apport d’enrichissement spécifique aux rongeurs dans le milieu et le recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les animaux sont hébergés en groupe de deux avec accès à la nourriture et à l’eau à volonté et à un enrichissement (bâton de peuplier et baguette de papier compressé) pour assouvir leur besoin naturel de ronger. Le stress lié à la nouveauté sera diminué par l’habituation de l’animal aux différents appareils (non fonctionnels). Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus) de souche Sprague-Dawley. Il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour l’étude combinée du sommeil et de la fonction respiratoire. La lignée Sprague-Dawley a été choisie en raison d’une variabilité inter-individuelle faible et des données déjà disponibles. Âge adulte (8 semaines à 12 semaines) pour s’approcher au mieux des données de la littérature et des résultats obtenus par le laboratoire