Système nerveux
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Evaluation de l’intérêt de nanoparticules visant à dégrader le caillot au cours d’un accident vasculaire cérébral chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral est provoqué par un caillot bouchant une artère du cerveau, suivi d'une chirurgie sous anesthésie, d'observations au microscope jusqu'à deux heures et de tests moteurs, l'AVC pouvant laisser douleurs et déficits de mouvement. L'étude teste des nanoparticules censées mieux dégrader les caillots résistants sans provoquer de saignement, un bénéfice pour de futurs patients formulé au conditionnel. Le résumé insiste à plusieurs reprises sur le "confort", le "bien-être" et la douleur prise en charge, autour d'un protocole qui déclenche délibérément un AVC.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux, ou AVC, sont un problème de santé majeur dans le monde. Chaque année, ils touchent plus de 13 millions de personnes. Ils sont l’une des principales causes de décès et la première cause de handicap chez l’adulte. Un AVC se produit lorsque le cerveau ne reçoit plus suffisamment de sang. Dans la majorité des cas, cela arrive lorsqu’un vaisseau sanguin cérébral est bouché par un caillot de sang : on parle alors d’AVC ischémique. Pour traiter ces AVC, les médecins disposent d’un médicament visant à dissoudre ce caillot pour rétablir la circulation du sang. Cependant ce traitement n’est pas toujours efficace et il peut parfois provoquer des saignements dans le cerveau. Des recherches récentes ont montré que les caillots résistants au traitement contiennent des structures ressemblants à des filets et produits par des cellules sanguines. L’objectif de ce projet est de faciliter la dégradation des caillots résistants, tout en réduisant les risques de saignements liés au traitement actuel. Pour cela, nous proposons d’utiliser une enzyme capable de détruire les filets et fixée sur de très petites particules ayant elles-mêmes un effet protecteur sur les vaisseaux sanguins. Des études sur l’animal sont nécessaires pour comprendre comment ces caillots se forment dans le cerveau puis tester l’efficacité et la sécurité de ce nouveau traitement. Nous étudierons notamment son effet sur la circulation du sang et sur les handicaps après l’AVC. Ce projet pourrait, à terme, permettre de développer un traitement plus efficace et plus sûr pour les personnes souffrant d’un AVC. Tout au long de ces recherches, le bien-être animal est une priorité. L’utilisation d’animaux est strictement nécessaire, leur nombre est limité au minimum, et toutes les procédures sont réalisées par du personnel formé, avec une prise en charge de la douleur adaptée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation de petites particules protectrices des vaisseaux modifiées avec une enzyme capable de dégrader les structures responsables de la résistance des caillots permet d’améliorer la circulation du sang et donc l’état des patients après un AVC.
Procédures
Les animaux participeront à différentes étapes au cours de l’étude, toutes réalisées avec une attention particulière portée à leur confort et à leur bien-être. Pour soulager la douleur, les animaux recevront deux à quatre administrations de médicaments antidouleur, selon les besoins de chaque procédure. Ces produits seront injectés, sur des animaux éveillés, et chaque injection durera environ une trentaine de secondes. Une injection de glucose pourra être réalisée si les résultats de la première procédure de l’étude le rendent nécessaire. Cette injection sera effectuée sur des animaux éveillés et durera une dizaine de secondes. Une intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale, après l’administration de médicaments contre la douleur. L’ensemble de l’anesthésie et de la chirurgie durera environ une heure. Pour certaines observations, une nouvelle anesthésie générale sera nécessaire. Elle permettra d’observer la circulation du sang en temps réel à l’aide d’un microscope spécifique. Cette phase pourra durer jusqu’à deux heures. Avant ces observations, un produit fluorescent sera injecté sous anesthésie générale afin de mieux visualiser les vaisseaux sanguins. Quatre heures après le début de l’AVC, deux traitements seront administrés à des animaux anesthésiés. Le premier, contenant nos petites particules modifiées (ou une solution de contrôle), sera injecté en environ une minute. Le second traitement, utilisé pour dissoudre les caillots, sera administré lentement sur une durée totale d’environ trente minutes afin de garantir la sécurité des animaux. À la fin de l’étude, les animaux seront placés sous anesthésie générale profonde, après prise en charge de la douleur, afin de permettre le prélèvement des tissus sans souffrance. Après certaines interventions, une ou deux injections de solution hydratante, réchauffée à la température du corps, seront administrées pour favoriser une bonne récupération. Chaque injection durera environ trente secondes.
Impact sur les animaux
Le modèle d’accident vasculaire cérébral utilisé dans cette étude peut entraîner une douleur au réveil de l’anesthésie ainsi que des difficultés de mouvement ou de sensibilité. Ces effets sont considérés comme modérés. Après l’intervention, certains animaux peuvent également présenter une perte de poids ou une déshydratation, en particulier lorsqu’ils sont suivis pendant 24 heures. Là encore, ces effets sont modérés. Un stress lié à l’anesthésie ainsi qu’un inconfort temporaire dû aux injections peuvent survenir lors des différentes manipulations. Ces désagréments sont légers et de courte durée. Enfin, les tests de comportement réalisés dans le cadre de l’étude peuvent provoquer un léger stress ou une anxiété passagère chez les animaux, sans effet durable.
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour récupérer du sang, le caillot et les tissus.
Remplacement
Des expériences réalisées en laboratoire, sur des cellules, ont permis de concevoir et de vérifier le fonctionnement des petites particules protectrices utilisées dans cette étude. Ces tests sont indispensables, mais ils ne suffisent pas à reproduire ce qui se passe réellement dans le cerveau lors d’un AVC, un phénomène complexe qui fait intervenir de nombreux mécanismes différents. L’utilisation de souris est donc nécessaire pour étudier l’efficacité de ces petites particules dans des conditions proches de la réalité. Le modèle expérimental utilisé consiste à provoquer la formation d’un caillot qui bouche une artère du cerveau. Il permet de reproduire les situations dans lesquelles le traitement utilisé par les médecins est moins efficace et/ou entraîne des effets indésirables lors de la dissolution du caillot. Il permet de mieux comprendre ses limites et de tester des solutions pour le rendre plus sûr et plus efficace.
Réduction
Afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats fiables, les groupes d’étude ont été préparés avec beaucoup de soin. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé à l’aide d’un outil informatique spécialisé, qui permet de déterminer précisément le minimum requis pour que les résultats soient interprétables. Cette organisation permet de limiter strictement le nombre de souris utilisées, tout en garantissant que l’étude puisse répondre correctement aux questions scientifiques posées.
Raffinement
Le bien-être des animaux est une priorité tout au long de cette étude. Avant et pendant les expériences, les animaux vivent en groupe, dans des cages adaptées et enrichies, afin de favoriser leur confort et leurs comportements naturels. Pour éviter toute douleur, des médicaments contre la douleur sont systématiquement administrés avant et après les interventions. Avant la chirurgie, une anesthésie locale est appliquée sur la zone concernée afin de limiter toute sensation désagréable. L’intervention elle-même est réalisée sous une anesthésie générale adaptée, permettant aux animaux de ne rien ressentir pendant l’opération. Après la chirurgie, les animaux sont étroitement surveillés jusqu’à leur réveil complet. Un suivi régulier de leur état de santé est ensuite assuré à l’aide de critères précis permettant de détecter rapidement toute gêne ou souffrance. Si un animal présente des signes de douleur ou de mal-être, des mesures immédiates sont mises en place pour le soulager. Lorsque cela s’avère nécessaire, et afin d’éviter toute souffrance prolongée, l’animal peut être mise à mort conformément à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
Des recherches précédentes ont montré que les études menées chez la souris sont adaptées pour mieux comprendre les maladies qui touchent les vaisseaux du cerveau. Le modèle utilisé dans ce projet consiste à provoquer la formation d’un caillot qui bouche une artère du cerveau. Il reproduit de façon proche ce qui se passe chez l’être humain lors d’un accident vasculaire cérébral (AVC). Ce modèle permet également d’étudier l’effet du traitement actuellement utilisé pour dissoudre les caillots et d’en évaluer les limites. L’utilisation de ce modèle chez l’animal est indispensable pour tester l’efficacité des petites particules protectrices, utilisées seules ou en association avec le traitement de référence. Elle permet d’observer leur impact sur la reprise de la circulation du sang dans le cerveau ainsi que sur les troubles neurologiques liés à l’AVC. L’AVC est un phénomène complexe qui fait intervenir de nombreux mécanismes agissant en même temps. Ces interactions ne peuvent pas être entièrement reproduites en laboratoire sur des cellules seules, ce qui rend l’expérimentation animale nécessaire pour répondre aux objectifs de cette étude.
Caractérisation de la neurostimulation transcranienne ultrasonore en photométrie par fibre MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chaque souris subit une injection intracérébrale de deux heures puis l'implantation d'une canule optique de trois heures sous anesthésie, avant des séances de stimulation par ultrasons. 187 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par perfusion intracardiaque. Le porteur qualifie pourtant la neurostimulation ultrasonore d'"indolore et non invasive", cette description ne portant que sur l'émission des ultrasons et laissant de côté la chirurgie cérébrale préalable. Les animaux sont tués pour vérifier au microscope l'expression du gène injecté et la position des canules.
Objectifs
Ce projet porte sur la neurostimulation ultrasonore. Cette technique permet théoriquement d’activer des zones du cerveau à travers le crâne de manière indolore et non invasive, offrant donc un espoir pour de nouvelles thérapies pour certains troubles neuropsychiatriques sévères. L’objectif de ce projet sera de caractériser les paramètres physiques et expérimentaux permettant une neurostimulation fiable et optimale de plusieurs zones du cerveau qui sont connues pour jouer un rôle important dans ces troubles. Cette caractérisation sera réalisée chez la souris avec une méthode de photométrie par fibre. Celle-ci permet de visualiser l’activité neuronale par imagerie chez la souris, laquelle sera soumise à différents types d’émissions d’ondes ultrasonores. La mesure de l’activité des neurones sera permise par (1) l’expression d’un gène spécial (dont la protéine dégage de la fluorescence en fonction de l’activité des neurones) qui devra être injecté (= transfecté) dans la zone du cerveau que l’on souhaite stimuler et imager, et (2) par une canule optique implantée dans la zone cérébrale dont on veut suivre l’activité neuronale, laquelle pourra être reliée par fibre optique à l’appareil de photométrie lors des mesures et des stimulations ultrasonores transcrâniennes. Le projet comprendra 2 phases : (1) une phase de développement permettant de déterminer l’expression optimale du gène transfecté pour des zone du cerveau superficiel ou profond (40 souris maximum). (2) une phase de caractérisation des effets de neurostimulation par les ultrasons dans différentes zones cibles en fonction des différents paramètres physiques et expérimentaux suivants : fréquence (2 niveaux 0.5 et 1.5 MHz), pression acoustique (10 niveaux de 0 à 500 kPa), distance de la cible (3 niveaux : rayon de 0 – 0.5 – 1 cm), niveau d’anesthésie (3 niveaux de 0.5% – 1% – 1.5% d’isoflurane). La deuxième phase nécessitera 21 souris par zone sur les 7 zones cibles donc un total de 147 souris.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra permettre de caractériser les paramètres optimaux de neurostimulation par ultrasons. Ceci est essentiel pour une meilleure évaluation des potentialités thérapeutiques de cette méthode pour de nombreux troubles neuropsychiatriques (comme l’autisme, la dépression et les troubles anxieux)
Procédures
Dans la procédure 1 : Chaque animal sera soumis à une injection intracérébrale sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 2h), puis à une implantation intracérébrale de canule optique sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 3h), et enfin à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine). Dans la procédure 2 : Chaque animal sera soumis à une injection intracérébrale sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 2h), à une implantation intracérébrale de canule optique sous anesthésie générale (1 seule fois, durée 3h), à 6 séances de stimulations transcrâniennes ultrasonores (6 séances de 30 minutes) et enfin à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine).
Impact sur les animaux
La chirurgie permettant l’injection du vecteur viral puis l’implantation de la fibre optique pour la photométrie a un impact modéré et limité dans le temps (quelques heures ou jours) sur le bien-être animal, les animaux récupérant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) étant très faibles (< 0,1 g) : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sur l’animal mobile et éveillé sans impact majeur sur le bien-être. La stimulation ultrasonore transcrânienne est une approche non invasive et indolore. L’animal sera installé sur le dispositif (permettant de calculer des coordonnées stéréotaxiques) et testé lors de chaque session à la suite d’une anesthésie gazeuse, limitant ainsi tout stress de manipulation et associé à l’installation dans le dispositif.
Devenir
Procédure 1 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure Procédure 2 : Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de cette procédure. Lors des 2 procédures, cette étape de mise à mort est nécessaire pour la caractérisation histologique de l’expression du transgène et du placement des canules optiques.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.8 pour une taille d’effet f de Cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux recevront un traitement analgésique (Buprecare, Metacam) avant, juste après et 24 à 48h suivant l’intervention, puis si nécessaire un traitement antibiotique. Chaque animal est placé sur un matelas chauffant pour éviter toute hypothermie. Les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire.
Choix des espèces
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux. Les animaux seront adultes (âgés d’environ 8 semaines ou plus) au début de l’étude. Justification : il s’agit de comprendre ces phénomènes dans un cerveau adulte (8 semaines correspondant au début de l’âge adulte chez la souris.
Etude du rôle des structures auditives centrales dans la discrimination de signaux de communication dans le bruit. MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux chirurgies cérébrales d'environ une heure espacées de plusieurs semaines, puis une tâche auditive quotidienne de deux à trois mois sous restriction d'eau limitée à trois millilitres par jour : 210 souris traversent ce protocole, une partie tuée sans réveil, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les enregistrements de neurones et l'inactivation du cortex auditif servent à identifier la structure cérébrale qui permet de distinguer des sons dans le bruit. Le porteur note que les souris stressées ou douloureuses ne réalisent pas la tâche, celles-là étant alors tuées. À la fin, le cerveau de chaque animal est prélevé pour vérifier au microscope la position des électrodes.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer quelles sont la, ou les, structures du système auditif qui permettent de discriminer comportementalement, des signaux de communication dans des environnements particulièrement bruyants. Comportementalement, la discrimination peut se quantifier chez l’humain ou l’animal par la capacité à répondre différemment à deux sons distincts. En combinant des enregistrements de neurones dans les structures du système auditif, l’inactivation de certaines structures et une tâche comportementale, nous serons en mesure de déterminer quelle est la structure du système auditif qui est cruciale lorsqu’une souris arrive à discriminer deux sons de communications dans un environnement bruyant.
Bénéfices attendus
Il a souvent été affirmé que le cortex auditif était la structure qui permettait d’avoir de bonnes performances dans des environnements bruités. Pourtant, des données très récentes suggèrent que les réponses neuronales des structures sous-corticales sont plus résistantes au bruit que les réponses corticales. Grâce à ce projet, où nous obtiendrons des donnés neuronales en simultané de la tâche comportementale et nous pourrons estimer quelle structure est le plus corrélée avec la réponse comportementale et ainsi évaluer quelle structure est essentielle et joue le plus grand rôle pour permettre de discriminer des sons en situations bruitées. Avec l’inactivation du cortex auditif nous pourrons estimer si ce dernier est nécessaire ou non à cette discrimination. Il est possible qu’en condition facile (bruit à une intensité sonore plus faible que les sons cibles à discriminer) le cortex auditif ne soit pas nécessaire mais qu’en condition difficile (avec du bruit à une intensité sonore plus forte que les sons cibles), sa présence permette de discriminer correctement les sons cibles. Ce projet permettra donc d’étendre nos connaissances sur le fonctionnement du système auditif en conditions bruitées ce qui représente une grande partie de situations rencontrées au quotidien.
Procédures
Les animaux seront soumis sous anesthésie générale à deux chirurgies d’environ une heure chacune espacées de plusieurs semaines et devront réaliser une tâche comportementale de façon quotidienne pendant 2 à 3 mois allant de 30 minutes à 1 heure par jour.
Impact sur les animaux
Les nuisances que pourraient subir les animaux seraient dues aux chirurgies, potentiellement à la contention lors du comportement et à la restriction hydrique. Cependant, après chaque chirurgie un suivi post-opératoire rigoureux aura lieu et les animaux auront un examen quotidien post-chirurgie jusqu’à la fin du comportement pour s’assurer de leur santé. Lors du comportement, les animaux seront placés en contention mais installés dans un tube en plastique qui sera adapté en hauteur et orientation en fonction de chaque souris pour limiter tout inconfort de position. La souris pourra remuer les pattes et le corps dans ce tube. La dose d’eau ingéré via le comportement sera enregistrée automatiquement et les souris entraînée auront un complément individuel et adapté tout les jours en fin de journée pour qu’elles aient une dose d’eau quotidienne de 3 ml qui est la dose recommandé pour les souris de 20g. Les souris contrôles, elles, auront un accès illimité à l’eau durant la journée et ne seront privées que la nuit. La tâche comportementale en elle-même n’apporte pas de nuisances car l’intensité des sons est contrôlée (75dB, niveau d’une conversation courante) pour de pas créer de dommage au système auditif. Précisons bien que nos souris ne pourront pas faire de bonnes performances si elles sont stressées ou si elles éprouvent des douleurs. SI cela devait se produire elles seront prises en charge rapidement. Si nous n’arrivons pas à éliminer le stress et/ou les douleurs occasionnées, les animaux seront euthanasiés car ils ne pourront pas être utilisés dans la tâche comportementale.
Devenir
Pour toutes les procédures, les cerveaux des animaux sont récupérés à la fin des enregistrements pour vérifier histologiquement les positions d’implantation des electrodes, l’emplacement de la position de la fibre optique pour l’optogénétique. En récupérant les cerveaux nous apportons une preuve histologique que nous avons bien enregistré les neurones de structures désirées.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle des neurones du cortex auditif, du colliculus inférieur et du thalamus auditif dans la discrimination des signaux de communication dans le bruit. Pour cela, il est nécessaire de pouvoir travailler au niveau neuronal sur un animal engagé dans une tâche comportementale. Le recours à des modèles in vitro n’est donc pas possible. De plus le système auditif n’est pas assez connu pour avoir recours à des modèles biomathématiques et donc le modèle in silico n’est pas possible non plus. Il est nécessaire de travailler sur la souris car son système auditif est proche et comparable avec celui de l’homme. De plus nous voulons étudier les différentes structures en simultané d’une tâche comportementale ce qui seraient difficilement faisable chez un modèle invertébrés.
Réduction
Selon des méthodes d’analyses statistiques basées sur des expériences précédentes nous avons déterminé qu’il fallait 15 animaux par groupe pour avoir des résultats interprétables statistiquement. Cependant nous réaliserons un groupe de 10 souris de mise au point afin de garantir la réussite des enregistrements chez les animaux entrainées et contrôles ce qui nous permettrait de n’avoir plus que 10 animaux par groupe au lieu de 15. De plus pour la partie optogénétique, nous n’utiliseront pas de groupe contrôle car les contrôles pourront avoir lieu sur une même souris en comparant les moments avec et sans inactivation corticale. On passe donc a un groupe 10 animaux pour cette partie.
Raffinement
Toutes les chirurgies seront réalisés dans des conditions d’anesthésie et analgésie adaptées afin de minimiser au maximum la douleur des animaux. Suite aux procédures chirurgicales, un suivi post-opératoire adapté aura lieu et le suivi continuera sur toute la durée de entraînement comportementale (animaux pesés tous les jours et comportement en cage avec leur congénère observé: vivacité, contact, isolement, harcèlement dans un même cage...). Des points limites strictement définis dans les différentes procédures seront utilisés afin de ne pas continuer l'expérience sur des animaux présentant des signes de souffrance. L’animalerie dans laquelle les animaux seront hébergés est agrée et les animaux seront minimum 2 et maximum 5 par cage. Dans chaque cage des enrichissement adaptés et recommandés par les réglementations seront mis (tunnel, maison en carton, matériel pour des
Choix des espèces
Les rongeurs ont un système auditif similaire au système auditif humain et la souris est capable de discriminations fines entre les signaux de communication acoustique qu’ils soient conspécifiques ou hétérospecifiques. Les outils génétiques étant bien développés chez cette espèce, il sera possible de poursuivre ces expériences en utilisant des modèles transgéniques pour mieux cerner les mécanismes impliqués dans certains des résultats obtenus. Les animaux utilisés subiront une première chirurgie à 8 semaines et commenceront l’apprentissage à 9 semaines. La souche de souris utilisée (CBA) conserve une audition normale jusqu'à plus de 6 mois. Ainsi en commençant entre 2 et 3 mois, les souris sont considérées comme adultes et cela nous permet de réaliser l’apprentissage et les enregistrements neuronaux avant que des pertes auditives ne surviennent.
Étude du recablage axonal par un outil photo-inductible remodelant le cytosquelette des neurones.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
858 souris vont être utilisées, une partie opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil, les autres tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale de vingt à quarante minutes pour implanter une fibre optique, puis des stimulations lumineuses qui remodèlent les connexions des neurones, avant des tests de coordination motrice et le prélèvement du cerveau. L'objectif est de comprendre le recâblage du cerveau pendant l'apprentissage, les retombées médicales pour des maladies neurologiques ou psychiatriques restant lointaines et hypothétiques. Sur le remplacement, le porteur décrit un modèle de cerveau sur puce ayant réduit les conditions à tester, tout en concluant que l'animal reste "indispensable".
Objectifs
Apprendre un nouveau geste, comme faire du vélo ou jouer d’un instrument, repose sur la capacité du cerveau à se transformer. Cette capacité, appelée plasticité cérébrale, permet aux neurones de modifier leurs connexions pour s’adapter à de nouvelles situations. Ce projet de recherche s’intéresse à un réseau précis du cerveau, essentiel pour le contrôle des mouvements et l’apprentissage moteur. Dans ce réseau, les neurones peuvent parfois créer de nouvelles connexions ou, au contraire, en supprimer. Ce phénomène de « recâblage » du cerveau a été identifié récemment et reste encore mal compris. Pour mieux étudier ce mécanisme, les chercheurs ont développé une technologie innovante, qui permet de contrôler ce recâblage à l’aide de la lumière. Selon la version utilisée, cette technologie peut soit favoriser la croissance de nouvelles connexions entre neurones, soit provoquer leur disparition. Plusieurs versions de cet outil ont été conçues et testées, certaines encourageant la formation de connexions, d’autres leur retrait. L’objectif principal du projet est d’observer, chez l’animal vivant, comment ces outils influencent l’organisation des connexions cérébrales, comment ces changements évoluent dans le temps, et quelles sont leurs conséquences sur l’activité du cerveau et sur les mouvements. Dans un second temps, les chercheurs étudieront l’impact de ces modifications cérébrales sur l’apprentissage d’une tâche motrice. Ils chercheront à déterminer si certaines formes de recâblage facilitent l’apprentissage, tandis que d’autres pourraient le ralentir ou le perturber. Finalement, ce projet vise à mieux comprendre comment les changements de connexions dans le cerveau influencent nos capacités motrices, et à explorer le potentiel d’une nouvelle technologie permettant de moduler de façon ciblée les réseaux cérébraux.
Bénéfices attendus
LLe cerveau a une capacité remarquable à se transformer lorsqu’on apprend : ses cellules nerveuses peuvent modifier leurs connexions pour s’adapter à de nouvelles expériences. Ce projet de recherche vise à mieux comprendre comment ces changements se produisent et comment ils influencent nos capacités sensorielles et motrices. Pour cela, les chercheurs ont mis au point une technologie innovante qui permet de contrôler, à l’aide de la lumière, la façon dont certaines connexions entre neurones se forment ou disparaissent. Cette technologie, agit sur des réseaux cérébraux bien définis, impliqués à la fois dans la perception et dans le mouvement. En utilisant cet outil dans le cerveau de souris adultes, le projet cherche à établir un lien direct entre les modifications des connexions neuronales, le fonctionnement des réseaux cérébraux concernés, et les performances individuelles dans des tâches comportementales. Ce lien est aujourd’hui largement soupçonné par la communauté scientifique, mais n’a jamais pu être démontré directement, faute d’outils adaptés. Notre technologie offre pour la première fois la possibilité de tester cette relation de manière directe. La validation de cet outil chez l’animal permettra d’explorer de façon nouvelle et ciblée la capacité du cerveau à se réorganiser. Au-delà de la recherche fondamentale, cette approche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour mieux comprendre les dysfonctionnements des circuits cérébraux et, à plus long terme, contribuer à l’identification de pistes thérapeutiques pour certaines maladies neurologiques ou psychiatriques, lorsque la plasticité du cerveau est altérée.
Procédures
Ce projet expérimental sera mené exclusivement sur des souris. Les animaux seront répartis en plusieurs groupes selon les procédures prévues. Un premier groupe sera soumis à une intervention chirurgicale d’une durée variant entre 20 et 40 minutes, sans réveil. Tous les groupes suivants seront tous soumis à la même intervention chirurgicale mais avec réveil, pour une période d'environ 2 semaines. A ce stade, les interventions pourront inclure, selon les besoins expérimentaux, des procédures terminales ou des manipulations préparatoires au cours desquelles les souris seront stimulées par la lumière, libres de leur mouvement dans une cage de test enrichie. Ces différentes expérimentations pourront induire un risque d’infection, un risque d’inflammation ou encore du stress. Les souris seront testées sur leurs performances afin d’évaluer leur coordination motrice ou sur leur motricité fine.
Impact sur les animaux
Les manipulations courantes (prise en main, transport, changement d’environnement) seront quotidiennes dès l’arrivée des animaux. Les chirurgies sont associées à un degré de sévérité modéré (risque d’infection, risque d’inflammation, stress), limité à la période autour de l’opération. Lors de la chirurgie, les animaux peuvent présenter du stress et un risque d’inflammation pendant plusieurs jours. Les tests comportementaux sont non invasifs, induisent un stress léger et temporaire lié à la mise en situation expérimentale, et seront réalisés une fois par jour pour chaque test lors des périodes expérimentales. Les procédures de stimulation par la lumière et un risque d’échauffement local du tissu. Aucun effet indésirable durable n’est attendu. Les expérimentations seront interrompues et l’animal retiré du protocole si un point limite clinique est atteint.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. Cet acte est justifié par l’un des points clés du présent projet, le but est de prélever le cerveau et d’identifier le degré de réarrangement du cerveau avec notre technologie.
Remplacement
Une phase de validation approfondie de notre technologie a été réalisée en laboratoire, à l’aide d’un modèle de cerveau sur puce développé sur place. Cette étape a permis de : • sélectionner les versions les plus efficaces de notre technologie, • déterminer les niveaux pertinents pour l’intensité lumineuse, • définir les modes de stimulation efficaces, • et optimiser les durées d’illumination (les durées longues étant plus efficaces que les courtes). Cette optimisation en laboratoire a considérablement réduit le nombre de conditions à tester chez l’animal. Cependant, l’objectif du projet est d’étudier l’effet du réarrangement des cellules nerveuses sur des comportements moteurs et des processus d’apprentissage, qui ne peuvent pas être reproduits de façon fiable sur des systèmes en laboratoire ou informatiques. L’utilisation d’un modèle animal demeure donc indispensable pour répondre aux questions scientifiques posées.
Réduction
Le projet a été conçu pour limiter le nombre d’animaux grâce à plusieurs leviers : • Optimisation préalable en laboratoire : La présélection des prototypes et des paramètres sur des modèles sans animaux permet de réduire le nombre de groupes à tester chez l’animal. • Contrôle interne bilatéral (lorsque possible) : Pour certaines analyses, une expression de notre technologie et une stimulation unilatérale permettront d’utiliser un hémisphère du cerveau comme condition test et l’autre comme contrôle, diminuant ainsi le nombre d’animaux. • Contrôle longitudinal individuel en comportement : Les souris seront testées en comportement avant la stimulation puis à différents temps après, ce qui permet d’utiliser chaque animal comme son propre contrôle pour les mesures comportementales. • Mise au point technique sur un nombre limité d’animaux : Trois souris par groupe seront utilisées pour calibrer les conditions d’expression et d’implantation lors des phases de mise au point. • Calculs de puissance statistique : Pour nos études, les données préliminaires indiquent un effet attendu d’environ 25 % avec une variabilité d’environ 10 %. Une analyse de puissance montre qu’un minimum de 15 souris par groupe est nécessaire pour détecter cet effet. Pour les études comportementales, les données suggèrent un effet d’environ 20 % sur la performance motrice, avec une variabilité d’environ 10 %. Les analyses de puissance indiquent qu’un minimum de 20 souris par groupe est requis pour atteindre la significativité.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie conventionnelle, dans des pièces où la température est contrôlée et dans des cages avec environnement enrichi. Le nombre optimal d’animaux par cage sera respecté et les animaux auront accès à l’eau et la nourriture sans limite. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures chirurgicales. Cette anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards, en ce qui concerne les pourcentages de gaz dans l’air lors des phases d’induction et de maintien. Elle sera accompagnée d’une analgésie locale et systémique afin de couvrir la douleur induite par ces interventions. Le maintien de la température corporelle sera assuré par un monitorage rectal associé à un tapis chauffant, et l’application d’un gel ophtalmique permettra de protéger les yeux des animaux pendant l’intervention. Un suivi post-opératoire rigoureux d’une durée de 7 jours, incluant une fiche individuelle de suivi, sera mis en place. Les fibres optiques implantées sont miniaturisées et adaptées à une utilisation murine. Leur conception limite la gêne potentielle lors des déplacements de l'animal dans la cage. Les tâches comportementales motrices présentent un stress léger chez l'animal, principalement dû à leur manipulation. Lors de chaque session, les animaux sont soigneusement manipulés et calmés par l’expérimentateur, constituant ainsi une interaction sociale positive pouvant être assimilée à une récompense. Tout le protocole vise à renforcer le confort de l’animal durant la réalisation des tâches et des interventions.
Choix des espèces
La souris est l’espèce la plus adaptée pour ce projet. La zone cible de l’étude est bien caractérisé chez la souris et présente une organisation comparable à celle des mammifères supérieurs, permettant une analyse fiable du réarrangement des cellules nerveuses et de ses conséquences fonctionnelles. Les outils génétiques utilisés sont largement validés et couramment employés chez la souris, assurant une expression spécifique, stable et reproductible. Le petit gabarit de l’animal facilite les chirurgies et l’implantation d’une fibre avec un risque limité. Les tests comportementaux moteurs sont standardisés et bien établis chez la souris, garantissant des mesures robustes des effets. La majorité des lignées transgéniques pertinentes pour de futurs développements du projet sont disponibles chez la souris. Optimiser dès à présent l’ensemble des paramètres techniques dans cette espèce évitera de devoir réimplémenter les protocoles dans un autre modèle, limitant ainsi la durée et le nombre total d’animaux utilisés à long terme. Les animaux utilisés auront entre 30 et 90 jours, correspondant à des stades de jeune adulte. Les injections seront effectuées après le sevrage. À l’issue des différentes procédures expérimentales, les animaux seront âgés au maximum de 90 jours. À cet âge, le cerveau possède encore un degré de plasticité suffisant pour étudier le réarrangement des cellules nerveuses tout en présentant une organisation fonctionnelle stable. Ces caractéristiques en font une période optimale pour évaluer l’effet de notre technologie.
Étude du rôle de la dopamine dans l’hippocampe de souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour caractériser la libération de dopamine dans l'hippocampe, 221 souris subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale d'environ quatre-vingt-dix minutes, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. La chirurgie peut provoquer une douleur post-opératoire pendant un à deux jours. 201 animaux sont tués pour analyses histologiques, 20 maintenus en vie et réutilisés dans d'autres projets. Le porteur justifie le recours à la souris par des outils de stimulation neuronale disponibles chez cette seule espèce.
Objectifs
La dopamine joue un rôle essentiel dans les processus d’apprentissage et de mémoire au sein de l’hippocampe. Ce projet a pour objectif de mieux caractériser la libération de dopamine dans l’hippocampe de la souris, afin de mieux comprendre sa fonction dans cette structure cérébrale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de la mémoire. Il permettra d’identifier les mécanismes qui font qu’on se souvient de certaines choses et pas d’autres, et à plus long terme de mieux comprendre les troubles de la mémoire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale, permettant une injection qui durera environ 90 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une chirurgie susceptible d’induire une douleur post-opératoire modérée durant 24 à 48h. Les pesées nécessaires au suivi post-opératoire peuvent entraîner un stress léger. La manipulation des animaux lors des expériences comportementales peut induire un stress léger.
Devenir
201 animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en vue d’analyses histologiques. 20 souris seront maintenues en vie et pourront être réutilisées dans d’autres projets.
Remplacement
Le projet vise à caractériser la libération de dopamine dans l’hippocampe. Cette étude nécessite l’intégrité fonctionnelle du cerveau, incluant à la fois les structures hippocampiques et les voies dopaminergiques. Compte tenu de la nécessité d’étudier la libération de dopamine dans un contexte physiologique et comportemental intact, une approche in vivo est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir de nos données antérieures de manière à obtenir une puissance statistique a priori de 90%. Sur cette base, un maximum de 15 souris par groupe seront incluses pour notre projet.
Raffinement
Les animaux seront progressivement entraînés à la manipulation afin de limiter le stress avant les procédures expérimentales. Tout au long du protocole, une surveillance quotidienne sera assurée, avec une attention accrue en période postopératoire. Des mesures spécifiques seront mises en place pour minimiser les effets indésirables sur le bien-être des animaux : maintien de la température corporelle pendant et après la chirurgie et mise à disposition de gel réhydratant et d’aliments faciles d’accès et gestion systématique de la douleur en post opératoire. En cas d’altération de l’état général d’un animal, une évaluation clinique structurée sera réalisée afin de définir la conduite à tenir.
Choix des espèces
Les outils nécessaires pour stimuler spécifiquement les neurones à dopamine avec une précision de l’ordre de la milliseconde sont disponibles uniquement chez la souris. Les structures impliquées dans la mémoire étudiées dans ce projet sont conservées chez la plupart des mammifères. Ce qui nous permet d'extrapoler nos conclusions tirées de cette étude chez l’humain. Les animaux seront inclus dans le protocole à l’âge adulte, entre 2 et 8 mois afin d’éviter des effets du développement ou du vieillissement.
Caractérisation comportementale des souris génétiquement modifiées n’exprimant pas l’enzyme sPLA2G5
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Soumises à une pression mécanique et à une source de chaleur provoquant des réactions réflexes, à des tests d'anxiété et à un isolement de 72 heures, 528 souris vont toutes être tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal est génétiquement modifié pour ne pas exprimer une enzyme dont le rôle dans le cerveau reste inconnu. Les prélèvements finaux se font sous anesthésie générale, après une injection d'analgésique. Le bénéfice avancé se limite à ouvrir de nouvelles voies de recherche.
Objectifs
Nos molécules d'intérêt coupent certains lipides présents dans les membranes des cellules. Chez l’humain, il existe plusieurs gènes codant pour différentes formes des molécules auxquelles nous nous intéressons. Elles participent à de nombreux processus biologiques, même si leurs rôles précis ne sont pas encore entièrement compris. Elles sont aussi intéressantes pour la recherche médicale, car elles jouent un rôle important dans la production de molécules qui régulent l’inflammation. Notre protéine d'intêret, une forme particulière de ces enzymes, est surtout présente dans le cœur, les muscles et certaines cellules du système immunitaire. Elle contribue notamment à réguler l’inflammation en favorisant la production de molécules pro-inflammatoires. Elle intervient également dans le fonctionnement du système cardiovasculaire, en influençant le tonus des vaisseaux et en participant à des processus comme l’athérosclérose ou l’infarctus. Elle a aussi été impliquée dans certains aspects du métabolisme, comme la régulation du glucose et la résistance à l’insuline. Cependant, toutes ces fonctions ont été étudiées en périphérie, c’est-à-dire en dehors du cerveau, et on ne sait pas encore ce que fait notre molécule d'intêret dans le cerveau. Des études récentes ont montré que chez la souris, son expression est limitée à deux zones cérébrales particulières à l'interface sang-cerveau. Le projet que nous souhaitons mener vise à étudier les conséquences comportementales d’une déficience en la molécule d'intêret dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Nos résultats permettront de révéler des rôles cérébraux jusqu'ici inconnus pour la molécule d'intêret et permettraient d'ouvrir de nouvelles voies de recherche.
Procédures
176 souris maximum seront exposées à un stress transitoire lié à: l’isolement temporaire (1 fois chacune, 30 min max), l'anxiété (2 fois chacune, 30 min la 1ere fois, 8 min la seconde). 176 souris maximum seront hébergées individuellement (avec stimuli auditifs et olfactifs) transitoirement (72h chacune, 1x). 176 souris maximum seront soumises à une douleur mécanique et thermique qui provoqueront un inconfort momentané et des réactions réflexes (2x20 min par souris) . D’autres facteurs de stress incluent les transferts, les manipulations répétées et le changement d’environnement. A la fin des procédures, toutes les souris recevront une première injection (1x par souris, 10 sec) 15 mn avant une seconde (1 fois par souris, 10 sec). Elles subiront ensuite des prélèvements sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
176 souris max seront exposées à: - l’isolement temporaire (1 fois chacune, 30 min max) qui entrainera un stress léger et transitoire - l'anxiété pour l'open-field (1 fois chacune, 30 min) qui entrainera un stress léger et transitoire - l'Y-maze (1 fois chacune, 8 min) qui entrainera un stress léger et transitoire 176 souris max seront exposées à: - l'isolement temporaire (72h chacune, 1x) qui entrainera un stress léger et transitoire. 176 souris max les souris subiront: - une pression mécanique (20 min par souris) entrainant une douleur mécanique évitable - une chaleur provoquant un inconfort momentané et des réactions réflexes (20 min par souris). D’autres facteurs de stress incluent les transferts, les manipulations répétées et le changement d’environnement. A la fin des procédures, les souris recevront une injection d'analgésique (1x par souris, 10 sec) 15 mn avant l'induction de l'anesthésie par une injection (1 fois par souris, 10 sec). Les contentions nécessaires entraîneront un léger stress et les injections une faible douleur de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder à des prélèvements biologiques ou des analyses histologiques.
Remplacement
Les phénomènes étudiés dans ce projet, tels que la sociabilité, la cognition, le métabolisme et la douleur, nécessitent l’observation de comportements complexes intégrant le système nerveux central et périphérique, ce qui ne peut être reproduit de manière fiable par des modèles in vitro ou informatiques. Par conséquent, l’utilisation de souris est indispensable pour obtenir des données physiologiquement pertinentes et transposables.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à l’aide d'un logiciel de calcul de puissance statistique. Les critères représentent un compromis raisonné entre robustesse statistique, faisabilité expérimentale et respect du principe de Réduction, conformément aux recommandations méthodologiques en expérimentation animale.
Raffinement
Des mesures de raffinement seront mises en place pour minimiser la souffrance et le stress des souris : - Habituation préalable à la salle, au matériel et aux manipulations avant les tests. - Manipulations douces et standardisées par du personnel expérimenté. - Durée d’isolement minimale dans les cages métaboliques et les tests individuels. - Surveillance attentive des animaux pendant tous les tests, avec critères d’arrêt définis pour toute détresse. - Espacement suffisant entre les tests stressants ou nociceptifs pour permettre la récupération. Une grille de score a été établie afin de définir des points limites adaptés, des mesures correctives à mettre en place et des critères d'arrêt de souffrance en cas de besoin.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car elles permettent d’étudier des fonctions complexes intégrant le système nerveux central et périphérique, comme la cognition, la sociabilité, le métabolisme et la douleur, dans un organisme intact. Leur physiologie et leur génétique sont bien caractérisées, ce qui rend les résultats transposables et comparables à d’autres études. Les alternatives in vitro ou informatiques ne permettent pas de reproduire ces interactions complexes entre tissus et organes, ni d’évaluer de manière fiable les comportements ou la nociception. Les expériences seront réalisées sur des souris âgées de 8 à 10 semaines, correspondant à l’âge adulte jeune où les systèmes nerveux, métabolique et sensoriel sont pleinement développés. Cet âge permet d’obtenir des données stables et comparables tout en évitant les variations liées à la croissance ou au vieillissement.
Prélèvement de tissu pour identifier des animaux utilisés en recherche
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
7 000 souris pour un prélèvement de deux millimètres de queue chacune : ce projet couvre le génotypage de routine d'un élevage de lignées génétiquement modifiées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Le geste, réalisé sans anesthésie sur des animaux de moins de quatre semaines, dure quelques secondes. Selon le résultat, chaque souris est ensuite utilisée dans une expérience, gardée pour la reproduction, ou tuée, 2 500 étant maintenues en vie. Le porteur écarte l'anesthésie, jugée une nuisance supplémentaire non justifiée au regard de la gravité déclarée.
Objectifs
Certains animaux ont des gènes modifiés afin de mieux comprendre le fonctionnement du vivant et d’étudier certaines maladies. Ces études contribuent à améliorer la santé humaine, la santé animale et la protection de l’environnement. Ces animaux sont élevés afin de répondre aux besoins des projets de recherche autorisés. Pour que les études soient fiables, il est essentiel de connaître précisément les caractéristiques de chaque animal et de sélectionner ceux qui correspondent aux besoins des chercheurs. L’élevage est donc organisé de manière rigoureuse afin d’assurer une production adaptée et régulière. Pour identifier les animaux présentant les caractéristiques recherchées, il est nécessaire de réaliser des prélèvements de tissu couplés à une méthode d’identification des animaux. L’objectif de ce projet est de décrire la méthode de prélèvement utilisée dans notre équipe pour identifier les animaux concernés, tout en veillant au respect du bien-être animal et à la réduction maximale de toute gêne ou douleur.
Bénéfices attendus
Ce projet de prélèvements de tissus pour génotypage permet une sélection des animaux d’intérêt et ainsi d'optimiser la gestion et l’élevage des modèles d'animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des utilisateurs pour des projets autorisés dans le cadre d’une utilsation continue. De plus, le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue constitue une méthode de génotypage de gravité légère, fiable et minimisant les risques de contaminations entre échantillons.
Procédures
Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue x 5 secondes x 1 par animal
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux et la légère douleur lors du prélèvement de tissus.
Devenir
À l’issue de la procédure, les animaux sont maintenus en vie. Leur devenir dépend ensuite du résultat de l’identification réalisée : a/ Utilisés dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé dans le cadre d’une utilisation continue b/ Utilisés pour le maintien de la lignée c/ Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.
Remplacement
Il existe des méthodes moins invasives pour obtenir du matériel génétique, comme prélever des poils, de la salive ou des fèces. Cependant, elles ne permettent pas d’identifier les animaux de manière fiable. La biopsie de tissus, associée au marquage par bague, garantit que chaque souris est correctement identifiée tout au long de sa vie. Nos modèles génétiques sont complexes, et chaque souris avec le bon génotype est précieuse, ce qui rend cette identification indispensable.
Réduction
L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consiste à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au stricte nécessaire à leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective, plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues. Les autres sont conservées congelées. - Les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence. - La nomenclature est harmonisée pour éviter les redondances et la duplication de lignées proches ou identiques. - Les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (croisement en individu de même génotype). -Développer et favoriser le recours à des méthodes de biopsies non invasives chaque fois que cela est compatible avec les impératifs scientifiques des projets.
Raffinement
Les méthodes utilisées sont éprouvées, précises, rapides et standardisées permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par prélèvement lui-même. Une anesthésie générale constituerait une nuisance additionnelle non justifiée au regard du niveau de gravité de la procédure. Une fois le prélèvement réalisé, l’animal est remis dans sa cage et un suivi de la cicatrisation au point de prélèvement est assuré.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèces (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (cancers, maladies neurodégénératives…). Les prélèvements de l’extrêmité de la queue peuvent être réalisés jusqu'a 4 semaines après la naissance, à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douleureux avec des risques hémorragiques extrêmement réduits.
Identification des mécanismes de régulation fine du système dopaminergique et de leur rôle dans l’addiction
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
4 984 souris vont être utilisées, dont 3 190 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 1 650 opérées sans réveil, le devenir déclaré étant la mise à mort. Chaque animal génétiquement modifié passe environ deux mois isolé dans un dispositif de libre accès à l'alcool, une partie subissant une chirurgie d'injection virale, une voltamétrie cérébrale sous anesthésie ou une IRM. L'objectif est de préciser le rôle d'une protéine, OCT3, dans la dépendance à l'alcool. Le porteur évoque une cohorte d'imagerie qui pourrait être réutilisée, sans que le champ sur le devenir ne le confirme.
Objectifs
La consommation excessive d’alcool constitue un problème important de santé publique. Elle peut conduire au trouble de l’usage d’alcool, une forme de dépendance caractérisée par une perte de contrôle de la consommation et des conséquences négatives pour la santé physique, mentale et sociale. Malgré l’ampleur de ce problème, les traitements actuellement disponibles restent limités et ne sont pas toujours efficaces pour toutes les personnes. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes biologiques qui contribuent à la dépendance à l’alcool afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le cerveau joue un rôle central dans les comportements liés à la consommation d’alcool. Certaines régions cérébrales participent à la régulation de la motivation, de la prise de décision et de la sensation de récompense. Ces processus reposent sur l’action de molécules appelées neurotransmetteurs, dont la dopamine, qui est impliquée dans la sensation de plaisir et dans la motivation à répéter certains comportements. Des perturbations du système dopaminergique sont souvent associées aux comportements addictifs. Des études scientifiques récentes suggèrent qu’une protéine appelée OCT3 pourrait participer à la régulation de ce système dans le cerveau et influencer certains effets de l’alcool. Cependant, son rôle exact dans la consommation répétée et excessive d’alcool reste encore mal compris. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans les mécanismes cérébraux impliqués dans la consommation d’alcool. Pour cela, des études seront réalisées chez l’animal, ce qui permet d’examiner de manière contrôlée les effets de certaines modifications biologiques sur le fonctionnement du cerveau et sur le comportement. Nous analyserons notamment l’influence de cette protéine sur la consommation d’alcool, les comportements associés à cette consommation, ainsi que certains mécanismes biologiques dans le cerveau. Ces travaux permettront d’améliorer les connaissances scientifiques sur les mécanismes impliqués dans la dépendance à l’alcool. À plus long terme, les résultats de ce projet pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et au développement de stratégies innovantes pour le traitement des troubles liés à l’usage d’alcool.
Bénéfices attendus
Sur le plan scientifique, ce projet permettra de mieux comprendre comment la dopamine agit sous l'effet de l'alcool, grâce à deux protéines clés : le DAT et l'OCT3, qui joue un rôle complémentaire. Nous étudierons comment ces protéines captent la dopamine après sa libération, et comment les bloquer modifie les effets de l'alcool. Nous évaluerons également les impacts sur le comportement et sur certaines fonctions cérébrales des animaux ne possédant pas ces protéines, ainsi que les changements génétiques dans différentes zones du cerveau impliquées dans la régulation de la dopamine. Sur le plan applicatif, ces connaissances constitueront une base solide pour envisager des stratégies thérapeutiques ciblées sur OCT3 ou des transporteurs associés (comme le DAT) dans le traitement des troubles liés à l’usage d’alcool et, plus largement, des addictions aux substances psychoactives. En résumé, il s’agit d’un projet à forte valeur ajoutée, à la fois pour la compréhension de l’addiction et pour l’exploration de médicaments innovants.
Procédures
Les animaux issus des lignées transgéniques seront générés par reproduction ciblée, avec un génotypage effectué entre 10 et 21 jours d’âge. Une partie des animaux génotypés subiront une chirurgie (environ 30 minutes) permettant l’injection d’un vecteur viral spécifique. La consommation volontaire d’alcool sera évaluée selon un protocole d’accès intermittent à deux bouteilles, dont environ 50 % (2420) affectés à un groupe contrôle ayant accès uniquement de l’eau. La durée de cette phase sera de deux mois, à partie de la 5ème semaine d’âge. Pour la voltamétrie, les animaux (14ème semaine de vie) sont anesthésiés avec un anesthésique gazeux, afin d’implanter une électrode de stimulation et une électrode d’enregistrement. Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure qui dure 2 à 3 heures. Des sessions d’imagerie par résonance magnétique (IRM) de 1h seront réalisées sous anesthésie gazeuse, avec réalisation d’injection au cours de l’anesthésie.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus chez les animaux dans le cadre de ce protocole incluent principalement l’hébergement individuel tout en conservant un contact visuel et auditif avec les autres cages. Les manipulations comme les injections de molécules et les tests comportementaux seront réalisés après une habituation progressive, incluant des séances quotidiennes de manipulation et d’exposition aux dispositifs expérimentaux. L’état des animaux sera surveillé quotidiennement et toute anomalie fera l’objet d’une prise en charge adaptée. Le génotypage par biopsie de queue ou d’oreille chez des souris âgés de 10 à 21 jours est classé comme procédure légère. Cet inconfort temporaire se résout spontanément en quelques minutes sans traitement spécifique requis. Cette procédure sera réalisée par du personnel formé et expérimenté afin de minimiser le stress et la douleur. La voltamétrie utilise des micro électrodes implantées sous anesthésie générale et gestion de douleur appropriée. Les animaux sont euthanasiés à l'issue de la procédure. L'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) est réalisée sous anesthésie légère avec maintien strict de la température (température 37°C), monitoring respiratoire continu
Devenir
Mis à mort
Remplacement
Le remplacement par des méthodes alternatives n’est pas possible pour les objectifs de ce projet. L’étude des comportements volontaires liés à la consommation d’alcool requiert l’usage d’organismes murins, car ces comportements impliquent des processus neurobiologiques complexes (motivation, récompense, apprentissage) qui ne peuvent pas être reproduits de manière pertinente par des approches expérimentales ne faisant pas intervenir l’organisme entier. Les souris constituent un modèle bien établi pour l’étude des mécanismes neurocomportementaux et permettent une transposition fiable des résultats chez les mammifères. Les conséquences de l’exposition répétée à l’alcool sur le circuit de la récompense ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires. En effet, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité de l’organisation cérébrale et des interactions dynamiques entre réseaux neuronaux L’étude des modifications fonctionnelles des circuits cérébraux induites par l’alcool nécessite donc le recours à des organismes vivants et entiers.
Réduction
Le nombre d’animaux (4984 animaux) prévu a été déterminé sur la base d’analyses de puissance statistique et de données issues d’expériences antérieures avec des modèles de consommation volontaire d’alcool du laboratoire, afin d’identifier le nombre minimal nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Le nombre initial d’animaux prend également en compte les pertes prévisibles liées à l’acquisition de la consommation d’alcool et aux manipulations expérimentales, réduisant ainsi la nécessité de répéter les expériences. Les analyses par IRM seront réalisées sur une cohorte distincte d’animaux n’ayant pas participé au paradigme de consommation volontaire d’alcool. Afin de répondre au principe de réduction du nombre total d’animaux utilisés, ces sujets ne seront pas systématiquement euthanasiés à l’issue de l’IRM. Sous réserve de compatibilité avec leur état de santé et les exigences des autres protocoles, ils pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales autorisées ou transférés vers des projets complémentaires, conformément à la réglementation en vigueur et après validation par le comité d’éthique. Par ailleurs, tous les animaux seront surveillés quotidiennement pour garantir leur bien-être et prévenir toute perte évitable. Cette stratégie garantie l’utilisation du nombre minimal d’animaux nécessaire tout en maintenant la rigueur scientifique et la fiabilité des résultats.
Raffinement
À partir de la 5ᵉ semaine d’âge, les animaux seront hébergés individuellement pour permettre le suivi précis de la consommation d’alcool dans le paradigme de libre choix à deux bouteilles avec accès intermittent. Cet hébergement, limité à la durée du protocole (2 mois), permet une mesure fiable de la consommation tout en maintenant un contact visuel et auditif entre animaux. Le bien-être sera préservé grâce à des enrichissements adaptés (matériaux de nidification, abris, roue). Une période d’acclimatation (1 semaine) et d’habituation (5 jours) précédera toute manipulation afin de réduire le stress et d’améliorer la fiabilité des mesures comportementales. Les manipulations et injections seront précédées de séances progressives de familiarisation, incluant des manipulations quotidiennes et trois injections d’habituation de solution saline (même voie et volume que les injections expérimentales). Cette approche progressive vise à diminuer la réponse au stress et à garantir la reproductibilité des données. Les procédures chirurgicales (implantation de microélectrodes pour voltametrie) seront réalisées sous anesthésie générale et locale, associée à une prise en charge de la douleur avant et après l’intervention. La température corporelle sera maintenue sur un tapis chauffant jusqu’au réveil complet. Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. L’IRMf sera réalisée sous anesthésie légère, en veillant au bon fonctionnement des fonctions physiologiques (température maintenue à 37 °C, surveillance de la respiration). Cette technique, non invasive, ne provoque pas de nuisance mesurable ni d’altération tissulaire. Les effets potentiels liés à l’exposition à l’alcool (modifications transitoires de l’activité motrice) seront surveillés quotidiennement à l’aide d’une grille d’observation spécifique. L’ensemble de ces mesures – acclimatation, enrichissement, contrôle rigoureux de la douleur et surveillance continue – vise à minimiser le stress, la douleur et l’inconfort, conformément aux principes de raffinement et de bien-être animal.
Choix des espèces
Le choix de la souris OGM repose sur sa pertinence scientifique pour l'étude des mécanismes neurobiologiques et comportementaux impliqués dans la dépendance à l'alcool. Cette espèce est un modèle de référence en neurosciences comportementales et en pharmacologie permettant une approche complémentaire entre manipulations génétiques fines et études comportementales complexes. Cette espèce possède, par ailleurs, une proximité physiologique et génétique suffisante avec l’humain, essentiels pour comprendre les mécanismes de l'addiction, notamment ceux impliquant la neurotransmission dopaminergique. Enfin, leur taille, leur facilité d'élevage, ainsi que la disponibilité d'outils génétiques avancés font des modèles adaptés à des études précliniques rigoureuses, tout en respectant les principes éthiques des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner). Les analyses par IRM seront réalisées sur une cohorte distincte, n’ayant pas participé au paradigme de consommation volontaire d’alcool. Ces animaux recevront uniquement des injections aiguës d’alcool au cours de l’imagerie. Nous utiliserons des animaux à partir de la 5ème semaine d’âge. À ce jour, aucune alternative ne permet de reproduire de manière intégrées les interactions moléculaires, cellulaires et comportementaux les effets de la consommation d’alcool, ce qui rend indispensable le recours à ces modèles animaux.
Analyse de la conduction nerveuse et de la locomotion suite à une anomalie du maintien de la myéline périphérique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génétiquement modifiées pour ne plus maintenir correctement la gaine de myéline de leurs nerfs, 1 088 souris développent un trouble neurologique progressif, avec perte de poids, posture anormale et difficulté à s'alimenter. Elles subissent une biopsie, quatre injections, la pose d'électrodes d'électromyographie et des tests de locomotion, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur affirme que le modèle murin est "indispensable" et teste au passage une molécule censée corriger ces anomalies.
Objectifs
Le projet étudie la formation et le maintien de la myéline, la gaine qui entoure et protège les nerfs. Cette gaine est essentielle pour que les signaux nerveux circulent rapidement. Quand elle est altérée, cela peut provoquer des problèmes de mouvements. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour comprendre comment une modification de l’ARN, influence le maintien de la myéline, la conduction nerveuse et le comportement moteur. Nous testerons également une molécule qui pourrait corriger ces anomalies. A terme, ces études permettront de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez les patients porteurs de mutation du gène étudié.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer les conséquences fonctionnelles d’une invalidation d’un gène sur le maintien de la gaine de myéline du système nerveux périphérique. A terme, ces études permettront d'améliorer le diagnostic chez les patients et améliorer les approches de thérapie.
Procédures
Plusieurs contentions, une biopsie (quelques secondes), 4 injections (environ 5 sec), ainsi que la pose d’électrode pour l’électromyographie seront réalisés. Des tests de locomotion seront également effectués, avec un entrainement au préalable.
Impact sur les animaux
La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress chez l’animal. Les différentes injections et la pose d’électrode pour l’électromyographie entraineront un stress et une douleur légère au point d’injection (environ 5 sec). Après injections, les souris présentent un phénotype neurologique progressif lié à des anomalies centrales et périphériques accompagné d’une perte de poids, une posture anormale, et une difficulté à s’alimenter. Ces paramètres seront surveillés régulièrement.
Devenir
Chaque animal sera mis à mort afin de prélever des tissus pour différentes études (transcriptomique, microscopie, immunohistochimie…).
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de comprendre comment le gène d’intérêt impacte le maintien de la gaine de myéline du système nerveux périphérique et la fonctionnalité des neurones. L’étude des mécanismes impliqués ne peut pas être réalisée uniquement in vitro car elle nécessite des interactions entre les différents types cellulaires et doivent être mesurées in vivo.
Réduction
Le nombre de souris est réduit à son minimum. Les données seront donc analysées avec des tests adaptés aux petits effectifs. Des tissus seront collectés après mise à mort afin d’approfondir les études au niveau du gène et de la cellule. Chaque souris génèrera donc de nombreuses informations.
Raffinement
Les points limites définis dans le projet seront strictement appliqués et la douleur sera limitée à son maximum. Une grille de score adaptée à la procédure sera mise en place. L’accès à l’eau et à la nourriture sera facilité, avec la nourriture placée directement dans la cage pour limiter le stress. Les animaux auront des séances de training (entrainement) pour les préparer aux différents tests comportementaux (test d’agrippement, rotarod, test de la poutre et test de la tige verticale).
Choix des espèces
Les mécanismes impliqués dans la formation et le maintien de la gaine de myéline sont très conservés entre l'homme et la souris. En particulier, les phénotypes observés après délétion d’un grand nombre de gènes sont très similaires dans les deux espèces. De plus, il existe un ensemble d’outils qui ont été développés quasiment exclusivement chez la souris. Les souris sont injectées entre 4 à 5 semaines lorsque la gaine de myéline est mature.
Effet de la dépression sur l’anhédonie olfactive chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à un stress chronique pouvant durer jusqu'à sept semaines puis à une chirurgie du crâne pour imagerie et optogénétique, 702 souris vont toutes être tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré pour la plupart et sévère pour 204 d'entre elles. Le porteur décrit des blessures liées aux attaques entre congénères, une hypothermie lors des tests et une douleur post-chirurgicale, ainsi que neuf tests comportementaux sans les nommer un à un. L'objectif est de comprendre pourquoi la dépression altère la perception agréable des odeurs. Les bénéfices thérapeutiques évoqués, promouvoir le bien-être "par les odeurs", restent une perspective lointaine face à des atteintes immédiates et certaines.
Objectifs
Contexte de travail Des études chez l’Homme ont montré que les patients dépressifs pouvaient présenter des troubles de l’olfaction. Parmi les différentes dimensions de la perception olfactive (altérations du seuil de perception, de la discrimination, de l’identification), celle qui semble le plus robustement touchée chez l’homme dans la dépression est le jugement de la valeur hédonique de l’odeur. Une altération de cette dimension hédonique des odeurs provoque des troubles de la prise alimentaire ou de l’humeur, ce qui impacte fortement la dégradation de la qualité de vie et pourrait aggraver le syndrome dépressif. Il va s’agir ici de comprendre les mécanismes neuronaux impliqués dans ces altérations de la perception des odeurs lors de la dépression.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet apporteront des éléments déterminant pour la compréhension des mécanismes de codage de la valeur hédonique de l’odeur et de ses modulations par la pathologie au cours de l’âge. Il s’agit d’un pan entier de la physiologie olfactive dont les processus fondamentaux restent très méconnus. Ce travail, d’un point de vue plus appliqué, devrait fournir de nouvelles pistes thérapeutiques pour promouvoir le bien être par les odeurs.
Procédures
Les animaux seront soumis à un stress chronique pouvant aller de 8 jours à 7 semaines selon le type de stress utilisé afin de produire chez l’animal un état de type dépressif. Afin d’étudier l’effet du stress sur la perception des odeurs, les animaux seront soumis à des test comportementaux visant à vérifier leur état de type dépressif et d’évaluer leurs déficits olfactifs (9 tests). L’ensemble de ces tests comportementaux s’étalera sur 3 semaines et sera effectué sur des groupes d’animaux ayant subis des stress différents pour étudier l’effet du type de stress. Afin d’analyser la dynamique des réseaux neuronaux impliqués dans les déficits olfactifs, nous utiliserons une approche d’imagerie calcique biphotonique nécessitant une chirurgie. L’ensemble de cette intervention comprend la chirurgie, la phase de récupération et les enregistrements pendant l’exposition a des odeurs et s’étend sur 2 mois maximum. Afin de définir l’effet de la manipulation de ces réseaux neuronaux, nous utiliserons la méthode de l’optogénétique nécessitant une chirurgie. L’ensemble de cette intervention comprend la chirurgie et la phase de récupération et s’étend sur 2 mois maximum. Les souris seront hébergées seules entre 3 jours et 12 semaines selon le test. Les souris subiront une restriction alimentaire puis hydrique de 12 heures par restriction (1 fois).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendues sur les animaux sont les suivants : - Stress précoce : stress, perte de poids liés aux mauvaises interactions des souriceaux avec la mère - Stress social : stress, blessures physiques liées aux attaques des souris - Stress imprédictible : stress, hypothermie liée aux tests comportementaux, blessures physiques liées à la mise en présence de congénères en nombre surnuméraire, perte de poids liée à la privation alimentaire et/ou hydrique. - Chirurgie : stress et douleur légère de courte durée liés à la contention légère pour l’injection d’anesthésique ou analgésique. Douleur, perte de poids, hypothermie, stress, apathie, stéréotypie liée à la chirurgie stéréotaxique.
Devenir
Tous les animaux utilisés seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et contrôler les injections ou analyser l’activité neurale.
Remplacement
L’étude de processus physiologiques et plus particulièrement l’étude des bases neuronale du comportement nécessite l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur modèles strictement in vitro. Dans ce contexte, nous utiliserons des souris mâles et femelles, jeunes adultes. Le choix de cette souche est principalement motivé par les données déjà acquises sur ce modèle dans le domaine de l’olfaction et du stress par notre équipe et d’autres.
Réduction
Nous étudions les bases neuronales du comportement. Les données bibliographiques et les prédictions statistiques montrent qu'il faut 5-12 souris minimum par groupe (un calcul préalable de puissance sera effectué en fonction du nombre de groupe expérimentaux). De plus, pour nous assurer de la fiabilité statistique, nous randomiserons les animaux et les groupes. Nous corrèlerons les données cellulaires et comportementales des mêmes animaux grâce à des statistiques appropriées ce qui réduira le nombre d’animaux utilisés. Afin de réduire le nombre souris utilisé, chaque souris sera utilisée comme agresseurs pour 2 à 3 cohortes expérimentales. Ce nombre étant limité par l'age de la souris.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes de 2 à 5 animaux par cage dans notre animalerie avec boisson ad libitum. Des pièces adaptées seront utilisées. Nous veillerons au maximum à limiter les atteintes au bien-être animal. Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée, à l’aide d’une grille d’évaluation, pour détecter les points limites de souffrance. Le poids des animaux sera mesuré quotidiennement. Une perte de poids supérieure à 20% ou un signe révélateur de souffrances engendrera une surveillance supplémentaire jusqu’à euthanasie en cas de nécessité. Le comportement et la posture des souris seront également observés afin d’évaluer le degré de bien-être ou de douleur. Pour réduire l’impact physique et psychique de la procédure, un temps de récupération d’une semaine minimum sera systématiquement permis après chirurgie. De la sciure avec copeaux longs sera utilisée afin que l’animal puisse faire un nid et une période d’habituation avec l’expérimentateur sera permise. L’expérimentateur pratiquera du nursing post chirurgie avant le training. Concernant les expériences in-vivo tête fixée, les animaux seront habitués graduellement au matériel de contention afin de minimiser le stress de l’animal. Le bien-être des animaux avant, pendant et après l’opération sera surveillé et nous utiliserons des anesthésiques, analgésique et antalgique. Les animaux après opération seront contrôlés quotidiennement pendant toute la phase de récupération. Après injection de traceurs ou virus, les animaux seront maintenus en groupe par cage. Après implantation de prismes en verres ou fibres optiques, les animaux seront seuls pour éviter l’altération du matériel fragile. Les cages sont transparentes pour permettre aux animaux de se voir et communiquer.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car son comportement et l’importance écologique de la fonction olfactive de cette espèce sont particulièrement adaptés à la question de recherche qui nous intéresse. De plus, l’ensemble des données antérieures a été obtenu chez cette espèce, elle est classiquement utilisée dans ce type d’étude et nos données pourront être comparées à celles de la littérature. Pour tester les effets du stress imprédictible et du stress social sur la perception des odeurs des animaux adultes seront utilisés (souris de 8 semaines au début de l’expérience). Le stress précoce est réalisé chez des animaux entre 4 et 11 jours après la naissance. Il sera donc nécessaire de réaliser la reproduction des animaux au laboratoire pour tester les effets du stress précoce sur la perception des odeurs. Les effets du stress seront ensuite évalués de façon comportementale chez l’animal adulte. Dans les 2 conditions, les animaux femelles et mâles seront testés.
MODIFICATION Mise en place et caractérisation d’un nouveau modèle d’adversité précoce chez la souris C57Bl/6.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
510 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée, les autres tuées. Les mères et leurs petits sont soumis à un protocole de stress précoce, les mâles adultes servant d'agresseurs dans des séances de défaite sociale, et les petits sont tués pour prélever leur cerveau. L'objectif est de mettre au point chez la souris un modèle de traumatisme de l'enfance transposé de l'humain, en vue de futurs travaux sur des lignées génétiquement modifiées. Cette version modifiée ajoute trois tests comportementaux que le porteur qualifie d'"essentiels" pour affiner les mesures.
Objectifs
L’hypothèse de la programmation précoce des maladies de l’adulte souligne l’importance de la période périnatale comme fenêtre critique de sensibilité aux facteurs environnementaux. Ainsi, la littérature scientifique a révélé que l’adversité dans l’enfance (trauma, abus, négligence) augmente le développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte chez l’humain. Le modèle de séparation maternelle chez le rat engendre des altérations physiologiques et comportementales chez la descendance adulte, permettant ainsi l’étude des mécanismes physiologiques sous-tendant les effets à long terme du stress précoce. Cependant, ce modèle a donné des résultats inconsistants chez la souris, limitant grandement l’accès à des modèles génétiquement modifiés, et ainsi à la compréhension des mécanismes sous-jacents. Une des limites des études antérieures est l’utilisation systématique chez la souris du paradigme utilisé chez le rat, alors qu’il s’agit de 2 espèces distinctes. Nous proposons ainsi dans ce projet de caractériser et valider un nouveau protocole de stress précoce chez la souris en nous basant sur le modèle de défaite sociale déjà caractérisé et validé chez cette même espèce. Les conséquences de ce nouveau protocole seront étudiées chez la descendance mâle et femelle à l’âge adulte en évaluant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs ». Ce protocole sera comparé à un nouveau protocole de séparation maternelle couplé à un sevrage précoce publié récemment pour identifier le protocole de stress précoce entrainant les comportements de type « anxieux » et « dépressifs » les plus robustes. L’objectif à plus long terme de ce projet sera de réemployer ce nouveau protocole en utilisant des modèles génétiquement modifiés qui permettront une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant la vulnérabilité émotionnelle dans un contexte d’adversité précoce.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de caractériser un nouveau modèle de stress précoce chez la souris. En effet les souris sont résistantes aux modèles couramment employés aujourd’hui (notamment la séparation maternelle), bloquant ainsi le potentiel accès à des modèles transgéniques. Cependant ces souris constituent le fond génétique de la plupart des modèles transgéniques de la littérature. Il est donc essentiel de valider une procédure robuste et reproductible de stress précoce. Ce projet servira ainsi de base pour de futurs projets s’intéressant à l’adversité dans l’enfance et nécessitant l’emploi du modèle murin. Ce dernier permet en effet d’accéder à des modèles génétiquement modifiés qui permettraient de mieux comprendre les bases moléculaires des liens entres stress précoce et développement de troubles anxieux et dépressif à l’âge adulte.
Procédures
Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue sur une partie des animaux vigiles pour mesurer les niveaux de stress des animaux. Le volume de sang sera adapté au poids de l’animal et il y aura un maximum de 2 prélèvements par animal. Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire, qui n’entrainera qu’une légère perte de poids surveillée tout au long de la procédure. MODIFICATIONS 3 TESTS COMPORTEMENTAUX SONT AJOUTES SUR LES MEMES ANIMAUX DE LA PROCEDURE 1 (MARBLE TES (TEST ENFOUISSEMENT BILLES FREQUENCE 1FOIS DUREE 20 MIN) OU DE LA PROCEDURE 3 (TEST DE MEMOIRE SOCIALE DUREE 20MIN ET TEST D’INTERACTION SOCIALE DIRECTE DUREE 6 MIN). ILS SONT ESSENTIELS POUR AFFINER LES MESURES COMPORTEMENTALES ILS SERONT EFFECTUES 1 SEULE FOIS CHACUN.
Impact sur les animaux
- De par sa nature et son objectif le protocole de stress social que nous allons utiliser pour modéliser les pathologies psychiatriques entraine un stress chez la souris. Celle-ci présente une élévation des comportements de types anxieux. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré d’après notre expérience au laboratoire et la littérature disponible. En effet, les animaux ne perdent pas de poids au cours du protocole et leur activité locomotrice n’est pas affectée. Les animaux sont observés durant les tests et après les tests et des soins appropriés sont mis en place en cas de besoin - Concernant la descendance, les protocoles de stress précoce visent à générer des comportements émotionnels de type « anxieux » et « dépressifs », qui sont l’objet de cette étude. Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux. Enfin, les procédures de conditionnement opérant nécessitent une restriction alimentaire légère limitée à la phase d’apprentissage (maintien à 90% du poids ad libitum).
Devenir
Pour les procédures 1, 2 et 3 : - Les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale et les mères seront soit mises à mort soit réutilisées par des membres du laboratoire dans d’autres expériences à chaque fois que ce sera possible pour répondre aux besoins de réduction de la règle des 3R. - Les petits seront euthanasiés à la fin de la procédure par raison scientifique afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et histologiques.
Remplacement
L’objectif du projet étant de caractériser et de valider un nouveau protocole de stress précoce dans un modèle murin et d’étudier les conséquences de ce stress sur le développement de troubles anxieux et dépressifs chez la progéniture à l’âge adulte. L’emploi de modèle animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie pour les prochaines étapes du projet qui nécessiteront l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements.
Réduction
Pour respecter la règle de réduction du nombre d'animaux utilisés, les souris mâles adultes utilisées pour la défaite sociale seront employées durant plusieurs sessions consécutives de ce protocole. Ces animaux seront proposées aux autres utilisateurs puisqu'ils n'auront pas reçu de traitements particuliers. De la même manière, les mères pourront être proposées aux autres utilisateurs. Le nombre total maximal d’animaux prévus dans le projet est de 510, mais ce nombre est susceptible d’être revue à la baisse, en fonction du succès des reproductions réalisées.
Raffinement
- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et dans un environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille qui peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet. - Les femelles seront achetées directement gestantes auprès du fournisseur. - Les souris utilisées pour la défaite sociale seront d’anciens mâles reproducteurs et arriveront donc à l’âge adulte (après 4 mois). - Les expériences de comportement sur la descendance démarreront sur des animaux âgés de 12 semaines et plus car le phénotype apparaît à l’âge adulte.
Ouverture des barrières hémato-médullaire et hémato-encéphalique combinée à un traitement anti-inflammatoire dans plusieurs modèles murins de Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
416 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à vingt-trois injections sur dix semaines, dont 336 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 40 opérées puis tuées sans réveil. S'y ajoutent l'ouverture répétée des barrières entre le sang et le système nerveux central par ultrasons sous anesthésie, des électromyographies et, pour certaines, une biopsie. Les modèles murins portent une sclérose latérale amyotrophique qui entraîne une paralysie progressive. Le porteur espère ralentir la maladie en faisant pénétrer des cellules immunitaires dans le système nerveux, un bénéfice pour les patients formulé au conditionnel.
Objectifs
La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative grave qui touche 7000 adultes en France, caractérisée par une atteinte des motoneurones au niveau du cortex et de la moelle épinière et résultant par la paralysie et le décès des patients 2 à 5 ans après le diagnostic. Le seul traitement utilisé en clinique, le Riluzole, ne permet de prolonger la survie que de 2 mois en moyenne. Les barrières entre le sang et le cerveau, hémato encéphalique et entre le sang et la moelle épinière, hémato médullaire sont des structures limitant le passage des molécules du sang vers le système nerveux central et représentent donc un challenge dans le traitement des maladies neurologiques et particulièrement de la sclérose latérale amyotrophique, qui ne trouve à ce jour pas de traitement satisfaisant. Il est aujourd’hui possible d’ouvrir cette barrière de manière transitoire et sans danger. Il a été montré que certaines cellules immunitaires dans des modèles murins de sclérose latérale amyotrophique permettaient de ralentir la progression de la maladie. L’objectif de notre étude sera de réaliser une approche combinée, avec une stimulation de ces cellules immunitaires associée à une ouverture transitoire des barrières hémato-médullaire et encéphalique, permettant d’augmenter leur infiltration dans le système nerveux central pour ralentir d’autant plus la progression de la maladie.
Bénéfices attendus
L’objectif de cette étude est de chercher à ralentir la progression de la maladie, en induisant une immunomodulation locale par ouverture des barrières hémato-médullaire et encéphalique, et stimulation de certaines cellules immunitaires. A plus long terme, en cas d’efficacité, un passage en essai clinique chez l’homme est envisagé. Des méthodes existent déjà chez l’homme pour ouvrir la barrière hémato encéphalique et un dispositif d’ouverture adapté aux patients atteint de sclérose latérale amyotrophique pourrait voir le jour si l’étude préclinique s’avère positive.
Procédures
Les modèles murins de sclérose latérale amyotrophique et les souris non génétiquement modifiées commerciales seront soumis à plusieurs injections d’un traitement immunomodulateur (animal vigil, 23 injections sur 10 semaines, 1 minute), des prélèvements sanguins (animal vigil, 10 maximum sur 10 semaines, 1 minute), des mesures de force musculaire et ou d’endurance (animal vigil, 17 fois sur 17 semaines, 5 minutes), contrôle du poids (animal vigil, 1 fois par semaine pendant 17 semaines, 2 minutes). Une biopsie sera réalisée pour unne vérification du génotype des souris provenant de fournisseurs extérieurs (animal anesthésié/analgésie lors de la première anesthésie pour ultrasons, 1 seule fois, 30 secondes) Ouverture des barrières hémato-médullaire ou encéphalique (animal sous anesthésie générale et analgésie, pendant 1h, 1 fois toutes les 2 semaines pendant 7 semaines, 5 minutes pour la procédure d’ouverture). Mesures électromyographiques pour tester la fonctionnalité des neurones moteurs au stade symptomatique de la maladie sous anesthésie générale, avec une analgésie (procédure durant 8minutes).
Impact sur les animaux
Les souris seront soumises à plusieurs injections qui pourront engendrer une douleur légère, de courte durée. Dans de rares cas, les injections répétées pourront, par exemple, engendrer une péritonite ou une inflammation au niveau oculaire. Les tests de mesure de force pourront engendrer un léger stress. Les prélèvements sanguins pourront créer un hématome. Le phénotype des animaux pourra entrainer une faiblesse musculaire conduisant à une paralysie. L’exposition aux ultrasons requiert un rasage et pourra engendrer un léger stress aux animaux. Cependant, toute la procédure, rasage et exposition aux ultrasons, se fait sous anesthésie générale. L’anesthésie pourra engendrer une hypothermie et un risque de détresse cardio-respiratoire. Le phénotype des modèles murin de sclérose latérale amyotrophique (SLA) se traduit par une perte de poids, une perte de force musculaire et une paralysie progressive, au cours de la maladie. Les sites d’injection et de prélèvement peuvent s’infecter. La manipulation des animaux pourra induire un stress. Les biopsies réalisées chez les souris provenant de fournisseurs extérieurs (sous anesthésie générale, lors de la première anesthésie pour ultrasons) pourront induire une douleur légère et de courte durée.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour permettre le prélèvement des différents tissus d’intérêt qui sont affectés par la maladie, notamment le tissus nerveux, les nerfs, les muscles et les cellules sanguines, pour des analyses histologiques ou transcriptomiques.
Remplacement
Ces modèles animaux sont actuellement les seuls qui permettent de reproduire la paralysie progressive chez l’adulte dans le cadre de la sclérose latérale amyotrophique et donc de modéliser la physiopathologie humaine. Ils sont aussi le seul modèle permettant d’étudier un effet sur la progression de la maladie, raisons pour lesquelles notre projet nécessite l’utilisation de modèle de souris à progression rapide et lente. Divers travaux ont déjà mis en œuvre des expériences utilisant des cultures cellulaires pour montrer l’intérêt des molécules que nous souhaitons tester. Dans le cadre de ce projet combinant l’administration d’un traitement anti-inflammatoire et l’ouverture transitoire des barrières hémato-médullaire et encéphalique, il n’est pas possible d’évaluer leurs effets sur la progression de la maladie et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central avec de telles cultures cellulaires. L’intérêt du projet est de mesurer un effet de l’entrée de ces cellules protectrices dans le système nerveux central, par rapport à l’effet de la périphérie, afin de pouvoir augmenter l’effet bénéfique. Nous avons donc besoin d’un modèle ayant un système nerveux central, un système vasculaire et un système nerveux périphérique, donc, un système animal. Nous utilisons la souris car, c’est dans cette espèce que le modèle de SLA est le plus représentatif de la progression de la maladie qui se développe chez les patients atteints de SLA.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 416 souris dans ce projet, la taille des effectifs a été établie de façon à obtenir un résultat statistiquement significatif et d’obtenir une conclusion scientifique à l’ensemble de nos travaux. Le nombre de souris par groupe sera déterminé par un calcul de puissance utilisant les mêmes aspects méthodologiques nous ayant permis d’obtenir des résultats significatifs pour nos travaux précédents.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Acclimatation minimale de 7 jours pour les animaux provenant des fournisseurs extérieurs. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères du même sexe (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et l’état des animaux est vérifié quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Des petites maisons en carton et des carrés de coton seront intégrés dans les cages pour permettre de faire des nids. Si la maladie des souris n’est pas synchrone d’une souris à l’autre, les souris ayant du mal à se déplacer (pour cause de paralysie engendrée par la maladie) seront séparées pour éviter que les souris plus vives ne les piétinent. Elles seront alors placées en hébergement individuel ou avec les autres souris paralysées (2 à 5 souris par cage sauf cas exceptionnel et peu probable où il n’y aurait qu’une souris dans cet état). Un mélange de poudre de nourriture et d'eau (bouillie) sera proposé dans la cage aux souris ayant des difficultés à se déplacer afin d'éviter une déshydratation et une dénutrition. Une attention particulière sera portée aux yeux des souris qui seront fréquemment nettoyés (à l’eau stérile) en cas de suintement, pour éviter toute infection. De la solution antiseptique sera utilisée si les yeux paraissent trop souillés comme désinfectant. Proche du stade terminal, les souris seront surveillées 1 à 2 fois par jour, tous les jours de la semaine (week-ends inclus). Toutes les précautions seront prises afin de n’imposer aucune souffrance ou une contrainte minimale aux souris utilisées et nous avons, pour chaque procédure, défini un point limite.
Choix des espèces
Il existe différents modèles animaux utiles pour étudier la sclérose latérale amyotrophique (SLA), souris, rats, poissons, mouches, vers. Cependant, nos questions concernent les interactions entre différents types cellulaires et la communication entre des cellules immunitaires infiltrant depuis la périphérie, dans un système nerveux central mammifère. Par conséquent, poissons, mouches, vers ne sont pas de bons modèles pour répondre à nos questions. Nous utilisons aussi des cultures cellulaires mais, celles-ci ne peuvent pas permettre d’évaluer un effet sur la progression de la maladie dans un modèle intégré et de mesurer un infiltrat cellulaire dans le système nerveux central. Nous avons donc besoin d’un modèle ayant un système nerveux central, un système vasculaire et un système nerveux périphérique, donc, un système animal. Nous avons une grande expérience des souris et le modèle est mieux établi chez la souris que chez le rat, c’est pourquoi nous avons décidé d’utiliser les souris comme modèle pour ce projet. C’est dans l’espèce souris que le modèle de SLA est le plus représentatif de la progression de la maladie qui se développe chez les patients atteints de SLA. Les souris SLA seront utilisées à l’âge adulte entre 7 semaines et 24 semaines pour les modèles à progression rapide et entre 7 semaines et 52 semaines pour le modèle à progression lente. L’utilisation de modèles murins dans ce projet va donc permettre d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la maladie, et évaluer la possibilité d’un essai thérapeutique chez l’homme.