Système nerveux

Une restriction alimentaire maintenant le poids à 90 % de la normale, une immobilisation de la tête et des chirurgies cérébrales de deux à quatre heures avec implant de fibre optique : 288 rats Long Evans vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ces gestes visent à cartographier la "boussole neuronale" qui indique la direction de la tête et à en tester le rôle dans une tâche de navigation. Les retombées médicales évoquées, rééducation ou prothèses vestibulaires pour les personnes âgées, restent hypothétiques et lointaines. Le porteur présente le rat Long Evans comme l'"expert de la navigation" reconnu partout, argument qui tient surtout aux décennies de travaux déjà accumulés sur cette souche.

Objectifs

Pour nous orienter dans l’espace, notre cerveau doit savoir en permanence dans quelle direction notre tête est tournée. De nombreux animaux, et en particulier les mammifères, possèdent ainsi une « boussole neuronale » localisée dans la partie antérieure du cerveau. Cette boussole est tenue informée des changements d’orientation de notre tête grâce aux détecteurs de mouvements de l’oreille interne, appelés organes vestibulaires, et qui sont classiquement associés au contrôle de l’équilibre. Notre objectif est de comprendre comment ces signaux sont utilisés pour synchroniser notre boussole neuronale avec les mouvements de notre tête. Ce projet comporte trois étapes : 1) Cartographier les connexions neuronales au sein du circuit reliant les organes vestibulaires et la boussole neuronale. 2) Observer comment les neurones de ce circuit s'activent en temps réel lorsque l'animal bouge la tête. 3) Tester le rôle de ce circuit en modifiant son activité chez des animaux réalisant une tâche de navigation spatiale.

Bénéfices attendus

En permettant de mieux comprendre comment les informations vestibulaires (relatives aux mouvements de la tête) sont utilisées par le cerveau pour s’orienter dans l’espace, les résultats de ce projet pourraient inspirer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients souffrant de déficits vestibulaires et de troubles de l’orientation, en particulier chez les personnes âgées. Par exemple, la présbyvestibulopathie, un syndrome vestibulaire lié au vieillissement, affecte 20 à 30 % des plus de 65 ans et plus de 50 % des plus de 80 ans. Elle se caractérise notamment par une altération des capacités cognitives spatiales, entraînant une perte d’autonomie. Une meilleure compréhension des mécanismes neuronaux sous-jacents pourrait conduire à des protocoles de rééducation plus ciblés ou à l’élaboration de prothèses vestibulaires adaptées. Les mécanismes identifiés pourraient également éclairer d’autres pathologies affectant l’orientation spatiale, comme la maladie d’Alzheimer, où les troubles de la navigation sont précoces et invalidants. D’autre part, Les mécanismes neuronaux identifiés dans le cadre de notre étude pourraient servir de modèle pour concevoir des algorithmes neuro-inspirés d’estimation de l’orientation. Ces algorithmes pourraient potentiellement améliorer la précision et la robustesse des systèmes robotiques autonomes ou des dispositifs d’assistance pour les personnes atteintes de troubles vestibulaires.

Procédures

HABITUATION AU CONTACT HUMAIN. Une partie des animaux (nombre : 228) va être habitué au contact humain pendant une semaine (quelques minutes, 2x/jour), préalablement à toute autre manipulation. CHIRURGIE. L’ensemble des animaux du projet (nombre : 288) va subir une intervention chirurgicale de quelques heures (entre 2 et 4 h) visant à injecter un vecteur viral dans le cerveau et, dans certains animaux (nombre: 228), à y implanter une fibre optique de petite taille (diamètre : 0,2 mm). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale avec couverture analgésique péri-opératoire. Au cours de cette procédure chirurgicale, les animaux recevront les injections sous-cutanées suivantes: 1) buprénorphine (analgésie péri-opératoire), 2) lidocaine (analgésie locale du point d'incision) et 3) sérum physiologique (réhydratation). IMMOBILISATION. Une partie des animaux (nombre : 108) subira une contention du corps et une immobilisation de la tête, au cours d’un protocole d’habituation, puis pendant la phase d’acquisition des données. Habituation : contention du corps uniquement (30 s à 2 min, 2x/jour pendant 4 jours), puis contention du corps et immobilisation de la tête (2 à 5 min, 2x/jour pendant 8 jours). Acquisition des données : une session de contention/immobilisation par jour (5 min) pendant 10 jours. Au cours de cette phase d’acquisition des données, 54 animaux subiront des mouvements imposés (rotations, translations) pendant la phase de contention/immobilisation. TÂCHE DE NAVIGATION SPATIALE. Pendant 4 à 5 semaines, une partie des animaux (nombre : 120) réalisera quotidiennement une tâche de navigation spatiale consistant à rechercher de la nourriture sur une table de 1,80 m de diamètre puis à retourner dans un refuge pour la consommer. Pendant cette période, les animaux seront en restriction alimentaire afin de maintenir leur poids à 90% de sa valeur normale.

Impact sur les animaux

NUISANCES ASSOCIÉES À LA CHIRURGIE (288 animaux au maximum) : 1) au réveil, hypothermie, difficulté à se nourrir et à boire, 2) en post-opératoire, douleur modérée. CONTENTION DU CORPS ET IMMOBILISATION DE LA TÊTE (108 animaux au maximum) : la contention du corps (dans un linge) et l'immobilisation de la tête peuvent induire un stress aigu chez les animaux. RESTRICTION ALIMENTAIRE (120 animaux au maximum) : stress métabolique chronique modéré.

Devenir

Tous les animaux utilisés dans ce projet seront mis à mort en fin de procédure afin de réaliser une analyse approfondie de l'anatomie des circuits neuronaux étudiés, ainsi que pour valider le placement d'une fibre optique de tout petit diamètre (0,2 mm), implantée pendant la chirurgie et utilisée pour les expériences de mesures et de perturbations de l'activité neuronale.

Remplacement

Pour comprendre comment un être vivant s'oriente, il faut pouvoir observer son cerveau pendant qu'il agit. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet de reproduire cette complexité. IMPORTANCE DU COMPORTEMENT : L'orientation spatiale est un processus qui dépend de ce que l'animal voit et ressent en bougeant. On ne peut pas étudier cette « boussole interne » sur des cellules isolées ou des tissus qui ne sont plus connectés aux sens (comme la vue ou l'équilibre). LIMITES DE L’INFORMATIQUE : Les simulations par ordinateur sont d'excellents outils pour tester des théories ou prédire des résultats. Cependant, elles ne peuvent pas remplacer la réalité biologique : elles servent à accompagner l'expérience, mais ne peuvent pas s'y substituer. DES MODÈLES DE SUBSTITUTION ENCORE TROP SIMPLES : Les cultures de cellules ou les « mini-cerveaux » (organoïdes) sont très utiles pour d'autres recherches, mais ils n'ont pas la structure complexe d'un cerveau adulte. En effet le cerveau d'un rat adulte a été « sculpté » par ses expériences et ses apprentissages. Cette maturité et cette organisation globale sont indispensables pour comprendre comment les signaux de mouvement sont traités, ce que les modèles de laboratoire ne savent pas encore reproduire. En résumé, pour comprendre une fonction aussi complexe que la navigation dans l'espace, l'observation d'un cerveau complet et actif reste actuellement la seule solution viable.

Réduction

Pour obtenir des résultats fiables tout en utilisant le plus petit nombre d'animaux possible, nous appliquons plusieurs stratégies de réduction. 1) Pour optimiser le rendement de la chirurgie, c'est à dire maximiser la proportion d'animaux avec un ciblage correct des structures cérébrales étudiées, un appareil stéréotaxique de haute précision sera utilisé. Les animaux dont le ciblage est erroné serviront de contrôles anatomiques, validant par contraste la spécificité fonctionnelle des noyaux visés. 2) Les cerveaux des procédures 2 et 3, exprimant des marqueurs fluorescents, viendront compléter les observations anatomiques réalisées dans la procédure 1, réduisant ainsi la pression sur le nombre d’animaux dans cette procédure. 3) Nos protocoles d’habituation et d’apprentissage sont optimisés pour obtenir un taux de réussite de 100 % pour les objectifs des procédure 2 et 3. 4) Si le rendement chirurgical est au-dessus des attendus expérimentaux et/ou si la significativité statistique des effets mesurés est atteinte plus tôt (analyse au fil de l’eau), les effectifs seront revus à la baisse.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont prévues à chaque étape des procédures. HABITUATION AU CONTACT HUMAIN. Les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur pour s'habituer au contact humain. Cette étape d'apprivoisement réduit considérablement leur stress lors des futures manipulations. UNE VIE SOCIALE PRÉSERVÉE. Les rats sont des animaux sociaux et supportent mal l’isolement. Pour pouvoir héberger les animaux par deux, nous utilisons des implants crânien ultra-résistants, garantissant leur durabilité malgré les tentatives de grignottage du congénère. Les cages sont également enrichies avec des tunnels, du coton et du carton pour stimuler le jeu et l’exploration. GESTION RIGOUREUSE DE LA DOULEUR. Toutes les interventions chirurgicales se font sous anesthésie avec une prise en charge systématique de la douleur (analgésiques). Un suivi très étroit est assuré durant la récupération, et des doses supplémentaires de médicaments sont prévues au moindre signe d'inconfort. APPRENTISSAGE EN DOUCEUR ET PAR LA RÉCOMPENSE. L'habituation à l’immobilisation se fait de manière très progressive. Pour encourager les animaux, nous utilisons un renforcement positif sous forme d'eau sucrée. La réduction alimentaire est légère et progressive. Elle vise à motiver l'animal à rechercher de la nourriture pendant la tâche de navigation spatiale. Les rats conservent un poids proche de la normale (au moins 90 % de leur poids normal) et reçoivent des briquettes de bois à ronger pour prendre soin de leurs incisives malgré une prise alimentaire réduite.

Choix des espèces

Le rat, et particulièrement la souche Long Evans, est considéré par les scientifiques du monde entier comme l'expert de la navigation. C'est un animal naturellement curieux, explorateur et doté d'excellentes capacités d'apprentissage. En travaillant avec ce modèle, nous pouvons comparer nos découvertes avec des décennies de recherches déjà accumulées sur sa « boussole interne ». Le cerveau du rat est suffisamment grand pour permettre le ciblage des petites structures cérébrales (souvent moins de 1 mm) étudiées dans ce projet. Pour observer le cerveau en action pendant que le rat se déplace, l'animal doit porter un petit dispositif de mesure sur sa tête. Le rat est assez robuste pour porter l'équipement de 10 à 12 g prévu dans ce projet, sans aucune gêne pour ses mouvements ou son confort. Les animaux arrivent à l'animalerie à l'âge de 8 ou 9 semaines, ce qui correspond au stade de jeune adulte. Nous attendons qu'ils atteignent 10 semaines pour l'intervention chirurgicale car, à cet âge, leur crâne a quasiment fini sa croissance. Cela assure une stabilité parfaite des implants sur le long terme et une sécurité maximale pour l'animal.

Toutes tuées pour prélever leur tissu nerveux à plusieurs stades de la maladie, 1 095 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ces souris porteuses d'une mutation liée à l'ataxie de Friedreich subissent des chirurgies cérébrales de 45 minutes à 3 heures, pose de fenêtre crânienne ou injections virales, puis des séances d'imagerie tête immobilisée de 30 à 45 minutes et des tests de coordination motrice, de marche et de force. Le projet prolonge un travail antérieur sur le même modèle et vise à explorer les circuits cérébelleux et à tester des thérapies géniques. Le porteur qualifie d'"indispensable" le suivi des protéines d'intérêt à plusieurs temps, ce qui justifie la mise à mort échelonnée des animaux.

Objectifs

L’ataxie de Friedreich (AF) est une maladie neurodégénérative rare et héréditaire qui provoque une perte progressive de la coordination motrice. Elle est causée par une perte de fonction de la frataxine, protéine clé du métabolisme du fer mitochondrial. Récemment, un nouveau modèle murin porteur d’une mutation ponctuelle dans le gène FXN (Fxn G127V KI/KI) a été généré (Fil et al., 2020). Cette mutation ayant été identifiée pour la première fois chez des patients atteints d’AF, ce modèle représente un outil préclinique particulièrement pertinent pour l’étude des mécanismes pathologiques et le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Dans ce projet, nous visons à caractériser de manière approfondie les altérations du circuit cérébelleux aux stades pré-symptomatique et symptomatique, en utilisant l’imagerie in vivo. Cette approche constitue le seul moyen d’évaluer dynamiquement l’activité neuronale en tenant compte des interactions synaptiques, mais également d’explorer la fonction mitochondriale et les interactions neurones–glie au sein du cortex cérébelleux. Sur la base de ces données, nous mettrons en place des stratégies de modulation du circuit cérébelleux par des approches chimiogénétiques et de thérapie génique ciblée, afin d’évaluer leur potentiel pour restaurer les déficits comportementaux. Enfin, l’étude des modifications moléculaires associées permettra d’identifier des mécanismes d’intérêt pour le développement de futures thérapies chez les patients atteints d’AF. Ce projet prolonge et complète le projet déjà approuvé consacré à la première caractérisation du modèle G127V KI/KI, en apportant une analyse plus fine des dysfonctionnements mitochondriaux, des interactions cellulaires et des altérations des circuits cérébelleux. ous chercherons à comprendre comment l’activité et le métabolisme des neurones et des cellules gliales fonctionnent à la fois chez les animaux contrôles et G127V. L’accent sera mis sur les interactions neurones–glie et sur le partage de voies métaboliques essentielles, dont la perturbation pourrait contribuer aux dysfonctionnements observés dans l’AF. Les approches de modulation et de protéomique offriront l’opportunité d’identifier les voies clés nécessaires au maintien de l’activité neuronale, de l’homéostasie gliale et d’un état métabolique correct, et permettront de mieux comprendre les altérations propres à l’AF.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à caractériser l’activité neuronale et gliale ainsi que la dynamique mitochondriale au sein du circuit cérébelleux dans un modèle préclinique de l’ataxie de Friedreich. Il fournira de nouvelles connaissances sur le rôle de la frataxine et les conséquences de sa perte de fonction, tout en permettant d’évaluer, d’un point de vue comportemental et moléculaire, la réintroduction de la frataxine dans des populations neuronales spécifiques affectées par la maladie. De plus, les voies ciblées identifiées mettront en évidence de nouvelles voies potentielles pour le développement d’interventions thérapeutiques chez les patients.

Procédures

Des tests comportementaux non invasifs seront réalisés afin d’évaluer la coordination motrice, la marche et la force musculaire. Chaque test dure entre 30 secondes et 5 minutes, pour un maximum de 15 minutes par session et par animal. Avant le début des tests, les animaux seront habitués à l’expérimentateur pendant 7 jours (10 à 20 minutes par jour et par animal) par des manipulations douces et progressives, afin de réduire le stress et d’assurer la fiabilité des observations. Au total, 120 animaux seront concernés par ces tests. Des interventions chirurgicales seront réalisées afin d’implanter des fenêtres ou des lentilles permettant l’observation directe du cerveau, ou pour injecter des vecteurs rendant certaines cellules visibles. Toutes les chirurgies seront effectuées sous anesthésie générale, avec une prise en charge adaptée de la douleur pendant et après l’intervention. La durée des interventions varie de 45 minutes (injections dans le cerveau) à 3 heures (implantation de fenêtre crânienne). Après la chirurgie, une période de récupération avec surveillance rapprochée et soins adaptés est prévue. Lorsque nécessaire pour garantir la sécurité des animaux et une récupération optimale, ceux-ci pourront être hébergés individuellement pendant la phase postopératoire. Après la phase de récupération, certains animaux participeront à des séances d’imagerie afin d’enregistrer l’activité cérébrale à l’état éveillé, au repos ou lors de tâches comportementales. Lors de ces sessions, la tête de l’animal est maintenue stable pendant 30 à 45 minutes. Une habituation progressive de 7 à 10 jours est mise en place, avec une augmentation graduelle de la durée, afin de limiter le stress et l’inconfort. Ces procédures concernent 720 animaux. Des injections ciblées dans le cerveau seront également réalisées pour moduler l’activité des cellules nerveuses ou de soutien, parfois en combinaison avec l’imagerie. Ces interventions concernent 160 animaux. Enfin, des analyses après le décès des animaux seront effectuées pour des études moléculaires et protéomiques, concernant 45 animaux. L’ensemble de ces interventions est conçu pour limiter le nombre total d’animaux utilisés, tout en assurant un suivi attentif et continu de leur bien-être.

Impact sur les animaux

Les données recueillies par notre laboratoire et par nos collaborateurs montrent que le modèle de souris utilisé pour l’ataxie de Friedreich ne présente pas de troubles moteurs marqués avant l’âge de 9 mois. Des signes légers de manque de coordination peuvent toutefois apparaître dès l’âge de 4 à 5 mois. Les tests de comportement réalisés chez les animaux sont non invasifs et n’entraînent pas de douleur. Ils peuvent cependant provoquer un stress léger et de courte durée, lié à la manipulation des animaux et à leur exposition à un environnement nouveau. Les séances d’imagerie nécessitent une immobilisation temporaire de l’animal, ce qui peut également générer un inconfort ou un stress transitoire, sans effet durable attendu. La chirurgie d’injection dans le cerveau et la pose d’une fenêtre crânienne constituent une intervention importante. Elles peuvent provoquer une douleur au moment de l’intervention ainsi qu’une gêne dans les jours suivants. Comme pour toute chirurgie, des complications post-opératoires telles qu’un saignement, une infection ou un gonflement peuvent survenir, mais elles restent rares et font l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter l’inconfort des animaux.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort pour prélever des tissus. Ces prélèvements seront utilisés pour plusieurs types d’analyses moléculaires et histologiques. Il est en effet indispensable de déterminer l’évolution du taux des protéines d’intérêt à plusieurs temps lors de l’étude.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier. Des projets de culture cellulaire ont toutefois débuté dans l’équipe à partir de ce modèle pour répondre à d’autres questions biologiques.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, plusieurs mesures ont été mises en place. Tout d’abord, les mêmes animaux sont utilisés pour différentes expériences lorsqu’il est possible, en combinant des analyses comportementales, de microscopie in vivo, et des études histologiques ou moléculaires. Cela permet de réduire le nombre total de sujets nécessaires tout en conservant la pertinence scientifique des données. Les effectifs ont été calculés pour garantir une puissance statistique adéquate, en tenant compte de la variabilité attendue entre individus. Pour chaque groupe expérimental, des mâles et des femelles sont utilisés afin de tenir compte des différences sexuelles potentielles dans les phénotypes et les réponses aux interventions, avec un équilibre idéal de 50 % de chaque sexe. De plus, les animaux non utilisés pour certaines analyses sont réservés pour des expériences complémentaires ou des validations ultérieures, évitant ainsi la répétition inutile d’expériences. Les tissus collectés lors des interventions chirurgicales ou des euthanasies sont également exploités de manière optimale pour plusieurs types d’analyses (histologie, biologie moléculaire, protéomique), réduisant le besoin d’animaux supplémentaires. Enfin, des stratégies alternatives, telles que l’utilisation d’animaux transgéniques combinées à des injections virales ciblées, permettent de limiter le recours à des croisements complexes ou à de grandes cohortes d’animaux, tout en obtenant des résultats comparables. Ces approches contribuent à une utilisation plus efficace des animaux et à une réduction significative du nombre total de sujets nécessaires pour ce projet, tout en garantissant la représentativité des deux sexes.

Raffinement

Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations afin de réduire leur stress. Des méthodes de manipulation douces et peu stressantes seront utilisées, comme l’utilisation de tunnels ou la prise des souris dans la main, plutôt que par la queue. La prise en charge de la douleur pendant et après l’intervention chirurgicale repose sur un protocole antidouleur complet, mis en place en collaboration avec la vétérinaire référente de la structure. Après la chirurgie, les animaux pourront être hébergés individuellement lorsque cela est nécessaire pour assurer leur sécurité et une surveillance adaptée durant la période de récupération. Pendant cette période, un enrichissement supplémentaire de l’environnement sera fourni (matériel de nidification, éléments à explorer) afin de limiter le stress et de prévenir l’apparition de comportements anormaux. Un suivi vétérinaire quotidien sera réalisé pendant 10 jours à l’aide d’une grille d’évaluation permettant de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de douleur. Plusieurs traitements antidouleur sont disponibles et pourront être ajustés si nécessaire. Des critères d’arrêt adaptés à cette chirurgie ont été définis afin de prévenir toute souffrance inutile. Ils incluent notamment l’observation de la prise de nourriture et d’eau, de l’état général, du toilettage et des déplacements de chaque animal. Les traitements seront administrés via l’eau de boisson, légèrement sucrée pour en faciliter la prise, ce qui permet d’éviter toute manipulation supplémentaire et limite le stress des animaux.

Choix des espèces

Le projet utilise exclusivement des souris-modèles génétiquement altérées présentant une diminution de la frataxine, ainsi que des animaux témoins de type naturel. Ce modèle reproduit de manière fidèle les déficits cellulaires et comportementaux observés chez les patients atteints d’ataxie de Friedreich, tout en permettant l’étude in vivo de l’activité cérébrale et de la progression de la maladie. Les stades de développement ont été choisis en fonction des objectifs expérimentaux : 40 à 50 jours post-natal (jeunes adultes pré-symptomatiques) : étude des altérations précoces de l’activité cérébelleuse, avant l’apparition des symptômes moteurs. 70 à 150 jours post-natal (stades précoce à symptomatique) : suivi de la progression de la maladie à travers l’analyse de l’activité cérébrale et des premiers signes d’incoordination. 180 à 270 jours post-natal (adultes symptomatiques) : évaluation de l’effet des approches thérapeutiques et étude des circuits cérébraux à un stade avancé de la maladie. L’utilisation de ces différents stades permet une couverture complète de l’évolution de la pathologie, de la phase présymptomatique à la phase symptomatique, tout en optimisant le nombre d’animaux grâce à la réalisation de plusieurs analyses sur les mêmes individus.

Pour valider une nouvelle technique d'IRM mesurant la myéline, 18 souris femelles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent de la cuprizone dans leur nourriture pour détruire la myéline, ce qui peut provoquer des troubles de la coordination, des troubles de la mémoire et des comportements anxieux ou dépressifs. Le porteur décrit ensuite une "phase de guérison" une fois le produit arrêté, alors que toutes les souris sont tuées en fin de protocole pour vérifier les images sur leur cerveau. La reconstitution de la myéline mise en avant sert à valider un outil d'imagerie, et non à soigner les souris qui l'ont subie.

Objectifs

De nombreuses maladies du cerveau et de la moelle épinière s’accompagnent d’une atteinte de la myéline, une structure agissant comme une couche isolante autour des neurones, permettant aux messages du cerveau de circuler plus vite et efficacement. Parmi ces maladies, nous retrouvons la sclérose en plaques (SEP), dont l'incidence est en augmentation depuis plusieurs années. Ainsi, pour mieux traiter ces patients, il est nécessaire de disposer d'outils en pratique clinique permettant de quantifier cette atteinte, et l’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet cela de façon non-invasive. Néanmoins, les techniques d’IRM actuellement utilisées en pratique clinique ne permettent pas de voir directement la myéline mais seulement les dégâts infligés au cerveau lors de l’atteinte de cette myéline. Depuis plusieurs années, des techniques d’IRM sont développées pour essayer de mesurer directement l’atteinte de la myéline, et il en existe aujourd’hui une qui est considérée comme la référence. Néanmoins, cette technique est complexe et nécessite une longue durée d’acquisition, rendant son utilisation en pratique clinique impossible en l’état. Nous avons donc développé une nouvelle technique d’IRM ciblant la myéline, plus simple dans sa mise en œuvre. Ce projet vise à tester cette nouvelle méthode d’imagerie, en la comparant à la technique de référence, à l’aide d’un modèle murin imitant la sclérose en plaques humaine : le modèle cuprizone. Le projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir une nouvelle méthode d'IRM fiable, non invasive et applicable en conditions cliniques pour quantifier la myéline in vivo, ce qui fait actuellement défaut pour le suivi des patients atteints de SEP. Cette nouvelle approche sera aussi utile dans le cadre d’autres pathologies neurodégénératives, comme la maladie d’Alzheimer. Ceci est d'autant plus important que le développement de thérapies innovantes visant à favoriser la remyélinisation (c’est-à-dire visant la réparation de la myéline atteinte, et donc la protection des neurones), devient une priorité depuis quelques années.

Procédures

Le traitement par cuprizone sera administré per os, directement incorporé au sein de la nourriture habituelle des souris, à la concentration de 0,2%. Les animaux bénéficieront de 2 à 4 sessions d’anesthésie générale gazeuse, afin de permettre leur immobilité et de réduire leur stress lors des examens par IRM. Chaque session aura une durée maximale de 2 heures.

Impact sur les animaux

L’administration du traitement par cuprizone peut entraîner chez la souris des troubles moteurs légers, à savoir principalement des troubles de la coordination et locomotion. Elle peut aussi entraîner des troubles comportementaux liés à des problèmes de mémoire et d’apprentissage, pouvant être à l’origine de comportements anxieux ou dépressifs. La cuprizone peut également avoir des effets physiologiques généraux avec une perte de poids et une baisse de l’activité. Toutefois, dès que l'on arrête de donner le produit à la 6ème semaine, le cerveau cesse d'être attaqué. Cela marque le début d'une phase de guérison où l'animal retrouve progressivement sa forme et son comportement normal. Par ailleurs, il peut y avoir un stress lié aux transports des souris entre les animaleries et la plateforme d'imagerie.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin de prélever et analyser leur cerveau. Cette étape est indispensable pour vérifier que les images obtenues en IRM reflètent bien la réalité biologique observée dans le cerveau.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est obligatoire pour valider la robustesse de nouveaux paramètres IRM dans des conditions biologiques réelles. Ces validations constituent une étape incontournable avant toute transposition en clinique. A ce jour, malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, aucune alternative non animale ne permet de reproduire de manière fiable la complexité des mécanismes de démyélinisation et de remyélinisation in vivo.

Réduction

Le nombre de 18 souris est nécessaire et suffisant pour analyser la perte de myéline induite par le traitement à la cuprizone, la reconstitution de la myéline tout en considérant les variabilités inter-individus, aux 3 points temporels de notre étude. Le suivi longitudinal permet de réduire la variabilité inter-individuelle et le nombre total d’animaux utilisés, tout en évaluant la nouvelle technique IRM.

Raffinement

Des mesures de raffinement seront prises au cours du suivi afin de réduire le stress engendré par les examens IRM répétés,les transports et les contentions multiples et les troubles induits par l'ingestion du médicament pour induire une démyélinisation . Ces mesures seront réalisées sous anesthésie générale, afin que l’animal ne bouge pas et permettra de diminuer le stress induit par le bruit des machines. L’hypothermie, induite par le passage dans la machine IRM sera prévenue par un maintien d’une température stable pendant toute la durée de l’anesthésie. Des points limites seront appliqués, conduisant selon la situation, à l’arrêt de la procédure et/ou à la mise à mort humanitaire conformément aux procédures en vigueur.

Choix des espèces

Le modèle cuprizone est le modèle de choix pour l'étude des changements du contenu en myéline dans le cerveau de souris. Il s’agira de souris femelles adultes ayant un développement cérébral achevé (âgées de 6 à 8 semaines) car la sclérose en plaques est une maladie du jeune adulte, touchant de façon prédominante les femmes.

Quarante séances de recharge par ultrasons et environ soixante-dix-sept passages au tube test étalés sur quatre-vingts semaines: 50 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque animal reçoit d'abord une sonde télémétrique implantée par chirurgie, puis subit des anesthésies répétées, des échographies et des tests comportementaux mesurant le statut social, le sursaut et l'anxiété. L'objectif déclaré est de valider un implant rechargeable sans fil pour un suivi cardiovasculaire de longue durée. Le porteur avance que ce dispositif "pourrait révolutionner" le suivi des patients, une perspective renvoyée à des applications cliniques futures.

Objectifs

L’utilisation de sondes implantables chez l’animal permet de mesurer les variations physiologiques chez l’animal vigile, offrant ainsi un suivi précis et non invasif de la dynamique cardiovasculaire et de ses fluctuations. Toutefois, ce type de dispositif est limité par la durée de vie des batteries, qui ne dépasse généralement pas quatre semaines. Or, dans le cadre de recherches nécessitant un suivi longitudinal des variables cardiovasculaires pour évaluer les modifications physiopathologiques à long terme, cette contrainte constitue un frein majeur car les dispositifs disponibles reposant sur des batteries à usage unique. Le développement d’un dispositif rechargeable sans fil représenterait donc un véritable atout. L’exploitation d’un phénomène physique tel que l’émission d’ultrasons pourrait offrir une solution innovante et durable pour recharger en toute innocuité des implants médicaux. L’objectif principal de ce projet est d’évaluer la faisabilité de l’implantation et de la recharge d’un tel dispositif chez le rongeur, ainsi que ses effets physiologiques et comportementaux, afin d’en caractériser et valider l’utilisation pour un suivi cardiovasculaire de longue durée. Un objectif secondaire consistera à étudier la réactivité et la résilience des rongeurs face aux stress sociaux, tout en explorant les corrélats neuronaux dans la régulation du système nerveux autonome à travers la réactivité des paramètres cardiovasculaires.

Bénéfices attendus

Le projet visant à utiliser des sondes de télémétrie rechargeables par ultrasons chez le rongeur présente de nombreux bénéfices importants potentiels pour la recherche biomédicale et les applications cliniques futures. 1. Amélioration de la durée de suivi Les dispositifs actuels de télémétrie sont limités par la durée de vie des batteries, généralement autour de quatre semaines. La recharge sans fil par ultrasons permet une surveillance continue sur une période prolongée, dépassant les limitations actuelles. Cela est particulièrement avantageux pour les études longitudinales nécessitant un suivi à long terme des variables cardiovasculaires. 2. Collecte de données de haute qualité (raffinement) En permettant un suivi continu et ininterrompu, ces sondes offrent une collecte de données plus complète et précise que les dispositifs externes. Les mesures en temps réel de la pression artérielle, de l'électrocardiogramme, de l'activité et de la température fourniront des informations détaillées sur la dynamique cardiovasculaire et les réponses physiologiques des animaux aux divers stimuli ou traitements. 3. Applications cliniques potentielles Les technologies développées et testées dans ce projet pourraient être transposées à des applications cliniques chez l'humain. Les dispositifs médicaux de types implants rechargeables par ultrasons pourraient révolutionner le suivi des patients sur le long terme et augmenter les capacités de mesures. 4. Avancées en recherche biomédicale La possibilité de suivre, sur le long terme et avec une grande précision, les changements physiopathologiques ouvriront de nouvelles perspectives pour la recherche biomédicale. Les chercheurs pourront ainsi approfondir la compréhension des mécanismes sous-jacents liant le stress aux maladies cardiovasculaires, notamment en explorant leurs interactions et comorbidités. 5. Efficacité et durabilité accrues Les dispositifs rechargeables par ultrasons représentent une avancée écologique en réduisant les déchets électroniques liés aux batteries jetables. De plus, l'efficacité de la recherche sera améliorée, avec moins de temps et de ressources nécessaires pour la maintenance des équipements.

Procédures

Chirurgie d’implantation d’une sonde télémétrique : 1 acte par animal, réalisé sous anesthésie gazeuse ; protocole opératoire standard avec incision minimale, implantation, fermeture en deux plans et surveillance post-opératoire. Séances de recharge du dispositif par ultrasons sous anesthésie gazeuse : environ 40 sur 80 semaines ; durée 10 à 20 minutes par session ; fréquence maximale attendue : une recharge toutes les deux semaines. Évaluations échographiques: environ 18 examens sur la période ; durée inférieure à 45 minutes par examen ; installation sur platine chauffante avec protection oculaire et gel ultrasonore, surveillance jusqu’au réveil complet. Jalons d’évaluations comportementales (statut social, réflexe de sursaut, anxiété) : environ 18 jalons sur la période ; paramètres et durées par test — Tube test : hebdomadaire à partir de la troisième semaine post-opératoire ; environ 77 sessions sur 80 semaines ; durée moyenne 30 secondes par essai (maximum 2 minutes), plusieurs essais par paire, ordre randomisé. Startle (réflexe de sursaut) : expositions sonores intense et brèves; enregistrement immédiat. Boîte claire/obscure: session de quelques minutes par jalon ; mesure du temps en zone claire et sombre et du nombre de transitions. Épreuves pharmacologiques de réactivité du système nerveux autonome : environ 12 sessions distinctes sur 80 semaines (environ une fois par trimestre pour deux composés) ; monitoring continu pendant 15 à 30 minutes après administration, puis retour en cage après réveil complet. Suivi longitudinal télémétrique : acquisitions de routine continues selon le calendrier expérimental ; collecte non invasive des paramètres (pression artérielle, ECG et variabilité, température, activité locomotrice).

Impact sur les animaux

1. Les chirurgies d’implantation des sondes télémétriques qui se feront sous anesthésie générale peuvent entraîner des douleurs post-opératoires légères à modérées, avec un impact limité dans le temps (quelques jours) sur le bien-être des animaux. 2. Anesthésie gazeuse : La manipulation des animaux et l’induction de l’anesthésie peuvent engendrer un stress léger. 3. Injection : Une douleur légère peut être ressentie au niveau du site d’injection.4. Tests comportementaux : Les tests comportementaux utilisés sont des tests classiques d’évaluation cognitive, sociale ou d’exploration, bien caractérisés dans la littérature. Bien que ces tests puissent générer un certain stress de manipulation, il est bien établi qu’ils n’induisent pas d’effets physiologiques indésirables immédiats ou à long terme. 5. Impact des sondes implantées Les sondes implantées peuvent provoquer une réaction immunitaire ou une irritation des tissus environnants, entraînant une inflammation chronique ou d'autres complications locales. Ces réactions peuvent affecter le bien-être des animaux et potentiellement altérer les données collectées.

Devenir

Les animaux ayant subi la chirurgie d’implantation d’un dispositif nécessitent une récupération post-mortem pour évaluer son impact sur les tissus environnants ; réalisation d’analyses histologiques et immunohistochimiques (examen des tissus cardiaques, vasculaires et cérébraux) ; impossibilité de réutilisation dans un autre protocole en raison des interventions subies.

Remplacement

Le remplacement des modèles animaux est un objectif central en recherche biomédicale. Toutefois, dans cette étude, l’utilisation de souris vivantes est indispensable, car aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire avec précision les interactions complexes entre le système nerveux autonome, le système cardiovasculaire et la réponse physiologique au dispositif implanté. Cependant, plusieurs alternatives ont été envisagées pour limiter l’utilisation des animaux : modélisation informatique et simulations physiologiques — avant les expérimentations in vivo, des simulations numériques sont utilisées pour optimiser les paramètres d’implantation et de recharge des sondes ; tests préliminaires sur tissus ex vivo — certaines validations techniques sont réalisées sur tissus cardiaques isolés avant l’expérimentation animale ; exploitation de données issues d’études précédentes — une revue approfondie de la littérature scientifique permet d’éviter toute duplication d’expérience déjà réalisée. Malgré ces approches, seul un modèle animal vivant permet d’évaluer de manière intégrée la dynamique cardiovasculaire et l’impact du dispositif sur le long terme, justifiant ainsi l’utilisation de souris dans ce projet.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique des résultats, plusieurs stratégies ont été mises en place : optimisation du nombre d’animaux — une analyse de puissance statistique a été réalisée pour déterminer le nombre minimal nécessaire, évitant ainsi toute utilisation excessive ; approche longitudinale — chaque souris servira à plusieurs analyses physiologiques et comportementales au cours du protocole, réduisant le besoin de multiplier les groupes expérimentaux ; phase d’optimisation préalable — des tests préliminaires seront effectués sur un nombre restreint d’animaux afin d’optimiser les procédures avant leur mise en œuvre à plus grande échelle ; exploration de plusieurs paramètres chez un même individu — l’utilisation de sondes télémétriques multi-paramétriques permet d’obtenir plusieurs types de mesures (ECG, pression artérielle, température, activité) à partir du même animal. Grâce à ces méthodes, cette étude respecte le principe de réduction, garantissant une utilisation responsable des animaux tout en assurant des résultats fiables et exploitables.

Raffinement

Le projet intègre des mesures strictes pour minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout en garantissant des résultats expérimentaux fiables : amélioration du bien-être animal — hébergement en groupe pour éviter l’isolement sauf nécessité médicale ; enrichissement du milieu avec matériaux de nidification, tunnels et abris pour favoriser les comportements naturels ; période d’habituation de 7 jours avant toute intervention pour réduire le stress lié aux manipulations ; optimisation des procédures chirurgicales et post-opératoires — chirurgie réalisée par des expérimentateurs formés afin de minimiser la durée d’intervention et le risque de complications ; utilisation d’une anesthésie générale gazeuse, plus douce et offrant une récupération rapide ; administration d’analgésiques et d’anti-inflammatoires avant, pendant et après la chirurgie pour limiter la douleur ; surveillance post-opératoire rapprochée (48 heures) avec critères stricts pour évaluer la récupération des animaux ; réduction du stress lié aux manipulations — entraînement progressif aux manipulations expérimentales pour limiter les réactions de peur ; utilisation de techniques de contention douce réduisant l’impact des interventions répétées ; recharge des sondes sous anesthésie gazeuse légère, évitant tout inconfort prolongé ; optimisation des tests comportementaux et physiologiques — tests éthologiques réalisés dans un environnement familier pour limiter le stress expérimental ; utilisation de mesures télémétriques pour un suivi en continu, évitant des manipulations invasives répétées ; critères d’arrêt éthique stricts pour interrompre toute procédure en cas de détresse excessive. Ces stratégies assurent une approche éthique et responsable, garantissant le bien-être des animaux tout en maintenant la qualité scientifique des données collectées.

Choix des espèces

L’espèce (souris) a été sélectionnée pour cette étude en raison de sa pertinence scientifique et expérimentale. Les souris sont couramment utilisées en recherche biomédicale en raison de leur homologie génétique élevée avec l’humain, de leur taille réduite facilitant la gestion expérimentale, et de leur cycle de reproduction court, permettant des études longitudinales efficaces. De plus, l’existence de modèles génétiquement modifiés et d’outils avancés, tels que la télémétrie, en fait une espèce idéale pour le suivi des variables cardiovasculaires en conditions chroniques. Leur système cardiovasculaire et nerveux autonome présente des similitudes avec celui des humains, ce qui permet d’étudier avec précision l’impact de la télémétrie rechargeable par ultrasons sur les paramètres physiologiques. Les animaux utilisés dans cette étude seront des souris jeunes adultes âgées de 7 semaines ou plus au moment du début des expérimentations. Ce choix est justifié par plusieurs facteurs scientifiques et expérimentaux : 1. Maturité physiologique : À cet âge, le système cardiovasculaire, nerveux et immunitaire est pleinement développé, garantissant une réponse physiologique stable et représentative des mécanismes étudiés. 2. Tolérance aux interventions : Les souris jeunes adultes présentent une meilleure récupération post-chirurgicale et une plus grande résistance au stress expérimental par rapport aux individus plus âgés ou immatures. 3. Comparabilité avec les études existantes : L’âge choisi correspond aux standards des études précliniques utilisant des modèles murins pour l’évaluation des dispositifs médicaux et des réponses cardiovasculaires. 4. Réduction des biais développementaux : L’utilisation de souris à un stade adulte permet de limiter les variations liées à la croissance et d’assurer des résultats plus homogènes. Ainsi, cet âge permet d’optimiser la qualité des données recueillies tout en garantissant le bien-être des animaux conformément aux principes éthiques en vigueur.

Un choc électrique, une restriction alimentaire et des injections de toxines directement dans le cerveau : 2 280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les toxines détruisent des voies nerveuses pour reproduire la maladie de Parkinson, avant l'implantation d'une canule cérébrale et une série de tests comportementaux. Le projet cherche des marqueurs d'imagerie des troubles moteurs et cognitifs, sur deux établissements. Le porteur reconnaît que ces modèles ne reproduisent que partiellement la maladie humaine, ce qui le conduit à en combiner plusieurs.

Objectifs

Le projet se déroulera désormais dans 2 EU. La maladie de Parkinson (MP) se caractérise par les classiques signes moteurs permettant le diagnostic mais également par des troubles cognitifs et psycho-comportementaux, plus variables dans leur apparition et leur expression, mais ayant un impact considérable sur l’autonomie et la qualité de vie des patients ainsi que sur les décisions thérapeutiques. Pourtant, leur prise en charge reste limitée et requiert une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, notamment via l’identification de biomarqueurs. Les biomarqueurs sont des indicateurs des processus pathogènes et des outils précieux tant pour faciliter le diagnostic précoce, que pour suivre l’évolution de la pathologie ou l’efficacité d’un traitement. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) avec ses explorations anatomiques et fonctionnelles, combinée à des méthodes spécifiques d’analyse a récemment permis de mettre en évidence des marqueurs de certains des troubles observés en clinique. Cependant son utilisation reste encore marginale notamment pour le diagnostic, et le lien entre ces marqueurs d’imagerie et l’histologie reste à établir. Cette corrélation est indispensable tant à la compréhension des mécanismes sous-jacents qu’à la validation de ces marqueurs en tant que Biomarqueurs de la pathologie. L’utilisation de modèles animaux est le moyen le plus adapté pour mener ce type d’études. Cependant, ils ne miment que partiellement la pathologie humaine et chaque modèle présentent des avantages et des limites. Il convient donc de valider les résultats obtenus sur plusieurs modèles complémentaires pouvant représenter les différents aspects physiopathologiques de la maladie. Le présent projet vise d’abord à étudier plusieurs de ces modèles afin de reproduire les différents troubles moteurs et non moteurs associés à la pathologie. Les objectifs seront ensuite d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en IRM/TEP et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent. Enfin, en fonction des résultats de cette première partie (et des résultats in vitro fait en parallèle), certains de ces modèles seront reproduits afin de tester l’effet de stratégies thérapeutiques . Un modèle de démence induite par une déplétion cholinergique centrale sera aussi utilisé comme contrôle positif de déclin cognitif sévère afin de contrôler l’efficacité de ces stratégies.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des biomarqueurs des troubles moteurs et non moteurs en imagerie in vivo (IRM ou TEP) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacent (Histologie). Ces biomarqueurs pourraient être validés et utilisés en clinique pour aider au diagnostic de certains troubles, le suivi non invasif de l'évolution de la pathologie et/ou de l'effet des traitements. L'étude des mécanismes sous jacents permettra l'idenitfication de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dont l'efficacité sera testée.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales visant à injecter des toxines pour induire des lésions cérébrales (30 minutes) dans l'EU2/2 pour les AAV2/9 hm-alpha-syn en A2 et dans l'EU1/2 pour les autres toxines (6OHDA, MPTP, IgG saporine). Après transfert dans l'EU1/2, certains d'entre eux subiront à nouveau une procédure chirurgicale pour l'implantation d'une canule d'administation cérébrale (30 minutes). Certains animaux subiront des injections sous-cutanées ou intra-péritonéales (Maximum 2/jours pendant 4 semaines). Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux dont certains nécessitent une restriction alimentaire avec rationnement, ou la délivrance d'un choc electrique (0,7 mA - 2 sec, 1 seule fois). Le transport entre les 2 EU sera assuré par un transporteur agréé respectant les conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA.

Impact sur les animaux

Les toxines injectées induisent une dégénérescence des voies cérébrales dopaninergiques et/ou cholinergiques, un déficit du contrôle moteur et/ou cognitif est donc attendu et étudié dans ce projet. Une perte de poids corporel peut aussi être observée chez certains animaux plus sévérement lésés. L'anesthésie subie lors de la chirurgie ou de l'imagerie en IRM pourrait être mal tolérée par certains animaux. Les évaluations comportementales n'induisent pas de perturbation en elles-mêmes. La restriction alimentaire associée au touchscreen pourrait être mal tolérée par certains animaux. La pose de canule intracérébrale et les injections de traitments pourraient être mal tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des évaluations en imagerie in vivo ou après l'evaluation des effets thérapeutiques sur ces variables

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’utilisation d’animaux pour étudier la physiopathologie de troubles cognitifs et comportementaux. Cependant pour limiter l’utilisation d’animaux, l'étude de la potentielle toxicité, des mécanismes d'action et l’efficacité des molécules thérapeutiques testées seront étudiés en parallèle sur un modèle cellulaire (Remplacement).

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au minimum sur la base d'un test de puissance. L'analyse statistiques des données débutera par une étude de la normalité et de l'homogénéité des variances. Selon la distribution des valeurs, des tests paramétriques (ANOVA puis Test de Fisher pour la compariason 2 à 2) ou non paramètriques (Kruskal-Wallis et Wil-Coxon test pour la comparaison 2 à 2) seront utilisés. Les mêmes animaux seront réutilisés pour l'analyse comportementale et l'imagerie cérébrale à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem. Les animaux seront réutilisés pour différentes évaluations (Comportement et Imagerie) à différents temps du processus pathologique, ainsi que pour les analyses histologiques post-mortem.

Raffinement

Les rats seront hébergés dans des portoirs ou armoires ventilées sous un cycle de lumière 12h/12h selon la règlementation, avec nourriture et accès à l'eau ad libitum. Le raffinement est assuré par un hébergement collectif, de l’enrichissement dans les cages, des sessions d’acclimatation aux expériences, une manipulation expérimentée des animaux. L'unique transport entre les 2 EU après la procédure de chirurgie en A2 sera effectuée par un transporteur agréé pendant 15 minutes maximum, dans des conditions optimales pour limiter le stress et maintenir le BEA (cage de transport spécifique, climatisation du camion, respect cycle lumière, vibrations amorties). De plus, un suivi quotidien du bien-être des animaux sera effectué pour surveiller l'apparition éventuelle de souffrance ou de points limites pour lesquels des décisions adaptées seront prises. Un point limite a été déterminé selon les critères suivants : Le comportement général : -Difficulté de mobilité, isolement, perte partielle de réactions aux stimuli -Prostration, automutilation, tremblements - Vocalisations, agressivité Le poids : perte de poids importante (20%) L’apparence physique : pelage très terne ou souillé, plaie cutanée, hémorragie oculaire, génitale et/ou anale. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique (Buprénorphine, 0.05 mg/kg), ou seront euthanasiés par dose létale de pentobarbital dans une salle dédiée (Doléthal®, 182.2mg/kg) . La structure BEA ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin.

Choix des espèces

Parmi les petits rongeurs, le rat est l’espèce la mieux adaptée pour l’évaluation des troubles cognitifs et psycho-comportementaux. Par ailleurs, les modèles expérimentaux choisis ont été décrits chez le rat. Les rats utilisés auront 8-10 semaines. Cet âge a été choisi en raison de la référence utilisé pour l’ATLAS cérébral de rat et la précision de localisation des repères stéréotaxiques pour les injections cérébrales.