Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Caractérisation de la pathogénicité de l’alpha-synucléine de souris agrégée en présence de protéines humaines impliquées dans la maladie d’Alzheimer et le diabète de type 2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
98 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le cerveau, par une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes, des formes altérées d'une protéine liée à la maladie de Parkinson, pour comparer leur pouvoir pathogène. Le porteur indique que cette inoculation conduit irrémédiablement à une paralysie mortelle, les animaux étant tués dès l'apparition d'une démarche saccadée et d'une perte d'équilibre. Il affirme que le projet ne peut être mené qu'in vivo, faute de méthode alternative.
Objectifs
L’alpha-synucléine est une protéine présente sous une forme anormale dans les lésions cérébrales des patients atteints de la maladie de Parkinson, la démence à corps de Lewy ou l’atrophie multisystématisée. Nous avons développé une méthode permettant d’amplifier in vitro les altérations de l’alpha-synucléine à partir d’un cerveau (substrat) provenant de souris conventionnelles C57Bl/6 après amorçage de la réaction par une petite quantité de matériel cérébral de souris modifiées génétiquement (M83) et présentant des altérations de l’alpha-synucléine humaine. Notre projet vise à évaluer dans quelle mesure la présence d'autres protéines humaines anormales dans le cerveau utilisé comme substrat peut modifier les altérations de l’alpha-synucléine lors de la réaction in vitro. Ces autres protéines humaines examinées sont celles impliquées dans la maladie d’Alzheimer (β-amyloïde et tau) et dans le diabète de type 2 (peptide amyloïde des ilots pancréatiques). Les caractéristiques de l’alpha-synucléine ainsi altérée in vitro sont évaluées dans notre projet par les caractéristiques de la maladie et des lésions cérébrales observées suite à son inoculation dans le cerveau de souris modifiées génétiquement (M83).
Bénéfices attendus
Le projet vise à apporter des nouvelles connaissances sur les relations entre des protéines qui sont altérées dans la maladie d’Alzheimer ou le diabète de type 2 et l’alpha-synucléine, qui est altérée dans la maladie de Parkinson. Il est en effet établi que l’altération des premières protéines entraîne une fréquence accrue et une aggravation des maladies humaines associées à l’alpha-synucléine altérée, mais les mécanismes en cause restent encore très mal compris. Ce projet envisage de répondre à la question de savoir dans quelle mesure ceci peut être lié à des altérations différentes de l’alpha-synucléine elle-même, du fait de la présence dans le cerveau d’autres protéines altérées. On parle de co-morbidités.
Procédures
Les produits d’amplification obtenus in vitro sont caractérisés par leur pathogénicité après inoculation dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 98 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.
Impact sur les animaux
L’inoculation de différentes formes altérées d’alpha-synucléine présentes dans les différents produits d’amplification étudiés est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie, et leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.
Remplacement
Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition des symptomes moteurs et à décrire l’extension des lésions et les altérations de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.
Réduction
Les 7 lots expérimentaux sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles, pour chaque produit d’amplification examiné. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée de survie, de la distribution des lésions cérébrales et des altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. L’analyse statistique de la distribution de l’alpha-synucléine nécessite en particulier un minimum de 6 souris au stade clinique de la maladie. Un lot de 14 souris nous permet ainsi de bénéficier au stade clinique d’au moins 6 cerveaux, pour les analyses biochimiques de l’alpha-synucléine et d'au moins 6 cerveaux pour l’analyse des lésions cérébrales. Les autres prélèvements (intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire dans ce modèle de souris sur les marqueurs de la maladie dans les tissus périphériques.
Raffinement
Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (igloos, nestlets ou sizzles) pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés selon les critères et le scoring prévu en annexe et justifiant la mise à mort de l’animal. Grâce à ce projet fondé sur l’inoculation de différentes sources d’alpha-synucléine anormale nous souhaitons affiner la caractérisation clinique comme possible critère de différenciation, une possibilité décrite dans la littérature scientifique, par exemple lors d’un test de suspension par la queue.
Choix des espèces
Plusieurs études récentes ont montré que les souris (M83) utilisées dans ce projet permettaient la caractérisation de différentes formes anormales d’alpha-synucléine, après leur inoculation dans le cerveau de ces souris, sur la base du délai d’incubation de la maladie, de l’extension des lésions dans le cerveau et des altérations biochimiques de l’alpha-synucléine. Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris âgées de 6 à 8 semaines. Compte-tenu de l’importance de la mesure de la durée d’incubation de la maladie ces souris sont entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à son apparition, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.
THYROCRISP: Création et caractérisation de lignées génétiquement modifiées pour étudier les effets d’une hypothyroïdie ou d’une hyperthyroïdie médiées par invalidation de gènes clés de l’axe thyroïdien lors du développement embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
883 xénopes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, la plupart tués et une partie réutilisée pour d'autres projets. Les femelles sont injectées pour pondre, les têtards génotypés par écouvillon puis soumis à un test de nage, et les embryons surnuméraires comme les têtards non porteurs de la mutation sont tués avant terme. Le porteur crée cinq lignées génétiquement modifiées pour étudier l'axe thyroïdien, et anticipe le développement possible d'un goitre chez les têtards rendus hypothyroïdiens. Il affirme que la complexité de cet axe ne peut être reproduite in vitro et présente le choix d'un amphibien à un stade larvaire comme un respect des 3R.
Objectifs
Les hormones thyroïdiennes (HTs) contrôlent de nombreux processus biologiques en régulant l’expression de nombreux gènes. Des perturbations de la signalisation de ces hormones sont à l’origine de diverses pathologies qui peuvent se manifester tout au long de la vie des êtres vivants et constituent des problèmes majeurs de santé publique et santé environnementale. Ainsi, l’étude des gènes contrôlés par les HTs est essentiel pour comprendre les mécanismes liés à cette signalisation. La complexité du système hormonal lié à la thyroïde ne peut être reproduite in vitro à cause de nombreux mécanismes de contrôles de la régulation de cet axe et nécessite de recourir à des organismes modèles animaux. A l’heure actuelle, aucune batterie de tests in vitro ne peut prendre en compte la circulation sanguine, la métabolisation par le foie et le rétrocontrôle exercé par le cerveau sur la production d’hormones par la thyroïde. Le xénope dont la métamorphose est dépendante d’un pic en hormones thyroïdiennes identique à celles des autres vertébrés dont l’Homme, est un amphibien couramment utilisé comme modèle pour étudier l’axe thyroïdien et les perturbations de cet axe. Pour étudier le rôle de ces HTs, nous avons donc choisi le xénope comme modèle et des stades d'études (embryo/larvaire) qui permettent de satisfaire au mieux la règle des 3R. Notre projet a pour objectif la création de 5 lignées génétiquement modifiées chez le xénope, où l’inactivation d’un gène clé de la signalisation HTs dans chaque lignée, entraine soit une hyperthyroïdie soit une hypothyroïdie chez les animaux portant la mutation. La caractérisation de ces 5 lignées nous permettra de mieux comprendre les conséquences d’une déficience ou d’un excès en HTs sur le développement des animaux, en s’interressant plus particulièrement au développement du cerveau.
Bénéfices attendus
Le but du projet est de pouvoir développer des modèles hypothyroïdiens et hyperthyroïdiens avec l’invalidation de 5 gènes sélectionnés pour leur rôle essentiel dans la signalisation thyroïdienne. Les hormones thyroidiennes (HTs) sont conservées parmi tous les vertébrés. Les HTs jouent un rôle clé dans les transitions des cycles de vie de ces vertébrés et notamment la métamorphose des amphibiens. Les retombées de ce projet seront, au niveau scientifique, de mieux comprendre les mécanismes d’action des HTs en étudiant les fonctions des protéines invalidées (stratégie de perte de fonction). Ce projet permettra en outre, d’établir des points de comparaison entre les modifications de l’expression des gènes observées suite à l’invalidation des 5 gènes clés de l’axe thyroïdien avec celles qui ont pu être observées suite à une exposition à des produits chimiques susceptibles de perturber la signalisation par les HTs. D’un point de vue applicatif, nous pourrons tester des stratégies profilaxiques afin de traiter les patients atteints de telles mutations, mais aussi analyser les comportements associés à la perte de fonction de ces gènes et faire des comparaisons avec ce qui est observé en écotoxicologie sur certaines espèces.
Procédures
Afin d'obtenir des œufs, les femelles adultes sont induites à pondre par injections en sous-cutané dans les sacs lymphatiques dorsaux avec de l'hormone chorionogonadotropine humaine. Elles sont capturées avec une épuisette (propre et désinfectée) dans laquelle ils sont maintenus manuellement sans pression, pour éviter qu’elles ne s’échappent pendant l’injection. Une pression légère sur le point d’injection est faite pendant quelques secondes au moment de retirer l’aiguille. Dans le but d’identifier les animaux portant la mutation du gène ciblé pour chaque lignée, un prélèvement de mucus sur les têtards anesthésiés est fait de façon non invasive, à l’aide d’un écouvillon frotté délicatement sur la peau de chaque animal. La durée du prélèvement est d’environ 15 secondes par animal et ne sera effectué qu’une seule fois sur les animaux à génotyper. Un test de mobilité consistant à suivre le mouvement de chaque têtard pendant 10 minutes avec une alternance de périodes lumière/obscurité sera fait pour les animaux de chacune des 5 lignées afin de contrôler si la mutation affecte ou non cette mobilité.
Impact sur les animaux
Pour les 5 gènes choisis, l’invalidation des différents gènes ciblés devrait conduire soit à une baisse des HTs circulantes entrainant une hypothyroïdie générale de l’animal, soit au contraire à une augmentation des HTs circulantes entrainant une hyperthroïdie de l’animal. Pour les invalidations de gènes qui sont succeptibles d’induire des hypothyroïdies, nous anticipons la possibilité pour les têtards de développer une hypertrophie de la glande thyroïde (goitre).
Devenir
Procédure 1 : Induction de la ponte des femelles xénope (18 femelles de type sauvage dites Wild Type) et récolte des œufs. Toutes les femelles sont gardées et pourront être impliquées dans d’autres projets à la suite de cette procédure. Procédure 2 : Création et élevage des animaux de chaque lignée où chacun des 5 gènes ciblés a été inactivé. Dans un 1er temps les 325 animaux impliqués dans cette procédure (soit 50 par lignée donc 250, et 75 animaux contrôles) seront élevés jusqu’au stade têtard pour être génotypés afin d’identifier et de conserver les animaux où le gène ciblé est bien inactivé, lesanimaux partiellement ou non invalidés ne seront pas conservés. Ensuite seuls les animaux pleinement invalidés sont élevés jusqu’au stade adulte où 2 couples d’animaux par lignée (soit 2x5 femelles et 2x5 mâles) seront conservés pour établir les 5 lignées qui serviront à produire les animaux portant chacune des mutations voulues. Tous les adultes des 5 lignées sont gardés et pourront être impliqués dans d’autres projets à la suite de cette procédure. Procédure 3 : Analyse moléculaire et comportementale des 5 lignées. La mobilité des animaux mutants pour chacune des 5 lignées sera étudiée. Cela comprendra l’analyse de 540 têtards pour le comportement de nage (90 animaux x 5 lignées + 1 lignée contrôle) au stade NF48 (15 jours post fécondation). Puis sur les 540 têtards, seuls 90 têtards (15 têtards par groupe) seront conservés afin de réduire le nombre d'animaux en expérimentation et ils seront élevés jusqu'au stade NF55 (33 jours post fécondation) pour prélever différents tissus destinés à être analysés.
Remplacement
L’objectif de notre projet est de comprendre les effets d’une déficience ou d'un excès en hormones thyroïdiennes au cours du développement. La complexité de l’axe hypothalamo-hypophyso-thyroïdien ne peut être reproduite in vitro à cause de nombreux mécanismes de régulation de cet axe et nécessite de recourir à des animaux modèles. Aucune batterie de tests in vitro ne peut prendre en compte la circulation sanguine, la métabolisation par le foie et le rétrocontrôle exercé par le cerveau sur la production d’hormones par la thyroïde. Nous avons choisi un modèle (amphibien) et des stades d'études (embryon/larve) qui permettent de satisfaire au mieux de la règle des 3R.
Réduction
La production d’animaux est réduite au maximum de façon à atteindre les objectifs. Pour les procédures 1 à 2, correspondant à la production de lignées, le nombre d’animaux utilisés correspond au meilleur compromis pour parvenir à établir le nombre de mutants, avec une reproductibilité sur au moins trois expériences indépendantes. Lorsqu’une ponte fournira plus d’embryons que nécessaire pour une expérience prévue, les embryons surnuméraires seront euthanasiés avant la fin des stades éleuthero-embryons.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Les embryons et larves sont maintenus dans un milieu d’élevage adapté à leur croissance et les adultes dans de l’eau dont les paramètres sont surveillés quotidiennement (température) ou de façon hebdomadaire (salinité, concentration en nitrate-nitrite et pH). Les têtards sont nourris avec de la poudre d’ortie avec un apport en proteines, puis après métamorphose les animaux sont nourris avec de la nourriture sèche ainsi que de la nourriture riche en protéines (vers de vase), afin d’assurer aux animaux une croissance optimale. Ils sont maintenus à une densité recommandée par la directive européenne afin d’éviter tout stress dû à une surpopulation ou un isolement. Enfin, les animaux sont l’objet d’un suivi quotidien et tout animal présentant des signes de maladies est isolé et soigné pour éviter toute propagation.
Choix des espèces
Le xénope (Xenopus laevis) est un modèle reconnu pour l’étude du système hormonal lié à la thyroïde. En effet la métamorphose est entièrement dépendante d'un pic en Hormone thyroïdienne. Ce pic a lieu à la naissance chez les humains (et la plupart des vertébrés) et permet la maturation du système nerveux. Cette espèce, comme tous les vertébrés, possède les mêmes hormones que les Hommes. Elle offre l'avantage 1) de ne pas être un mammifère et d'avoir un développement externe qui permet un traitement avec des différentes molécules par balnéation et non par gavage ou par injection, 2) d'être un vertébré tétrapode (à la différence des poissons) et d'être évolutivement relativement proche de l'Homme. De plus, son développement rapide, le grand nombre d’embryons synchronisés obtenus par fécondation in vitro, la transparence des embryons, les possibilités de transgénèse et de mutagenèse, en font un modèle de choix pour la recherche. Les femelles adultes de type sauvage permettront d’assurer la production des œufs qui serviront à créer les 5 lignées génétiquement modifiées présentant chacune l’inactivation d’un gène clé de la signalisation thyroïdienne. Pour établir les 5 lignées, les têtards seront élevés jusqu’au stade adulte pour sélectionner 20 adultes, soit 10 mâles et 10 femelles matures sexuellement correspondant à 2 couples par lignée créée. Pour caractériser les 5 lignées, les couples permettront d’assurer les reproductions, puis les tests de mobilité (comportement de nage) seront pratiqués sur les têtards issus de ces reproductions au stade NF48 (15 jours post fécondation) et les tissus seront prélevés pour analyse au stade NF55 (33 jours post fécondation).
Modèle de suivi de l’expression de l’aSynucléine par bioluminescence chez la souris_1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau avec injection d'un virus faisant surexprimer une protéine liée à la maladie de Parkinson, puis des séances d'imagerie sous anesthésie et des tests comportementaux que le porteur qualifie de "non invasifs" sans les détailler. Les animaux sont tués pour analyse du tissu cérébral. Le porteur affirme avoir besoin d'un "modèle intégré" que la culture cellulaire ne remplace pas, et présente le suivi par bioluminescence comme un moyen de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Certains sont basés sur l'injection intracérébrale de virus permettant la surexpression d’alpha-synucléine (protéine abondante dans le cerveau et dont l’agrégation provoque une dégénérescence de certains neurones) mutée (A53T) ou d’injection de fibrilles synthétiques d’alpha-synucléine, formes toxiques de la synucléine, qui serait une des causes de la mort des neurones dopaminergiques et des problèmes moteurs conséquents. L’accumulation d’alpha-synucléine n’est étudiée que post-mortem chez l’animal.Les objectifs sont doubles : 1/ Tout d’abord la création d’un modèle de surexpression de l’alpha-synucléine mutée couplée à la production de la NanoLuc, protéine traçable in vivo au cours du temps et qui permettra le suivi de l’évolution du syndrome pathologique. Pour cette approche in vivo, nous comparerons la souche C57Bl6 et son équivalent albinos pour s'affranchir de la pigmentation de la peau. 2/ En plus de cette évolution pour ce modèle, nous souhaitons aussi améliorer l'infection et la transduction des virus dans les neurones dans le cerveau chez la souris, en affinant la méthode d’injection intracérébrale (grâce à l'utilisation de fibroine, comme protéine facilitante).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus, sont : La création d’un modèle de surexpression de l’alpha-synucléine mutée couplée à la production d’une protéine traçable in vivo au cours du temps, ce qui permettra le suivi de l’évolution du syndrome pathologique à différents temps et sans sacrifier les animaux, ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés dans nos recherches. L’amélioration de l'infection et de la transduction des virus dans les neurones dans le cerveau chez la souris, en affinant la méthode d’injection intracérébrale.
Procédures
Chirurgie stéréotaxique : 30 minutes par animal, une seule fois dans l'étude, sous anesthésie gazeuse et couverture analgésique. Imagerie in vivo : 10 minutes sous anesthésie gazeuse. Deux sessions de comportement classique non invasif, durée 2H à 10 semaines et 20 semaines postchirurgie. Nuisances dues au transport entre les deux animalerie pour les souris qui suivront l'imagerie in vivo.
Impact sur les animaux
Ils sont représentés par l’utilisation de la chirurgie stéréotaxique, mais bien cadrés par l’utilisation d’analgésiques adaptés et d’un suivi régulier des animaux.
Devenir
Les animaux (sauf ceux qui sont transférés pour l'imagerie) sont mis à mort à la fin de chaque étude afin de réaliser une étude histologique et biochimique du tissu cérébral.
Remplacement
Nous souhaitons améliorer un modèle du laboratoire, en optimisant la transduction virale et ainsi l’expression des formes pathologiques de synucléine. Nous avons besoin d’un modèle intégré ce qui n’est pas le cas avec des alternatives comme la culture cellulaire. En amont de nos expériences in vivo, le matériel biologique virus, fibroine..etc est testé en culture cellualire afin de valider leur efficacité, de déterminer les concentrations nécessaires et de valider un protocole expérimental correct.
Réduction
Nous utilisons des tests comportementaux qui sont non invasifs et permettent un suivi au long cours sur un même animal. Le développement de modèles avec un suivi en bioluminescence qui est non invasif pour les animaux, permet des études longitudinales et ainsi une diminution du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Acclimatation : une période de deux semaines permet une bonne acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés soit par la peau du dos soit dans des tubes, afin de ne pas les manipuler par la queue. Chirurgie : une attention particulière est apportée pour un maintien de l'aseptie pendant la période opératoire. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal.
Choix des espèces
Les modèles de neurodégénérescence induite chez la souris sont bien établis au sein de notre institut. Ces travaux d'étude des maladies neurodégénératives en utilisant la souris comme modèle sont largement decrits dans la littérature ce qui nous donne une base solide pour valider nos résultats. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte qui est compris entre 8 et 12 semaines.
Etude du potentiel thérapeutique de peptides ciblant les oligomères d’Aβ dans le modèle murin APP/PS1 de la maladie d’Alzheimer EU 3/3
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
112 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par le nez, tous les deux jours pendant six mois, des composés censés limiter les protéines anormales de la maladie d'Alzheimer, puis subissent trois tests de mémoire, spatiale, d'association entre contexte et émotion et de reconnaissance d'objet, avant d'être tuées pour analyse du cerveau. Le porteur indique que l'administration par le nez peut induire un stress et une détresse respiratoire. Il décrit l'utilisation de ces animaux comme "indispensable" et conclut que l'effet sur la mémoire ne peut s'étudier qu'in vivo.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante de démence chez les personnes âgées. Elle se caractérise par un déclin progressif de la mémoire et des capacités cognitives, qui est initié par l'accumulation de protéines anormales dans le cerveau. Ces protéines anormales provoquent une altération des cellules nerveuses qui est responsable du déficit de mémoire. Le défi est donc d'augmenter la résistance des cellules nerveuses à cette toxicité. Cependant, les traitements actuels de la maladie d'Alzheimer améliorent les symptômes comportementaux sans modifier l'évolution de la maladie. Une approche prometteuse consiste à contrer l'accumulation de ces protéines anormales à un stade précoce de la maladie et nous avons concu pour cela de nouveaux composés moléculaires. Nous avons caractérisé l'efficacité de ces composés à bloquer la formation, l'accumulation et la toxicité de ces protéines anormales dans des modèles in vitro de la maladie. L'ensemble de ces résultats ouvrent la voie à l’utilisation de ces composés pour lutter contre les altérations cognitives précoces dans la maladie d'Alzheimer. Dans ce projet, ces composés seront utilisés in vivo dans un modèle murin préclinique de la maladie d'Alzheimer, afin d'étudier leur impact sur différents types de mémoire et sur les cellules nerveuses. Les conséquences de cette stratégie expérimentale seront également analysées sur la charge du cerveau en protéines anormales.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces expériences a pour but de déterminer si cette stratégie peut limiter la toxicité due aux protéines anormales et améliorer de manière durable les capacités de mémorisation chez des souris, modèle de la maladie d’Alzheimer. L’objectif est d’étudier l’impact de ces composés sur les déficits de mémoire, les altérations des cellules nerveuses et la charge en protéines anormales dans le modèle murin de la maladie d'Alzheimer. L’utilisation de ces animaux est donc indispensable à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer et à l’estimation d’un effet bénéfique potentiel du traitement sur les déficits cognitifs. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie pour envisager dans le futur de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les 3 procédures envisagées s’appuient sur la production de souris, puis l’administration non invasive de composés d’intérêt par voie intranasale chez la souris vigile pour faciliter leur transport jusqu’au cerveau. Ces traitements d’infusion d’une durée de 10 minutes seront initiés à la 8ème semaine et répétés tous les 2 jours sur une période de 6 mois. Dans la procédure 1 d’élevage, 112 souris transgéniques mâles et femelles APP/PS1 seront obtenues par croisement de souris hétérozygotes à phénotype non-dommageables. Dans la procédure n°2, l’effet de ces traitements sera étudié sur 64 souris (16 souris par groupe) par des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités à fixer une information en mémoire. Pour chaque animal, 3 tests comportementaux seront réalisés au 8ème mois. Tout d’abord, un test destiné à évaluer la mémoire de travail spatiale sera réalisé 1 fois sur 5 jours, sur une durée de 8 minutes chaque jour. Après une semaine de délai, un test évaluant la capacité d’associer un contexte à une émotion sera effectué 1 fois sur 2 jours, sur une durée de 4 minutes chaque jour. Enfin, après une autre semaine de délai, un test de reconnaissance d’objet sera entrepris sur 3 jours, sur une durée de 20 minutes le premier jour et 10 minutes les 2 jours suivants. Après cette étude comportementale, les souris seront anesthésiées profondément puis mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique complémentaire. Cette étude permettra d’analyser l’impact des traitements sur la charge en protéines anormales dans ces souris modèle de la maladie d'Alzheimer. Dans la procédure n°3, 48 souris (12 souris par groupe) seront anesthésiées profondément et analgésiées après la fin des traitements, puis perfusées en intracardiaque en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. L’effet de ces traitements sur les cellules nerveuses sera étudié par un marquage spécifique sur coupes de cerveau.
Impact sur les animaux
L'application intranasale de composés peut induire un certain stress chez la souris. Pour limiter ce stress au maximum, les souris auront une période d'habiuation au protocole de 2 semaines avec un renforcement positif appliqué à chaque étape clé. Des aléas expérimentaux peuvent se produire après l'administration intranasale de composés comme l'induction d'une détresse respiratoire. Pour réduire ce risque, le protocole respecte une attente de 2 minutes entre chaque administration intranasale. Enfin, la possibilité qu'une hypersensibilité aux composés administrés apparaissent chez de rares souris sera envisagée. Dans ce cas, l'animal sera sorti immédiatement de l'étude et mis à mort après induction d'une anesthésie profonde.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les 112 souris seront utilisées dans la procédure expérimentale 2, pour 64 d’entre elles, et dans la procédure 3 pour les 48 souris restantes. A l’issue de la procédure n°2, les 64 souris seront anesthésiées profondément et mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique en complément de l’étude comportementale. A l’issue de la procédure n°3, les 48 souris seront analgésiées puis anesthésiées profondément et perfusées en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. Ces 3 procédures permettront de déterminer si l’administration des composés d'intérêt permet de limiter la toxicité due aux protéines anormales, chez la souris modèle de la maladie, et d’améliorer de manière durable les capacités de mémorisation de ces souris, en conservant l'intégrité de leurs cellules nerveuses.
Remplacement
Des études sur ces composés ont été réalisées sur des modèles cellulaires et en éprouvette pour limiter l’utilisation d’animaux au strict nécessaire, c’est à dire à l’évaluation des performances cognitives. Les effets du traitement sur la mémoire ne peuvent en effet s’étudier que dans les conditions in vivo chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans compromettre les objectifs du projet et avoir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre de souris a été réduit à n=112 en référence aux études comparables de la littérature. Ce nombre d’animaux est nécessaire car plusieurs traitements seront délivrés par voie intranasale en administrant les composés actifs ou les molécules contrôles chez des souris de génotypes différents. Les performances cognitives de ces souris seront évaluées après traitement grâce à trois apprentissages comportementaux. Comme ces apprentissages successifs peuvent réorganiser les circuits nerveux, il sera nécessaire d'utiliser d'autres souris (procédure 3) pour étudier l’impact des traitements sur la densité et la morphologie des cellules nerveuses. Dans la procédure 2, un même cerveau sera utilisé pour 2 approches différentes (i.e. approche comportementale sur l’animal vivant, puis approche moléculaire avec l’analyse biochimique de la charge en protéines anormales du cerveau). Une compilation d’études de la littérature indique qu’il est nécessaire d’avoir 15 animaux par groupe (4 groupes) pour atteindre la significativité statistique avec un test statistique adapté. Cette limite justifie le nombre de souris fixé à 16 souris par groupe, soit 1 animal supplémentaire à la limite de la significativité, afin de prévoir les possibles aléas (problème survenant lors des 6 mois de l'étude et/ou mort de l’animal).
Raffinement
Avant d’initier le protocole d’administration intranasale, les souris de 6 semaines seront habituées à la manipulation pendant une période de deux semaines. Elles seront habituées à être soulevées, placées en position inclinées vers l’arrière, et à recevoir une microgoutte (2,5 ul) de saline en contact avec la narine pour qu’elle soit aspirée au moment de l’inspiration. Cette habituation sera réalisée de manière à limiter le stress de l’animal lors de l’administration intranasale des composés, et se base sur une technique de renforcement positif avec une récompense sous forme de lait concentré sucré. Les souris seront suivies quotidiennement suite à l’infusion intranasale des traitements. Leur état sera noté selon des critères établis qui prennent en compte divers facteurs (poids, état du pelage, comportement dans la cage et lors de la manipulation de l’animal, fabrication d’un nid). Ceci nous permettra de nous assurer du bien-être des animaux. Tout animal présentant des signes de douleur ou de mal être avec atteinte de point limite sera aussitôt sorti du protocole, anesthésié profondement et mis à mort.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées sont couramment utilisées en neurosciences pour l'étude de traitements visant à améliorer les performances de mémoire dans la maladie d’Alzheimer ou pour mieux connaître les mécanismes moléculaires mis en jeu. Ces souris génétiquement modifiées présentent l'avantage unique de mimer les formes dites familiales de la maladie qui sont observées chez certains patients. Des souris âgées de 6 semaines à 8 mois seront utilisées dans ce projet car l’accumulation de protéines anormales dans leur cerveau débute à 8 semaines, et les déficits de mémoire se produisent au 8ème mois chez les mâles ou les femelles.
Etude du potentiel thérapeutique de peptides ciblant les oligomères d’Aβ dans le modèle murin APP/PS1 de la maladie d’Alzheimer EU 1/3
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent des peptides par voie intranasale tous les deux jours pendant six mois, puis passent trois tests de mémoire nommés, mémoire de travail spatiale, association d'un contexte à une émotion et reconnaissance d'objet, avant le prélèvement du cerveau. Le porteur revendique le caractère "indispensable" de ces animaux pour comprendre la maladie. Il indique avoir d'abord testé les composés sur des modèles cellulaires.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la forme la plus courante de démence chez les personnes âgées. Elle se caractérise par un déclin progressif de la mémoire et des capacités cognitives, qui est initié par l'accumulation de protéines anormales dans le cerveau. Ces protéines anormales provoquent une altération des cellules nerveuses qui est responsable du déficit de mémoire. Le défi est donc d'augmenter la résistance des cellules nerveuses à cette toxicité. Cependant, les traitements actuels de la maladie d'Alzheimer améliorent les symptômes comportementaux sans modifier l'évolution de la maladie. Une approche prometteuse consiste à contrer l'accumulation de ces protéines anormales à un stade précoce de la maladie et nous avons concu pour cela de nouveaux composés moléculaires. Nous avons caractérisé l'efficacité de ces composés à bloquer la formation, l'accumulation et la toxicité de ces protéines anormales dans des modèles in vitro de la maladie. L'ensemble de ces résultats ouvrent la voie à l’utilisation de ces composés pour lutter contre les altérations cognitives précoces dans la maladie d'Alzheimer. Dans ce projet, ces composés seront utilisés in vivo dans un modèle murin préclinique de la maladie d'Alzheimer, afin d'étudier leur impact sur différents types de mémoire et sur les cellules nerveuses. Les conséquences de cette stratégie expérimentale seront également analysées sur la charge du cerveau en protéines anormales.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ces expériences a pour but de déterminer si cette stratégie peut limiter la toxicité due aux protéines anormales et améliorer de manière durable les capacités de mémorisation chez des souris, modèle de la maladie d’Alzheimer. L’objectif est d’étudier l’impact de ces composés sur les déficits de mémoire, les altérations des cellules nerveuses et la charge en protéines anormales dans le modèle murin de la maladie d'Alzheimer. L’utilisation de ces animaux est donc indispensable à une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer et à l’estimation d’un effet bénéfique potentiel du traitement sur les déficits cognitifs. Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la maladie pour envisager dans le futur de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les 3 procédures envisagées s’appuient sur la production de souris, puis l’administration non invasive de composés d’intérêt par voie intranasale chez la souris vigile pour faciliter leur transport jusqu’au cerveau. Ces traitements d’infusion d’une durée de 10 minutes seront initiés à la 8ème semaine et répétés tous les 2 jours sur une période de 6 mois. Dans la procédure 1 d’élevage, 112 souris transgéniques mâles et femelles APP/PS1 seront obtenues par croisement de souris hétérozygotes à phénotype non-dommageables. Dans la procédure n°2, l’effet de ces traitements sera étudié sur 64 souris (16 souris par groupe) par des tests comportementaux pour évaluer leurs capacités à fixer une information en mémoire. Pour chaque animal, 3 tests comportementaux seront réalisés au 8ème mois. Tout d’abord, un test destiné à évaluer la mémoire de travail spatiale sera réalisé 1 fois sur 5 jours, sur une durée de 8 minutes chaque jour. Après une semaine de délai, un test évaluant la capacité d’associer un contexte à une émotion sera effectué 1 fois sur 2 jours sur une durée de 4 minutes chaque jour. Enfin, après une autre semaine de délai, un test de reconnaissance d’objet sera entrepris sur 3 jours, sur une durée de 20 minutes le premier jour et 10 minutes les 2 jours suivants. Après cette étude comportementale, les souris seront anesthésiées profondément puis mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique complémentaire. Cette étude permettra d’analyser l’impact des traitements sur la charge en protéines anormales dans ces souris modèle de la maladie d'Alzheimer. Dans la procédure n°3, 48 souris (12 souris par groupe) seront anesthésiées profondément et analgésiées après la fin des traitements, puis perfusées en intracardiaque en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. L’effet de ces traitements sur les cellules nerveuses sera étudié par un marquage spécifique sur coupes de cerveau.
Impact sur les animaux
L'application intranasale de composés peut induire un certain stress chez la souris. Pour limiter ce stress au maximum, les souris auront une période d'habiuation au protocole de 2 semaines avec un renforcement positif appliqué à chaque étape clé. Des aléas expérimentaux peuvent se produire après l'administration intranasale de composés comme l'induction d'une détresse respiratoire. Pour réduire ce risque, le protocole respecte une attente de 2 minutes entre chaque administration intranasale. Enfin, la possibilité qu'une hypersensibilité aux composés administrés apparaissent chez de rares souris sera envisagée. Dans ce cas, l'animal sera sorti immédiatement de l'étude et mis à mort après induction d'une anesthésie profonde.
Devenir
A l’issue de la procédure 1, les 112 souris seront utilisées dans la procédure expérimentale 2, pour 64 d’entre elles, et dans la procédure 3 pour les 48 souris restantes. A l’issue de la procédure n°2, les 64 souris seront anesthésiées profondément et mises à mort pour prélever leur cerveau et réaliser une étude biochimique en complément de l’étude comportementale. A l’issue de la procédure n°3, les 48 souris seront analgésiées puis anesthésiées profondément et perfusées en état de mort cérébrale pour fixer leur cerveau et réaliser une étude immunohistochimique. Ces 3 procédures permettront de déterminer si l’administration des composés d'intérêt permet de limiter la toxicité due aux protéines anormales, chez la souris modèle de la maladie, et d’améliorer de manière durable les capacités de mémorisation de ces souris, en conservant l'intégrité de leurs cellules nerveuses.
Remplacement
Des études sur ces composés ont été réalisées sur des modèles cellulaires et en éprouvette pour limiter l’utilisation d’animaux au strict nécessaire, c’est à dire à l’évaluation des performances cognitives. Les effets du traitement sur la mémoire ne peuvent en effet s’étudier que dans les conditions in vivo chez l’animal.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum sans compromettre les objectifs du projet et avoir des résultats statistiquement exploitables. Le nombre de souris a été réduit à n=112 en référence aux études comparables de la littérature. Ce nombre d’animaux est nécessaire car plusieurs traitements seront délivrés par voie intranasale en administrant les composés actifs ou les molécules contrôles chez des souris de génotypes différents. Les performances cognitives de ces souris seront évaluées après traitement grâce à trois apprentissages comportementaux. Comme ces apprentissages successifs peuvent réorganiser les circuits nerveux, il sera nécessaire d'utiliser d'autres souris (procédure 3) pour étudier l’impact des traitements sur la densité et la morphologie des cellules nerveuses. Dans la procédure 2, un même cerveau sera utilisé pour 2 approches différentes (i.e. approche comportementale sur l’animal vivant, puis approche moléculaire avec l’analyse biochimique de la charge en protéines anormales du cerveau). Une compilation d’études de la littérature indique qu’il est nécessaire d’avoir 15 animaux par groupe (4 groupes) pour atteindre la significativité statistique avec un test statistique adapté. Cette limite justifie le nombre de souris fixé à 16 souris par groupe, soit 1 animal supplémentaire à la limite de la significativité, afin de prévoir les possibles aléas (problème survenant lors des 6 mois de l'étude et/ou mort de l’animal).
Raffinement
Avant d’initier le protocole d’administration intranasale, les souris de 6 semaines seront habituées à la manipulation pendant une période de deux semaines. Elles seront habituées à être soulevées, placées en position inclinées vers l’arrière, et à recevoir une microgoutte (2,5 ul) de saline en contact avec la narine pour qu’elle soit aspirée au moment de l’inspiration. Cette habituation sera réalisée de manière à limiter le stress de l’animal lors de l’administration intranasale des composés, et se base sur une technique de renforcement positif avec une récompense sous forme de lait concentré sucré. Les souris seront suivies quotidiennement suite à l’infusion intranasale des traitements. Leur état sera noté selon des critères établis qui prennent en compte divers facteurs (poids, état du pelage, comportement dans la cage et lors de la manipulation de l’animal, fabrication d’un nid). Ceci nous permettra de nous assurer du bien-être des animaux. Tout animal présentant des signes de douleur ou de mal être avec atteinte de point limite sera aussitôt sorti du protocole, anesthésié profondement et mis à mort.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées sont couramment utilisées en neurosciences pour l'étude de traitements visant à améliorer les performances de mémoire dans la maladie d’Alzheimer ou pour mieux connaître les mécanismes moléculaires mis en jeu. Ces souris génétiquement modifiées présentent l'avantage unique de mimer les formes dites familiales de la maladie qui sont observées chez certains patients. Des souris âgées de 6 semaines à 8 mois seront utilisées dans ce projet car l’accumulation de protéines anormales dans leur cerveau débute à 8 semaines, et les déficits de mémoire se produisent au 8ème mois chez les mâles ou les femelles.
Effet de la consommation d’aliments sucrés à l’adolescence et ses conséquences à l’âge adulte chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
336 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Adolescentes, elles sont exposées à des solutions sucrées puis soumises à des tests comportementaux censés révéler des profils dépressifs ou anxieux, certaines subissant en amont une chirurgie cérébrale pour stimuler ou inhiber des structures du cerveau, avant le prélèvement du cerveau. Le porteur décrit ces tests comme sans douleur mais ne précise pas lesquels. Il affirme qu'un syndrome dépressif ne peut pas être modélisé in vitro.
Objectifs
Nos sociétés abondantes en aliments très palatables, car riches en sucre et en graisse, favorisent la prévalence de mauvaises habitudes alimentaires dès l’enfance ou l’adolescence. Ces comportements précoces peuvent affecter durablement les choix alimentaires adultes. Il a été montré que l’adolescence est une fenêtre critique de vulnérabilité au cours du développement cérébral, caractérisée par des comportements spécifiques et une sensibilité accrue aux récompenses. Des données chez le rat indiquent qu’une surconsommation de sucre pendant l’adolescence altère durablement la sensibilité et la motivation à consommer des aliments palatables (dont la qualité gustative et la texture sont agréables au palais) à l’âge adulte, et fait émerger un profil comportemental spécifique rappelant la dépression, pouvant être reversé par un antidépresseur. De même, il a été mis en évidence qu'une alimentation hautement palatable à l'adolescence pouvait altérer la maturation des circuits cérébraux du plaisir alimentaire, encore en cours de développement, modifiant ainsi durablement l’impact hédonique des aliments et impactant le comportement alimentaire à l'âge adulte. Des processus neurobiologiques affectant la perception sensorielle plaisante ou non des aliments ont ainsi pu être mis en évidence et il apparaît qu'une modification du plaisir alimentaire et de la sensibilité des systèmes de récompense pourrait être l’un des déterminants clés des dérèglements du comportement alimentaire. Ce projet consiste à vérifier chez la souris des données obtenues chez le rat afin de pouvoir aborder les substrats neurobiologiques de façon beaucoup plus précises. En effet, l'existence chez la souris (et non chez le rat) de lignées de souris génétiquement modifiées rend possible l'activation de sous-population de neurones SPECIFIQUES dans des structures SPECIFIQUES. Ces données pourront nous permettre de comprendre en quoi l’adolescence est une fenêtre critique de vulnérabilité des effets à long terme de la surconsommation de récompenses sur le fonctionnement cérébral, et par là-même sur les désordres comportementaux. Ces données seront particulièrement pertinentes au regard des épidémies d'obésité et de dépression des sociétés modernes où le sucre est largement surconsommé par les populations jeunes.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à tester l’hypothèse selon laquelle une expérience précoce avec des aliments hautement palatables altérerait la maturation des circuits cérébraux du plaisir alimentaire encore en cours de développement et modifierait durablement l’impact hédonique des aliments. La souris est un modèle permettant d'obtenir facilement des animaux génétiquement modifiés, facilitant ainsi l'étude et l'implication de certains processus neuronaux. Si ce modèle permet de retrouver des résultats comportementaux similaires à ceux obtenus chez le rat , nous pourrons alors utiliser des souris modifiées génétiquement afin de tester l'implication du système de récompense via une approche neurobiologique. Plus précisemment nous étudierons les processus impliqués dans le système de récompense par l'utilisation d'outils viraux permettant l'activation ou l'inactivation de certaines voies neuronales d'intérêt.
Procédures
Les animaux seront exposés à des solutions sucrées durant leur adolescence (pour une durée allant de 2 à 8 semaines) avant de suivre divers tests comportementaux permettant de caractériser l'apparition de phénotypes dépressifs ou anxieux, tels que retrouvés chez l'homme. La durée des tests varie entre 5 et 30 min par jour, certains n'étant réalisé qu'une seule et unique fois. Pour certains tests, une procédure chirurgicale, n'excédant pas 1h,devra être mise en place en amont afin de pouvoir stimuler ou inhiber des structures cérébrales spécifiques, impliquées dans le traitement des récompenses.
Impact sur les animaux
L'exposition aux solutions sucrées et les différents tests comportementaux sont sans douleur sur l'animal et n'engendre pas de nuisances ou d'effets néfastes. Les procédures chirurgicales peuvent être source de douleurs post-opératoires pour lesquels des traitements anatalgiques et un suivi post-opératoire sont mis en place.
Devenir
A la fin des expérimentations tous les animaux seront euthanasiés et perfusés afin de pouvoir effectuer des mesures histologiques sur cerveaux.
Remplacement
Il n'est pas possible de modéliser ou d'utiliser des modèles in vitro permettant de reproduire certaines pathologies humaines. Les nombreuses similitudes entre les humains et les animaux en termes de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que certaines caractéristiques neuronales et hormonales permettent de justifier l’utilisation du modèle animal rongeur comme outil dans de nombreuses études. En effet, il est impossible de modéliser ces pathologies et ces caractéristiques, et par là-même d’étudier un syndrôme dépressif, chez un modèle in vitro. Le modèle animal, et plus particulièrement le modèle rongeur, est pour cela le modèle le plus adapté.
Réduction
Afin d'obtenir des résultats statistiquement fiable, et réduire au maximum le nombre d'animaux nécessaires, nous avons pu déterminer selon notre expérience qu'un effectif de 16 animaux par groupes (16 animaux contrôle, 16 animaux exposés au sucrose) est nécessaire pour la partie comportementale et pour nos analyses statistiques (le plus couramment ANOVAs à 1, 2 ou 3 facteurs) afin de s'abstenir de la variabilité interindividuelle. Un effectif de 20 animaux par groupe est nécessaire pour la partie neurobiologique afin de tenir compte du pourcentage d'animaux pour lesquels les injections intracérébrales ne seraient pas correctes.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en cages collectives (2 souris par cage) dans un milieu enrichi (carrés de cellulose et papier ouaté) et dans des conditions optimales de température et d'humidité. La surveillance des animaux est réalisée de façon quotidienne. Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident de la conduite à tenir en fonction de points limites strictes. Des mesures compensatoires sont mises en oeuvre en amont afin de palier à tout problème de santé éventuel. En cas de non amélioration de l'état général de l'animal, le reponsable du projet sera averti et prendra la décision si nécessaire d'euthanasie de l'animal, ceci dans les délais les plus brefs.
Choix des espèces
Notre projet de recherche implique une expérimentation chez la souris génétiquement modifiée qui constitue pour les neurobiologistes un support indispensable à l'étude de l'organisation et du fonctionnement du système nerveux central en situation normale mais également, et surtout, en situations expérimentales ou pathologiques. L'ensemble de nos travaux considère l'animal in vivo, et met à profit différents protocoles comportementaux développés et codifiés depuis de nombreuses années chez ces espèces, et irréalisables matériellement et/ou scientifiquement sur d'autres espèces. L'organisation du cerveau de souris est proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus dans ces conditions permettent de proposer des hypothèses de fonctionnement du cerveau humain dans le cadre de surconsommation de récompenses. Les animaux débuteront les expérimentations à l'âge de 26 jours, ce qui correspond à l'entrée dans la phase d'adolescence
Effets de l’exposition au dioxyde de carbone sur les accidents de désaturation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à sévères. Elles sont placées dans un caisson hyperbare simulant une plongée, un protocole que le porteur reconnaît comme sévère et qui provoque des accidents de désaturation, avec convulsions, déficits moteurs et décès par arrêt cardio-respiratoire pour une partie d'entre elles. Le porteur prévoit qu'un tiers des animaux meurent et un tiers gardent des séquelles neurologiques. L'objectif est d'étudier l'effet du CO2 avant la plongée, une recherche liée aux plongeurs militaires.
Objectifs
3.3.2.1 Objectifs du projet Les accidents de désaturation (ADD) représentent la première cause d’accidents de plongée et sont responsables d’une morbidité non négligeable. Ils peuvent conduire à la paralysie, voire à la mort, avec un risque de séquelles neurologiques à long terme. Ces accidents sont liés à la formation de bulles, essentiellement composées d’azote, qui proviennent de la ventilation d’air comprimé pendant la plongée. La charge tissulaire en azote dans l’organisme, et la formation de bulles qui en découle, sont proportionnelles à la durée et à la profondeur de la plongée réalisée. Cette formation de bulles est favorisée en présence de noyaux gazeux micro et nanométriques, initialement présents à la pression atmosphérique. La variabilité inter individuelle de la formation de bulles post décompression semble être directement liée à la vitesse de désaturation mais également à la quantité initiale de noyaux gazeux présents dans l’organisme. Ces noyaux gazeux sont également directement influencés par les gaz dissous tissulaires comme l’oxygène, l’azote ou le CO2. Le CO2 étant un gaz très diffusible, il pourrait contribuer significativement à l’activation du processus bullaire, surtout lorsque sa concentration augmente dans le sang. La présence de bulles engendre des destructions cellulaires mais aussi une activation plaquettaire, de l’inflammation et une vasoconstriction, aboutissant à la mort tissulaire. Les bulles circulantes se comportent comme des agents capables de léser le système nerveux central. Les affections au niveau de la moelle épinière et du cerveau, sont les plus fréquentes et les plus graves. La réaction inflammatoire liée à l'augmentation du CO2 a surtout été étudiée concernant les phénomènes environnementaux. L’augmentation du CO2 favorise, la formation de peroxynitrite délétères. Les macrophages en phagocytant ces cellules, libèrent des cytokines pro-inflammatoires. Le CO2 inhalé lors de l’exposition hyperbare favorise les accidents ostéo-articulaires. Par ailleurs le niveau de dépressurisation (altitude simulée) nécessaire pour engendrer la formation de bulles est plus faible lors de l'exposition des animaux au CO2. Enfin l'exposition chronique au CO2 favorise les accidents de décompression d’altitude. Fort est de constater une absence de données sur l’influence du CO2 avant la plongée.
Bénéfices attendus
Si notre hypothèse se confirme, les procédures de plongée chez l’homme pourraient être modifiées. Par exemple en pratiquant une hyperventilation pré-plongée afin d’éliminer le CO2 et de diminuer ainsi les risques d’accidents de décompression.
Procédures
Les animaux traités et contrôles seront soumis à un protocole simulant une plongée sèche dans un caisson hyperbare. L’évaluation des différents protocoles se fera sur un modèle animal d’accident de désaturation qui peut paraitre sévère, en comparaison de l’Homme, mais les fréquences cardiaques et ventilatoires élevées des petits animaux limitent fortement la genèse bullaire et donc le traumatisme. Les accidents de désaturation se manifestent principalement par des signes de dysfonction respiratoire (gasps), des symptômes neurologiques (convulsions, déficits moteur et/ou sensitif) ou par un état d’asthénie marquée. Les formes les plus sévères peuvent entrainer le décès de l’animal par arrêt cardio-respiratoire. Quant aux symptômes potentiellement douloureux, l’expérience de l’équipe sur ce modèle n’a pas de mauvais retour d’expérience en ce sens et les observations précédentes ont montrées qu’aucun rongeur ne présente de signe d’excitation ni ne se gratte les oreilles dans le caisson et en sortie de caisson, ni ne se lèche particulièrement sur une zone, ne laissant penser ni à un barotraumatisme de l’oreille, ni à des bends. Mais la vitesse de compression de notre protocole est très lente au début (1m/min puis 10m/min, contre 10m/min chez l’homme) ce qui doit permettre d’éviter tout risque de barotraumatisme de l’oreille. Une évaluation clinique et comportementale est effectuée après les expositions hyperbares. La durée de l’évaluation et de l’observation clinique est de l’ordre de 30 minutes. Puis les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés suivant la procédure décrite. Nous profiterons de l’anesthésie pour effectuer, avant euthanasie, un prélèvement de sang à la queue, 90 microlitres de sang total et dosage sur EPOC Siemens pour bilan standard, proteine S,, proteine 100, ionogrammme, gaz du sang. Au total, la durée de l'intervention sera de 3 heures incluant l'exposition à la pression, l'observation et les prèlevements.
Impact sur les animaux
Les animaux traités et contrôles seront soumis à un protocole simulant une plongée sèche dans un caisson hyperbare. L’évaluation des différents protocoles se fera sur un modèle animal d’accident de désaturation qui peut paraitre sévère, en comparaison de l’Homme, mais les fréquences cardiaques et ventilatoires élevées des petits animaux limitent fortement la genèse bullaire et donc le traumatisme. Les accidents de désaturation se manifestent principalement par des signes de dysfonction respiratoire (gasps), des symptômes neurologiques (convulsions, déficits moteur et/ou sensitif) ou par un état d’asthénie marquée. Les formes les plus sévères peuvent entrainer le décès de l’animal par arrêt cardio-respiratoire. Quant aux symptômes potentiellement douloureux, l’expérience de l’équipe sur ce modèle n’a pas de mauvais retour d’expérience en ce sens et les observations précédentes ont montrés qu’aucun rongeur ne présente de signe d’excitation ni ne se gratte les oreilles dans le caisson et en sortie de caisson, ni ne se lèche particulièrement sur une zone, ne laissant penser ni à un barotraumatisme de l’oreille, ni à des bends. Il n’y a pas d’étude histologique sur le barotraumatisme chez le rongeur. La vitesse de compression de notre protocole est très lente au début (1m/min puis 10m/min, contre 10m/min chez l’homme) ce qui doit permettre d’éviter tout risque de barotraumatisme de l’oreille. Une évaluation clinique et comportementale est effectuée après les expositions hyperbares. Le modèle murin d’accident de décompression a déjà fait l’objet de nombreuses publications, il existe bien sûr des limites à la transposition à l’homme, mais ce modèle a déjà permis des avancées en terme de compréhension physiopathologique et d’évaluation thérapeutiques. Le métabolisme et le poids des rongeurs sont des facteurs très importants à prendre en compte nécessitant des expositions beaucoup plus sévères que chez l’homme pour observer des symptômes d’accident de décompression.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Concernant le modèle hyperbare d’ADD, seul le modèle animal vigile peut présenter l’ensemble de la symptomatologie complexe dans le cadre d’une unique expérimentation (avec utilisation de drogues) et ainsi fournir la puissance nécessaire à ce type de recherche, sans multiplier les supports biologiques. Seule l’utilisation de l’animal entier peut-être à l’origine d’une inflammation systémique consécutive à la présence de bulles circulantes. Il est toutefois possible de générer des bulles dans un seul organe isolé, mais pas de reproduire la maladie de décompression (qui comprend entre autres des réactions immuno-inflammatoires) qui succède à l’accident de désaturation. Aucun modèle physico-chimique ou mathématique actuel ne peut rendre compte de la complexité de la réponse.de désaturation chez l’homme.
Réduction
L’effectif de 110 souris nécessaire à ce projet est estimé sur la base des études précédentes réalisées sur le modèle souris d’accident de désaturation. En effet, dans les conditions expérmentales envisagées nous prévoyons qu'avec une vitesse de décompression de 10m/s , un tiers des animaux vont décéder, un autre tiers aura des séquelles neurologiques et le dernier tiers sera sain et sauf . Dans cette perspective des groupes de 20 à 30 animaux pourront être constituées, ce qui permettra une analyse statistiques suffisament performente. Les valeurs des paramètres recueillies seront exprimées en moyenne et écarts types ou mediane et range selon les cas.Les tests statistiques non paramétriques seront privilégiés en rapport du faible nombre d’animaux intra-groupes. Les comparaisons intergroupes via un test de Kruskall-Wallis adjoint à des comparaisons post hoc de Dunn devraient être opérées, et complétées si besoin est par des comparaisons deux-à-deux avec des tests de Mann-Withney ou Wilcoxon. Le seuil de risque alpha retenu est de 5%. -Manipulation 1 : - 15 souris non exposées - 15 souris exposées à 7% de CO2 Manipulation II : Le nombre de 40 animaux par groupe correspond à : - 20 plongeurs - exposition AIR avant plongée : - 30% (n=6) sans ADD exploitable en clinique. - 30% (n=6) avec ADD exploitable en clinique. - 40% (n=8) avec ADD létal exploitable en clinique seulement. Ces 40% représentent aussi une marge de progression pour mettre en évidence l’effet négatif du gaz inhalé avant la plongée. - 20 plongeurs - exposition CO2 avant plongée : Exemple de tests statistiques (Kruskal-Wallis) sur la clinique : si n=10 sans ADD, n= 9 ADD, n=1 ADD létal. p=0.035 si n=11 sans ADD, n= 7 ADD, n=2 ADD létal. p=0.037
Raffinement
Les animaux, en groupe, disposent d’une litière, de boisson et de croquettes à volonté et aussi de mini buchettes de bois pour ronger. L’application d’un feuillet opaque sur une partie de l’extérieur de la cage (en plexiglass transparent) leur permettra de se cacher et éventuellement de nidifier avec le coton mis à disposition dans la cage. Le cycle jour/nuit 12h/12h est respecté avec l’extinction des lumières à 19h. La température des pièces est régulée à 22 ± 1°C
Choix des espèces
Les modèles murins d’accident de désaturation sont bien identifiés et utilisés, notamment la souris C57bl6. Le modèle souris permet d’obtenir des réponses facilement observables sur des effectifs raisonnables. Les souris C57bl6 mâles sont privilégiées car elles permettent d'obtenir plus facilement le poids cible. De plus les plongeurs des armées concernés sont en très grande majorité des hommes. Un point cible de 25-30g doit être respecté pour observer la survenue des accidents de désaturation. Par ailleurs le modèle murin a été validé sur ce type d'expérimentation dans plusieurs publications y compris par d'autres équipes . Les animaux utilisés sont des jeunes adultes. Les souris C57bl6 mâles de 25-30g mâles sont choisies afin de répondre aux critères de susceptibilité à l’accident de désaturation. Les animaux de faible poids ne développeront peu ou pas d’ADD en rapport de ceux ayant un poids plus important.
Impact de l’exposition précoce aux drogues sur le comportement et le système dopaminergique dans un modèle de comorbidite schizophrénie – troubles de la consommation d’alcool
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
960 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès le septième jour de vie, une chirurgie lèse leur hippocampe pour induire un modèle de schizophrénie, puis ils sont exposés jeunes à l'alcool et à des cannabinoïdes avant une seconde chirurgie d'implantation de canules, pour étudier l'impact de ces drogues sur la consommation d'alcool. Le porteur signale des douleurs postopératoires après chaque chirurgie. Il présente ce modèle par lésion comme le plus utilisé et le plus complet pour cette comorbidité.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'étudier l'impact d'expositions précoces aux drogues sur les troubles de la consommation d'alcool à l'âge adulte dans un modèle animal de schizophrénie. En effet il existe une prévalence élevée de patients atteints de schizophrénie qui présentent un trouble de la consommation d'alcool. Les consommations d'acool et de cannabis sont fréquentes à l'adolescence aussi bien dans la population générale que chez les sujets qui risquent de présenter la maladie. Nous chercherons donc à étudier le rôle de ces expositions précoces d'alcool et d'agents cannabinoides sur les comportements des animaux modèles de schizophrénie mais également sur la neurotransmission. En effet la dérégulation des systèmes de neurotransmission est directement impliquée aussi bien dans les troubles de la consommation d'alcool que dans ceux associés à la schizophrénie.
Bénéfices attendus
Il n'existe à l'heure actuelle aucune étude visant à étudier l'impact de la co-exposition précoce à l'alcool est aux cannabis ni chez l'Homme, ni chez l'animal alors que la consommation de ces drogues est relativement fréquentes chez les adolescents et jeunes adultes. Grâce aux expériences proposées dans ce projet nous pourrons obtenir des données importantes concernant les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent les troubles de la consommation d'alcool dans un modèle pertinent pour l'étude de la schizophrénie. L'aspect neurobiologique de ce projet aidera la communauté scientifique à mieux comprendre l'impact d'une exposition précoce à des drogues couramment utilisées sur les systèmes dopaminergiques. Nous ajouterons à cette étude neurobiologique un aspect purement comportemental qui nous permettra d'évaluer l'impact de cette exposition précoce aux drogues sur les comportements associés à la consommation d'alcool et à ceux associés à la schizophrénie.
Procédures
Tous les animaux subiront une chirurgie à l'âge de 7 jours. Chacune de ces opérations ne durera jamais plus de 20 minutes. Par la suite à l'âge adulte 320 rats subiront une seconde chirurgie qui ne durera pas plus de 30 minutes. Lors de ces chirurgies les animaux subiront une anesthésie gazeuse et recevront une injection d'analgésiques adaptés. En soins post-opératoires, les animaux (au 7ème jour de vie et à l'âge adulte) recevront pendant au moins 2 jours post-opératoires au moins 2 injections quotidiennes d'analgésique adapté.
Impact sur les animaux
- Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à J7 suite à la lésion de l'hippocampe ventral par chirurgie stéréotaxique. Durée attendue : 2-3 jours. - Douleurs post-opératoires de palier 1 à 2 à l'âge adulte suite à l'implantation des canules par chirurgie stéréotaxiques. Durée attendue : 3-4 jours.
Devenir
Procédures 1, 2, 3: Ces procédures ne sont que des étapes qui nous permettent de générer nos animaux modèles de comorbidité. Tous les animaux issus de ces procédures seront répartis soit dans la procédure 4 (640 rats) soit dans la procédure 5 (320 rats). Procédure 4 : A la fin des analyses comportementales les cerveaux de ces animaux devront être récupérés pour des analyses post-mortem en vue d’étudier l’expression de marqueurs biologiques importants dans ces pathologies et iront donc en procédure 6. Procédure 5: Tous les animaux seront euthanasiés pour vérifications histologiques des sites d'implantation des électrodes d'enregistrement et de stimulation. Procédure 6: Tous les animaux seront euthanasiés au cours de cette procédure.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme la schizophrénie ou l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Le modèle que nous avons choisi fait partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant le même modèle en prennant en compte la variabilité interindividuelle observée aussi bien dans les modèles animaux que dans les différents paradigmes comportementaux utilisés. Nous utiliserons au maximum les mêmes animaux entre les différentes procédures pour limiter le nombre total d'animaux utilisés dans ce projet.
Raffinement
Pour chacune des procédures nous avons mis en place un série de points limites ainsi qu'une grille de scoring du bien-être animal. Une action thérapeutique adaptée sera déclenchée dès q'un point limite sera atteint. « En ce qui concerne les conditions d'hébergement, les animaux seront stabulés en groupe tout au long du projet sauf pendant les périodes d'évaluation de la consommation d'alcool. Ces périodes seront limitées au strict minimum nécessaire et l'isolement sera contrebalancé par une manipulation accrue par les expérimentateurs (enrichissement inter-espèce).
Choix des espèces
Le modèle de lésion choisi pour induire des symptômes de schizophrénie est le plus utilisé en recherche sur la comorbidité addictive car ce modèle est sans doute celui qui représente le mieux l'évolution de la maladie. Les animaux seront utilisés tout au long de leur vie. Ce modèle nécessite une lésion du cerveau au 7ème jour de vie. Tous les petits seront ensuite soumis à la procédure d'exposition aux drogues pendant la période d'adolescence (entre les jours 28 et 50). Les rats seront conservés jusqu'à l'âge adulte pour évaluer les effets d'une telle pré-exposition précoce sur les comportements et la neurobiologie à l'âge adulte.
Evaluation et traitement par neurostimulation ultrasonore du profil autistique dans un modèle murin de l’X fragile et de l’autisme.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
246 souris porteuses d'une mutation du gène Fmr1, modèle du syndrome de l'X fragile, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Elles reçoivent des séances de stimulation ultrasonore transcrânienne sous anesthésie puis une perfusion intracardiaque létale, pour évaluer un effet thérapeutique sur des symptômes autistiques. Le porteur qualifie la stimulation de non invasive et indolore et présente les tests comportementaux comme classiques et sans effet indésirable. Il justifie le modèle murin par l'absence de méthode in vitro.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de la stimulation transcrânienne ultrasonore focalisée (tFUS) chez la souris KO Fmr1 (dont le gène FMR1 est inactif et produisant un modèle de profil autistique et de syndrome de l’X fragile), d’évaluer les symptômes associés à ce modèle et aux effets de la tFUS. Notre approche expérimentale permettra d’évaluer les effets comportementaux et neurobiologiques de la tFUS et donc d’estimer son potentiel thérapeutique. Le projet comprendra 2 étapes : (a) Mise en place du protocole de neurostimulation (tFUS) dans la lignée Fmr1 KO. Cette étape sera réalisée dans le but de trouver les paramètres optimaux de stimulations cérébrales dans la lignée de souris Fmr1 KO. Le laboratoire a déjà l’expérience de cette technique dans d’autres lignées. Toutefois, ces paramètres peuvent varier d’une lignée de souris à l’autre, et il est conseillé de valider l’approche et les paramètres avant d’engager plus d’animaux dans des expériences chroniques. (b) Evaluation du phénotype autistique des souris Fmr1 KO et des potentialités thérapeutiques du tFUS Cette étape correspondra à l’étude du phénotype comportemental induit par modèle en lui-même et à l’évaluation des éventuels effets thérapeutique du traitement tFUS sur les symptômes de type autistique. Pour une caractérisation la plus complète, les souris passeront une batterie de test comportementaux qui permettront d’évaluer les différentes dimensions symptomatiques du trouble du spectre de l’autisme et de déterminer ensuite si les eventuels effets thérapeutiques du tFUS se concentrent plus fortement sur certaines dimensions particulières ou sur la globalité du trouble et cela en fonction de la zone cérébrale ciblée.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra permettre de caractériser précisément les effets de la neurostimulation ultrasonore trancrânienne in vivo. Ceci est essentiel pour une meilleure évaluation des potentialités thérapeutique de la neurostimulation ultrasonore transcrânienne et de son utilisation dans les modèles précliniques de maladies neuropsychiatriques puis chez les sujets humains.
Procédures
Procédure 1 : Mise en place du protocole de neurostimulation (tFUS) dans la lignée Fmr1 Chaque souris sera soumise à une séance de stimulation transcrânienne ultrasonore (tFUS) sous anesthésie générale (1 fois, 30 minutes) et enfin à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine). Procédure 2 : Evaluation du modèle et des effets thérapeutiques du tFUS Chaque souris sera exposée à 5 séances de stimulations ultrasonores réels ou simulées (témoin) de 30 minutes chacune sur 5 jours. Chaque souris sera soumise à 16 tests comportementaux répartis sur 40 jours (et de durée maximum de 30 minutes par session et un seul par jour maximum). Aucun de ces tests n’induit des douleurs ou du stress excessif autre qu’être brièvement exposé à un nouvel environnement, un nouveau congénère ou un nouvel objet. Enfin, chaque souris sera soumise à une perfusion intracardiaque terminale létale (20 minutes) initiée soit sous anesthésie générale sans réveil (kétamine/xylazine) soit après injection létale (pentobarbital/xylazine).
Impact sur les animaux
La stimulation ultrasonore transcrânienne est une approche non invasive et indolore. L’animal sera installé sur le dispositif (permettant de calculer des coordonnées stéréotaxiques) et testé lors de chaque session à la suite d’une anesthésie gazeuse, limitant ainsi tout stress de manipalution et associé à l’installation dans le dispositif. Les tests comportementaux utilisés sont des tests classiques d’évaluation cognitive, sociale ou d’exploration et bien caractérisés dans la littérature. Il est bien établi qu’ils n’induisent pas d’effets indésirables.
Devenir
Procédure 1 : Tous les animaux seront mis à morts en fin de procédure et les cerveaux sont récupérés afin d’effectuer des analyses histologiques et d’expertiser d’eventuels effets des stimulations ultrasonores Procédure 2 : Tous les animaux seront mis à morts en fin de procédure et les cerveaux sont récupérés afin d’effectuer des analyses histologiques et d’expertiser d’eventuels effets des stimulations ultrasonores.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le modèle du syndrôme de l’X fragile et de de l’aurisme chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique d’au moins 0.9 pour une taille d’effet f de cohen égale à 0.25 à un seuil de significativité de 0.05.
Raffinement
La neurostimulation ultrasonore est une technologie actuellement en développement dans notre laboratoire, nous possédons donc le matériel le plus récent et le plus adapté pour ce type d’intervention. Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Les animaux ne reçoivent aucun traitement qui pourrait interférer avec l’étude. Les animaux sont hébergés en cage avec enrichissement du milieu (cabanes, smarthome® et tubes). Les procédures d’anesthésie seront réalisées sous isoflurane (anesthesie gazeuse) qui représente une méthode optimale et recommandée, le débit et la concentration pouvant être contrôlés en temps réel, réduisant fortement tout risque de complication lié à l’anesthésie et permettant le réveil étant très rapide (quelques secondes ou minutes). Les procédures de ce projet n’induisent pas de douleurs ou d’inconvenance particulière. Toutefois, si une perte de poids ou des signes d’inconfort ou de douleurs apparaissent chez une souris, un traitement d’analgésie (metacam) sera fourni à la souris. Les points limites sont précisément définis : une perte de poids supérieure à 15%, ou une chute de température (diminution de 2°C ou < 35°C). Ces paramètres seront évalués quotidiennement. Dès qu’un problème minime est détecté, la souris est traitée avec un analgesique (metacam 20 mg/kg SC) et on passe à deux évaluations par jour. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration en 48 heures.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation de l’activité cérébrale in vivo ou comportementale des rongeurs, l’implémentation de neurostimulation adaptée aux rongeurs. Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le modèle du syndrôme de l’X fragile et de de l’autisme chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la stimulation ultrasonore transcrânienne nécessite l’utilisation d’animaux. L’âge des animaux en début d’expérience sera P28 (lors de la détermination des seuils moteurs lors de l’étape 3). Il s’agit d’un stade prépubère ou pubère (début de maturité sexuelle) qui se justifie d’un point de vue translationnel. En effet, l’autisme étant un trouble du développement, il est préférable qu’un potentiel traitement intervienne le plus tôt possible lors du développement pour augmenter les chances de succès et son impact à long-terme. Nous avons donc choisi de soumettre les animaux à la tFUS après une semaine d’habituation postsevrage P28, puis d’évaluer le comportement et différentes dimensions symptomatiques dans les semaines suivantes afin d’évaluer les éventuels effets thérapeutiques du tFUS à court terme et leur maintien (ou non) à plus long terme.
Évaluation du potentiel thérapeutique de la greffe de cellules souches hématopoïétiques modifiées génétiquement dans la maladie d’Alzheimer.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
385 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont affaiblies par quatre jours de Busulfan qui peut entraîner infections et perte de poids, reçoivent une greffe de cellules souches par injection derrière l'œil, puis passent des tests de mémoire nommés (piscine de Morris, labyrinthe en croix surélevé, open field). Le porteur évalue une thérapie cellulaire contre la maladie d'Alzheimer, dont il présente le bénéfice pour l'humain au conditionnel. Il justifie le modèle murin par l'absence de modèle in vitro reproduisant la perte de mémoire.
Objectifs
Notre objectif est de développer une nouvelle approche thérapeutique dans la maladie d'alzheimer (MA) visant à surexprimer deux protéines du métabolisme du cholesterol, en utilisant comme véhicule des cellules souches hématopoïétiques (CSH) de souris. Ces cellules peuvent en effet être génétiquement modifiées ex vivo par un vecteur lentiviral pour exprimer un gène thérapeutique. Elles peuvent être ensuite réinjectées chez l’animal (modèle de la MA), après un traitement qui détruit les CSH de la moelle. Les cellules ainsi injectées reconstitueront le système hématopoïétique des animaux hôtes et après passage de la barrière hématoencéphalique, pourront se différencier localement pour exprimer nos protéines d'intêrets. Ce projet a pour but d’évaluer le potentiel thérapeutique de cette approche dans le but de diminuer la pathologie liée à l’accumulation de l’amyloïde Beta.
Bénéfices attendus
Le projet permettrait de mieux caractériser les rôles des protéines d'intérêts dans la maladie d’Alzheimer. Si cette étude apporte des résultats encourageants, les bénéfices seraient de développer une approche thérapeutique potentielle permettant de traiter la MA chez l'humain. Cette approche permettrait une administration par voie intraveineuse de macrophages/monocytes purifiés et génétiquement modifiés obtenus à partir des CSH des patients eux-mêmes au lieu d'une greffe de CSH (qui est une technique invasive). Ces cellules élimineraient les protéines toxiques qui causent les symptômes de la maladie.
Procédures
Les animaux seront immunodéprimés par injection de Busulfan pendant 4 jours (l'injection dure 10 secondes par souris) puis recevront une greffe de cellules souches génétiquement modifiées par injection rétro-orbitale le jour d'après la dernière injection de Busulfan (l'injection dure moins de 2 min par souris, réalisée sous anesthésie gazeuse). Deux semaine après la greffe, une partie des animaux seront nourris avec de la nourriture spéciale (appelée PLX5622) permettant de dépleter la microglie du système nerveux central pendant 28 jours. Des prélèvements sanguins seront réalisés (1 fois par mois maximum avec un volume prélevé de 150 uL maximum et seulement si les souris pèsent plus de 20g, le prélèvement dure 2 min maximum par souris) sous anesthésie gazeuse pour vérifier la bonne prise de la greffe. Le premier prélèvement sera réalisé 2 mois après la greffe. Des tests comportementaux seront réalisés sur un des modèles murins de la maladie d'Alzheimer. Les tests commenceront 1 semaine après le prélèvement sanguin et s'étaleront sur 2 semaines. Pour la piscine de Morris, chaque essai dure maximum 1 min et chaque animal a 3 essai par jour pendant 5 jours. Le labyrinthe en croix surélevé et l'openfield durent 10 min chacun par souris et un seul essai est réalisé. L'euthanasie sera réalisée après les tests comportements, entre 6 et 7 mois d'âge.
Impact sur les animaux
Le conditionnement pré-greffe par injection de Busulfan 4 jours de suite affaibli les souris (perte de poids) et peut entrainer des infections. L’injection IV se fait dans le sinus rétro-orbitale se trouvant à l’arrière de l’œil. L’aiguille est donc insérée à côté de l’œil et l’œil n’a aucun dommage après l’injection (une lésion oculaire est possible mais rare). L’injection dure moins d’une minute. Nous avons préféré réaliser des injections rétro orbitale au lieu d’injection dans la veine caudale car cette dernière méthode est plus stressante que l’injection rétro orbitale (placement sous une lampe chauffante pour dilater la veine, contention mécanique). Les croquettes spécifiques n’entrainent aucun effet indésirable. Lors des prélèvements sanguins, les souris peuvent perdre beaucoup de sang. Les tests comportementaux peuvent être stressants et angoissants pour les animaux.
Devenir
A l'issue de nos deux procédures, les animaux sont euthanasiés pour récuperer les tissus post mortem pour réaliser des analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
Nous souhaitons utiliser un modèle animal (souris) car aucun modèle in vitro ou de culture cellulaire ne permet aujourd’hui d’étudier les symptômes de perte de mémoire typiques de cette maladie ainsi que la complexité des mécanismes neuronaux. De plus, la souris est un modèle d'alzheimer bien caractérisé tant d’un point de vue comportemental que biologique (marqueurs histologiques ou moléculaires) pour évaluer le bénéfice thérapeutique associé à notre approche. Pour ce faire, nous utiliserons au maximum 4 modèles de d'alzheimer déjà décrits.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques fiables. En effet, des travaux précédents ont permis de montrer que l’étude de groupes de 15 animaux par groupe permettait d’obtenir des résultats statistiquement significatifs en comportement, ainsi que dans les analyses biochimiques et de biologie moléculaire, réalisées sur de petits échantillons (1 hippocampe / souris). De plus, ce nombre d’animaux prend en compte la mortalité spontanée, ayant cours du fait du phénotype, particulièrement chez les APP/PS1 De9 (perte d’environ 10% dans un groupe APP/PS1 De9 non traité), et de l’âge des souris. Ainsi, dans ce projet, nous prévoyons un total de 385 souris. Des tests statistiques seront ensuite réalisés sur les résultats obtenus pour avoir une interprétation fiable de ces résultats.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation (annexe III de la directive 2010/63/EU), les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (avec mise au point de points limites) et des soins adaptés si besoin. Les animaux sont hébergés en groupe avec un coton pour faire un nid dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et par le personnel de l'animalerie. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Tous signes d’inconfort ou de détresse, tels que l'apparence (poil ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) et un comportement anormal (agressivité soudaine, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit), feront l’objet d’une surveillance accrue et d’un isolement en cas de besoin. Les critères absolus (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires) entraîneront l’euthanasie. Toutefois, les critères absolus ne devraient pas être mis en évidence aux vues des procédures utilisées. Pour les chirurgies, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale et en prévention de la douleur un antidouleur sera administrer. Une nouvelle injection sera administrée à l’animal le lendemain matin. Un gel ophtalmologique est appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant l'anesthésie. Les animaux ayant subi une chirurgie seront observés quotidiennement la semaine suivant la chirurgie avec une attention particulière.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues et sont relativement proches de celles de l’Homme. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la maladie humaine. Nous avons prévu d’utiliser au maximum 4 modèles animaux de la MA ayant tous des avantages à leur utilisation afin de valider notre approche thérapeutique dans ces modèles. Pour les souris APP/PS1 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition du phénotype (plaques Ab). Pour les souris THY-Tau22 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition du phénotype (protéines Tau). Pour les souris APP23 : jeunes adultes de 2 mois pour réaliser la greffe avant l’apparition des symptômes cognitifs.
Etude des effets combinés de différentes molécules dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie inocule un peptide amyloïde dans leur cerveau pour provoquer une perte de mémoire, puis elles reçoivent un traitement combiné et passent des tests comportementaux, dont un test d'évitement où elles subissent un choc électrique. Le porteur vise une combinaison de molécules contre la maladie d'Alzheimer, à tester ensuite chez l'humain. Il présente le modèle murin comme "indispensable", seul recours in vivo reproduisant les symptômes.
Objectifs
Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer (MA) est aujourd’hui une priorité. Cependant la MA étant une maladie multi-cible les chercheurs s’accordent à dire qu’un seul traitement ciblant une des nombreuses cibles de la MA ne sera pas suffisant et qu’une combinaison de plusieurs molécules serait plus efficace afin d’obtenir un effet thérapeutique. La combinaison de la mémantine ainsi que du Donepezil reste aujourd’hui un des traitements utilisés chez les patients atteints de la MA et ce malgré une efficacité remise en doute depuis plusieurs années par la communauté scientifique. Il est donc primordial de tester d’autres molécules de manière combinée sur un modèle de la MA afin de pouvoir un jour procéder au développement clinique d’un traitement combinatoire.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de mettre en avant un effet combinatoire de diverses molécules afin de contrer les symptômes de la maladie d'Alzheimer. Les combinaisons efficaces testées sur le modèle murin auront pour but finale d'être testé en clinique chez l'homme.
Procédures
Les animaux auront au cours de leur vie une chirurgie permettant l'inoculation du peptide amyloide 25-35 dans le ventricule cérébral droit. Cette intervention est d'une durée de 7 minutes maximun entre le début de l'anesthésie à l'isoflurane et la fin de l'innoculation du peptide amyloide. Ensuite durant 7 jours les animaux recevront une injection intrapéritonéale du traitement combinatoire mis en place. Suite à ce traitement les performances mnésiques des animaux seront testées, avec des tests comportementaux.
Impact sur les animaux
Un certain stress lié à la procédure chirurgicale et aux injections pourra être engendré. Une perte mnésique voulu, et dû à la diffusion du peptide amyloide dans le cerveau sera également observé. Durant le test comportemental d'évitement passif, les animaux recevront un choc électrique léger, (0.3 mA pendant 3 sec) afin d'évaluer leur performance mnésique.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer le cerveau et procéder à des tests biochimiques post- mortem.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins de la MA pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la MA dans une fenêtre de temps relativement courte.
Réduction
Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe (12 souris/groupe). Une veille bibliographique sera également prise en compte durant les 5 années du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de concentrer un maximum d’échantillons et éviter ainsi de relancer des expérimentations.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carés de cotons afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu et si nécessaire la mise à mort de l’animal serait anticipée. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur
Choix des espèces
Afin de mimer rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer en vue d'un traitement curatif, la souris reste à ce jours le modèle se rapprochant au plus près de l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines.
Rôle des filets périneuronaux dans la ré-activation des mémoires traumatiques associées au stress précoce chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 872 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souriceaux sont soumis dès le sevrage à une "défaite sociale juvénile", des agressions physiques répétées par des souris adultes, puis reçoivent du tamoxifène, une chirurgie cérébrale et pour certains une stimulation magnétique, avec de nombreux tests comportementaux. Le porteur écrit que ce modèle induit "de la douleur physique" et "de la douleur psychique" et un phénotype anxio-dépressif, cette souffrance étant "la base du modèle". Les souris agresseuses sont aussi tuées, et il affirme qu'aucune méthode alternative in vitro ou in silico n'est disponible.
Objectifs
L’exposition précoce à des traumas, incluant la maltraitance infantile (négligence, abus sexuel, physique ou psychologique), est indiscutablement un des plus importants facteurs prédicteurs de pathologies psychiatriques à l’adolescence et à l’âge adulte, notamment de la dépression et du suicide. Les études d’imagerie montrent de façon systématique que les expériences de maltraitance infantile modifient les trajectoires de développement et la connectivité de régions cérébrales impliquées dans les mémoires aversives. Les substrats neurobiologiques de ces altérations sont cependant particulièrement inexplorés. Notre hypothèse est les memoires traumatiques associées au stress precoce sont consolidés et deviennent persistantes jusqu’à l’age adulte grace a la formation de la matrice extracellulaire, en particulier les filets perineuronaux (PNNs), qui se developpent autour de certains neurones pendant l’enfance et l’adolescence. Indirectement les PNNs participeraient ainsi à la survenue de troubles liés au stress, dont la dépression et le syndrome de stress post-traumatique. Pour tester cette hypothèse, nous utiliserons un modele animal de stress précoce chez la souris, la défaite sociale juvénile (DSj), basé sur un évenement traumatique pendant la periode juvénile (aggression physique). Nos objectifs sont de : - Cartographier les neurones qui participent à la mémoire du trauma - Tester si la manipulation de ces neurones est suffisante pour rappeler la mémoire du trauma - Tester comment ce modele de stress précoce affecte le développement des PNNs. - Tester si les la suppression des PNNs modifie l’activité des neurones qui participent au souvenir du trauma - Tester si une approche non-invasive de neurostimulation, en particulier la stimulation magnétique transcranienne (rTMS), au potentiel clinique bien établi dans le traitement des pathologies liées au stress tel que le stress post-traumatique et la dépression, modifie la formation des PNNs et perturbe le rappel de la mémoire du trauma.
Bénéfices attendus
L’adversité précoce est le plus grand prédicteur des troubles mentaux, en particulier de l’anxieté, du trouble de stress post-traumatique et de la dépression. Ces troubles sont les maladies mentales les plus rependues et la première cause d’invalidité dans le monde. En permettant une meilleure compréhension des substrats neurobiologiques des effets à long terme du stress précoce, ce projet s’inscrit donc dans une démarche nécessaire pour établir de nouvelles pistes thérapeutiques afin de soigner ces maladies. Ce projet vise en outre à étudier le rôle des PNNs dans la consolidation des traces mnésiques, à travers une démarche expérimentale innovante, il s’aligne donc parfaitement avec les enjeux et défis actuels en neurosciences fondamentales, avec pour bénéfice une meilleure compréhension du fonctionnement du cerveau au niveau cellulaire. Finalement, si la stimulation cérébrale non-invasive a des potentiels thérapeutiques bien établis en clinique pour les pathologies liées au stress, en particulier le trouble de stress post-traumatique et la dépression, les bases neurobiologiques de cette action thérapeutique est actuellement inconnue. En caractérisant mieux comment la rTMS modifie les traces mnésiques du trauma et la plasticité cérébrale à travers le remodelage des PNNs, cette étude permettra donc de mieux comprendre le potentiel de cette approche.
Procédures
Procédure 1 : sélection de souris de la souche agressives (200 souris de la souche expérimentale non OGM, 300 souris de la souche agressive) Des souris de la souche expérimentale subissent 3 sessions de 5 minutes (1 session par jour) où elles sont potentiellement agressées physiquement par des souris agressives afin de sélectionner des agressives. Procédure 2 : optimisation du dosage du tamoxifène (84 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Agression physique unique de souris expérimentale OGM par une souris agressive pendant 10 minutes 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène sur les souris expérimentale OGM (2 secondes par animal) 3) Agression physique unique de souris expérimentale OGM par une souris agressive (10 minutes) Procédure 3 : visualisation des neurones participant à la mémoire de la défaite sociale juvénile (544 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Tests de comportement (interaction sociale, hypophagie induite par la nouveauté, open-field, labyrinthe en croix surélevé, test de préférence au sucrose, test de nage forcée, boîte claire obscure. Procédure 4 : Rôle des filets périneuronaux dans le rappel du trauma (344 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Injection unique intra-cérébrale de chondroïtinase ou de solution saline par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie gazeuse (durée de 2 heures par animal) 3) Tests de comportement Procédure 5 : effet de l’inhibition des neurones activés pendant la défaite sociale juvénile sur le rappel du trauma (216 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Implantation de fibres optiques par chirurgie stéréotaxique sous anesthésie gazeuse (durée de 2 heures par animal) 3) Tests de comportement combinés à stimulation lumineuse Procédure 6 : Effet de la Stimulation Magnétique Transcrânienne répétitive (rTMS) sur les traces mnésiques du trauma visualisées par photométrie (216 souris de la lignée expérimentale OGM) 1) Exposition à la défaite sociale juvénile 2) Injection intra péritonéale de Tamoxifène 3) Implantation de fibres optiques 4) protocole de rTMS sous anesthésie gazeuse (durée 10mn, 5 jours consécutifs) 3) Tests de comportement combinés à stimulation lumineuse
Impact sur les animaux
Les effets indésirables des différentes approches utilisées sont décrits ci-dessous : - Modèle de défaite sociale juvénile : Le modèle étant base sur des agressions physiques répétées, il induira de la douleur physique. Il induira également de la douleur psychique, un état de stress aigu pendant la procédure mais aussi durable, en induisant un phénotype anxio-depressif chez les souris exposées au modèle. Cette douleur psychique est la base du modèle, l’objectif étant d’étudier les substrats neurobiologiques des changements comportementaux induits par ce stress. - Injection IP de 4-OHT : La procédure peut avoir une conséquence négative sur le bien-être animal et induire une douleur aigue. -Tests de comportement : Basés sur des mesures quantitatives ou qualitatives d’exploration dans des dispositifs nouveaux et donc possiblement anxiogènes, les tests utilises peuvent induire un stress léger chez les animaux. - Injections intra-cérébrale et implantation de fibres optiques : La chirurgie stéréotaxique est susceptible d’induire douleurs physiques et inconfort chez l’animal, avec perte potentielle de poids et mobilité réduite dans les 2 jours qui suivent la procédure (pour l’implantation de la fibre optique, l’injection seule étant bien tolérée).
Devenir
Les animaux expérimentaux seront euthanasiés à l’issue des tests comportementaux en vue d’une perfusion transcardiaque permettant d’effectuer des procédures d’immunohistochimie après prélèvement des cerveaux. Les agresseurs, du fait de leurs caractéristiques agressives, seront euthanasiés étant donné l'impossibilité de réutiliser ces animaux ou de les faire adopter.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des zones cérébrales impliquées dans la réponse au stress et les émotions.
Réduction
Les effectifs sont optimisés pour prendre en compte qu’une partie des animaux (~15 à 30% selon nos données préliminaires et la littérature) sera résiliente au protocole de défaite sociale juvénile (DSj), ces effectifs sont donc nécessaires pour pouvoir comparer statistiquement les groupes expérimentaux pour les différentes variables comportementales (témoins, DSj susceptibles, DSj résilients). Dans le cas où aucune raison préalable ne laisse supposer un dimorphisme sexuel dans la variable mesurée l’expérience ne sera faite que sur des males. S’il est essentiel de pouvoir identifier des souris « aggresseurs », ce qui est un prérequis au protocole de DSj, les aggresseurs sélectionnés peuvent être réutilisés par la suite en tant qu’agresseurs au cours des procédures suivantes. Etant donné que les tests statistiques utilisés seront non-paramétriques, et donc ne seront pas basés sur des comparaisons de moyennes mais de rangs, une analyse de puissance cohérente dans ces conditions sans une connaissance a priori précise de la distribution des variables est difficile. Le choix des effectifs est basé principalement sur les données préliminaires comportementales et histologiques obtenues.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux qui subissent la DSj seront suivis quotidiennement, dans l’heure suivant l’épisode de défaite sociale, avec une attention particulière portée à l’état général, l’état de chair et aux plaies cutanées potentielles des animaux tests, ce qui sera facilite par des formulaires de sante précis pour chaque souris. Des points limites énoncés plus bas seront mis en place avant intervention ou exclusion du protocole.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, et finalement la possibilité d’utiliser des animaux transgéniques permettant l’utilisation d’outils de neurosciences intégratives font de la souris le modèle animal le plus pertinent. Les souris expérimentales sont utilisées le lendemain du sevrage, a P21, a un stade juvénile, et les expérimentations continuent jusqu’à l’âge adulte. Les souris CD1 servant d’agresseurs dans le modèle de DSj sont d’anciens reproducteurs adultes. Les souris C57BL/6 utilisées comme sentinelles pour tester l’agressivité des CD1 sont utilisées à un stade juvénile (P21).