Système nerveux
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LXRβ et remyélinisation du nerf sciatique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1415 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 1400 d'entre elles subissent une compression chirurgicale du nerf sciatique qui altère la marche et peut provoquer une douleur, suivie d'analyses du déplacement, 415 recevant en plus des injections de tamoxifène cinq jours par semaine. Le porteur indique surveiller quotidiennement la douleur avec une grille dédiée et administrer des dérivés morphiniques, et met à mort les animaux par exsanguination sous anesthésie pour prélever sang et nerfs. Il étudie le rôle d'un gène dans la réparation de la gaine des nerfs et affirme que ce processus complexe ne peut être modélisé in vitro.
Objectifs
Le but est de caractériser chez la souris la cinétique des évènements cellulaires et moléculaires impliqués de la réparation de la gaine isolante des nerfs (gaine de myéline, riche en lipide et cholestérol) après écrasement du nerf sciatique. Nous voulons analyser les conséquences sur cette régénération de l’absence d'un gène impliqué dans le métabolisme du cholestérol (le Liver X Receptor β -LXRβ-) dans les cellules qui forment la gaine de myéline (les cellules de Schwann). Nous nous intéresserons au fonctionnement du nerf en régénération, aux changements de son architecture tissulaire et aux modifications de l'activité des acteurs impliqués dans la réparation de la gaine de myéline. L’objectif est de mieux comprendre l’impοrtance du gène LXRβ dans les cellules de Schwann pour la réparation de la gaine de myéline.
Bénéfices attendus
L’ensemble des résultats nous permettra de décrire avec précison les évènements cellulaires et moléculaires au sein des cellules de Schwann lors de la remyélinisation du nerf sciatique chez la souris et de comprendre l’implication du gène LXRβ dans ce processus complexe. Les résultats attendus pourraient ainsi permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des atteintes de la gaine de myéline des nerfs périphériques.
Procédures
415 des 1415 animaux seront traités au Tamoxifène pendant 2 semaines, à raison d'1 injection/jour dans le péritoine pendant 5 jours/semaine au moyen d'une seringue à aiguille fine, adaptée pour limiter au minimum la douleur de l'injection. Elle a pour but d'induire une recombinaison génétique du gène étudié dans les cellules de Schwann à l'âge adulte. Pour étudier la réparation de la gaine de myéline, 400 animaux parmi les 415 traités au Tamoxifène et 1000 animaux non traités au Tamoxifène seront destinés à la procédure chirurgicale de compression du nerf sciatique. Cette procédure a pour but d'induire une altération de la gaine de myéline. Elle dure quelques minutes et sera effectuée sous anésthésie générale après traitement analgésique pour limiter la douleur liée à l'opération. Après l'opération, nous suivrons au cours des semaines suivantes la récupération des fonctions du nerf sciatique par diverses études comportementales (analyse de la démarche de l'animal, analyse de la mobilité des doigts...).
Impact sur les animaux
L'injection de Tamoxifène dans le péritoine des souris est une procédure couramment exécutée en laboratoire qui ne produit pas de douleur notable chez l'animal. Une grille spécifique de prise en charge de la douleur a toutefois été créée pour évaluer les conséquences douloureuses qui pourraient survenir suite à l'invalidation génétique induite par ce traitement. Chez la souris, la démyélinisation induite par compression du nerf sciatique altère la locomotion et peut entraîner une douleur. Nous quantifierons quotidiennement la douleur chez les souris en utilisant la grille spécifique d'évaluation de la douleur que nous avons mis en place afin de prendre en charge chez ces animaux les nuisances induites par cette procédures.
Devenir
Nous souhaitons analyser chez tous les animaux concernés le statut immunitaire. Nous devons pour cela prélever une grande quantité de sang pour pouvoir analyser les marqueurs inflamatoires et immunitaires systémiques. Ainsi, à l'issue de chaque procédure, les 1415 animaux seront sacrifiés par exsanguination sous anesthésie générale avec traitement analgésique préalable. Après la mise à mort des animaux, les 2mL de sang prélevés seront analysés pour établir le profil cytokinique et les nerfs seront disséqués pour analyse biochimique et histologique.
Remplacement
La remyélinisation est un processus complexe qui nécessite l’intervention de multiples acteurs cellulaires qui ne peut être modélisé in vitro. La qualité de la mise en place de la gaine de myéline et de son maintien a des conséquences fonctionnelles qui nécessitent l’analyse de composantes sensori-motrices propres aux animaux vivants.
Réduction
Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre la puissance statistique suffisante pour l'analyse des altérations comportementales induites par la perturbation du systême sensori-moteur. Nous soumettrons les données au test satistique one way ANOVA suivi d'un test de Bonferroni et comparerons les groupes d'animaux deux à deux (sauvages vs transgéniques / lésés vs non lésés).
Raffinement
Afin de limiter au minimum la souffrance des animaux une grille spécifique d'évaluation de la douleur a été mise en place. Elle permettra une prise en charge adaptée de la douleur due aux injections et aux opérations chirurgicales (traitement journalier des animaux avec des dérivés morphiniques). Pour l'opération chirurgicale de compression du nerf sciatique, un traitement analgésique avant l'opération est prévu ainsi que durant les 5 jours qui suivent l'opération. L'état général des animaux sera quotidiennement évalué (mobilité, aspect du pelage...) et du gel d'hydratation ainsi que des croquettes seront mis à disposition des animaux au fond de la cage si un défaut de locomotion des souris était constaté.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères au système métabolique et physiologique suffisamment proche de l’Homme pour être utilisées dans une étude pertinante de la gaine isolante des nerfs (myéline) et pour élucider l’importance d'un gène (le LXRβ) dans la réparation de cette gaine. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de ce gène sont très bien adaptées chez la souris. L’analyse comportementale ainsi que les techniques biochimiques et histologiques envisagées pour étudier la myéline nous permettront d’apporter des réponses claires sur le rôle du LXRβ sur la qualité de la gaine des nerfs. Les animaux utilisés sont âgés de 6 à 12 semaines, âge adulte classique pour étudier les phénomènes de réparation de la gaine de myéline pour lequel le système nerveux a achevé son développement et est pleinement fonctionnel.
Modèles conditionels pour étudier la dystrophie myotonique de type 1
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
848 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance surtout modéré. Un modèle de dystrophie myotonique est induit par la doxycycline, y compris chez des souriceaux étudiés jusqu'à sept jours de vie pour leurs vocalises, leur respiration et leur alimentation, 160 animaux étant tués sans réveil par perfusion d'un fixateur. Le porteur indique que les effets attendus des souris induites sont neurologiques et présente les autres actes comme légers. Il cherche à créer un modèle "plus performant" de la forme congénitale de la maladie et qualifie ce développement d'étape "incontournable".
Objectifs
Les objectifs du projet sont: 1) la création d'un nouveau modèle murin (souris) conditionnel de la Dystrophie Myotonique de type 1, spécifique du cerveau permettant de décortiquer les mécanismes physiologiques, histologiques et moléculaires observées chez l'homme 2) la validation de ce modèle et l'optimisation des conditions d'induction de la mutation 3) étudier les impacts physiopathologiques des ARN DMPK mutants exprimés dans les motoneurones de souris nouveau-nés transgéniques: analyses phénotypiques, histologiques, moléculaires et fonctionnelles.
Bénéfices attendus
Ce nouveau modèle permettra de déterminer l'implication des motoneurones des nerfs craniaux et spinaux dans la pathologie notamment dans la forme grave néonatale. L'obtention et l'étude de ce nouveau modèle murin plus performant ouvrira la voie à une meilleure caractérisation des mécanismes moléculaires à l'origine de la pathologie et des conséquences physiologiques. Enfin l'utilisation de ce modèle devrait permettre de tester et de valider chez la souris le développement de nouvelles thérapies de traitement de la DM1 développées au laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur cette maladie.
Procédures
Les 848 souris de ce projet seront impliquées dans des procédures de sévérité légère, modérée et sans réveil. De séverité légère, sont concernées 96 souris qui seront utilisées pour l'étude des vocalises à 7 jours avec 3 minutes comme durée d'acte . De sévérité modérée, sont concernéees 592 souris: - les souris meres (128 souris) qui recevront la doxycycline au stade E11et P1 jusqu’à 7 jours, - les 16 souris qui permettront la validation du modèle après injection de l'inducteur doxycycline en injection intra-péritonéale sur une durée de 4 jours. - les 96 souris utilisées pour optimisation de la concentration de doxycycline. Cet acte durera jusqu à 7 jours de vie. - les 96 souris utilisées pour l'étude de la respiration par pléthysmographie à 7 jours. Cet acte dure au maximum 1h - les 96 souris utilisées pour l'étude de l’alimentation sur une durée de 7 jours. - les 160 souris utilisées qui recevront la doxycycline pour les etudes moléculaires jusqu’à 7 jours de vie. De classe sans réveil, sont concernées les 160 souris utilisées pour les études histologiques , perfusées au PAF pendant une durée d environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les symptômes ou effets attendus pendant ou à l'issue de la procédure P1 (classée modérée) sur les souris induites uniquement (cad ayant recu de l'inducteur: doxycycline) sont exclusivement neurologiques compte tenu de la specificité d'expression de l'ARN mutant. Les effets indésirables attendus pendant les autres procédures sont classés légers et sont un stress léger lors des manipulations et test d'évaluation fonctionnelle non invasifs ou de l'ordre de la gène ressentie lors d'une piqure (injections de doxycycline ou d'anesthésique).
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements qui sont nécessaires pour les analyses post-mortem.
Remplacement
La compréhension des mécanismes à l’origine de la DM1 et le développement d’approches thérapeutique nécessitent d’avoir recours à des modèles animaux de cette pathologie qui expriment la mutation DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique. A ce jour, les modèles murins de la DM1 existants ne reproduisent que partiellement les anomalies moléculaires et physiologiques observées chez les patients. Le développement d’un nouveau modèle murin de la DM1 présentant davantage de similitudes avec la pathologie chez l'homme est un enjeu majeur et une étape incontournable dans la compréhension de la pathologie humaine et l'évaluation des approches thérapeutiques développées dans notre laboratoire mais aussi par tous les laboratoires qui travaillent sur la DM1.
Réduction
Afin d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux, tous les animaux issus des croisements (mâles et femelles) seront utilisés soient 848 animaux. De plus, le protocole est établi de manière à ce que chaque animal testé permette d’obtenir le plus de résultats possibles en physiologie, histologie et biologie moléculaire. Enfin ce projet se déroulera en plusieurs étapes. Ainsi la réussite de la première étape détermine la poursuite, la mise en place et l’utilisation d’animaux supplémentaire prévue dans la seconde étape, et ainsi de suite. Les analyses physiologiques finales seront réalisées avec des lots suffisants dont le nombre a été établi par un calcul mathématique lors d’études precedents. Nous avons ainsi déterminer le nombre minimum de souris à utiliser afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés et assurer la distribution normale de nos données. Il sera ensuite nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats
Raffinement
En conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. L’entretien des souris ainsi que les différents protocoles expérimentaux seront assurés par du personnel qualifié et le bien-être des animaux sera amélioré par la mise en place d’un enrichissement de milieu avec des nid de lanière kraft. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température (20-24 degrés) et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (éclairage 6h30- 18h30). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur ainsi qu’une de perte de poids de 20% seront considérés comme critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduiront à l’euthanasie des animaux concernés. Afin de réduire la souffrance et le stress des animaux, des points limites ont été établis et un suivi du bien-être des animaux sera réalisé régulièrement. Il est à noter que les souris transgéniques n’ont aucun phénotype avant l’addition de doxycycline au régime alimentaire. Les tests invasifs seront réalisés sous anesthésie et seront sans réveil. Des études histologiques et moléculaires seront réalisées à partir d’échantillons de tissus prélevés sur les mêmes animaux après euthanasie de l’animal selon les procédures standard, réalisées dans le respect de l'éthique animal.
Choix des espèces
Notre choix s'est orienté vers les modèles de souris transgéniques, modèles classiques d'étude de certaines maladies comme celle que nous étudions. Les souris transgéniques que nous avons créées en insérant le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie, nous permettent d'étudier les mécanismes moléculaires au niveau ADN, ARN et protéines dans différents tissus, chez l'embryon et la souris adulte. Ce projet vise à comprendre les mécanismes et impacts physiopathologiques des expansions CTG dans le système nerveux d'un modèle murin conditionnel de la forme congénitale de la dystophie myotonique de type 1. La forme congénitale est “reproduite” chez les souriceaux d’ou le choix des analyses à 7 jours de vie.
Caractérisation d’un nouveau modèle murin d’autisme et évaluation d’une nouvelle stratégie thérapeutique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 48 étant tuées sans réveil. Elles reçoivent un traitement dans l'eau de boisson puis passent une batterie de tests comportementaux mesurant locomotion, apprentissage, mémoire, anxiété, coordination et interactions sociales, avant prélèvement du cerveau, une partie subissant une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur affirme que ces tests ne provoquent qu'un léger stress et utilise des souris génétiquement modifiées comme modèle d'autisme. Il étudie un gène et un traitement par modulateurs endocannabinoïdes, retombées cliniques présentées au conditionnel, et affirme qu'il n'existe pas de modèle informatique des comportements complexes.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont doubles : Le premier objectif est d'étudier la contribution d'un gène muté dans le trouble du spectre autistique. Nous explorerons son rôle dans l'apprentissage et la mémoire et l'activation des circuits cérébraux. Nous analyserons l'activité des régions cérébrales suite à un test de reconnaissance d'objet et explorerons les populations neuronales impliquées chez des souris invalidées pour le gène d'intérêt comparées aux souris sauvages. Le deuxième objectif est d'évaluer une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à administrer des modulateurs du système endocannabinoïde aux souris transgéniques modèles d'autisme. Nous étudierons leur capacité d'améliorer ou corriger les déficits comportementaux et au niveau des synapses observés chez les souris transgéniques.
Bénéfices attendus
L'étude dans des modèles murins des conséquences neurobiologiques de l'absence des gènes mutés dans l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux est une étape clé dans la compréhension des mécanismes impliqués dans ces maladies, afin de permettre à terme de développer des approches thérapeutiques adaptés. Ces expériences devraient permettre de déterminer le rôle du gène d'intérêt dans l'activité des circuits cérébraux lors de l'apprentissage et la mémoire, contribuant ainsi à mieux comprendre son implication dans l'autisme et la déficience intellectuelle. Par ailleurs, l'évaluation d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à administrer des modulateurs du système endocannabinoïde aux souris modèles d'autisme pourrait mener à terme à des essais cliniques chez les personnes atteintes.
Procédures
Certaines souris recevront un traitement chronique, administré par voie orale dans l'eau de boisson, pendant 1 mois. Après 7 jours de prétraitement, les souris seront testées séquentiellement dans une batterie de tests comportementaux, effectués à 1-3 jours d'intervalle ; pendant les tests elles continueront à recevoir le traitement. Nous évaluerons l'activité locomotrice (1 jour), l'apprentissage et la mémoire (4 jours), l'anxiété (2 tests, chacun 1 jour), la coordination locomotrice (5 jours) et le comportement social (1 jour). La durée de l'ensemble des tests est de 3 semaines. A la fin des expériences, le cerveau sera prélevé post-mortem afin de réaliser des analyses pour comprendre le mécanisme d'action du traitement. Dans d'autres expériences, les animaux subiront une perfusion intracardiaque avec un agent fixateur, sous anesthésie profonde, afin de prélever le cerveau pour des analyses histologiques.
Impact sur les animaux
L'administration par voie orale des traitements n'engendre pas d'effets secondaires. Les expériences de comportement réalisées ne provoquent pas de gêne particulière sauf un léger stress dû à la manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau. L'injection intrapéritonéale d'un anesthésique avant la perfusion intracardiaque peut causer de la douleur.
Devenir
Tous les animaux traités avec des modulateurs du système endocannabinoïde seront euthanasiés à la fin des expériences, afin de prélever le cerveau et le sang pour effectuer des analyses. Dans d'autres expériences, les animaux seront perfusés avec un agent fixateur à la fin, afin de fixer le cerveau et effectuer des analyses histologiques.
Remplacement
Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs puisque nous étudions des mécanismes pathologiques complexes associés à l’autisme et la déficience intellectuelle tels que des déficits cognitifs et moteurs et l'activité des circuits neuronaux intacts. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour mieux comprendre les conséquences de l'inactivation des gènes d'intérêt dans le cerveau et développer de nouvelles approches thérapeutiques. La nature expérimentale de notre recherche nécessite l’utilisation de modèles animaux plutôt que des sujets humains. De plus, il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 1148 souris. Ce nombre des souris s'explique par la nécessité d'étudier des souris génétiquement modifiées et de souris normales de deux sexes traitées avec différents composés administrés à plusieurs doses. Les groupes d’animaux nécessaires afin d’obtenir des résultats robustes statistiquement dans les expériences de comportement doivent se situer entre 12-15 par condition étudiée. En effet, la variabilité interindividuelle élevée observée lors des tests comportementaux nécessite de groupes de taille relativement élevée. La taille des groupes est déterminée sur la base de la littérature scientifique et notre propre expérience dans ce type d'analyses. Les données seront analysées à l'aide de tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux à utiliser dans les expériences d'administration chronique des traitements, les souris seront testées séquentiellement dans une batterie de tests comportementaux, effectués à 1-3 jours d'intervalle. De plus, à la fin des expériences de comportement, nous récupérons le cerveau des souris, afin d'étudier l'effet du traitement et doser le taux des substances administrées. Enfin, lors des études explorant les effets des nouveaux traitements, nous effectuons toujours une étude pilote de taille réduite, afin de déterminer la nécessité de réaliser des études dose-réponse utilisant un grand nombre d'animaux.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les protocoles utilisés ont été optimisés pour exposer les animaux au minimum de gêne possible. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance est exclue du protocole. Les souris sont hébergées à raison de 2 à 5 animaux par cage dans une animalerie de stabulation (température 19–21°C, cycle jour–nuit 12h–12h), avec accès libre à l’eau et aux croquettes. La litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Une semaine avant les expériences, les souris sont manipulées quotidiennement par l'expérimentateur pendant 5 min afin de les habituer et réduire le stress. De plus, avant le test de reconnaissance d'objet, les souris sont exposées au champ ouvert plusieurs fois, d'abord en groupe et ensuite individuellement, afin de réduire le stress engendré par l'environnement nouveau. 24-72 h de repos sont réservées entre les procédures comportementales. A la fin de certaines expériences nécessitant de prélever le cerveau avec fixation pour des analyses histologiques, les souris sont anesthésiées avant d'être perfusées, leur évitant toute détresse.
Choix des espèces
Le système nerveux de la souris présente des analogies avec celui de l’être humain. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé pour les études neurobiologiques et comportementales en rapport avec l'autisme et autres troubles neurodéveloppementaux. Enfin, on a accès à des souris transgéniques afin d’étudier le rôle des gènes d’intérêt, ce qui permet d’aborder leur fonction dans le cerveau de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (2-6 mois). L'autisme étant un trouble qui persiste toute la vie, nous avons choisi d'étudier les conséquences de la perte du gène chez l'adulte, une fois que l'ensemble du système nerveux est développé.
Évaluation du potentiel anti-obésité d’un composé ciblant le récepteur à l’Acide gamma amino butyrique de type B (GABAB))
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont rendues obèses par un régime gras pendant douze semaines, reçoivent un composé par gavage oral et subissent des prélèvements sanguins lors de tests de tolérance au glucose, avant une mise à mort pour analyser sang et tissus. Le porteur reconnaît un isolement en cage individuelle pour mesurer la prise alimentaire, compensé selon lui par le rapprochement des cages. Il teste un candidat médicament anti-obésité et affirme qu'il "n'existe pas d'autre alternative" que l'animal, un modèle informatique étant selon lui impossible.
Objectifs
Contexte : Pour les autorités réglementaires, la prévention de l'obésité d'origine alimentaire chez le rongeur est le modèle classique pour étudier l'effet des médicaments anti-obésité. Nous allons utiliser un modèle d’obésité d’origine alimentaire, des souris seront rendues obèses par exposition à un régime riche en graisse (RRG), dans lequel les lipides représentent 60% de l’apport calorique, les animaux seront mis en contact avec cette alimentation pendant 12 semaines avant de débuter le traitement.
Bénéfices attendus
L’obésité est un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Actuellement, plus de 300 millions de personnes sont obèses et ce nombre ne cesse de s’accroître. Ces patients ont un risque accru de développer des pathologies chroniques telles que le diabète de type 2, des maladies cardiovasculaires et plusieurs types de cancers. Soigner l’obésité permettrait ainsi de réduire de manière significative l’incidence de toutes ces maladies associées. Malheureusement, les traitements existants à l’heure actuelle sont peu efficaces et les régimes hypocaloriques ne conduisent qu’à une perte de poids temporaire, suivie très fréquemment par un retour rapide au poids initial dès la fin du régime (phénomène dit de « yo-yo »). Seule une intervention chirurgicale associant une réduction de la taille de l’estomac et une déviation de l’intestin est à ce jour efficace à long terme pour traiter l’obésité. Cependant, les risques et effets secondaires liés à cette chirurgie en font un choix de dernier recours réservé aux cas d’obésité les plus graves. Nous manquons ainsi de traitements qui permettraient une prise en charge efficace de la majorité des patients obèses tout en limitant les contraintes et effets secondaires. Ce type d’étude permettrait de découvrir de nouvelles pistes de traitement pharmacologique.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront potentiellement réalisés lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, si le composé montre une efficacité à diminuer le poids corporel des animaux obèses. Les quantités de sang prélevées sont minimes et correspondent à moins de 1% du volume sanguin total. L'acte en lui-même n'est pas douloureux.
Impact sur les animaux
Dans notre étude, les animaux seront isolés à l’âge adulte pour nous permettre de pouvoir quantifier la consommation de nourriture, afin de compenser le manque d’interactions sociales et le possible stress d’isolation, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. Afin de réduire au maximum le stress ressenti par les animaux lors des différents actes expérimentaux (gavage, RMN, test de tolérance …), nous allons habituer les animaux aux expérimentateurs et à l’acte lui-même quand cela sera possible (habituation au gavage une semaine avant le début du traitement). De plus les animaux seront manipulés et pesées quotidiennement, nous pourrons donc détecter très rapidement toute modification comportementale.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans ce projet seront mises à mort à la fin de l'expérience pour récupérer du sang et des tissus afin de réaliser des études biochimiques et moléculaires complémentaires.
Remplacement
Pour évaluer l'efficacité d’une nouvelle thérapie pour lutter contre l’obésité, il n'existe pas d'autre alternative que l'expérimentation animale, le niveau de complexité d’une telle étude est si important qu’aucun modèle informatique n’existe à l’heure actuelle pour remplacer l’animal, d’autant que les nombreux mécanismes biologiques qui contrôlant la balance énergétique restent inconnus. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, que ce soit le rongeur ou l'humain. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement différent serait donc inappropriée.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé́ en se basant sur notre expérience ultérieure et en utilisant un estimation mathématique adapté. Les résultats seront analysés en utilisant des tests statistiques appropriés.
Raffinement
1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 18 semaines (10 semaines de RRG chez l’éleveur). Ils seront manipulés pendant 2 semaines, une semaine d’habituation générale à la manipulation des animaux (mesure du poids corporel et de la prise alimentaire) et 1 semaine d’habituation à l’administration par gavage oral. Cette habituation, permettra de diminuer le stress des animaux en réponse aux expérimentateurs et aux procédures qui seront pratiquées tout au long de l'étude. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, sont rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement se compose de frisure de papier kraft et de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et d’un tunnel en carton pour se cacher et réaliser le transfert et la manipulation des animaux. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis, ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, les attitudes, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant) et permettent de décider si l'animal peut être maintenu dans l'étude ou s'il doit être mis à mort afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et de la balance énergétique fait de la souris un bon modèle prédictif. Toutes les souris arriveront à l’âge de 18 semaines dans notre animalerie, et nous commencerons un traitement de 4 semaines à partir de l’âge de 20 semaines (deux semaines d’habituation). Nous allons étudier l’effet d’un composé sur des animaux obèses, pour cela nous avons besoin que les animaux soient en contact avec le RRG pendant un minimum de 12 semaines (début du RRG chez des animaux adultes et âgés de 8 semaines).
Modulation GABAergique et cholinergique du circuit hippocampique en condition vigile
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une craniotomie avec injection intracérébrale et pose d'une barre pour être enregistrées tête fixée pendant qu'elles sont éveillées, un conditionnement comportemental, puis une mise à mort par perfusion transcardiaque. Le porteur reconnaît un maintien en cage individuelle qui prive ces animaux grégaires de relations sociales, ainsi qu'un risque infectieux et l'inconfort du réveil après la chirurgie. Les bénéfices annoncés se limitent à une meilleure compréhension du cerveau présentée comme un "intérêt sociétal considérable", et il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut simuler la cognition.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de comprendre comment une structure clé de l'encodage de l'information spatiale et de la mémoire épisodique (l'hippocampe) est contrôlée par des catégories de neurones spécifiques, locaux (interneurones) ou issus de sa principale structure afférente modulatrice (le septum médian). Il s'inscrit dans l'objectif plus général de comprendre les propriétés des réseaux neuronaux qui sous-tendent l'encodage, le traitement et le stockage des informations ainsi que les déficits cognitifs associés aux principales pathologies cérébrales (neurodéveloppementales, neurodégénératives, épilepsie), sur des modèles expérimentaux chez le rongeur (souris).
Bénéfices attendus
Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 types d'interventions, sur une durée totale de 2 à 4 mois : procédures chirurgicales (injection intracérébrale d'agents neuromodulateurs et implantation d'une barre pour enregistrement en mode tête-fixée chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine et d'attente de l'expression des constructions virales de 2 à 4 semaines, procédure comportementale expérimentale (enregistrements en mode tête fixée chez l'animal vigile) par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 2 à 4 semaines), et enfin anesthésie terminale (perfusion transcardiaque), procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.
Impact sur les animaux
Les dommages suivants : - l'élevage d'animaux normaux et transgéniques (mais sans phénotype dommageable) - la stabulation dans des conditions standardisées (et donc monotones) afin de permettre des résultats reproductibles et comparables à ceux d'autres laboratoires - les animaux doivent être maintenus en cage individuelle pendant la periode expérimentale, entrainant un déficit de relations sociales chez des espèces grégaires - du conditionnement comportemental afin de caractériser les réseaux neuronaux pendant la résolution de tâches cognitives et d'états cérébraux contrôlés - des anesthésies (avec ou sans réveil) et interventions chirurgicales (craniotomie) afin d'injecter des constructions virales et d'insérer les électrodes d'enregistrement de l'activité cérébrale, avec le cas échant l'inconfort associé au réveil post-chirurgical et un risque infectieux - des mises à mort prématurées (euthanasie) en fin d'expérience
Devenir
Les animaux doivent être maintenus en vie jusqu'à la dernière procédure (terminale), de façon à ce que les données scientifiques soient recueillies, y compris les données histologiques post-mortem.
Remplacement
L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur l'animal vivant. Il est en effet à ce stade de nos connaissances impossible de modéliser de façon réaliste le fonctionnement cognitif in vitro ou in silico. Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation).
Réduction
Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Le nombre d'animaux nécessaires pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences est ici de 182 souris.
Raffinement
Les animaux utilisés sont des souris transgéniques, qui expriment un marqueur moléculaire permettant de cibler spécifiquement les neurones du type d'intérêt, et de leur faire exprimer des molécules nous permettant de contrôler expérimentalement leur niveau d'activité. Il devient ainsi possible de tester des hypothèses quant au rôle de ces neurones dans le circuit de façon causale (que se passe t'il quand ces neurones sont expérimentalement activés ou au contraire bloqués) et non plus seulement corrélative (quand ces neurones sont ils actifs). Les marqueurs moléculaires spécifiques des lignées utilisées n'ont pas d'incidence sur la physiologie, en dehors des strictes périodes de manipulation de l'activité des neurones, et le phénotype des animaux est donc sans conséquence sur leur bien être. Des éléments de distraction (les animaux sont élevés en cages collectives, autant que possible, selon des normes qui respectent leur besoin d'interactions sociales, et le milieu est enrichi avec du matériel de construction du nid) sont introduits dans les cages d'élevage pour pallier à la monotonie des conditions d'élevage en laboratoire. Pour prévenir, détecter et corriger les conditions de mal-être éventuel, les animaux sont suivis de façon très régulière par du personnel spécialisé, formé et sensibilisé au bien-être animal.
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. La souris est également une espèce de choix pour modéliser les pathologies cérébrales concernées par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (4-8semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats pour les manipulations optogénétiques (meilleur taux de succès d'infection virale, meilleure récupération post-cirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.
Génération de modèles de souris transgéniques la technologie par CRISPR / Cas9 combinée ou pas à un transgène
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
1366 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 1128 femelles reçoivent un traitement hormonal par deux injections pour produire des embryons, 178 autres subissent une chirurgie de réimplantation au niveau de l'oviducte et 60 mâles une vasectomie, l'ensemble servant à fabriquer de nouvelles lignées génétiquement modifiées à la demande d'équipes de recherche. Les mâles vasectomisés sont tués six à douze mois après l'opération, les femelles au moment du sevrage des portées. Le porteur affirme que seul un "organisme intégré" permet d'étudier les interactions entre cellules et tissus et présente ces souris transgéniques comme des "modèles indispensables".
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste à développer de nouvelles lignées de souris transgéniques pour permettre aux chercheurs d’avoir les outils les plus adaptés à leurs études. La première étape de ce projet est de vérifier que cette lignée de souris transgéniques n’est pas disponible dans une banque internationale ou dans un laboratoire académique. En cas d’indisponibilité, le modèle de souris transgénique est alors créé dans notre service par transgénèse aléatoire ou par la technologie CRISPR/Cas9.
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes (Bradley et al., 2012, Meehan et al., 2017).
Procédures
Pour obtenir un grand nombre d’embryons, les 1128 femelles donneuses reçoivent un traitement hormonal qui consiste en 2 injections intra-péritonéales à 48h d’intervalle. Ces injections sont réalisées sur animal vigile. Les embryons sont ensuite manipulés génétiquement puis réimplantés dans 178 femelles receveuses (=mères porteuses) au niveau de l’oviducte qui est un conduit reliant l'ovaire à l’utérus, Ces femelles receveuses sont produites en accouplant des femelles avec des males vasectomisés c’est-à-dire rendus stériles. Pour obtenir ces mâles vasectomisés, 60 males subissent une chirurgie qui consiste à couper les canaux qui permettent aux spermatozoïdes de sortir du testicule. La réimplantation et la vasectomie requièrent une chirurgie qui est réalisée sous une anesthésie générale induite par une injection intra-péritonéale d’un complexe anesthésique. L’anesthésie de ces 238 animaux (178 femelles receveuses + 60 mâles vasectomisés) dure en moyenne 20 minutes. Une prise en charge de la douleur est systématiquement effectuée par une injection intra-péritonéale d’un anti-inflammatoire non stéroïdien Pour une récupération de meilleure qualité après l’anesthésie et la chirurgie, une injection sous cutanée d’une solution de réhydratation est réalisée sur les animaux opérés. Pour éviter l’hypothermie, le réveil se fait sur un tapis chauffant. Un apport de graines de tournesol et d’une nourriture enrichie en matières grasses permet d’augmenter les bien-être des femelles opérées. Il favorise ainsi un meilleur développement des gestations et une lactation de meilleure qualité pour la prise en charge des nouveaux nés L’ensemble de ces approches technologiques permettent de générer des modèles de souris transgéniques pour l’étude de mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire, le cancer ou dans des maladies immunitaires, par les équipes de recherche.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont : 1- ceux liés à l’injection intrapéritonéale d’hormone. La durée des effets indésirables est limitée au moment de l’injection. 2- ceux liés à des petites chirurgies abdominales. La durée des effets n’excédera pas 24 heures.
Devenir
Vasectomie : Les mâles sont conservés pendant la période de leur plus forte activité sexuelle et seront euthanasiés 6-12 mois après leur vasectomie (selon leur aptitude d’accouplement scorée). Après 8 accouplements sans bouchon vaginal, le mâle est euthanasié. Superovulation des femelles donneuses Les femelles superovulées qui présentent un bouchon vaginal sont euthanasiées pour la récupération des embryons Toutes les femelles sans bouchon vaginal sont réutilisées pour une deuxième injection d’hormones, 2-3 semaines plus tard. Réimplantation d’embryons L’ensemble des femelles réimplantées sont euthanasiées au moment du sevrage des naissances.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de des bases de données (études in silico ) et des modèles in-vitro ( culture de cellules , organoïdes…) . En revanche, seul un organisme intégré permet d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Les nouveaux outils technologiques tel que l’électroporation combinée à des nucléases toujours plus performantes et des ARN guides commerciaux plus stables (IDT ; Synthego) ont permis de diminuer par un facteur 2 le nombre de séances nécessaires à l’obtention de modèles Knock-Out et de petits Knock-In. Le nombre de naissance a été augmenté en changeant notre approche pour la réimplantation. Une réimplantation bilatérale sur une femelle unique est désormais effectuée en routine (Mahabir E et al 2018) Pour les grands Knock-In, un test d’efficacité de coupure des ARN guides est effectué sur un test in-vitro. Une analyse sur blastocyste unique est réalisée et permet d’éviter d’avoir recours à des femelles réimplantées et des naissances. À la suite de ces tests, une séquence d’ARN guide est choisie. Le plasmide donneur sera alors élaboré en fonction des résultats de ce test. L’expérimentation in-vivo (Injection des embryons avec mélange contenant le plasmide donneur / ARN guides / Cas9) sera alors réalisée avec réimplantation des femelles pseudogestantes.
Raffinement
L’ensemble des procédures nécessitant de la chirurgie se fait sous anesthésie générale. Injection IP d’un mélange Xylazine (7.5mg/kg), kétamine (40 mg/kg) et flunitrazépam (0.5 mg/kg) dans du NaCl 0.9%, à raison de 50 μL pour 10g. Ce mélange permet une anesthésie assez longue et profonde ce qui permet de réaliser l’opération dans de bonnes conditions pour l’animal. L’effet analgésique de la Xylazine est utilisé pour soulager la douleur. En complément à la Xylazine, une injection de Rimadyl est effectuée pour une meilleure prise en charge de la douleur. A la fin de l’intervention avant de refermer la paroi musculaire, du Carprofène (Rimadyl) est administré dans la cavité abdominale à raison de 1mg/ml dans NaCl 0.9% à raison de 100µl pour 20g de souris.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée (superovulation efficace et embryons faciles à injecter) Nous n’utilisons que des souris adultes car nous les utilisons pour leur fonction reproductrice. En fond mixte B6D2 (C57BL6 x DBA/2), les femelles donneuses ont 8 semaines ce qui permet une quantité et une qualité optimale des embryons. En revanche pour un fond pur C57BL6/J ou N, les femelles ont 4 semaines pour l’obtention d’un plus grand nombre d’embryons avec une qualité correcte. Nous utilisons femelles pseudogestantes NMRI entre 8 et 24 semaines. Les mâles stériles NMRI (vasectomisés) utilisés pour les accouplements ont entre 2 mois et 12 mois.
Deficits synaptiques cerebelleux dans un modele murin des maladies du spectre Schizophrene
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
563 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Les souriceaux reçoivent trois injections de phencyclidine pendant leur deuxième semaine de vie, ce qui provoque des heures d'hyperactivité, une difficulté à se nourrir et un retard de prise de poids. Ils sont ensuite tués par décapitation après sédation ou par perfusion, pour prélever le cerveau et étudier les synapses du cervelet. Le porteur affirme qu'une telle étude "ne serait pas possible en culture cellulaire" et nécessite des animaux vivants.
Objectifs
Le cerveau est composé de différents types de neurones, qui établissent entre eux des contacts appelés synapses. Ces synapses peuvent être très différentes dans leur morphologie et/ou leur manière de fonctionner, chaque type de synapse ayant ainsi sa propre « identité synaptique ». Les synapses sont considérées comme des acteurs centraux des pathologies comme la schizophrénie. Cependant, la plupart des analyses ont été faites à l’échelle des structures cérébrales et peu d’études se sont penchées sur l’identité des synapses affectées. La schizophrénie est une pathologie neuropsychiatrique provoquant des symptômes psychotiques, émotionnels et des déficits cognitifs comme des problèmes de mémoire ou d’attention. Le cervelet est une structure intéressante à étudier dans la schizophrénie puisque certains patients présentent des déficits et une activité anormale dans cette structure du cerveau. De plus, son implication dans des processus cognitifs est de plus en plus fréquemment mise en évidence. Les neurones de ce réseau et leur architecture particulière sont très largement caractérisés, ce qui en fait un modèle de choix pour l’étude des déficits des synapses. Nous avons récemment étudié les altérations des synapses du cervelet dans un modèle murin connu pour mimer certaines composantes de la physiopathologie de la schizophrénie. Ce modèle murin consiste en l’injection de Phencyclidine (PCP) chez le souriceau à 7, 9 et 11 jours après la naissance, sachant que le PCP est connu pour induire des symptômes similaires à ceux induits par la schizophrénie chez l’humain. Cette première étude nous a permis de montrer que le PCP conduit à une augmentation de l’activité du réseau de neurones du cervelet et à des déficits au niveau d’un type de synapses qui semblent être liés à des changements transitoires de la quantité de molécules situées à la surface des neurones et qui seraient importantes pour former ces synapses. Le présent projet est la suite de cette étude et consiste à déterminer quels sont les neurones du réseau dont l’activité est modifiée par l’injection de PCP et quels sont les effets sur la composition moléculaire et la fonctionnalité de leurs synapses.
Bénéfices attendus
Les maladies mentales et neurologiques constituent un réel problème de santé publique puisqu’elles sont la première cause d’invalidité dans le monde. Parmi ces maladies, la schizophrénie touche 1% de la population. Les symptômes associés à cette maladie sont très variés et apparaissent à la fin de l’adolescence ou chez le jeune adulte. Les patients présentent des déficits cognitifs (problèmes de concentration, d’attention, de mémoire de travail…) qui apparaissent dans l’enfance et auraient pour origine des défauts dans le développement des neurones. Les traitements, qui restent pour l’heure purement symptomatiques, sont la plupart du temps peu efficaces. Il est donc crucial de comprendre l’origine de cette maladie, pour pouvoir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Les synapses, connexions permettant aux neurones de communiquer entre eux, sont indispensables au bon fonctionnement du cerveau. Aujourd’hui, il est très bien établi que des déficits de connexion entre les neurones sont visibles dans le cortex cérébral chez des patients atteints de schizophrénie. En revanche, en dépit de la présence évidente de déficits dans la structure du cerveau appelée cervelet chez certains patients schizophrènes, son implication dans cette pathologie reste très mal étudiée. Nos résultats récents obtenus sur le modèle murin de schizophrénie, le modèle PCP, nous ont permis d’identifier des déficits au niveau de synapses du cervelet, suite à la modification de l’activité neuronale au cours du développement du cervelet. La présente étude nous aidera à mettre en évidence les molécules des synapses qui sont potentiellement modifiées en fonction de l’activité des neurones et qui pourraient provoquer l’apparition de certaines maladies du cerveau lorsqu’elles ne sont pas présentes en quantité normale.
Procédures
Nous injecterons le NaCl 0.9% (contrôle) ou la Phencyclidine (PCP) en sous-cutané, trois fois à 2 jours d’intervalle pendant la deuxième semaine de vie post-natale. Le poids des souriceaux sera déterminé avant chaque injection afin d'adapter la dose de PCP ou de NaCl 0.9% à injecter. Les animaux sont maintenus immobiles en réalisant un pli de peau au niveau du cou qui permet également l’insertion de l’aiguille la plus fine possible (29G) afin de limiter la douleur. Lors des injections, les souriceaux sont séparés seulement quelques minutes de leur mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Lorsque l'âge voulu est atteint, les souris recevront une injection d'anesthésique local afin de prévenir toute douleur qui pourrait être engendrée par l'injection de la dose léthale d'euthanasiant qui précède la perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Chez l’homme, le PCP à des effets psychotomimétiques tels que l’altération de l’image corporelle, des sentiments d’éloignement et de solitude. Lorsqu’il est injecté chez la souris en néonatal, des altérations cognitives sont visibles chez la souris adulte. Parmi elles, des déficits de mémoire spatiale et un déficit dans la capacité de reconnaissance de nouveaux objets sont observés. Après chaque injection, les souris présentent une période de quelques heures d’hyperactivité qui semble conduire à une difficulté à se nourrir pendant cette période, avec un retard de prise de poids que nous avons établi à moins de 4% par rapport aux contrôles dans notre précédent projet autorisé par le CEEA. Aucun autre effet indésirable n’a été observé sur ces animaux dans notre précédent projet.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédures. Après les injections de PCP ou NaCl 0.9%, les animaux resteront auprès de leur mère dans une cage enrichie (cotons et dôme en carton pour leur nid) jusqu’à l’âge du prélèvement. Pour toutes les études d’électrophysiologie ou protéiques, les animaux seront euthanasiés par décapitation après une sédation à l’isoflurane pour prélèvement du cerveau. Pour l'étude d'histologie, les animaux seront perfusés avec un agent fixateur des tissus pour pouvoir procéder à des analyses en immunohistochimie.
Remplacement
La souris est devenue un modèle de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. Elle permet l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elle permet également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. Il existe actuellement plusieurs modèles de souris pour la schizophrénie, dont le modèle pharmacologique qui nous intéresse : la souris PCP (Phencyclidine). Certaines études fonctionnelles ne peuvent pas être réalisées chez les patients. De plus, il est important d’étudier les réseaux cérébelleux dans le contexte du cerveau puisque le cervelet est connecté à d’autres régions du cerveau dont le cortex qui est déjà connu pour son implication, par exemple, dans la schizophrénie. Une telle étude ne serait donc pas possible en culture cellulaire et nécessite d’avoir recourt à des animaux vivants.
Réduction
Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Afin de tenir compte de la perte potentielle de souriceaux qui peut aller jusqu’à 20% dans un élevage normal, nous estimons avoir besoin de 6 portées par expérience pour avoir de 15 à 21 souris par condition et par timepoint. Les expériences sont stoppées lorsque l’on atteint le nombre minimum, soit 15 animaux par condition. Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Notamment, des compléments environnementaux (dômes en carton, cotons) sont ajoutés afin de permettre à la femelle de créer un meilleur nid et de diminuer tout stress éventuel. De même, les injections sous-cutanées chez le souriceau seront réalisées avec les aiguilles les plus fines possibles (29G) afin de minimiser la douleur. Lors de ces injections, les souriceaux sont séparés de la mère afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux. Les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère afin d’éviter le rejet des souriceaux par la mère. Les animaux sont surveillés quotidiennement jusqu’à leur euthanasie. Si un souriceau présente des signes de souffrance ou de stress dans les jours qui suivent les injections (souriceau hors du nid, pas de lait dans l’estomac indiquant des problèmes importants pour se nourrir, posture anormale…) témoignant d’une altération du bien-être des animaux, l’expérimentateur pourra consulter le personnel compétant de l’animalerie ou le vétérinaire pour avis, afin de mettre en place une médication adaptée si cela est possible. En cas de souffrance ne pouvant être prise en charge, l’animal sera sorti du projet avec une euthanasie immédiate sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie si l’expérimentateur n’est pas joignable.
Choix des espèces
Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elles permettent également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. De plus, le court cycle de reproduction chez la souris et sa petite taille permettent leur maintien de manière relativement simple, tout en gardant une espèce relativement proche de l’homme en termes de développement. L’analyse sera faite à P7, P9, P11 pour les expériences 1 (immunohistologie), 2 (électrophysiologie par multi electrode array) et 3 (analyse de protéines synaptiques) afin de connaître en détail l’effet directe de chaque injection de PCP sur le réseau olivo-cérébelleux. Les analyses des expériences 1, 2 et 3 ainsi que de l’expérience 4 (électrophysiologie sur tranches de cervelet) se feront aussi à P30 qui correspond à l’âge où la connectivité du réseau olivo-cérébelleux est finalisée et commence sa maturation. Cette période chez la souris correspondrait ainsi au début de la période de déclanchement de la pathologie chez l’homme, à savoir à la fin de l’adolescence ou le jeune adulte. Le modèle PCP néonatal a été très largement décrit dans la littérature, et une injection chronique développementale à P7, P9 et P11 a montré des effets comportementaux légers à long terme, cohérents avec des déficits observés chez les sujets schizophrènes. De plus, la période d’induction du modèle est cohérente pour mimer les altérations neuronales produites par des stimulations pendant le troisième trimestre de la grossesse.
Impact d’un traitement chronique avec un modulateur sélectif des récepteurs aux glucocorticoïdes sur un modèle murin transgénique de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont la moitié vigiles au moment de la mise à mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris transgéniques modèles de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une chirurgie pour implanter une pompe délivrant le traitement, des tests comportementaux, puis sont tuées pour analyser le cerveau. Les souris perdant plus de 15 % de leur poids ou montrant prostration ou agressivité sont mises à mort. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de modèles alternatifs validés" et que l'euthanasie est "incontournable".
Objectifs
La maladie d’Alzheimer sous sa forme sporadique est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et le stress. Cependant, le rôle du stress dans cette maladie est très mal connu. Il nous a donc semblé important de caractériser de façon précise l’implication des hormones du stress (les glucocorticoïdes) dans la maladie d'Alzheimer et d’évaluer le potentiel thérapeutique des glucocorticoïdes, grâce à l’utilisation de nouveaux modulateurs sélectifs de leurs récepteurs (sGRm), dans un modèle préclinique de la maladie d’Alzheimer, la souris transgénique J20. Ce projet comprend 2 objectifs principaux: Déterminer l’impact d’un traitement chronique (4 semaines) avec un modulateur sélectif des récepteurs aux glucocorticoïdes sur l’évolution de la pathologie Alzheimer chez des souris J20 ; et d’évaluer l'efficacité de ce traitement chronique à long terme.
Bénéfices attendus
La maladie d’Alzheimer est le résultat d’interactions fortes entre des facteurs génétiques et environnementaux. La cause primaire et les mécanismes sous-jacents au développement de la maladie d'Alzheimer restent à ce jour inconnus, mais un lien important semble exister entre la maladie d'Alzheimer et l’hypersécrétion précoce des hormones du stress ou glucocorticoïdes. Cependant, le rôle de ces hormones, ainsi que leur potentiel thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer reste très méconnu. L’objectif de cette étude sera donc d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une nouvelle famille de molécules très sélectives modulant l’activité des récepteurs aux glucocorticoïdes. Si l’efficacité de ces modulateurs sélectifs est démontrée, une étude clinique chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer pourra être envisagée très rapidement, dans la mesure où les tests de toxicité chez l’homme ont été validés sur cette famille de composés et que l’une de ces molécules est déjà en clinique (Phase II) dans le cadre d’une autre pathologie associée aux stress.
Procédures
L’ensemble des animaux (160 animaux) seront soumis à une procédure chirurgicale pour la mise en place de la pompe osmotique (durée 5 minutes sous anesthésie gazeuse), à des tests comportementaux et enfin seront mis à mort pour l’analyse des tissus cérébraux. Mise à mort sur animaux anesthésiés (80 animaux) ou vigiles (80 animaux). Les animaux seront suivis entre 4 (80 animaux) et 8 semaines (80 animaux).
Impact sur les animaux
L’incision nécessaire à l’introduction de la pompe osmotique délivrant le traitement peut entrainer un inconfort temporaire (dans les 24h suivant la chirurgie), et induire un grattage plus important au niveau de la cicatrice. Afin d'éviter au maximum cet effet lié à la cicatrisation, l’incision est réalisée au niveau de la nuque de l’animal, une zone moins accessible au grattage.
Devenir
Dans la mesure où il sera nécessaire d’étudier l’impact des différents traitements sur le cerveau, l’euthanasie des souris est incontournable.
Remplacement
De manière très générale, il est aujourd’hui très difficile en neurosciences d’étudier le fonctionnement du cerveaux sur des modèles simplifiés et donc de remplacer l’étude sur l’animal dans sa globalité. En effet, il n'existe pas de modèles alternatifs validés pour étudier la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans la maladie d’Alzheimer.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé pour ne pas compromettre les objectifs du projet. Le nombre d'animaux est basé sur une connaissance approfondie des modèles et de l'expérience acquise par notre équipe. Le nombre d'animaux a été déterminé par un logiciel de statistique.
Raffinement
Afin de minimiser les effets du stress, mais également de contrôler l’état général des animaux, l’animalier, et/ou l’expérimentateur, manipuleront quotidiennement les animaux et observeront le comportement général de l’animal, ainsi que leur apparence. Toute observation anormale (comportement, poids, pelage, plaie,…) sera transmise à l’expérimentateur afin d’être traitée dans les plus brefs délais et sera noté dans un tableau de suivi expérimental. Un animal sera euthanasié s’il présente, une perte de poids > 15%, une attitude inhabituelle traduisant un mal être (prostration, agressivité...), ou l’apparition de toute altération de l’état général (altération du pelage, tumeur, excroissance, prolapsus…).
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix au niveau international pour l’étude de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer. Ces études chez l’animal vigile sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements potentiels. De plus, l'utilisation d'animaux transgéniques (modèle de la maladie d’Alzheimer) justifie également le choix de cette espèce. Nous allons réaliser le traitement chronique sur le modèle souris Alzheimer entre 6 et 9 mois. C’est-à-dire à un âge où ces souris présentent des déficits comportementaux, et une augmentation des différents marqueurs biochimiques associés à la physiopathologie Alzheimer, mais aussi une hyperactivité de l’axe du stress (augmentation des taux sanguins en glucocorticoïdes).
La thermoception chez le nouveau-né murin, un biomarqueur potentiel des troubles du spectre autistique
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
560 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les souriceaux, séparés de leur mère, subissent une ouverture du crâne pour des enregistrements du cerveau, le porteur anticipant que certains se réveilleront pendant l'opération ou en mourront. Ils ne sont pas rendus à leur mère, qui risquerait de les délaisser, et sont tués pour prélever le cerveau. Le projet cherche un éventuel biomarqueur précoce de l'autisme et le porteur affirme que ces mesures "ne peuvent pas être envisagées" hors de "l'organisme entier".
Objectifs
L’objectif de notre projet actuel et pour les 4 années à venir est de démontrer l’existence de potentiels évoqués dans le cortex somatosensoriel à la suite d’un stimulus thermique périphérique oro-facial frais non-nociceptif. Il s’agira donc de conduire chez le nouveau-né des enregistrements en imagerie et en électrophysiologie in-vivo combiné à des traitements pharmacologiques appliqués en topique afin de vérifier que l’activité observée provient bien d’une activation par le frais des thermorécepteurs périphériques et notamment des TRPM8.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’apporter des réponses à différents niveaux : Du point de vue fondamentale il va permettre de donner des indications sur la présence ou non d’une intégration corticale de la sensibilité thermique aux températures fraiches. Si des activités corticales sont mesurées, nous pourrons également obtenir des résultats quant à la régionalisation topique du cortex somatosensoriel concernant cette sensibilité thermique. En faisant nos études sur les deux premières semaines de vies, nous allons également savoir s’il y a une modification du codage de l’information de la sensibilité thermique au sein de cette aire. Du point de vue plus translationnel, l’étude sur un modèle murin autistique va nous permettre d’explorer plus précisément au niveau cortical les atypies sensoriels. Les traitements avec l’ocytocine vont nous permettre de vérifier le site d’action périphérique et/ou central de l’ocytocine. Si des altérations des potentiels évoqués en réponse à des stimuli au frais sont démontrés chez les souriceaux autistes, plusieurs perspectives peuvent être alors engagées pour essayer de savoir si cette atypie de thermosensibilité est une caractéristique partagée chez d’autres modèles autistiques. On pourrait alors envisager pour cette atypie un potentiel rôle de biomarqueur précoce de l’autisme. Les traitements à l’ocytocine nous permettront de vérifier son action de modulateur de la sensibilité thermique et d’envisager de nouvelles pistes thérapeutiques pour traiter les atypies sensorielles.
Procédures
- procédures chirurgicales: craniotomie pour l'enregistrement in vivo pour tous les animaux. Durée de l'intervention 30-45 min - Prélèvements de cerveaux après anesthésie et perfusion intracardiaque pour tous les animaux de la procédure 2. Durée de l'intervention 20-30 min
Impact sur les animaux
Les animaux pourront être stressés par leur séparation avec leur mère avant l’opération. On s’attend à ce qu’une partie des animaux notamment pour les stades les plus précoce se réveillent au cours de la chirurgie due à des problèmes de maintien de l’anesthésie à l’isoflurane ou même décèdent durant la chirurgie par surdose d’anesthésique. On peut s’attendre également à avoir des animaux avec des états post-opératoire mauvais marqué par une hypotonie, une absence de réaction, une souffrance trop importante avec des mouvements excessifs. Dans les cas les plus extrême, un décès à la suite de la chirurgie peut être attendu. Durant les enregistrements in vivo on peut constater des signes de mal-être des animaux tels une agitation, une tachycardie, une hyperventilation des vocalisations excessives ou à l’inverse une totale absence de réaction.
Devenir
L'ensemble des animaux seront sacrifiés après chaque procédure. Ces procédures ne permettent pas de remettre les souriceaux avec leur mère sous risque que cette dernière les délaisse ou les blaisse. Pour éviter ces souffrances des souriceaux, il convient de les euthanasier.
Remplacement
Les mesures d’activité cérébrale et potentiels évoqués à la suite d’un stimulus thermique périphérique ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, ces connaissances fondamentales ne pouvant pas être transposées sur des modèles ex-vivo ou organoïdes, le remplacement n’est donc pas possible
Réduction
Un plan d’expérience sera systématique rédigé avant les expérimentations dans un souci permanent d’optimisation du nombre d’animaux. Aucune étude antérieure n’a été menée sur ce projet auparavant. Utilisation de pharmacologie au lieu de prendre différentes lignées de souris Utilisation de tests statistiques non-paramétriques afin de faire diminuer le nombre d’animaux utilisé dans cette étude L'enregistrement de plusieurs centaines de neurones par animal, permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Expérience faite sur trois stade clés pour éviter de faire une étude sur tous les stades des deux premières semaines de vie dans le but de diminuer le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les expériences seront conduites sur un seul modèle animal. Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Une attention particulière sera portée aux nouveau-nés au cours des chirurgies pour réduire douleur et stress (anesthésie générale et locale, tapis chauffant, suivi strict post-chirurgie des nouveau-nés). Les mères et leur nouveau-nés opérés ou non seront hébergés dans des armoires ventilées, sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids. Afin de réduire la souffrance des traitements pharmacologiques, ceux-ci seront appliqués de manière non-invasive soit par administration topique d’agonistes/antagonistes des TRMP8 soit par dépôt dans la fenêtre crânienne d’agonistes ocytocinergiques. Les stimuli thermiques seront réalisés à des température fraiches et non froides pour éviter tout test douloureux. Les expériences seront conduites uniquement en situation aigües et non chroniques.
Choix des espèces
L’étude des réseaux corticaux, par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme. De plus la réalisation de l’étude sur un modèle autistique doit passer par une mutation génétique, mutation qui n’existe, pour ce modèle Magel2, que chez la souris. C’est dans ce contexte que se situent nos travaux dont l’objectif est d'étudier la mise en place des activités corticales en lien avec un stimulus thermique frais non-nociceptif de l'échelle cellulaire et à l’échelle du réseau. Les enregistrements in vivo (imagerie et électrophysiologie) seront étudiés durant les deux premières semaines de vie aux stades suivant : P2 : un stade précoce au cours duquel nous avons identifié des troubles sensori-moteurs dans nos études précédentes. P7 : un stade intermédiaire où le système ocytocinergique est en plein développement. P15 : un stade où le système ocytocinergique est complètement mature
Manipulation transgénique des taux d’acides gras polyinsaturés dans des populations neuronales spécifiques: conséquences sur la prise de décision
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 240 un niveau modéré. Elles sont soumises pendant trois à quatre semaines à des tâches de conditionnement opérant sous privation alimentaire, maintenues à 90 % de leur poids, et une partie subit une chirurgie du cerveau pour implanter des capteurs. Elles sont ensuite tuées par décapitation ou perfusion pour prélever le tissu cérébral. Le seul bénéfice annoncé est de comprendre comment le statut cérébral en acides gras influence la prise de décision, sans application décrite.
Objectifs
Le but de ce projet est de déterminer quelles sont les populations neuronales au sein du système cérébral de la récompense et de la prise de décision (système mésocorticolimbique) qui sont vulnérables à une déficience en acides gras polyinsaturés (AGPI) de type n-3. Pour cela, nous utiliserons une approche transgénique qui permettra de restaurer les taux d'AGPI dans des populations neuronales spécifiques en situation de carence générale en AGPI n-3. Nous testerons les processus de prise de décision en utilisant des tâches comportementales en conditionnement opérant.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de comprendre comment le statut cérébral en AGPI influence les processus de prise de décision.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire. Une partie des animaux subira des procédures chirurgicales (1 fois, durée de 1h à 1h30) afin d'exprimer des senseurs permettant d'enregistrer l'activité de systèmes neuronaux.
Impact sur les animaux
Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum). Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet, soit par décapitation soit pas perfusion intracardiaque afin de récupérer le tissu cérébral pour des analyses biochimiques et histologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.
Réduction
Nous anticipons l'utilisation de 840 animaux. Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons une stratégie de croisements génétiques qui permettra l'utilisation de tous les animaux de la descendance et comparerons les mâles et les femelles. Du fait de cette stratégie, tous les animaux (génotypes et sexes) issus de nos croisements seront utilisés.
Raffinement
Tous les efforts seront faits pour réduire la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en cages collectives et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés et les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille de scores. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera sacrifié dans les 48h.
Choix des espèces
Ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. Les animaux expérimentaux seront utilisés à l'âge adulte (>8 semaines) puisque le projet vise à évaluer les conséquences fonctionnelles des manipulations en AGPI sur le cerveau mature.
Développement d’un modèle murin du trouble comportemental en sommeil paradoxal, une parasomnie prodromique de la maladie de Parkinson : impact de l’âge sur les processus dégénératifs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
52 souris âgées de 15 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections dans le cerveau d'un facteur pathogène et, pour une partie, la pose d'électrodes puis un isolement une semaine sur deux pour enregistrer leur sommeil pendant plusieurs mois. Leur cerveau est ensuite prélevé pour analyse après la mort. Le porteur affirme que la souris reste "incontournable" et présente le projet comme visant à valider un premier modèle animal évolutif de la maladie de Parkinson.
Objectifs
La maladie de Parkinson (MP) est connue pour ses symptômes moteurs dus une dégénérescence neuronale bien identifiée. D’autres symptômes de la MP sont aujourd’hui caractérisés comme le trouble du comportement en sommeil paradoxal (TCSP). Pendant le sommeil paradoxal (SP), nous sommes inconscients et naturellement paralysés. Les patients TCSP (âgés d’une cinquantaine d’années) perdent cette paralysie et extériorisent alors leurs rêves sous forme de mouvements incontrôlés dangereux. Le TCSP est le meilleur marqueur diagnostic à 10 ans de la MP, ces deux pathologies étant donc intimement liées. Sur la base de nos travaux récents chez les rongeurs, nous avons formulé une hypothèse sur ces mécanismes délétères communs aux deux pathologies, affectant d’abord les neurones controlant le sommeil, puis au cours du vieillissement ceux atteints dans la MP. Le délai entre l’apparition du TCSP et de la MP refléterait la lente propagation des processus dégénératifs à travers le cerveau au cours du vieillissement. Notre objectif est de tester cette hypothèse en tentant de reproduire chez la souris âgée ces mêmes processus pathologiques affectant le SP puis d’observer si un syndrome parkinsonien se develope avec le temps, comme observé chez les patients MP. Ce projet de recherche préclinique s’articule autours de deux volets experimentaux complémentaires et menés en parallèle, l’un anatomo-pathologique (neurones dégénérés), l’autre physiologique (modification du sommeil) et comportemental (comportements de type parkinsonien), permettant de corréler les différents evénements pathologiques et leur évolution au cours du vieillissement.
Bénéfices attendus
Malgré d’intenses recherches, un modèle animal reproduisant fidèlement au cours du vieillissement la maladie de Parkinson (MP) fait encore défaut, en particulier au cours de la période pendant laquelle la pathologie s’installe insidieusement dans le cerveau. L’un des biomarqueurs pré-symptomatiques de la MP reconnu aujourd’hui est une maladie du sommeil (Trouble comportemental en sommeil paradoxal) qui anticipe la MP d’une dizaine d’années. Il y a donc un intérêt à comprendre les mécanismes pathologiques liant le TCSP et la MP. Concrètement, ce projet scientifique ambitieux vise à valider le premier modèle animal évolutif dont la puissance résiderait dans la reproduction chronologique des évènements pathologiques prenant place, insidieusement, pendant la phase pré-symptomatique de la MP. Cet outil ouvrirait des perspectives pour l’élaboration de stratégies neuroprotectrices pour anticiper précocement l’évolution aujourd’hui encore irréversible vers la MP.
Procédures
Pour ce projet de recherche préclinique, 2 procédures expérimentales sont prévues nécessitant l’utilisation d’un total de 52 souris âgées de 15 mois. Procédure 1 (n = 20 souris, 2 lots de 13 et 7 individus, respectivement): les souris subiront sous anesthésie générale controlée une intervention chirurgicale consistant en deux injections intracérébrales du facteur pathogène (ou contrôle) responsable de la MP, suivi de l'implantation d'électrodes à demeure permettant l'enregistrement chronique du sommeil. Les souris seront isolées une semaine sur 2 en chambre d'enregistrement, dans un baril de plexiglass transparent de 25cm de diamètre contenant enrichissement, eau et nourriture ad libitum et filmées 24h/24h. En fin de procédure (12 mois maximum apès la chirurgie selon l’évolution de leur état général), les souris subiront une anesthésie chirurgicale profonde sans réveil pour l’analyse post-mortem des cerveaux. Procédure 2 (n = 32 souris, 4 lots, n = 8 individus chacun): les souris subiront sous anesthésie générale controlée une intervention chirurgicale consistant en une injection intracérébrale du facteur pathogène responsable de la MP. Selon les lots experimentaux, les souris ainsi traitées subiront 30, 60, 90 ou 180 jours après la chirurgie une anesthésie chirurgicale profonde sans réveil pour l’analyse post-mortem des cerveaux afin de corréler l’évolution des modifications anatomo-pathologiques aux effets physiologiques observés et au vieillissement.
Impact sur les animaux
Procédure experimentale n° 1 de degré de sévérité modéré: les souris seront soumises à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour deux injections intracérébrales du facteur pathogène (ou contrôle) responsable de la MP. Des électrodes permettant l’enregistrement en continu de l’activité du cerveau pendant le sommeil seront posées à demeure. Pendant cette intervention d’une durée de 90 min, toute douleur sera couverte par l’administration générale et locale d’analgésiques avant, pendant et après la chirurgie. Une légère perte de poids est attendue (-5%) avec un retour au poids initial en 48h. Pendant la semaine de récupération, les souris seront 2 par cage avec un séparateur grillagé de sorte qu’elles puissent interagir tout en limitant les possibilités d’agression et de détérioration des électrodes. Elles seront isolées une semaine sur 2 en caisson individuel pour l’enregistrement de leur sommeil et de leurs comportements pour toute la durée de la procédure. Nous attendons l’apparition d’un TCSP sans savoir par avance si/quand il apparaîtra, ce délai constituant de fait l’objectif de l’étude. Nous serons quotidiennement vigilants pour détecter dès que possible l’apparition de signes comportementaux et physiologiques indicateurs du TCSP, de modifications quantitatives et qualitative de leurs sommeil et de leurs comportements. En fin de procedure, elles subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde sans réveil. Procédure expérimentale n°2 de degré de sévérité modéré: les souris seront soumises à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour l’injection intracérébrale du facteur pathogène responsable de la MP. Pendant cette intervention d’une durée de 60 minutes, toute douleur sera couverte par l’administration générale et locale d’analgésiques avant, pendant et après la chirurgie. Une légère perte de poids est attendue (- 5%) avec un retour à la normale en 48h. Les souris seront alors placées à 4 par cage pour favoriser les interactions sociales. Elles subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde sans réveil après 30, 60, 90 et 180 jours de survie apres la chirurgie pour prélever leur cerveau. N’attendant pas de dérèglement de leur sommeil ni de leur comportement, elles seront cependant régulièrement observées pour détecter de légères dégradations de leur état général, possible au cours du vieillissement.
Devenir
A l'issue des procédures 1 et 2, les souris subiront une anesthésie générale profonde et sans réveil pour nous permettre de récupérer leur cerveau dans les meilleures conditions de préservation des tissus neuronaux et d’analyser ainsi l’évolution des phénomènes dégénératifs cérébraux au cours du vieillissement (selon la durée de survie après la chirurgie initiale) et de les corréler avec les modifications de leur sommeil et de leurs comportements. Les données anatomiques ainsi obtenues chez des souris âgées seront comparées à celles obtenues chez des souris jeunes avec les mêmes paradigmes expérimentaux, permettant de mieux comprendre ce qui se passe pendant le vieillissement.
Remplacement
L’intérêt d’étudier le TCSP réside dans son caractère prédictif de la MP. Il est impossible d’aborder ces questions chez l’homme sain ou malade car aucune méthode d’imagerie cérébrale spécifique de la MP n’est encore disponible à l’hôpital. Des contrôles anatomo-pathologiques sont souvent réalisés chez des patients décédés pour confirmer le diagnostic mais ils ne permettent pas d’étudier l’origine de la maladie. Par ailleurs, des animaux moins évolués que les mammifères (drosophile, poisson rouge, vers C. elegans etc.) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité/inactivité) mais ils ne possèdent de sommeil paradoxal et la complexité de leur cerveau n’est en rien comparable avec celle de l’Homme. D’autres méthodes prometteuses se développent actuellement comme la modélisation in silico, l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces et depuis peu les organoïdes cérébraux mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles à la souris pour aborder des mécanismes pathologiques complexes responsables de ces pathologies évolutives et neurodégénératives. Aussi, l’utilisation de la souris est encore aujourd’hui incontournable et c’est un animal parfaitement adapté aux études physiologiques et comportementales de très longue durée prévues dans ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux (n=52) nécessaire pour cette étude est légitimé par son organisation en 2 procédures expérimentales (physiologie/comportement et anatomo-pathologie) conduites en parallèle. La taille de chaque lot a été calculée, optimisée et réduite à son minimum sur la base de nos travaux antérieurs mettant en œuvre les mêmes techniques expérimentales chez la souris. Ces calculs tiennent compte, sans compromettre la reproductibilité et la significativité statistique des données expérimentales (petits échantillons): 1) des « erreurs et échecs » possibles à chaque étape des procédures expérimentales ; 2) la variabilité interindividuelle des paramètres physiologiques considérés ; et 3) la dégradation des signaux au cours du temps (plusieurs mois de suivi longitudinal) pouvant rendre leur interprétation aléatoire. Chaque animal ne sera soumis qu’à une seule procédure expérimentale se terminant par une anesthésie sans réveil avec prélèvement du cerveau pour analyses post-mortem, éliminant toute possibilité de réutilisation. En revanche, le nombre de lots, et donc celui des souris, pourra être sensiblement réduit selon les résultats obtenus, en particulier pour la procédure expérimentale n°2. Ainsi, les lots prévoyant des temps de survie post-traitement de longue durée seront abandonnés si des indices de TCSP et de perturbations locomotrices apparaissent plus précocement.
Raffinement
Pour minimiser le stress individuel par le maintien d’interactions sociales quotidiennes, les souris seront hébergées dès leur arrivé dans notre animalerie en groupes de 4 individus par cage jusqu’à ce qu’elles atteignent l’âge de 15 mois, marquant alors le début des deux procédures expérimentales. L’agressivité peut augmenter avec le temps chez certains mâles, nous obligeant alors à les séparer du groupe. Le cas échéant, ils seront placés dans une cage double munie d’un séparateur grillagé afin que les deux souris puissent interagir mais sans contact direct. De plus, des enrichissements seront systématiquement mis en place dans les cages pour favoriser le bien-être des animaux pendant toute la durée des procédures. Après l’étape de chirurgie sous anesthésie générale, l’état de santé des animaux sera suivi régulièrement jusqu’à la fin des procédures, une attention particulière étant d’abord portée à la récupération post-opératoire (ajout d’AINS si nécessaire, suivi du poids, de la mobilité et du comportement). Nous utiliserons donc une grille d’évaluation de différents paramètres pour suivre leur retour objectif à des valeurs normales pendant la semaine de récupération. Une fois les procédures débutées, notre préoccupation sera de suivre quotidiennement l’évolution de plusieurs paramètres physiologiques et locomoteurs pertinents pour notre étude (qualité et quantité du sommeil, locomotion, exploration, etc.) pour détecter rapidement l’apparition de signes caractéristiques du TCSP et suivre de près la dégradation de l’état de santé général, aussi lié au vieillissement naturel. Ces modifications constitueront dès lors le point limite de nos procédures expérimentales avec mise à mort sans délai, pour prévenir l’apparition d’une éventuelle souffrance et d’une dégradation de leur autonomie, tout en établissant la preuve de concept recherchée dans cette étude.
Choix des espèces
Pour plusieurs raisons, nous avons choisi de travailler avec des souris âgées de 15 mois au début des procédures expérimentales. A cet âge-là, les souris sont à la moitié de leur espérance de vie, en pleine santé et sont matures sur le plan cérébral et locomoteur avec un cycle veille-sommeil stabilisé, efficace et consolidé. C’est à cet âge moyen qu’apparaît le TCSP chez les patients, précurseur de la MP. Le sommeil paradoxal (SP) est spécifique aux mammifères incluant la souris et l’Homme. Des animaux de niveau phylogénétique inférieur (mouche, poisson, vers etc) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité / inactivité) mais ils n’ont pas de SP et la complexité de leur système nerveux n’est pas comparable à celle des mammifères. Ces modèles animaux ne sont donc pas des alternatives à la souris pour étudier le sommeil et développer des modèles précliniques de ses principales pathologies. Nos travaux récents ont identifié chez la souris les structures cérébrales ciblées dans le TCSP, leur organisation anatomique étant très similaire à celle du cerveau humain. Enfin, c’est une espèce animale plus adaptée que le rat aux études physiologiques et comportementales de longue durée (pas d’augmentation significative du poids et du volume corporel) facilitant ainsi leur manipulation et hébergement sur le long terme et raccourcissant la durée des procédures du fait de leur plus courte espérance de vie (2,5 ans maximum).
Mesure de biomarqueurs d’imagerie cérébrale en IRM haut champ dans des modèles murins de sclérose en plaques
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 10 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 30 un niveau modéré. Selon le modèle, elles subissent une chirurgie intracrânienne pour détériorer localement la myéline ou une induction d'encéphalomyélite provoquant une paralysie progressive des membres, avant des séances d'IRM sous anesthésie. Elles sont ensuite tuées à différents temps pour des analyses histologiques. Le porteur affirme que l'étude de la pathologie "ne peut actuellement pas être remplacée" par des systèmes in vitro et que l'animal vivant est "nécessaire" pour valider un biomarqueur avant la clinique.
Objectifs
L'objectif de ce projet est d’évaluer et de mettre au point des mesures par imagerie de résonance magnétique, technique non invasive, à très haut champ magnétique (11,7T) pour le suivi des atteintes de la gaine protectrice des neurones (la myéline) telles celles que l’on observe chez les patients atteints de sclérose en plaques (maladie neurologique). Deux modèles de souris présentant des lésions dans la gaine de myéline seront utilisés: 1) le modèle LPC pour lequel la lésion est localisée 2) le modèle EAE pour lequel les lésions sont plus petites et réparties dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet va contribuer à établir de nouvelles méthodes de mesure par imagerie pour le suivi de la dynamique de la détérioration/reconstitution de la gaine de myéline –protectrice des neurones- chez les sujets atteints de sclérose en plaques au cours de la maladie. Ces phénomènes doivent être davantage explorée, à un moment où des thérapies innovantes pour aider à la reconstitution de la gaine de myéline doivent être évaluées cliniquement. De plus, la mise au point de biomarqueurs d’imagerie non invasive réalisée dans ce projet représente un bénéfice pour les futures études thérapeutiques sur le petit animal puisque l’imagerie permettra le suivi du même animal et donc de réduire le nombre d’animaux.
Procédures
Chirurgie intracranienne pour détériorer localement la gaine de myéline des neurones pour mimer la sclérose en plaque. Une seule chirurgie sur l'animale. Pas de prélèvement sur animal vigile.
Impact sur les animaux
La démyélinisation focale au LPC nécessite une chirurgie (injection stéréotaxique, durée < 1h)et n’engendre pas de signes cliniques persistents. Seule la cicatrisation post-chirugie est à surveiller et seuls les animaux ayant complètement récupéré et cicatrisé seront éligibles au suivi par IRM haut-champ, réalisé sous anesthésie générale (4 sessions de 2 h maximum réalisées sur 3 mois). Pour le modèle EAE, un altération de l’état général de l’animal est attendu avec un score clinique maximal généralement entre 15 et 25 jours après l’induction de l’EAE, suivi d’unerémission partielle. Les animaux subissent un ensemble d’étapes de classe de gravité légère (injections i.v.) à moyenne (symptômes cliniques de l’EAE) et il existe une gradation des symptômes allant de la queue molle; au réflexe de redressement avec facultés affaiblies et parésie d'un membre à la paralysie des membres postérieurs et/ou antérieurs. La procédure complète est de classe de gravité moyenne. Il est nécessaire de préciser que la faiblesse ou la paralysie des membres n’entraîne pas de douleur en soi, mais plutôt une gêne pour l’animal dans ses déplacements, à l’instar de la pathologie humaine.
Devenir
Ils seront mis à mort à différents temps en vue de réaliser des mesures histologiques post-mortem.
Remplacement
À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables. Nous utiliserons des modèles de pathologies très bien décrits dans la littérature, ce qui permettra un suivi précis de la sévérité de la maladie. L’animal vivant est nécessaire pour valider un biomarqueur d’imagerie avant som implémentation en clinique, dans une démarche de recherche translationnelle
Réduction
Pour chacune des procédures expérimentales, le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et interprétables, en tenant compte de la variabilité biologiques des modèles animaux. Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet est de 40. Le suivi longitudinal effectué en imagerie permet d’obtenir jusqu’à 4 points de mesure par animal pour suivre les phases de démyénisation et remyélinisation sans mise à mort intermédiaire des groupes supplémentaires d’animaux.
Raffinement
Les points limites qui permettront d'arrêter le protocole sont les suivants: cicatrisation de la plaie crânienne, changement de poids corporel , apparence physique i.e. pelage, posture et comportement (vocalisations non sollicitées, automutilation, animal très agité ou immobile). L'arret des souffrances si elles sont constatées se fera par traitement antalgique ou par euthanasie des animaux concernés.
Choix des espèces
L’IRM haut champ ne peut accueillir que des petits animaux de type rongeur. Nous avons réalisé une première étude sur rat du fait d’un cerveau plus grand que la souris ce qui a facilité la mise en œuvre des techniques IRM avec des volumes à explorer plus gros. L’objectif étant d’étudier les pathologies cérébrales, les procédures de cette demande se feront chez la souris afin d’étudier notamment le modèle de sclérose en plaques EAE modèle pour lequel les protocoles expérimentaux sont bien établis et permettent de reproduire fidèlement les symptômes de la sclérose en plaques. Animaux adultes ayant un développement cérébral achevé (7-10 semaines).