Système nerveux

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, elles reçoivent une injection d'un virus dans le cerveau, puis sont évaluées à quatre mois par des tests comportementaux, l'open field et le labyrinthe en Y, avant perfusion intracardiaque et prélèvement du cerveau. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des traitements et décrit les manipulations comportementales comme indolores. Il juge encore "indispensable" le recours à l'animal, les modèles cellulaires iPS ou CRISPR n'offrant selon lui que des informations partielles.

Objectifs

Ce projet répond à des interrogations scientifiques qui sont essentielles au développement de nouvelles stratégies anti-Alzheimer innovantes ciblant MT5-MMP. Les objectifs du projet sont les suivants :

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet nous apportera: A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux impliquant MT5-MMP dans : 1) le métabolisme de l’APP et plus précisément celui de ses fragments neurotoxiques, C99 et Abêta ; 2) le métabolisme de Tau ; et 3) les processus inflammatoires dans le cadre de la MA. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités de MT5-MMP qui pourraient apporter des solutions chez l’homme.

Procédures

Le projet est organisé sur une seule procédure car les animaux de départ (nouveau-nés au stade P1) seront utilisés jusqu'à la fin de l'expérimentation (5 mois). La procédure est organisée en 4 étapes : 1) injection intracérébroventriculaire d'AAV9 dans des souris nouveau-nées. Nous injecterons par voie intracérébroventriculaire (ICV) des souris nouveaux-nées 5xFAD et leurs contrôles sauvages à P1 avec des AAV9 qui codent pour différents variants de la protéase MT5-MMP. Cette étape d'injection est d'une durée de 30 sec. 2) Génotypage des nouveaux-nés. Une biopsie de la queue (< 1 mm) est réalisée et les petits sont remis avec leur mère. Le génotypage permettra l'identification WT (sauvages) ou 5xFAD (Alzheimer). Cette étape est réalisée dans la durée de l'anesthésie. 3) Analyse comportementale. Quatre mois après l’injection, les capacités cognitives des souris seront évaluées dans des tests comportementaux, notamment l’open field et le labyrinthe en Y. La durée des manipulations dans l'open field est de 2x5min pendant 5 jours, et la durée des manipulations dans le labyrinthe est de 8min pendant 5 jours. 4) Perfusion intracadiaque et prélèvements. La durée de cette étape est d'environ 15min. Suite aux tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés, leurs cerveaux récupérés pour des analyses histopathologiques ou microdisséqués pour des analyses biochimiques. Ces analyses porteront sur différents marqueurs de la pathologie, notamment en relation avec le métabolisme de l’APP et de ses fragments les plus toxiques (e.g., C99, peptide Abêta), l’accumulation de la protéine tau, ainsi que sur des marqueurs cellulaires et moléculaires de la neuroinflammation.

Impact sur les animaux

Il n’y pas d’effets indésirables attendus sur les animaux liés à l’utilisation des traitements proposés. Les interventions telles que l'injection ICV chez le jeune et la biopsie de la queue sont réalisés sous anesthésie. En ce qui concerne le comportement, il s'agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique en injection IP d’un mélange Kétamine (150 mg/kg) et Xylazine (15 mg/kg) suivi d'une perfusion intracardiaque. La mort survient par les effets du surdosage anesthésique.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants (cellules iPS et système CRISPR/Cas9), ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, pour compléter nos observations in vivo (compréhension des effets bénéfiques de l’absence de MT5-MMP), nous avons développé des approches expérimentales in vitro comme des cultures primaires ou des cultures HEK ou iPS, avec des sous-expression/sur-expression de MT5-MMP, en parallèle du développement de modulateurs d’activité de MT5-MMP. Nos résultats obtenus doivent à présent être confortés in vivo. L’efficacité de futurs traitements originaux anti-MT5-MMP dans la MA doit se traduire par une amélioration biologique/histologique et comportementale dans des modèles murins, notamment le modèle 5xFAD. Ces souris 5xFAD représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie car elles développent rapidement une MA expérimentale (dès 2 mois), laquelle est très similaire à celle observée chez l’homme, comparée à la MA développée par d’autres modèles des souris (9-12 mois).

Réduction

Le nombre de lots expérimentaux et d'animaux au total est décrit en détail au paragraphe 4.2. - WT (mâles+ femelles)n= 6 groupes x32 souris = 192 - 5xFAD (mâles+ femelles)n= 6 groupes x32 souris = 192 Soit 384 animaux Ce nombre d'animaux a été réduit au minimum pour pouvoir être validé d’un point de vue statistique notamment pour les études comportementales, d'autant que nous travaillons sur des souris issues de plusieurs reproductions et prend également en compte un certain nombre d’échec dès l’étape d’injection des AAV à P1.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et une attention particulière sera accordée aux procédures de raffinement. Les souris disposeront de nids végétaux à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l'environnement et matériau de nidification afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité tout en procurant un sentiment de sécurité chez l'animal.

Choix des espèces

Les souris constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que, comme modèle pré-clinique pour tester les effets in vivo de molécules thérapeutiques potentielles. Pour étudier l’impact de MT5-MMP sur les marques de la pathologie nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées (5xFAD) exprimant les gènes humains codant pour l’APP et la PSEN1 (préséniline 1) portant, respectivement, 3 et 2 mutations familiales de la MA, d’où leur nom 5xFAD. Toutes les souches possèdent le même fond génétique C57/BL6 et seront générées à l'animalerie. Les animaux seront utilisés à deux stades : 1) Stade post-natal P1, dans lequel les injections d’AAVs seront faites, permettant ainsi l’expression des variants de MT5-MMP dès les premiers jours de vie post-natale. 2) Stade adulte à l’âge de 4 et 5 mois. Cet âge représente une phase précoce de la maladie dans laquelle on peut déjà observer des marques évidentes de la pathologie, aussi bien au niveau comportemental que biochimique et histopathologique.

289 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes cérébrales, puis des inhalations répétées de solvants organiques comme le toluène en chambre, avec des tests comportementaux et un test du nystagmus post-rotatoire. Le porteur indique que de fortes concentrations peuvent provoquer troubles de l'équilibre et tremblements, censés disparaître dans l'heure suivant l'exposition. Il rattache le projet à la fixation de valeurs limites d'exposition des salariés et écarte le remplacement, l'électrocorticographie n'étant pas réalisable in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la mise en place d'une méthode de suivi en temps réel de l’action des solvants organiques sur le cerveau par une mesure de l’activité cérébrale. Cette méthode d’enregistrement sans fil permettra de mesurer ces effets chez des animaux vigiles et libres de leurs mouvements lors de l’inhalation des solvants dans des chambres à atmosphère contrôlée. En outre, divers tests comportementaux seront réalisés en fin d’exposition afin de mettre en relation les modifications de l’activité du cerveau avec d’éventuelles déficiences motrices et/ou sensorielles. Ceci permettra d’avoir une vue d’ensemble sur les effets neurotoxiques aigus d’une exposition aux solvants organiques volatils.

Bénéfices attendus

L’e xposition des salariés à des solvants peut conduire à une dépression du système nerveux central et mener à une altération de leurs performances psychomotrices. L’exposition aux solvants peut donc être responsable de d’accidents du travail. Ainsi, afin de protéger la santé des salariés et limiter l’exposition de ces derniers à de fortes doses de solvant, des valeurs limites d’exposition ont été mise en place. Néanmoins, les relations doses/réponses des solvants sur l’activité cérébrale sont mal connues. Ce projet vise à proposer une méthode de mesure objective de l’effet des solvants sur le système nerveux central et d’améliorer les connaisances sur les risques liés aux expositions aiguës aux solvants organiques.

Procédures

Procédure 1 : Etude pilote (N=16) : N=12 : Chirurgie (1h) ; Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; inhalation « toluène » + électrocorticographie (4 x 8h) ; mise à mort et prélèvement de tissus N=4 : Mise à mort et prélèvement de tissus Procédure 2 : Mesure de l'activité cérébrale par électrocorticographie et analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=56) N=14 par dose de solvant : Chirurgie (1h) ; [Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; Comportement (30min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 3 : Mesure du nystagmus post-rotatoire suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : Chirurgie (45min) ; [Inhalation « contrôle » (4 x 8h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 4 : Analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : [Inhalation « contrôle » (4 x 8h); Comportement (30min); Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 5 : Prélèvement sanguin et de tissus neuronaux suite à l’exposition aux solvants (N=96) N=8 par temps de prélèvement (temps 1 : à la fin du 4ème jour des périodes « solvant » ; temps 2 : à la fin de la semaine post-exposition). Les animaux seront mis à mort par prélèvement final du sang et du cerveau (5 minutes maximum, sous anésthésie profonde). Dans le cas où les quantités de solvant dans le sang ou le cerveau sont égales à zéro après une semaine de récupération lors de la phase expérimentale 1, le nombre de rats mis à mort au temps 2 pourra être réduit à n=4 pour les expérimentations suivantes.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant. Ils pourront présenter des signes cliniques tels que des troubles de l'équilibre ou des tremblements. Ces signes cliniques devront, néanmoins, disparaître dans l'heure qui suivra la fin de l'exposition.

Devenir

La totalité des animaux prévus dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures les concernant, afin de récupérer les tissus biologiques d’intérêt pour les analyser.

Remplacement

Le modèle animal est indispensable pour obtenir des résultats exploitables puisque : - notre approche expérimentale, qui vise à étudier l’activité cérébrale par électrocorticographie, n’est pas possible in vitro. - notre projet étudie les atteintes au niveau comportemental et neuro-sensoriel, expérimentations qui ne peuvent être réalisées que sur l'animal vivant.

Réduction

Le protocole a été construit de telle sorte que le nombre d’animaux requis soit réduit à son minimum. Autant que possible, l’utilisation de chaque animal a été optimisée pour récolter un maximum de mesures, à la fois fonctionnelles, comportementales et histologiques. Sont décrites ci-dessous les mesures prises pour réduire le nombre d’animaux : 1) Les animaux seront leurs propres contrôles : Ils seront exposés initialement à une période de 4 jours d’air ambiant (période « contrôle ») puis 4 jours à des vapeurs de solvants organiques (période « solvant »). Les mêmes mesures fonctionnelles et comportementales seront réalisées pendant et à la fin de ces deux périodes pour comparaison. 2) Lors de la phase expérimentale 2, les effets fonctionnels et comportementaux de trois doses incrémentales du même solvant seront testés sur les mêmes animaux. Chaque exposition à une dose de solvant sera précédée d’une période « contrôle » afin de s’assurer que les animaux sont bien à leur niveau basal en terme de fonction cérébrale et de comportement. 3) Les animaux dont l'activité cérébrale sera mesurée pendant l'exposition aux solvants réaliseront également certains tests comportementaux, et seront ensuite mis à mort pour analyse histologique des tissus d’intérêt. 4) Les animaux dédiés aux tests comportementaux, mais dont l’acitivité cérébrale n’est pas enregistrée, seront également utilisés pour le dosage des solvants dans les tissus d’intérêt afin de réduire au maximum le nombre d’animaux concernés par la procédure de prélèvement seule.

Raffinement

1. Pe ndant toute la durée du projet, les animaux seront traités avec douceur et compassion par le personnel compétent. Des caresses seront prodiguées lors de chaque manipulation. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Les animaux seront hébérgés (si possible) par deux. Leur environnement sera enrichi par un tunnel en carton. 2. Concernant les chirurgies : - Afin d'atténuer la douleur, les animaux recevront un analgésique pré-opératoire et un anti-inflammatoire non stéroïdien sera délivré à l'animal (deux fois à 24h d’intervalle) après les chirurgies. - Pendant l'intervention chirurgicale : o Un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter le dessèchement oculaire o La température corporelle de l'animal sera maintenue à l’aide d’une couverture chauffante thermorégulée. - A la fin de l'intervention chirurgicale : o Une pommade sera appliquée afin d’accélérer le processus de cicatrisation. o Une injection de sérum physiologique sera faite afin de palier la déshydratation de l’animal, inhérente à la chirurgie - Suite à l’intervention : o Le réveil des animaux se fera dans une armoire chauffante ; ils bénéficieront d’une surveillance accrue avant le retour dans leur pièce d'hébergement. o De la nourriture sous forme de bouchon et sous forme gélifiée sera mise à disposition à l'intérieur de la cage. o Les animaux bénéficieront d'une période de suivi post-opératoire de 5 jours pendant laquelle ils seront observés (afin de déceler tout signe de douleur ou toute modification comportementale) et pesés quotidiennement. o Les animaux seront hébergés individuellement afin d'éviter l'exploration de sites d'incision et de suture par leurs congénères et la détérioration du dispositif implanté, mais seront mis dans des cages transparentes afin de garder un contact visuel entre eux. 3. Concernant les inhalations de solvants : - Les animaux seront habitués progressivement à être placés dans les enceintes d'inhalation afin de diminuer le stress lié à ce nouveau lieu. - Pendant la période d'exposition, les animaux seront observés toutes les 2 heures et une fiche de suivi clinique individuelle sera remplie en cas d'observation de signes de souffrance chez un animal. 4. Concernant les tests comportementaux : - Les animaux seront habitués progressivement aux divers dispositifs au moins deux semaines avant le début des expositions.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal s’est porté sur les rats Long Evans. En effet, le rat présente un métabolisme des solvants proche de celui de l'Homme. De plus, les tests comportementaux utilisés ici visent à évaluer les atteintes des solvants sur le fonctionnement de l’oreille interne. Les expérimentations, donc, doivent être menées sur des souches de rat pigmentées car, comme chez l'Homme, la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne (les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants). Les rats seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 3 mois) car l'oreille interne ainsi que les cytochromes présents dans le métabolisme des solvants doivent être matures.

292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracérébrale d'un virus exprimant une forme mutée de l'alpha-synucléine pour induire une lésion type Parkinson, puis une injection d'amphétamine avec observation du comportement rotatif, avant perfusion intracardiaque. Le porteur indique que la chirurgie cérébrale peut provoquer stress, douleur locale et variations de poids, et que les cerveaux seront prélevés pour analyse. Il présente le projet comme un préalable à une demande d'essai clinique de thérapie génique et écarte le remplacement, l'in vitro n'offrant pas le contexte physiologique.

Objectifs

La maladie de Parkinson se caractérise notamment par une dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire. Via le recours à de multiples modèles animaux de cette pathologie, notre laboratoire a démontré le rôle essentiel de la protéine EN1 pour la survie de ces neurones. Il est à noter qu’une seule et unique injection de EN1 permet une activité neuroprotectrire pendant >12 semaines, suggérant que son mécanisme d’action repose sur des leviers épigénétiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer si faire exprimer EN1 de façon durable via des vecteurs viraux de type AAV permettrait de prolonger son effet neuroprotecteur. Pour ce faire, nous prévoyons de développer un modèle murin de lésion progressive et chronique des neurones DA de la substance noire via l’utilisation d’un vecteur viral (type AAV) codant pour une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine. L’expression durable de EN1 sera induite grâce à l’injection d’un second AAV. Afin de soutenir une prochaine demande d’essai clinique pour l’utilisation de vecteurs viraux permettant une expression durable de la protéine thérapeutique hEN1 chez les patients atteints de la maladie de Parkinson, ce projet a deux objectifs. Objectif 1 : développer un modèle murin de lésion progressive et chronique des neurones DA de la SN via l’utilisation d’un vecteur viral (type AAV) codant pour une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine. Objectif 2 : Utiliser des vecteurs viraux (type AAV) pour permettre une expression durable d’EN1 dans le but de prolonger son effet neuroprotecteur.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’investigations précliniques qui devront permettre la soumission d’une demande d’essai clinique pour l’utilisation d’un outil de thérapie génique chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce projet développe un modèle murin de lésion chronique qui permettra de mieux rendre compte de l’aspect évolutif de la pathologie humaine. Quant à l’utilisation de vecteurs viraux permettant une expression durable de EN1, elle devrait permettre une action neuroprotectrice prolongée et offrir de nouvelles perspectives pour le traitement de la maladie de Parkinson.

Procédures

Ce projet contient 3 procédures avec plusieurs interventions par procédure. Un maximum de 292 souris seront utilisées dans ce projet. 1) Injection stéréotaxique intracérébrale : La chirurgie se déroule en conditions d’asepsie et d’anesthésie et analgésie générale sur des souris âgées de 60 jours au minimum. Un maximum de 292 souris seront injectées d’un adeno-associated virus. La procédure dure moins d’une heure. Les souris seront gardées un maximum de 16 semaines après injection. 2) Injection intrapéritonéale d'amphétamine pour stimulation du système nigrostriatal et suivi du comportement rotatif : La procédure se déroule sur animal vigile. Après une injection intrapéritonéale d’amphétamine, l’animale est filmé pendant 10 min dans une boite ouverte. Un maximum de 204 souris seront soumis à cette intervention. La procédure dure moins de 30 minutes. 3) Perfusion intracardique : La procédure se déroule en conditions d’anesthésie et analgésie générale. Un maximum de 292 souris seront soumis à cette intervention. La procédure dure moins de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Nos expériences nécessitent des procédures de classe modérée. Pour toutes nos expériences, les souris sont anesthésiées selon les bonnes pratiques vétérinaires. Cependant, et même si notre laboratoire a acquis une solide expérience en la matière, des souris peuvent ne pas supporter la chirurgie ou avoir un mauvais placement du site d’injection stéréotaxique. Aussi, suite à une injection stéréotaxique intra-cérébrale, il est possible que les animaux soient stressés, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite. Après une période de surveillance post anesthésique, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec leurs congénères. Nous ne nous attendons pas à une certaine mortalité dû aux molécules injectées. Dans le cadre du suivi des animaux selon les paramètres définis dans une grille d’évaluation du bien-être, à la suite d’une injection intracérébrale, les animaux seront observés quotidiennement pendant 5 jours (puis 2 fois par semaine), afin de détecter au plus vite les signes de perturbations du bien-être animal et d’intervenir dans les plus brefs délais.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau collecté afin de permettre des analyses histochimiques permettant d’évaluer la lésion induite par la surexpression de la synucléine et/ou l’effet protecteur de EN1 sur les neurones DA de la SN.

Remplacement

Ici, nous chercherons à développer un modèle murin de la maladie de Parkinson avec des AAVs dont l’expression a été déjà validé. Nos expériences devant permettre de soutenir une demande d’essai clinique, il est nécessaire qu’elles soient réalisées sur l’animal. L’expérimentation in vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de l’activité neuroprotectrice de EN1. Enfin, le développement d’un modèle chronique de la maladie de Parkinson n’est pas réalisable in vitro car la diffusion et toxicité de la protéine synucleine mutée ne peuvent être évaluées que dans le contexte physiologique.

Réduction

Sur la base de notre expérience antérieure, nous prévoyons d'utiliser 8 souris par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Pour les analyses histologiques, nos résultats préliminaires indiquent que 6 souris par groupe constituent un nombre minimum d’animaux pour avoir suffisamment de puissance statistique (www.stasticalsolutions.net/pssTtest_calc.php). Nous proposons n=8 pour maintenir la puissance statistique en cas de décès au cours de la chirurgie ou de mauvais placement du site d’injection stéréotaxique. Les données quantitatives obtenues feront l’objet d’une analyse de variance, suivie de tests post hoc. Si les distributions des moyennes sont normales, nous utiliserons des tests statistiques paramétriques (Student ou Anova). Si ce n’est pas le cas, nous opterons pour un test non-paramétrique (i.e. Mann-Whitney). Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux, la caractérisation de nos différents lots/type de virus étant notamment réalisée sur des effectifs réduits. En effet, dans le cadre des expériences visant à optimiser les conditions d’utilisation de nos AAVs, nous prévoyons d’avoir recours à des injections bilatérales afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. Après une chirurgie, les animaux seront transférés dans une cage elle-même chauffée grâce à un matelas chauffant jusqu’à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leurs groupes d’origine afin d’éviter le stress lié à l’isolement et observés et pesés chaque jour pendant cinq jours. Ensuite, en plus d’une inspection visuelle quotidienne, des relevés de poids seront réalisés au moins 2 fois par semaine et d’éventuels signes de douleur seront recherchés. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.

Choix des espèces

La souris est une des espèces majoritairement utilisées dans le domaine scientifique pour l'étude des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet ainsi une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de maladie de Parkinson ont été générés et caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de EN1 dans un modèle murin de maladie de Parkinson, une maladie neurodégénérative pour laquelle l’âge moyen d’apparition des premiers symptômes est de 57 ans en France. Nous utiliserons donc exclusivement des souris adultes dont l’âge sera voisin de 60 jours.

175 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de lésion de la substance noire puis huit injections de venin d'abeille, avec des tests moteurs (cylindre, labyrinthe en croix, rotameter), pour évaluer un effet antiparkinsonien. Le porteur indique que la chirurgie et les injections répétées peuvent provoquer perte de poids, inflammation de la suture et lésions cutanées, et que tous les cerveaux seront prélevés après mise à mort. Les retombées annoncées restent un préalable à une éventuelle étude chez l'homme, tandis qu'une partie des données servira à un travail dirigé d'étudiants.

Objectifs

Chez l'homme, la MP engendre des déficits moteurs tels que l'akinésie , la bradykinésie, la rigidité musculaire et le tremblement de repos. Chez l'animal, la catalepsie peut être mesurée et est un bon indice du symptome d'akinésie de la MP : une étude pilote sur le modèle pharmacologique nous a permis de connaître la dose efficace ainsi que la cinétique de différentes molécules candidates antiparkinsoniennes : le venin d'abeille (Bee Venom, BV 1/3/5 µG/kG)/ et le venin d'abeille sans son composé allergène, le deltaBV (1/3/10 µG/kG). Toutefois, il est nécessaire de valider les effets de cette molécule dans un autre modèle animal de la MP (modèle chirurgical) imitant la dégénérescence des neurones dopaminergiques. Ce modèle consiste en la lésion unilatérale totale de la substance noire. Ce modèle nous permettra d'aller plus loin dans la connaissance de l'effet thérapeutique des diverses molécules au moyen de plusieurs tests moteurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples : - Reproduction de l'effet bénéfique de la première étude utilisant un autre type de BV (alyostat)- Mise en évidence de l'effet bénéfique du dBV : pré-requis à une étude ultérieure chez l'homme. - Collecte de données pour la réalisation d'un TD

Procédures

Dans le modèle chirugical de la MP, les rats seront opérés (chirurgie de 45 min) puis seront injectés 2 semaines après en ip avec le BV ou le dBV selon le groupe. Ils seront injectés au total 8 fois : en J16/J19/22/25/28/31/34/37 et 40. En J40 les groupes lésés (soit 8 groupes) recevront une dose d'apomorphine (0.1 mG/kG). Les animaux seront testés ensuite en comportement , au niveau du test du cylindre et du cross maze (J16/J22/J28/J34) et au niveau du rotameter (J40)

Impact sur les animaux

La lésion induit plusieurs effets indésirables : une perte de poids après la chirurgie, une possibilité d'inflammation au niveau de la suture. De plus, les injections ip ou sc répétées peuvent induire des lésions cutanées au site d'injection.

Devenir

L'ensemble des animaux (175) sera euthanasié et leur cerveau sera prélevé afin d'effectuer des vérifications histologiques de la lésion.

Remplacement

Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez le rat qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. Le modèle chirurgical de lésion unilatérale de la substance noire chez le rongeur induit des symptômes moteurs (assymétrie posturale)qui ne peuvent être observés que sur l'animal vigile.

Réduction

56 rats proviennent d'une étude antérieure. Les données collectées lors de cette étude vont pouvoir servir de base pour de nombreuses promotions d'étudiants de 2ème année de BUT. De plus, cette étude repose sur l’utilisation d’un modèle chirurgical de la MP et de tests comportementaux validés par la communauté scientifique internationale, ce qui permet d’utiliser le minimum d’animaux necessaire pour obtenir des données fiables. Des études statistiques en amont (GPower) ont été effectuées pour aboir une significativité de 5% avec le nombre d'animaux étudiés.

Raffinement

Tout au long de cette étude, les animaux seront observés, pesés et manipulés. Ils seront maintenus par 2 dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad lib. Lors de la chirurgie, ils seront anesthésiés avec un mélange de Kétamine (100 mG/mL) à la dose de 60 mG/kG et Métomidine (1 mG/mL) à la dose de 0.25 mG/kG. Après s'être assuré de l'efficacité de l'anesthésie (retrait de la patte après pincement), les yeux sont recouverts d'une pommade occulaire. De la lidocaîne est introduite également au niveau des oreilles 15 minutes avant la mise en place de l'animal dans le cadre stéréotaxique. Le rat est ensuite positionné dans le cadre sur une couverture chauffante pour maintenir sa température ( contrôlé par sonde anale). Après désinfection de la peau du scalp à la bétadine et injection sous-cutanée d'un anesthésique local (0.1 mL/ de lidocaïne 0.4 % 15 minutes avant), une incision est effectuée afin de révéler le crâne. Après avoir injecté la neurotoxine ou son solvant, la peau est agrafée. De la bétadine est appliquée sur la suture et le rat reçoit une injection sc d'analgésiques (Buprénorphine 0.05 mG/kG). L'animal est ensuite laissé au calme pendant 2 semaines et observé régulièrement (grille de score binaire et note état corporel en annexe). Lors de l'étude pharmacologique, si un abcès apparaît après les injections intrapéritonéales, l'expérimentateur nettoiera la plaie à la bétadine et reportera les injections pour le/les animaux concernés.

Choix des espèces

Le rat représente le modèle de choix dans cette pathologie au regard des différents tests comportementaux qu'il peut effectuer. Par ailleurs, la plupart des études portant sur cette neuropathologie repose sur le modèle rat de la MP, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Enfin, nos travaux antérieurs sur le venin d'abeille ont été réalisés chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats issus de nos projets. Le projet vise à établir l'effet bénéfique du BV et du dBV chez le sujet jeune adulte. Comme pour tous nos travaux précédents, nous utiliserons des animaux d'environ 4 mois (matures sans être âgés), nous permettant de comparer les résultats avec nos données antérieures. De plus, les coordonnées stéréotaxiques (atlas de Paxinos et Watson) ont été établies pour des rats de ce poids.

135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un accident vasculaire cérébral leur est provoqué, puis leur mémoire spatiale est évaluée par le test du labyrinthe de Barnes, répété plusieurs fois par jour sur plusieurs jours, pour étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale. Le porteur décrit un déficit moteur et sensoriel faible et transitoire, qui disparaîtrait en trois jours. Les retombées pour les patients victimes d'AVC sont renvoyées au conditionnel, l'objectif immédiat restant de comprendre la contribution des plaquettes.

Objectifs

En France, l'accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique, c’est à dire l’occlusion d’un vaisseau cérébral par un caillot sanguin, touche une personne toutes les 4 minutes. Les conséquences d’un AVC sont sévères : 25% des patients décèdent de leur AVC, 40% garderont un handicap et 25% développeront une démence. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament permettant de dissoudre le caillot de sang soit un dispositif médical permettant de le retirer mécaniquement. Malheureusement, ces traitements ne sont possibles que lors des 6 premières heures après la survenue de l’AVC ce qui limite considérablement leur utilisation. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements pour étendre la fenêtre thérapeutique à la phase aiguë de l'AVC, mais aussi pour améliorer la réparation et /ou la récupération des dommages neurologiques post AVC. Des études récentes ont montré que des thérapies ciblant l’inflammation cérébrale pouvaient stimuler la modification structurale ou fonctionnelle du réseau neuronal (remodelage cérébral) et favoriser la récupération post-AVC à long terme, sur le plan de la motricité mais aussi en limitant/empêchant la démence. Un caillot sanguin est formé essentiellement de plaquettes. Ces dernières jouent un rôle essentiellement dans la coagulation du sang mais sont de plus en plus reconnues comme des modulateurs pertinents d'autres processus physiopathologiques, tels l'inflammation et la régénération tissulaire. A ce jour, leur contribution à la réparation neurovasculaire n’a été que très peu étudiée et uniquement à la phase aiguë. Étant donné que les plaquettes peuvent produire des facteurs favorisant le remodelage cérébral et/ou neuroprotecteurs, elles pourraient être impliquées dans les processus de remodelage cérébral après un AVC. L’objectif de ce projet vise à étudier le rôle des plaquettes dans la réparation cérébrale à long terme, et en particulier les conséquences d’un déficit en plaquettes sur la mémoire et l’apprentissage à long terme dans un modèle murin d’AVC.

Bénéfices attendus

L’AVC ischémique est aujourd’hui la 2nde cause de démence dans le monde, faisant d’elle une maladie chronique. Les plaquettes étant des réservoirs de facteurs neurotrophiques (protéines responsable de la croissance et de la survie des neurones) et de réparation cérébrale, facteurs connus pour être impliqués dans les processus de remodelage cérébral à long terme, il est nécessaire de comprendre leur contribution dans le développement de ces troubles de la mémoire. L’étude des mécanismes de mémoire et d’apprentissage dans des modèles d’AVC à long-terme nous permettrait ainsi d’obtenir une première réponse quant au rôle des plaquettes dans les processus de réparation post-AVC à long terme et dans le développement de ces troubles de la mémoire.

Procédures

Le Barnes maze consiste à explorer la mémoire spatiale, c’est-à-dire le temps mis par la souris pour se souvenir de l’endroit où a été placée une boite noire sous un labyrinthe circulaire de 20 trous. C’est une procédure observationnelle sans geste technique. La souris est placée dans un labyrinthe de Barnes permettant d’évaluer le temps nécessaire à une souris pour se souvenir de l'emplacement d'une zone cible. La souris sera simplement observée pendant 4 minutes. Cette phase d’observation sera réalisée 3 fois par jour pendant 4 jours, puis renouvelée 1 fois sur une journée après 2 jours de repos (même zone cible) et enfin pendant 3 jours en changeant l’emplacement de la zone cible. Entre chaque essai sur une journée, les souris seront laissées 1h au repos.

Impact sur les animaux

Ce modèle d’AVC conduit à un faible déficit et transitoire de la fonction motrice et sensorielle. Ces troubles disparaissent en quelques jours (3 jours en général)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de projet dans un autre établissement pour lequel une autorisation a déjà été obtenue.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de la complexité des évènements qui se mettent en place de manière intégrée au cours du temps après l’accident vasculaire cérébral, en particulier le comportement de la souris tels l’apprentissage et la mémoire.

Réduction

Les modèles d’AVC développés chez la souris sont parfaitement connus et maitrisés par les membres de l’équipe impliqués dans ce projet, ce qui permet l’évaluation précise du nombre d’animaux nécessaire afin de réaliser des statistiques ayant une puissance suffisante pour interpréter les résultats.

Raffinement

Le soin et le suivi des animaux seront faits par des personnes compétentes et expérimentées, journalière par l’animalier et bi-hebdomadaire par l’expérimentateur. Le bien-être de l’animal est également assuré par un enrichissement de son milieu environnemental (coton pour nidification). La douleur sera évaluée par la mise en place de points limites bien définis à l’aide d’une grille de score. En cas de douleurs, l’administration d’antalgique et d’analgésie sera réalisée. Si la douleur persiste, l’animal sera euthanasié. L’évaluation du comportement neurologique n’est pas douloureuse ; il s’agit de données d’observation. Toutes les précautions environnementales sont prises pour éviter le stress de l’animal. Les souris seront isolées dans une pièce calme adaptée à l’évaluation cognitive réservée exclusivement aux animaux de ce projet.

Choix des espèces

En se basant sur les nombreuses publications au sein de notre laboratoire, Les souris mâles seront évaluées sur le plan cognitif à l'âge adulte (fin des tests à 6 semaines après l'induction de l'accident vasculaire cérébral réalisée chez des souris adultes de 12 semaines). Nous utilserons que des souris mâles pour eviter des interférences avec le cycle hormonal des femelles.

48 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une microchirurgie du cerveau sous anesthésie puis des enregistrements EEG sous contention répétés sur vingt-trois jours, avant d'être tués pour prélever sang et cerveau, afin de tester une molécule anti-épileptique. Le porteur indique des douleurs liées au cadre stéréotaxique et un stress lié à la contention. Il présente ce modèle génétique d'épilepsie absence comme "incontournable" pour évaluer un nouveau médicament.

Objectifs

L'épilepsie est le syndrome neurologique le plus répandu, avec environ 70 millions de patients dans le monde. Elle se caractérise par des crises pouvant se manifester sous des formes diverses, comme une absence de manifestation visible caractérisant les épilepsies absences, ou des convulsions généralisées très spectaculaires dans beaucoup de formes d’épilepsies. Il existe de nombreux médicaments anti-épileptiques (MAEs) sur le marché, dont l’objectif est de contrôler (supprimer) les crises d’épilepsie. Néanmoins, 30 % des patients ne peuvent pas être libérés des crises malgré le large panel de MAEs disponibles. Le développement de nouvelles molécules, est donc nécessaire. C’est le sens de ce projet, visant à évaluer une nouvelle molécule dont les bénéfices ont déjà été démontrés in vivo. Il envisage de tester l’effet de la molécule sur un modèle rat d’épilepsie absences reconnu comme un modèle classique d’épilepsie généralisée d’origine génétique.

Bénéfices attendus

Les épilepsies absences affectent majoritairement les jeunes enfants. Le nombre journalier de crises peut être très élevé. Au-delà de l’impact immédiat que ces crises peuvent avoir au moment où elles se produisent (le jeune patient apparaît pour l’extérieur comme « dans la lune »), les crises peuvent altérer profondément les performances scolaires, via des mécanismes de défaut de consolidation mnésique durant le sommeil, induisant de ce fait des retards importants dans les différents apprentissages. Le développement de MAEs pertinents dans ce syndrome pourrait permettre de maintenir à un bon niveau les capacités d’apprentissage et de mémoire. De surcroît, au-delà de l’intérêt direct pour cette forme d’épilepsie, l’épilepsie absences est un modèle d’épilepsie généralisée d’ordre génétique incontournable pour l’évaluation d’un nouveau MAE.

Procédures

Micro Chirurgie cérébrale sous anesthésie général et analgésie, 30 min par rat sur 48 rats. Limitation de mobilité légère (monitoring EEG), 10 X 3h étalé sur 23J sur 48 rats.

Impact sur les animaux

Des douleurs (prise en charge par l’anesthésie et l’analgésie) liées au placement de l’animal dans le cadre stéréotaxique et à l'incision de la peau au dessus du crâne. Stress momentané (quelques minutes) dû à la contention de l’animal nécessaire pour connecter le système électroencéphalographique au rat.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour le prélèvement du sang et du cerveau

Remplacement

Les processus physiopathologiques conduisant à la récurrence des crises épileptiques sont différents d’un syndrome à un autre. Il n’est pas donc pas envisageable d’utiliser une approche in-vitro, encore moins in-silico, en remplacement de l’approche in-vivo puisque le trait évalué (fréquence des crises épileptiques) correspond à la réponse mettant en jeu tout un processus physiologique intégré chez un sujet respirant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été réduit autant que possible tout en garantissant l’atteinte de l’objectif scientifique visé. Ainsi, la taille des échantillons a été calculée de sorte à mettre en évidence de façon statistique une réduction de 30% de la fréquence des crises épileptiques.

Raffinement

Le protocole suit des procédures standardisées soucieuses de minimiser le stress et toute souffrance des animaux avec une détermination précise des points limites. Ceci se traduit par une visite quotidienne à l’animalerie pour contrôler le bien-être des animaux, l’enrichissement des cages autant que faire se peut, le respect des normes liées aux surfaces/volumes des cages pour éviter la surpopulation ainsi que celles liées aux plages acceptables pour la température et l’hygrométrie. En outre, avant les procédures chirurgicales et les enregistrements EEG, les rats seront emmenés aux salles d’expérimentation, pour habituation et diminution du stress induit par la nouveauté.

Choix des espèces

Ce modèle génétique d’épilepsie absences établi chez le rat a été validé aussi bien pour la période d’installation de l’épilepsie (épileptogénèse) que pendant la période où l’animal est considéré comme présentant une épilepsie stabilisé. Dans ce modèle d’épilepsie absences, les crises apparaissent spontanément et progressivement à partir de l’âge de 2-3 mois chez tous les rats et se stabilisent à l’âge de 6 mois, atteignant alors un plateau. Nous réaliserons donc les chirurgies et les enregistrements EEG à partir de l’âge de 6 mois.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau puis l'implantation d'une micro-LED sur le crâne, avant des tests moteurs et des injections de L-dopa destinées à reproduire les mouvements anormaux des patients parkinsoniens. Le porteur indique que le modèle provoque hypoactivité, perte de poids et mouvements involontaires, qu'il décrit comme non douloureux. Il affirme qu'aucune simulation informatique ne reproduit la physiopathologie cérébrale et sa traduction comportementale.

Objectifs

Ce projet a pour but de tester le potentiel thérapeutique d'une méthode peu invasive de stimulation du cerveau dans la maladie de Parkinson. Le traitement symptomatique de la maladie de Parkinson repose sur la substitution de la dopamine manquante par la L-Dopa. Cependant, après plusieurs années sous L-Dopa, les patients développent des complications motrices : les dyskinésies (mouvements anormaux involontaires). Une alternative thérapeutique non médicamenteuse peut alors être proposée à certains patients: la stimulation cérébrale profonde à haute fréquence du noyau subthalamique (HFS-STN), un des noyaux des ganglions de la base. Il s’agit d’un traitement neurochirurgical symptomatique très efficace, mais qui présente l’inconvénient majeur d’être invasif et de ne profiter qu’à une minorité des patients du fait de critères d’éligibilité stricts (environ 10%). Certains types de neurones dans le cortex moteur sont activés par la HFS-STN, et la stimulation directe de ces neurones par la lumière (grâce à une fibre optique implantée dans le cerveau) dans des souris transgéniques parkinsoniennes permet de reproduire partiellement les effets bénéfiques de la HFS-STN sur les symptômes moteurs dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Ces résultats ouvrent une nouvelle voie thérapeutique moins invasive que la stimulation cérébrale profonde, donc pouvant potentiellement bénéficier à plus de patients. Dans cette étude, nous optimiserons cette voie thérapeutique chez des souris modèle de la maladie de Parkinson sur deux axes : 1) en mettant au point une méthode d'activation neurones moins invasive : illuminer à travers le crâne à la place d'insérer une fibre optique dans le cerveau 2) en comparant les effets de la stimulation sur de nouvelles localisations pour sélectionner celle qui induit les meilleurs effets bénéfiques sur les symptômes parkinsoniens.

Bénéfices attendus

Cette étude s'insère dans un projet plus large de mise au point de techniques alternatives à la stimulation cérébrale profonde dans la maladie de Parkinson. En effet cette technique est très invasive et ne peut donc bénéficier qu'à environ 10% des patients. Certains types de neurones du cortex moteur, activés par la stimulation cérébrale profonde, constituent des cibles thérapeutiques plus superficielles donc moins invasives. La stimulation par la lumière de ces neurones améliore les symptômes moteurs dans un modèle de la maladie de Parkinson chez la souris, mais nécessite l'insertion d'une fibre optique dans le cerveau. Cette étude permettra de tester et mettre au point une méthode moins invasive de stimulation par la lumière des neurones du cortex : à travers le crâne intact.

Procédures

Les souris du lot de mise au point subiront 1 chirurgies d'injection cérébrale sous anesthésie générale de courte durée (

Impact sur les animaux

Les souris utilisées pour la mise au point technique et dans le groupe contrôle non parkinsonien n'auront que peu d'effets indésirables : en effet, les lignées transgéniques utilisées n'ont pas de phénotype dommageable, et toutes les mesures sont prises pour prendre en charge la douleur péri-opératoire. Pour les souris modèles de la maladie de Parkinson, nous nous attendons à diminution de l'activité et une perte de poids durant les deux premières semaines, pendant lesquelles elles bénéficieront d'un suivi renforcé pour minimiser au maximum les nuisances. Après stabilisation, ces souris présenteront également des modifications à long terme du comportement moteur (légère hypoactivité, asymétrie de l'usage des membres). Ces modifications sont inhérentes au modèle parkinsonien, et nécessaires pour tester les effets bénéfiques de la stimulation, et ne causent pas de douleur. Après induction des dyskinésies (mouvements anormaux involontaires), les souris présenteront temporairement après chaque injection des mouvements involontaires (rotations, posture tournée d'un côté, tics des pattes et tics faciaux). Là aussi ces nuisances sont non douloureuses et nécessaires pour pouvoir tester les effets bénéfiques de la stimulation dans les conditions les plus proches de celles vécues par les patients parkinsoniens.

Devenir

Il est nécessaire de mettre à mort les animaux dans toutes les procédures pour pouvoir effectuer une vérification histologique des aires corticales ciblées et du modèle parkinsonien.

Remplacement

Pour étudier le bénéfice des stimulations proposées sur les symptômes moteurs de la maladie de parkinson, il est nécessaire d'utiliser des animaux produisant un comportement moteur (et modèles de cette maladie). Aucune méthode de simulation informatique ne permet de récapituler la complexité de la physio-pathologie cérébrale, et encore moins sa traduction comportementale. Les structures cérébrales étudiées ne sont pas présentes chez les invertébrés.

Réduction

Trois conditions sont testées sur les mêmes animaux (Parkinson, et 2 états dyskinétiques) pour réduire le nombre total d'animaux utilisés.

Raffinement

Toutes les mesures sont prises pour minimiser les nuisances subies par les souris: une anesthésie et analgésie appropriée lors des chirurgies, un suivi post-opératoire quotidien et adapté tout au long de l'utilisation des animaux, et renforcé dans le cas des modèles de la maladie de Parkinson (maintien au chaud, nourriture appétante et hypercalorique, surveillance et maintien de l'hydratation, analgésique selon nécessité), pendant tout le temps nécessaire à la stabilisation (en général 2 semaines). Les souris sont hébergées dans une animalerie agréée et disposent de matériel d'enrichissement (coton pour faire des nids, petites maisons ou tubes pour se cacher).

Choix des espèces

Il est nécéssaire d'utiliser un modèle animal mammifère pour obtenir des résultats potentiellement transposables à l'Homme, car les structures étudiées ne sont pas présentes, ou sont organisées différement chez les autres vertébrés (et absentes chez les invertébrés). Parmi les modèles animaux mammifères, nous utilisons le modèle souris qui permet l'utilisation de lignées transgéniques nécessaires à cette étude. adulte : il est nécessaire d'étudier l'effet de la stimulation cérébrale sur un animal dont le cerveau est complètement développé