Système nerveux

52 souris âgées de 15 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue sous anesthésie profonde sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections dans le cerveau d'un facteur pathogène et, pour une partie, la pose d'électrodes puis un isolement une semaine sur deux pour enregistrer leur sommeil pendant plusieurs mois. Leur cerveau est ensuite prélevé pour analyse après la mort. Le porteur affirme que la souris reste "incontournable" et présente le projet comme visant à valider un premier modèle animal évolutif de la maladie de Parkinson.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est connue pour ses symptômes moteurs dus une dégénérescence neuronale bien identifiée. D’autres symptômes de la MP sont aujourd’hui caractérisés comme le trouble du comportement en sommeil paradoxal (TCSP). Pendant le sommeil paradoxal (SP), nous sommes inconscients et naturellement paralysés. Les patients TCSP (âgés d’une cinquantaine d’années) perdent cette paralysie et extériorisent alors leurs rêves sous forme de mouvements incontrôlés dangereux. Le TCSP est le meilleur marqueur diagnostic à 10 ans de la MP, ces deux pathologies étant donc intimement liées. Sur la base de nos travaux récents chez les rongeurs, nous avons formulé une hypothèse sur ces mécanismes délétères communs aux deux pathologies, affectant d’abord les neurones controlant le sommeil, puis au cours du vieillissement ceux atteints dans la MP. Le délai entre l’apparition du TCSP et de la MP refléterait la lente propagation des processus dégénératifs à travers le cerveau au cours du vieillissement. Notre objectif est de tester cette hypothèse en tentant de reproduire chez la souris âgée ces mêmes processus pathologiques affectant le SP puis d’observer si un syndrome parkinsonien se develope avec le temps, comme observé chez les patients MP. Ce projet de recherche préclinique s’articule autours de deux volets experimentaux complémentaires et menés en parallèle, l’un anatomo-pathologique (neurones dégénérés), l’autre physiologique (modification du sommeil) et comportemental (comportements de type parkinsonien), permettant de corréler les différents evénements pathologiques et leur évolution au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Malgré d’intenses recherches, un modèle animal reproduisant fidèlement au cours du vieillissement la maladie de Parkinson (MP) fait encore défaut, en particulier au cours de la période pendant laquelle la pathologie s’installe insidieusement dans le cerveau. L’un des biomarqueurs pré-symptomatiques de la MP reconnu aujourd’hui est une maladie du sommeil (Trouble comportemental en sommeil paradoxal) qui anticipe la MP d’une dizaine d’années. Il y a donc un intérêt à comprendre les mécanismes pathologiques liant le TCSP et la MP. Concrètement, ce projet scientifique ambitieux vise à valider le premier modèle animal évolutif dont la puissance résiderait dans la reproduction chronologique des évènements pathologiques prenant place, insidieusement, pendant la phase pré-symptomatique de la MP. Cet outil ouvrirait des perspectives pour l’élaboration de stratégies neuroprotectrices pour anticiper précocement l’évolution aujourd’hui encore irréversible vers la MP.

Procédures

Pour ce projet de recherche préclinique, 2 procédures expérimentales sont prévues nécessitant l’utilisation d’un total de 52 souris âgées de 15 mois. Procédure 1 (n = 20 souris, 2 lots de 13 et 7 individus, respectivement): les souris subiront sous anesthésie générale controlée une intervention chirurgicale consistant en deux injections intracérébrales du facteur pathogène (ou contrôle) responsable de la MP, suivi de l'implantation d'électrodes à demeure permettant l'enregistrement chronique du sommeil. Les souris seront isolées une semaine sur 2 en chambre d'enregistrement, dans un baril de plexiglass transparent de 25cm de diamètre contenant enrichissement, eau et nourriture ad libitum et filmées 24h/24h. En fin de procédure (12 mois maximum apès la chirurgie selon l’évolution de leur état général), les souris subiront une anesthésie chirurgicale profonde sans réveil pour l’analyse post-mortem des cerveaux. Procédure 2 (n = 32 souris, 4 lots, n = 8 individus chacun): les souris subiront sous anesthésie générale controlée une intervention chirurgicale consistant en une injection intracérébrale du facteur pathogène responsable de la MP. Selon les lots experimentaux, les souris ainsi traitées subiront 30, 60, 90 ou 180 jours après la chirurgie une anesthésie chirurgicale profonde sans réveil pour l’analyse post-mortem des cerveaux afin de corréler l’évolution des modifications anatomo-pathologiques aux effets physiologiques observés et au vieillissement.

Impact sur les animaux

Procédure experimentale n° 1 de degré de sévérité modéré: les souris seront soumises à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour deux injections intracérébrales du facteur pathogène (ou contrôle) responsable de la MP. Des électrodes permettant l’enregistrement en continu de l’activité du cerveau pendant le sommeil seront posées à demeure. Pendant cette intervention d’une durée de 90 min, toute douleur sera couverte par l’administration générale et locale d’analgésiques avant, pendant et après la chirurgie. Une légère perte de poids est attendue (-5%) avec un retour au poids initial en 48h. Pendant la semaine de récupération, les souris seront 2 par cage avec un séparateur grillagé de sorte qu’elles puissent interagir tout en limitant les possibilités d’agression et de détérioration des électrodes. Elles seront isolées une semaine sur 2 en caisson individuel pour l’enregistrement de leur sommeil et de leurs comportements pour toute la durée de la procédure. Nous attendons l’apparition d’un TCSP sans savoir par avance si/quand il apparaîtra, ce délai constituant de fait l’objectif de l’étude. Nous serons quotidiennement vigilants pour détecter dès que possible l’apparition de signes comportementaux et physiologiques indicateurs du TCSP, de modifications quantitatives et qualitative de leurs sommeil et de leurs comportements. En fin de procedure, elles subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde sans réveil. Procédure expérimentale n°2 de degré de sévérité modéré: les souris seront soumises à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale pour l’injection intracérébrale du facteur pathogène responsable de la MP. Pendant cette intervention d’une durée de 60 minutes, toute douleur sera couverte par l’administration générale et locale d’analgésiques avant, pendant et après la chirurgie. Une légère perte de poids est attendue (- 5%) avec un retour à la normale en 48h. Les souris seront alors placées à 4 par cage pour favoriser les interactions sociales. Elles subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde sans réveil après 30, 60, 90 et 180 jours de survie apres la chirurgie pour prélever leur cerveau. N’attendant pas de dérèglement de leur sommeil ni de leur comportement, elles seront cependant régulièrement observées pour détecter de légères dégradations de leur état général, possible au cours du vieillissement.

Devenir

A l'issue des procédures 1 et 2, les souris subiront une anesthésie générale profonde et sans réveil pour nous permettre de récupérer leur cerveau dans les meilleures conditions de préservation des tissus neuronaux et d’analyser ainsi l’évolution des phénomènes dégénératifs cérébraux au cours du vieillissement (selon la durée de survie après la chirurgie initiale) et de les corréler avec les modifications de leur sommeil et de leurs comportements. Les données anatomiques ainsi obtenues chez des souris âgées seront comparées à celles obtenues chez des souris jeunes avec les mêmes paradigmes expérimentaux, permettant de mieux comprendre ce qui se passe pendant le vieillissement.

Remplacement

L’intérêt d’étudier le TCSP réside dans son caractère prédictif de la MP. Il est impossible d’aborder ces questions chez l’homme sain ou malade car aucune méthode d’imagerie cérébrale spécifique de la MP n’est encore disponible à l’hôpital. Des contrôles anatomo-pathologiques sont souvent réalisés chez des patients décédés pour confirmer le diagnostic mais ils ne permettent pas d’étudier l’origine de la maladie. Par ailleurs, des animaux moins évolués que les mammifères (drosophile, poisson rouge, vers C. elegans etc.) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité/inactivité) mais ils ne possèdent de sommeil paradoxal et la complexité de leur cerveau n’est en rien comparable avec celle de l’Homme. D’autres méthodes prometteuses se développent actuellement comme la modélisation in silico, l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces et depuis peu les organoïdes cérébraux mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles à la souris pour aborder des mécanismes pathologiques complexes responsables de ces pathologies évolutives et neurodégénératives. Aussi, l’utilisation de la souris est encore aujourd’hui incontournable et c’est un animal parfaitement adapté aux études physiologiques et comportementales de très longue durée prévues dans ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux (n=52) nécessaire pour cette étude est légitimé par son organisation en 2 procédures expérimentales (physiologie/comportement et anatomo-pathologie) conduites en parallèle. La taille de chaque lot a été calculée, optimisée et réduite à son minimum sur la base de nos travaux antérieurs mettant en œuvre les mêmes techniques expérimentales chez la souris. Ces calculs tiennent compte, sans compromettre la reproductibilité et la significativité statistique des données expérimentales (petits échantillons): 1) des « erreurs et échecs » possibles à chaque étape des procédures expérimentales ; 2) la variabilité interindividuelle des paramètres physiologiques considérés ; et 3) la dégradation des signaux au cours du temps (plusieurs mois de suivi longitudinal) pouvant rendre leur interprétation aléatoire. Chaque animal ne sera soumis qu’à une seule procédure expérimentale se terminant par une anesthésie sans réveil avec prélèvement du cerveau pour analyses post-mortem, éliminant toute possibilité de réutilisation. En revanche, le nombre de lots, et donc celui des souris, pourra être sensiblement réduit selon les résultats obtenus, en particulier pour la procédure expérimentale n°2. Ainsi, les lots prévoyant des temps de survie post-traitement de longue durée seront abandonnés si des indices de TCSP et de perturbations locomotrices apparaissent plus précocement.

Raffinement

Pour minimiser le stress individuel par le maintien d’interactions sociales quotidiennes, les souris seront hébergées dès leur arrivé dans notre animalerie en groupes de 4 individus par cage jusqu’à ce qu’elles atteignent l’âge de 15 mois, marquant alors le début des deux procédures expérimentales. L’agressivité peut augmenter avec le temps chez certains mâles, nous obligeant alors à les séparer du groupe. Le cas échéant, ils seront placés dans une cage double munie d’un séparateur grillagé afin que les deux souris puissent interagir mais sans contact direct. De plus, des enrichissements seront systématiquement mis en place dans les cages pour favoriser le bien-être des animaux pendant toute la durée des procédures. Après l’étape de chirurgie sous anesthésie générale, l’état de santé des animaux sera suivi régulièrement jusqu’à la fin des procédures, une attention particulière étant d’abord portée à la récupération post-opératoire (ajout d’AINS si nécessaire, suivi du poids, de la mobilité et du comportement). Nous utiliserons donc une grille d’évaluation de différents paramètres pour suivre leur retour objectif à des valeurs normales pendant la semaine de récupération. Une fois les procédures débutées, notre préoccupation sera de suivre quotidiennement l’évolution de plusieurs paramètres physiologiques et locomoteurs pertinents pour notre étude (qualité et quantité du sommeil, locomotion, exploration, etc.) pour détecter rapidement l’apparition de signes caractéristiques du TCSP et suivre de près la dégradation de l’état de santé général, aussi lié au vieillissement naturel. Ces modifications constitueront dès lors le point limite de nos procédures expérimentales avec mise à mort sans délai, pour prévenir l’apparition d’une éventuelle souffrance et d’une dégradation de leur autonomie, tout en établissant la preuve de concept recherchée dans cette étude.

Choix des espèces

Pour plusieurs raisons, nous avons choisi de travailler avec des souris âgées de 15 mois au début des procédures expérimentales. A cet âge-là, les souris sont à la moitié de leur espérance de vie, en pleine santé et sont matures sur le plan cérébral et locomoteur avec un cycle veille-sommeil stabilisé, efficace et consolidé. C’est à cet âge moyen qu’apparaît le TCSP chez les patients, précurseur de la MP. Le sommeil paradoxal (SP) est spécifique aux mammifères incluant la souris et l’Homme. Des animaux de niveau phylogénétique inférieur (mouche, poisson, vers etc) sont parfois utilisés pour l’étude du sommeil (activité / inactivité) mais ils n’ont pas de SP et la complexité de leur système nerveux n’est pas comparable à celle des mammifères. Ces modèles animaux ne sont donc pas des alternatives à la souris pour étudier le sommeil et développer des modèles précliniques de ses principales pathologies. Nos travaux récents ont identifié chez la souris les structures cérébrales ciblées dans le TCSP, leur organisation anatomique étant très similaire à celle du cerveau humain. Enfin, c’est une espèce animale plus adaptée que le rat aux études physiologiques et comportementales de longue durée (pas d’augmentation significative du poids et du volume corporel) facilitant ainsi leur manipulation et hébergement sur le long terme et raccourcissant la durée des procédures du fait de leur plus courte espérance de vie (2,5 ans maximum).

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, elles reçoivent une injection d'un virus dans le cerveau, puis sont évaluées à quatre mois par des tests comportementaux, l'open field et le labyrinthe en Y, avant perfusion intracardiaque et prélèvement du cerveau. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des traitements et décrit les manipulations comportementales comme indolores. Il juge encore "indispensable" le recours à l'animal, les modèles cellulaires iPS ou CRISPR n'offrant selon lui que des informations partielles.

Objectifs

Ce projet répond à des interrogations scientifiques qui sont essentielles au développement de nouvelles stratégies anti-Alzheimer innovantes ciblant MT5-MMP. Les objectifs du projet sont les suivants :

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet nous apportera: A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux impliquant MT5-MMP dans : 1) le métabolisme de l’APP et plus précisément celui de ses fragments neurotoxiques, C99 et Abêta ; 2) le métabolisme de Tau ; et 3) les processus inflammatoires dans le cadre de la MA. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités de MT5-MMP qui pourraient apporter des solutions chez l’homme.

Procédures

Le projet est organisé sur une seule procédure car les animaux de départ (nouveau-nés au stade P1) seront utilisés jusqu'à la fin de l'expérimentation (5 mois). La procédure est organisée en 4 étapes : 1) injection intracérébroventriculaire d'AAV9 dans des souris nouveau-nées. Nous injecterons par voie intracérébroventriculaire (ICV) des souris nouveaux-nées 5xFAD et leurs contrôles sauvages à P1 avec des AAV9 qui codent pour différents variants de la protéase MT5-MMP. Cette étape d'injection est d'une durée de 30 sec. 2) Génotypage des nouveaux-nés. Une biopsie de la queue (< 1 mm) est réalisée et les petits sont remis avec leur mère. Le génotypage permettra l'identification WT (sauvages) ou 5xFAD (Alzheimer). Cette étape est réalisée dans la durée de l'anesthésie. 3) Analyse comportementale. Quatre mois après l’injection, les capacités cognitives des souris seront évaluées dans des tests comportementaux, notamment l’open field et le labyrinthe en Y. La durée des manipulations dans l'open field est de 2x5min pendant 5 jours, et la durée des manipulations dans le labyrinthe est de 8min pendant 5 jours. 4) Perfusion intracadiaque et prélèvements. La durée de cette étape est d'environ 15min. Suite aux tests comportementaux, les animaux seront euthanasiés, leurs cerveaux récupérés pour des analyses histopathologiques ou microdisséqués pour des analyses biochimiques. Ces analyses porteront sur différents marqueurs de la pathologie, notamment en relation avec le métabolisme de l’APP et de ses fragments les plus toxiques (e.g., C99, peptide Abêta), l’accumulation de la protéine tau, ainsi que sur des marqueurs cellulaires et moléculaires de la neuroinflammation.

Impact sur les animaux

Il n’y pas d’effets indésirables attendus sur les animaux liés à l’utilisation des traitements proposés. Les interventions telles que l'injection ICV chez le jeune et la biopsie de la queue sont réalisés sous anesthésie. En ce qui concerne le comportement, il s'agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique en injection IP d’un mélange Kétamine (150 mg/kg) et Xylazine (15 mg/kg) suivi d'une perfusion intracardiaque. La mort survient par les effets du surdosage anesthésique.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants (cellules iPS et système CRISPR/Cas9), ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, pour compléter nos observations in vivo (compréhension des effets bénéfiques de l’absence de MT5-MMP), nous avons développé des approches expérimentales in vitro comme des cultures primaires ou des cultures HEK ou iPS, avec des sous-expression/sur-expression de MT5-MMP, en parallèle du développement de modulateurs d’activité de MT5-MMP. Nos résultats obtenus doivent à présent être confortés in vivo. L’efficacité de futurs traitements originaux anti-MT5-MMP dans la MA doit se traduire par une amélioration biologique/histologique et comportementale dans des modèles murins, notamment le modèle 5xFAD. Ces souris 5xFAD représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie car elles développent rapidement une MA expérimentale (dès 2 mois), laquelle est très similaire à celle observée chez l’homme, comparée à la MA développée par d’autres modèles des souris (9-12 mois).

Réduction

Le nombre de lots expérimentaux et d'animaux au total est décrit en détail au paragraphe 4.2. - WT (mâles+ femelles)n= 6 groupes x32 souris = 192 - 5xFAD (mâles+ femelles)n= 6 groupes x32 souris = 192 Soit 384 animaux Ce nombre d'animaux a été réduit au minimum pour pouvoir être validé d’un point de vue statistique notamment pour les études comportementales, d'autant que nous travaillons sur des souris issues de plusieurs reproductions et prend également en compte un certain nombre d’échec dès l’étape d’injection des AAV à P1.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et une attention particulière sera accordée aux procédures de raffinement. Les souris disposeront de nids végétaux à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l'environnement et matériau de nidification afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité tout en procurant un sentiment de sécurité chez l'animal.

Choix des espèces

Les souris constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que, comme modèle pré-clinique pour tester les effets in vivo de molécules thérapeutiques potentielles. Pour étudier l’impact de MT5-MMP sur les marques de la pathologie nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées (5xFAD) exprimant les gènes humains codant pour l’APP et la PSEN1 (préséniline 1) portant, respectivement, 3 et 2 mutations familiales de la MA, d’où leur nom 5xFAD. Toutes les souches possèdent le même fond génétique C57/BL6 et seront générées à l'animalerie. Les animaux seront utilisés à deux stades : 1) Stade post-natal P1, dans lequel les injections d’AAVs seront faites, permettant ainsi l’expression des variants de MT5-MMP dès les premiers jours de vie post-natale. 2) Stade adulte à l’âge de 4 et 5 mois. Cet âge représente une phase précoce de la maladie dans laquelle on peut déjà observer des marques évidentes de la pathologie, aussi bien au niveau comportemental que biochimique et histopathologique.

289 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation d'électrodes cérébrales, puis des inhalations répétées de solvants organiques comme le toluène en chambre, avec des tests comportementaux et un test du nystagmus post-rotatoire. Le porteur indique que de fortes concentrations peuvent provoquer troubles de l'équilibre et tremblements, censés disparaître dans l'heure suivant l'exposition. Il rattache le projet à la fixation de valeurs limites d'exposition des salariés et écarte le remplacement, l'électrocorticographie n'étant pas réalisable in vitro.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la mise en place d'une méthode de suivi en temps réel de l’action des solvants organiques sur le cerveau par une mesure de l’activité cérébrale. Cette méthode d’enregistrement sans fil permettra de mesurer ces effets chez des animaux vigiles et libres de leurs mouvements lors de l’inhalation des solvants dans des chambres à atmosphère contrôlée. En outre, divers tests comportementaux seront réalisés en fin d’exposition afin de mettre en relation les modifications de l’activité du cerveau avec d’éventuelles déficiences motrices et/ou sensorielles. Ceci permettra d’avoir une vue d’ensemble sur les effets neurotoxiques aigus d’une exposition aux solvants organiques volatils.

Bénéfices attendus

L’e xposition des salariés à des solvants peut conduire à une dépression du système nerveux central et mener à une altération de leurs performances psychomotrices. L’exposition aux solvants peut donc être responsable de d’accidents du travail. Ainsi, afin de protéger la santé des salariés et limiter l’exposition de ces derniers à de fortes doses de solvant, des valeurs limites d’exposition ont été mise en place. Néanmoins, les relations doses/réponses des solvants sur l’activité cérébrale sont mal connues. Ce projet vise à proposer une méthode de mesure objective de l’effet des solvants sur le système nerveux central et d’améliorer les connaisances sur les risques liés aux expositions aiguës aux solvants organiques.

Procédures

Procédure 1 : Etude pilote (N=16) : N=12 : Chirurgie (1h) ; Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; inhalation « toluène » + électrocorticographie (4 x 8h) ; mise à mort et prélèvement de tissus N=4 : Mise à mort et prélèvement de tissus Procédure 2 : Mesure de l'activité cérébrale par électrocorticographie et analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=56) N=14 par dose de solvant : Chirurgie (1h) ; [Inhalation « contrôle » + électrocorticographie (4 x 8h) ; Comportement (30min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 3 : Mesure du nystagmus post-rotatoire suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : Chirurgie (45min) ; [Inhalation « contrôle » (4 x 8h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min) ; Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Test du nystagmus post-rotatoire (10min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 4 : Analyse du comportement suite à l’exposition aux solvants (N=48) : N=12 par dose de solvant : [Inhalation « contrôle » (4 x 8h); Comportement (30min); Inhalation « solvant » (4 x 6h) ; Comportement (30min)]* ; mise à mort et prélèvement de tissus * La séquence entre crochets est répétée trois fois sur les mêmes animaux lors de la phase expérimentale 2 (dose incrémentales) Procédure 5 : Prélèvement sanguin et de tissus neuronaux suite à l’exposition aux solvants (N=96) N=8 par temps de prélèvement (temps 1 : à la fin du 4ème jour des périodes « solvant » ; temps 2 : à la fin de la semaine post-exposition). Les animaux seront mis à mort par prélèvement final du sang et du cerveau (5 minutes maximum, sous anésthésie profonde). Dans le cas où les quantités de solvant dans le sang ou le cerveau sont égales à zéro après une semaine de récupération lors de la phase expérimentale 1, le nombre de rats mis à mort au temps 2 pourra être réduit à n=4 pour les expérimentations suivantes.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant. Ils pourront présenter des signes cliniques tels que des troubles de l'équilibre ou des tremblements. Ces signes cliniques devront, néanmoins, disparaître dans l'heure qui suivra la fin de l'exposition.

Devenir

La totalité des animaux prévus dans ce projet seront mis à mort à la fin des procédures les concernant, afin de récupérer les tissus biologiques d’intérêt pour les analyser.

Remplacement

Le modèle animal est indispensable pour obtenir des résultats exploitables puisque : - notre approche expérimentale, qui vise à étudier l’activité cérébrale par électrocorticographie, n’est pas possible in vitro. - notre projet étudie les atteintes au niveau comportemental et neuro-sensoriel, expérimentations qui ne peuvent être réalisées que sur l'animal vivant.

Réduction

Le protocole a été construit de telle sorte que le nombre d’animaux requis soit réduit à son minimum. Autant que possible, l’utilisation de chaque animal a été optimisée pour récolter un maximum de mesures, à la fois fonctionnelles, comportementales et histologiques. Sont décrites ci-dessous les mesures prises pour réduire le nombre d’animaux : 1) Les animaux seront leurs propres contrôles : Ils seront exposés initialement à une période de 4 jours d’air ambiant (période « contrôle ») puis 4 jours à des vapeurs de solvants organiques (période « solvant »). Les mêmes mesures fonctionnelles et comportementales seront réalisées pendant et à la fin de ces deux périodes pour comparaison. 2) Lors de la phase expérimentale 2, les effets fonctionnels et comportementaux de trois doses incrémentales du même solvant seront testés sur les mêmes animaux. Chaque exposition à une dose de solvant sera précédée d’une période « contrôle » afin de s’assurer que les animaux sont bien à leur niveau basal en terme de fonction cérébrale et de comportement. 3) Les animaux dont l'activité cérébrale sera mesurée pendant l'exposition aux solvants réaliseront également certains tests comportementaux, et seront ensuite mis à mort pour analyse histologique des tissus d’intérêt. 4) Les animaux dédiés aux tests comportementaux, mais dont l’acitivité cérébrale n’est pas enregistrée, seront également utilisés pour le dosage des solvants dans les tissus d’intérêt afin de réduire au maximum le nombre d’animaux concernés par la procédure de prélèvement seule.

Raffinement

1. Pe ndant toute la durée du projet, les animaux seront traités avec douceur et compassion par le personnel compétent. Des caresses seront prodiguées lors de chaque manipulation. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Les animaux seront hébérgés (si possible) par deux. Leur environnement sera enrichi par un tunnel en carton. 2. Concernant les chirurgies : - Afin d'atténuer la douleur, les animaux recevront un analgésique pré-opératoire et un anti-inflammatoire non stéroïdien sera délivré à l'animal (deux fois à 24h d’intervalle) après les chirurgies. - Pendant l'intervention chirurgicale : o Un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter le dessèchement oculaire o La température corporelle de l'animal sera maintenue à l’aide d’une couverture chauffante thermorégulée. - A la fin de l'intervention chirurgicale : o Une pommade sera appliquée afin d’accélérer le processus de cicatrisation. o Une injection de sérum physiologique sera faite afin de palier la déshydratation de l’animal, inhérente à la chirurgie - Suite à l’intervention : o Le réveil des animaux se fera dans une armoire chauffante ; ils bénéficieront d’une surveillance accrue avant le retour dans leur pièce d'hébergement. o De la nourriture sous forme de bouchon et sous forme gélifiée sera mise à disposition à l'intérieur de la cage. o Les animaux bénéficieront d'une période de suivi post-opératoire de 5 jours pendant laquelle ils seront observés (afin de déceler tout signe de douleur ou toute modification comportementale) et pesés quotidiennement. o Les animaux seront hébergés individuellement afin d'éviter l'exploration de sites d'incision et de suture par leurs congénères et la détérioration du dispositif implanté, mais seront mis dans des cages transparentes afin de garder un contact visuel entre eux. 3. Concernant les inhalations de solvants : - Les animaux seront habitués progressivement à être placés dans les enceintes d'inhalation afin de diminuer le stress lié à ce nouveau lieu. - Pendant la période d'exposition, les animaux seront observés toutes les 2 heures et une fiche de suivi clinique individuelle sera remplie en cas d'observation de signes de souffrance chez un animal. 4. Concernant les tests comportementaux : - Les animaux seront habitués progressivement aux divers dispositifs au moins deux semaines avant le début des expositions.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal s’est porté sur les rats Long Evans. En effet, le rat présente un métabolisme des solvants proche de celui de l'Homme. De plus, les tests comportementaux utilisés ici visent à évaluer les atteintes des solvants sur le fonctionnement de l’oreille interne. Les expérimentations, donc, doivent être menées sur des souches de rat pigmentées car, comme chez l'Homme, la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne (les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants). Les rats seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 3 mois) car l'oreille interne ainsi que les cytochromes présents dans le métabolisme des solvants doivent être matures.

292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intracérébrale d'un virus exprimant une forme mutée de l'alpha-synucléine pour induire une lésion type Parkinson, puis une injection d'amphétamine avec observation du comportement rotatif, avant perfusion intracardiaque. Le porteur indique que la chirurgie cérébrale peut provoquer stress, douleur locale et variations de poids, et que les cerveaux seront prélevés pour analyse. Il présente le projet comme un préalable à une demande d'essai clinique de thérapie génique et écarte le remplacement, l'in vitro n'offrant pas le contexte physiologique.

Objectifs

La maladie de Parkinson se caractérise notamment par une dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques de la substance noire. Via le recours à de multiples modèles animaux de cette pathologie, notre laboratoire a démontré le rôle essentiel de la protéine EN1 pour la survie de ces neurones. Il est à noter qu’une seule et unique injection de EN1 permet une activité neuroprotectrire pendant >12 semaines, suggérant que son mécanisme d’action repose sur des leviers épigénétiques. Ce projet a pour objectif d’évaluer si faire exprimer EN1 de façon durable via des vecteurs viraux de type AAV permettrait de prolonger son effet neuroprotecteur. Pour ce faire, nous prévoyons de développer un modèle murin de lésion progressive et chronique des neurones DA de la substance noire via l’utilisation d’un vecteur viral (type AAV) codant pour une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine. L’expression durable de EN1 sera induite grâce à l’injection d’un second AAV. Afin de soutenir une prochaine demande d’essai clinique pour l’utilisation de vecteurs viraux permettant une expression durable de la protéine thérapeutique hEN1 chez les patients atteints de la maladie de Parkinson, ce projet a deux objectifs. Objectif 1 : développer un modèle murin de lésion progressive et chronique des neurones DA de la SN via l’utilisation d’un vecteur viral (type AAV) codant pour une forme mutée de l’alpha-synucléine humaine. Objectif 2 : Utiliser des vecteurs viraux (type AAV) pour permettre une expression durable d’EN1 dans le but de prolonger son effet neuroprotecteur.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’investigations précliniques qui devront permettre la soumission d’une demande d’essai clinique pour l’utilisation d’un outil de thérapie génique chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce projet développe un modèle murin de lésion chronique qui permettra de mieux rendre compte de l’aspect évolutif de la pathologie humaine. Quant à l’utilisation de vecteurs viraux permettant une expression durable de EN1, elle devrait permettre une action neuroprotectrice prolongée et offrir de nouvelles perspectives pour le traitement de la maladie de Parkinson.

Procédures

Ce projet contient 3 procédures avec plusieurs interventions par procédure. Un maximum de 292 souris seront utilisées dans ce projet. 1) Injection stéréotaxique intracérébrale : La chirurgie se déroule en conditions d’asepsie et d’anesthésie et analgésie générale sur des souris âgées de 60 jours au minimum. Un maximum de 292 souris seront injectées d’un adeno-associated virus. La procédure dure moins d’une heure. Les souris seront gardées un maximum de 16 semaines après injection. 2) Injection intrapéritonéale d'amphétamine pour stimulation du système nigrostriatal et suivi du comportement rotatif : La procédure se déroule sur animal vigile. Après une injection intrapéritonéale d’amphétamine, l’animale est filmé pendant 10 min dans une boite ouverte. Un maximum de 204 souris seront soumis à cette intervention. La procédure dure moins de 30 minutes. 3) Perfusion intracardique : La procédure se déroule en conditions d’anesthésie et analgésie générale. Un maximum de 292 souris seront soumis à cette intervention. La procédure dure moins de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Nos expériences nécessitent des procédures de classe modérée. Pour toutes nos expériences, les souris sont anesthésiées selon les bonnes pratiques vétérinaires. Cependant, et même si notre laboratoire a acquis une solide expérience en la matière, des souris peuvent ne pas supporter la chirurgie ou avoir un mauvais placement du site d’injection stéréotaxique. Aussi, suite à une injection stéréotaxique intra-cérébrale, il est possible que les animaux soient stressés, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite. Après une période de surveillance post anesthésique, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec leurs congénères. Nous ne nous attendons pas à une certaine mortalité dû aux molécules injectées. Dans le cadre du suivi des animaux selon les paramètres définis dans une grille d’évaluation du bien-être, à la suite d’une injection intracérébrale, les animaux seront observés quotidiennement pendant 5 jours (puis 2 fois par semaine), afin de détecter au plus vite les signes de perturbations du bien-être animal et d’intervenir dans les plus brefs délais.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront euthanasiés et leur cerveau collecté afin de permettre des analyses histochimiques permettant d’évaluer la lésion induite par la surexpression de la synucléine et/ou l’effet protecteur de EN1 sur les neurones DA de la SN.

Remplacement

Ici, nous chercherons à développer un modèle murin de la maladie de Parkinson avec des AAVs dont l’expression a été déjà validé. Nos expériences devant permettre de soutenir une demande d’essai clinique, il est nécessaire qu’elles soient réalisées sur l’animal. L’expérimentation in vitro ne présente pas le contexte tridimensionnel et physiologique nécessaire à la caractérisation de l’activité neuroprotectrice de EN1. Enfin, le développement d’un modèle chronique de la maladie de Parkinson n’est pas réalisable in vitro car la diffusion et toxicité de la protéine synucleine mutée ne peuvent être évaluées que dans le contexte physiologique.

Réduction

Sur la base de notre expérience antérieure, nous prévoyons d'utiliser 8 souris par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Pour les analyses histologiques, nos résultats préliminaires indiquent que 6 souris par groupe constituent un nombre minimum d’animaux pour avoir suffisamment de puissance statistique (www.stasticalsolutions.net/pssTtest_calc.php). Nous proposons n=8 pour maintenir la puissance statistique en cas de décès au cours de la chirurgie ou de mauvais placement du site d’injection stéréotaxique. Les données quantitatives obtenues feront l’objet d’une analyse de variance, suivie de tests post hoc. Si les distributions des moyennes sont normales, nous utiliserons des tests statistiques paramétriques (Student ou Anova). Si ce n’est pas le cas, nous opterons pour un test non-paramétrique (i.e. Mann-Whitney). Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux, la caractérisation de nos différents lots/type de virus étant notamment réalisée sur des effectifs réduits. En effet, dans le cadre des expériences visant à optimiser les conditions d’utilisation de nos AAVs, nous prévoyons d’avoir recours à des injections bilatérales afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, combinée à un traitement analgésique. Après une chirurgie, les animaux seront transférés dans une cage elle-même chauffée grâce à un matelas chauffant jusqu’à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leurs groupes d’origine afin d’éviter le stress lié à l’isolement et observés et pesés chaque jour pendant cinq jours. Ensuite, en plus d’une inspection visuelle quotidienne, des relevés de poids seront réalisés au moins 2 fois par semaine et d’éventuels signes de douleur seront recherchés. Si les animaux montrent de tels signes, ils recevront un traitement adapté.

Choix des espèces

La souris est une des espèces majoritairement utilisées dans le domaine scientifique pour l'étude des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet ainsi une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de maladie de Parkinson ont été générés et caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de EN1 dans un modèle murin de maladie de Parkinson, une maladie neurodégénérative pour laquelle l’âge moyen d’apparition des premiers symptômes est de 57 ans en France. Nous utiliserons donc exclusivement des souris adultes dont l’âge sera voisin de 60 jours.

175 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie de lésion de la substance noire puis huit injections de venin d'abeille, avec des tests moteurs (cylindre, labyrinthe en croix, rotameter), pour évaluer un effet antiparkinsonien. Le porteur indique que la chirurgie et les injections répétées peuvent provoquer perte de poids, inflammation de la suture et lésions cutanées, et que tous les cerveaux seront prélevés après mise à mort. Les retombées annoncées restent un préalable à une éventuelle étude chez l'homme, tandis qu'une partie des données servira à un travail dirigé d'étudiants.

Objectifs

Chez l'homme, la MP engendre des déficits moteurs tels que l'akinésie , la bradykinésie, la rigidité musculaire et le tremblement de repos. Chez l'animal, la catalepsie peut être mesurée et est un bon indice du symptome d'akinésie de la MP : une étude pilote sur le modèle pharmacologique nous a permis de connaître la dose efficace ainsi que la cinétique de différentes molécules candidates antiparkinsoniennes : le venin d'abeille (Bee Venom, BV 1/3/5 µG/kG)/ et le venin d'abeille sans son composé allergène, le deltaBV (1/3/10 µG/kG). Toutefois, il est nécessaire de valider les effets de cette molécule dans un autre modèle animal de la MP (modèle chirurgical) imitant la dégénérescence des neurones dopaminergiques. Ce modèle consiste en la lésion unilatérale totale de la substance noire. Ce modèle nous permettra d'aller plus loin dans la connaissance de l'effet thérapeutique des diverses molécules au moyen de plusieurs tests moteurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples : - Reproduction de l'effet bénéfique de la première étude utilisant un autre type de BV (alyostat)- Mise en évidence de l'effet bénéfique du dBV : pré-requis à une étude ultérieure chez l'homme. - Collecte de données pour la réalisation d'un TD

Procédures

Dans le modèle chirugical de la MP, les rats seront opérés (chirurgie de 45 min) puis seront injectés 2 semaines après en ip avec le BV ou le dBV selon le groupe. Ils seront injectés au total 8 fois : en J16/J19/22/25/28/31/34/37 et 40. En J40 les groupes lésés (soit 8 groupes) recevront une dose d'apomorphine (0.1 mG/kG). Les animaux seront testés ensuite en comportement , au niveau du test du cylindre et du cross maze (J16/J22/J28/J34) et au niveau du rotameter (J40)

Impact sur les animaux

La lésion induit plusieurs effets indésirables : une perte de poids après la chirurgie, une possibilité d'inflammation au niveau de la suture. De plus, les injections ip ou sc répétées peuvent induire des lésions cutanées au site d'injection.

Devenir

L'ensemble des animaux (175) sera euthanasié et leur cerveau sera prélevé afin d'effectuer des vérifications histologiques de la lésion.

Remplacement

Ce projet de recherche repose sur la modélisation de déficits comportementaux chez le rat qui ne peuvent être abordés via l’étude d’organismes modèles phylogénétiquement moins évolués, ou à fortiori des outils moléculaires in-vitro. Le modèle chirurgical de lésion unilatérale de la substance noire chez le rongeur induit des symptômes moteurs (assymétrie posturale)qui ne peuvent être observés que sur l'animal vigile.

Réduction

56 rats proviennent d'une étude antérieure. Les données collectées lors de cette étude vont pouvoir servir de base pour de nombreuses promotions d'étudiants de 2ème année de BUT. De plus, cette étude repose sur l’utilisation d’un modèle chirurgical de la MP et de tests comportementaux validés par la communauté scientifique internationale, ce qui permet d’utiliser le minimum d’animaux necessaire pour obtenir des données fiables. Des études statistiques en amont (GPower) ont été effectuées pour aboir une significativité de 5% avec le nombre d'animaux étudiés.

Raffinement

Tout au long de cette étude, les animaux seront observés, pesés et manipulés. Ils seront maintenus par 2 dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad lib. Lors de la chirurgie, ils seront anesthésiés avec un mélange de Kétamine (100 mG/mL) à la dose de 60 mG/kG et Métomidine (1 mG/mL) à la dose de 0.25 mG/kG. Après s'être assuré de l'efficacité de l'anesthésie (retrait de la patte après pincement), les yeux sont recouverts d'une pommade occulaire. De la lidocaîne est introduite également au niveau des oreilles 15 minutes avant la mise en place de l'animal dans le cadre stéréotaxique. Le rat est ensuite positionné dans le cadre sur une couverture chauffante pour maintenir sa température ( contrôlé par sonde anale). Après désinfection de la peau du scalp à la bétadine et injection sous-cutanée d'un anesthésique local (0.1 mL/ de lidocaïne 0.4 % 15 minutes avant), une incision est effectuée afin de révéler le crâne. Après avoir injecté la neurotoxine ou son solvant, la peau est agrafée. De la bétadine est appliquée sur la suture et le rat reçoit une injection sc d'analgésiques (Buprénorphine 0.05 mG/kG). L'animal est ensuite laissé au calme pendant 2 semaines et observé régulièrement (grille de score binaire et note état corporel en annexe). Lors de l'étude pharmacologique, si un abcès apparaît après les injections intrapéritonéales, l'expérimentateur nettoiera la plaie à la bétadine et reportera les injections pour le/les animaux concernés.

Choix des espèces

Le rat représente le modèle de choix dans cette pathologie au regard des différents tests comportementaux qu'il peut effectuer. Par ailleurs, la plupart des études portant sur cette neuropathologie repose sur le modèle rat de la MP, ce qui permet de disposer d'une littérature abondante sur laquelle s'appuyer. Enfin, nos travaux antérieurs sur le venin d'abeille ont été réalisés chez le rat, ce qui permet de comparer les résultats issus de nos projets. Le projet vise à établir l'effet bénéfique du BV et du dBV chez le sujet jeune adulte. Comme pour tous nos travaux précédents, nous utiliserons des animaux d'environ 4 mois (matures sans être âgés), nous permettant de comparer les résultats avec nos données antérieures. De plus, les coordonnées stéréotaxiques (atlas de Paxinos et Watson) ont été établies pour des rats de ce poids.