Système nerveux

217 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et les femelles peuvent subir jusqu'à deux frottis vaginaux par jour pendant treize semaines au plus, ainsi que neuf prélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours. Elles sont aussi soumises à trois semaines de décalage horaire chronique, des avances et des retards successifs de la phase d'obscurité qui perturbent leur sommeil, pour imiter le travail posté. Le porteur prévoit le stress de l'isolement pour les femelles gestantes, une irritation modérée du vagin due aux frottis répétés et une douleur modérée due à l'incision du bout de la queue, et indique que 170 souris seront tuées, les 47 autres étant gardées en vie pour d'autres expériences ou tuées à défaut. Les retombées pour les femmes en travail posté sont renvoyées au "plus long terme", sous la forme de recommandations auxquelles l'étude doit seulement "ouvrir la voie".

Objectifs

La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.

Bénéfices attendus

A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.

Procédures

Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.

Devenir

Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 170 animaux. 47 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.

Réduction

Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.

6 300 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour le compte de clients de l'industrie pharmaceutique. Selon les cas, ils reçoivent des injections deux fois par jour pendant jusqu'à trois mois, sont des lignées génétiquement modifiées ou ont été opérés, avant d'être mis à mort par décapitation ou perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélèvement de tissus nerveux. L'objet est de mesurer ex vivo l'effet de molécules candidates sur le système nerveux. Le porteur affirme que des réseaux neuronaux "plus physiologiques" sont nécessaires et qu'aucune reproduction in silico n'est possible.

Objectifs

Les grands groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour traiter la douleur. D’autre part, pour une meilleur appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). A l’importance de mise au point de nouvelle molécule, il faut ajouter le developpement de modèle rongeur génétiquement modifé (GM). Ces modèles permettent de mimer des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage certain pour l’evaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soit électrophyisiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranche et/ ou de cellulles nerveuses de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé dans le SNC et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) et le PATCH = un enregistrement à l'echelle du neurone. Le projet vise à déterminer, ex vivo, les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques (composés « LEADS ») en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule, le cas échéant - afin de pouvoir déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire. Notre direction scientifique valide une stratégie d’étude, comportant plusieurs conditions, en se basant sur des données bibliographiques.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du SNC. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aigüe, constitue la meilleure approche car elle permet: - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons); - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphallique et des problèmes de pharmacocinétique. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développment de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques couteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Procédure 1, par étude, 60 animaux vigiles seront injectés deux fois par jour. Ces injections seront réalisées par du personnel entrainé, qualifié et du matériel adapté. Ces injections pourront durer trois mois, mais durent en moyenne un mois. L’animal sera habitué à la contention, limitant le stress lors des gestes à venir. La plus grande vigilance de suivi sera portée pour éviter les problèmes dus aux injections répétées. 2700 animaux maximum entreront dans les 5 ans du projet. La Procédure 2 permettra de phénotyper 60 animaux génétiquement modifiés par étude, 2700 animaux sur 5 ans. Nous travaillerons sur des animaux asymptomatiques. Nos critères de surveillance seront ceux associés aux animaux symptomatiques. Procédure 3 : 900 animaux subirront une chirurgie par notre partenaire, 15 jours avant leur envoi. Avant réception dans nos locaux, les animaux auront pleinement récuperer leur état de santé. En fonction de l’opération subie, les animaux devront être isolés depuis leur intervention jusqu’à leur MAM et donc être isolés 3 semaines. Tous ces animaux seront mis à mort par deux techniques: *- en fonction de leur âge, l’animal sortira de la zone d’hébergement par décapitation rapide sous anesthésie gazeuse; *- certains animaux sevrés seront mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthéise gazeuse.

Impact sur les animaux

Nous avons des procédures qui peuvent amener à des effets indésirables: La procédure 1 peut par : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. Nous habituerons les animaux concernés à ces manipulations avant leur entrée dans le projet; *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. Pour éviter, par exemple, les inflammations génerées, nous varierons les sites d’injection autant que possible et assurerons une surveillance précise des animaux pour limiter la persistance d’effets indésirables provoqués en suivant nos règles de point limites. Nous utiliserons, aussi, le matériel d’administration adapté à l’espèce, au poids et l’âge des animaux ; *- La mise à mort par perfusion intracardiaque sous anesthésie gazeuse peut amener un stress premortem important. Elle sera réalisée par du personnel dûment formé et quanlifié régulièrement avec utilisation d’un analgésique ; La procédure 2 peut par : *-La nature des animaux GMs, créer des douleurs auxquelles les animaux ne peuvent s’échapper. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptômatiques. Nous adapterons, tout de même, notre surveillance et nos points limites en fonction des symptômes possibles pout anticiper toute apparition précoce de douleur, qui ne devraient pas se declencher avant leur mise à mort et nos enrigistrements dans ce projet ; La procédure 3 peut par : *-la nature des opérations faites sur les animaux reçus et opérés par notre partenaire, induire des problèmes de type post-opératoire. Nous contrôlerons avec notre partenaire que les animaux opérés sont stables et aptes à être transportés, deux semaines après leur chirurgie. De plus, les conditions d’hébergement ainsi que les points de surveillance spécifique enrichieront nos points limites et nos points de surveillance au cours des 3 semaines d’hébergement des animaux. .

Devenir

A l’issue de la procédure 1, tous les animaux seront mis à mort pour mesurer l’efficacité du traitement par la molécule à tester. Tous les animaux génétiquement modifiés de la procédure2 et tous les animaux opérés de la procédure 3 sont mises à mort pour enregistrement électrophysiologique, ex vivo. Ces mis à mort seront nécessaires pour assurer l’évaluation d’efficacité et la détermination des mécanismes d’action de futurs candidats médicament, grâce aux modèles d’animaux mimant les pathologies neurodégéneratives et nos protocoles d’enregistrement d’activité électrique cérébrale que nous maitrisons.

Remplacement

Nos évaluations ou caractérisations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc plus physiologiques ».Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme ces tests que nous proposons. Nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato encephalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne sgnificativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (4 souris adultes et 2 rats adultes/cage). Ils béneficent d’enrichissement adaptés deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le founisseur ou le partenaire. Pour les animaux opérés, ils seront adaptés au mieux et l’information est conservée et partagée dans les documents de renseignement de la lignée. Les animaux utilisés en Procédure 1 seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaire. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur inoccuité. Les animaux seront surveillés deux foix par jour et pesés. Pour la procédure 2, les animaux génétiquement modifiés auront une semaine d’acclimatation et un mois de temps d’hébergement, maximum. Il se fera en groupes sociaux de 4 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée, aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Les points limites seront tout de même adaptés aux symptomes possibles et nous adapterons notre surveillance. Nous mélangerons les génotypes pour que les animaux mutés puissent exprimer la plus large palette de comportements naturels. Toute perte de poids en deça de la limite préetablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Pour les animaux opérés (Procédure3), les conditions d’hébergement seront transmises par notre partenaire. Les animaux seront reçus après une complète récuperation de la chirurgie. Toutefois, un contrôle de l’apparition d’infection ou d’inflammation sera exercé. Si un animal infecté apparait, il sera sorti temporairement du projet et le vétérinaire sera consulté pour un traitement adapté jusqu’à récupération.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du SNC des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leurs élevages, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de ces espèces, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée ou opérée (Procédure 2 et Procédure 3) fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques ou ayant pleinement récupérés de leur chirurgie. Toutefois, la connaissance des phénotypes et chirurgies ayant des impacts possibles sur le bien-être de l’animal, cela entrainera la mise en place de conditions d’hébergement spécifiques et une validation des points limite modifiés pour palier à des symptômes qui ne devraient pas apparaitre dans ce projet. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous pouvons travailler aussi bien avec des animaux nouveaux nés, juvéniles, adultes ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée (maladies neurodégénératives le plus souvent). Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux. Les animaux, des procédures 1 et 3, seront exclusivement des animaux post sevrage. L’âge des animaux de la procédure 2 dépendra de l’âge de l’apparition des symptômes de la maladie.

Pour savoir si le récepteur CB1, un récepteur aux cannabinoïdes, règle la peur et la prise alimentaire à travers les neurones à POMC de l'hypothalamus, 1 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 792 d'entre elles reçoivent sous anesthésie une injection de virus dans le cerveau, et certaines une lentille implantée pour suivre l'activité des neurones. Chaque souris passe au plus deux tests anxiogènes, dont un conditionnement à la peur qui "augmente le niveau de stress chez les souris" selon le porteur, sans qu'il nomme les autres tests ni dise comment la peur est provoquée. Toutes sont tuées à l'issue, par dislocation cervicale ou par perfusion intracardiaque sur cœur battant sous dose létale de pentobarbital, et le porteur justifie l'effectif par "12 à 29 animaux par groupe", sans dire combien de groupes il prévoit.

Objectifs

Notre organisme répond à la peur en mobilisant des réserves énergétiques et en ajustant notre physiologie pour faire face à cette situation. Les processus par lesquels la peur affecte notre cerveau prennent naissance à différents niveaux cellulaires, ce qui a pour effet d'affecter nos réactions émotionnelles et comportementales. La peur peut entraîner des changements inadaptés, par exemple une consommation compulsive de nourriture. Dans le cerveau, la principale région qui contrôle la prise alimentaire est appelée l'hypothalamus. Parmi les neurones participant à ce contrôle, les neurones à POMC sont chargés de diminuer la prise alimentaire. D'un point de vue moléculaire, le récepteur cannabinoïdes de type 1 (CB1) régule la réponse à la peur mais également la prise alimentaire. L'objectif principal de ce projet est de comprendre si ce récepteur peut réguler la réponse à la peur et la prise alimentaire dans les neurones à POMC. Pour répondre à cette question, nous allons travailler sur deux sous-objectifs différents : 1) Étudier si CB1 module l'activité des neurones à POMC dans une situation où les souris ont peur. Etant donné que les neurones à POMC de l'hypothalamus sont activés pendant un test de peur conditionnée, nous allons également 2) Etudier si le CB1 présent au niveau des neurones à POMC régule le comportement alimentaire pendant la peur conditionnée.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons souligner la nouveauté de ce projet, puisque le rôle de la POMC dans la réponse à la peur n'a jamais encore été étudié auparavant. Les neurones à POMC ont été largement explorés dans le domaine du comportement alimentaire, mais leur rôle dans la régulation de l'anxiété et celui de la peur n'a pas encore été étudié. Il est admis que le stress ou l'anxiété altère le comportement alimentaire, ce qui peut entraîner des troubles du comportement alimentaire et l'obésité. Cependant, les mécanismes moléculaires reliant ces deux phénomènes ne sont toujours pas clairs. Dans ce contexte, les neurones à POMC et le récepteur CB1, par leur capacité à réguler à la fois l'alimentation et la réponse au stress, semblent être de bons candidats pour expliquer l’interaction entre alimentation et comportement de peur.

Procédures

Au cours de ce projet, nous réaliserons des opérations chirurgicales sur des souris afin d'injecter des particules virales dans le cerveau. Les souris subiront une seule injection de virus, certaines d'entre-elles recevront une lentille qui nous permettra d'étudier l'activité neuronale en temps réel. Ces procédures, qui durent de l’ordre de 45 minutes, sont réalisées sous anesthésie générale. Afin de prévenir toute souffrance nous réalisons également une anesthésie locale au niveau du site d'incision et les souris reçoivent un traitement analgésique pré et post-opératoire. Ce qui permet d'assurer une bonne récupération après la procédure. L'état général des souris, ainsi que le poids corporel, seront évalués les jours suivant la chirurgie. Des points limites suffisamment précoces ont été mis en place pour chacune des procédures afin d'éviter toute souffrance. Cette procédure sera effectuée sur un total de 792 souris, et seulement une seule fois par animal.

Impact sur les animaux

Pour les procédures chirurgicales, afin d'éviter toute douleur, nous utilisons des analgésiques en pre-opératoires et réalisons une anesthésie locale de la peau avant l'incision. Après la chirurgie, un traitement analgésique est administré pendant 48h, nous suivons le poids corporel quotidiennement et nous évaluons les animaux selon les points limites. Pour les tests anxiogènes, nous laisserons un intervalle de 7 jours entre les tests effectués sur les mêmes animaux pour leur permettre de récupérer. Nous effectuerons toujours le test le moins anxiogène en premier et avec un maximum de 2 tests chez les mêmes souris. Le test de conditionnement à la peur augmente le niveau de stress chez les souris. Les animaux ayant subi une peur conditionnée ne seront pas réutilisés pour ce même test ou pour un test anxiogène.

Devenir

Toutes les souris utilisées dans ce projet seront sacrifiées à la fin de l'expérience pour récupérer les tissus et réaliser des études moléculaires. Nous sacrifierons les souris de deux manières différentes : la dislocation cervicale pour le prélèvement de tissus frais et la perfusion intracardiaque sur cœur battant afin de fixer le cerveau pour les études histologiques. La persufion intracardiaque se fait à l'aide d'une dose létale de pentobarbital mélangée avec un anesthésique local, la lidocaïne.

Remplacement

Pour évaluer l'implication des neurones à POMC et du système endocannabinoïde dans la régulation de la peur et du comportement alimentaire, il n'existe aucune alternative à l'heure actuelle que l'expérimentation animale. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement ne serait pas approprié. Le niveau de complexité de l'étude que nous proposons de réaliser est tel qu’aucun modèle informatique ne pourrait remplacer l’animal.

Réduction

Nous avons déterminé, en utilisant un calcul de puissance statistique, que nous avons besoin de 12 à 29 animaux par groupe pour obtenir des données exploitables.

Raffinement

De manière générale, les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 semaines, en cages collectives, et seront manipulés de façon bi-hebdomadaire pendant au minimum une semaine avant le début des expériences. Ces manipulations permettront d’habituer les animaux aux expérimentateurs et de réduire le stress. Les animaux auront une période de récupération d’au moins une semaine entre chaque expérience afin de limiter le stress et l’angoisse. Les animaux soumis à un test de peur conditionnée ne seront pas utilisés pour un autre test stressant ou anxiogène, ils seront sacrifiés après le test. L’enrichissement se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnet en bois pour ronger et de tunnel en carton pour se cacher/manipuler les animaux. Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. Les souris seront hébergées en cages collectives, sauf lorsqu'elles auront à subir une chirurgie, et que la consommation de nourriture devra être consignée.

Choix des espèces

La peur et le comportement alimentaire sont depuis longtemps évalués chez la souris, qui représente une espèce pertinente pour ce type d’étude. La grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de réponse à la peur, ainsi que l'étude du système endocannabinoïde sont réalisées chez la souris. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, ce qui implique que les résultats obtenus chez le rongeur seront transposable à l'humain, ce qui aura pour conséquence de faire avancer les connaissances dans ce domaine et à plus long terme de trouver de nouvelles voies thérapeutiques. Par ailleurs, les modèles génétiques dont nous avons besoin pour répondre à nos questions ne sont disponibles que chez la souris. Les expériences ne commenceront que lorsque les souris seront adultes (8 semaines). Mâles et femelles seront utilisés dans cette étude, car il a été montré que le système endocannabinoïde du cerveau de souris femelles est différent de celui des mâles, à la fois dans les conditions basales et lorsque les souris sont dans une situation de stress.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des douleurs inflammatoires, post-chirurgicales ou neuropathiques leur sont provoquées, par injection de carragénine ou d'adjuvant dans la patte, incision chirurgicale ou pose d'un manchon autour du nerf sciatique, puis mesurées par des tests nociceptifs répétés. Le porteur précise que ces douleurs sont recherchées car c'est le but de l'étude, et que les tests s'arrêtent au retrait de la patte. Il justifie le recours à cette lignée transgénique par le fait que la caractérisation de la douleur exige l'observation d'un animal vivant.

Objectifs

Les neurones communiquent en sécrétant des messagers chimiques appelés neurotransmetteurs. Ces messagers sont stockés à l’intérieur de la cellule dans des vésicules spécialisées qui, en fusionnant avec la périphérie cellulaire, libèrent les neurotransmetteurs au bon moment et au bon endroit. Ce processus, appelé exocytose, est à la base de la neurotransmission (transmission d’un message entre 2 neurones). Bien que de nombreuses données aient été générées quant aux protéines impliquées, le rôle de ces protéines sur les comportements nociceptifs et douloureux, ainsi que sur l'initiation et/ou le développement de douleurs chroniques ne sont que très peu étudiés. Aujourd’hui, nous disposons d’une lignée de souris génétiquement modifiées pour la synapsine II (Syn II), une protéine synaptique, pour laquelle ces comportements douloureux pourraient être altérés (ces animaux semblent présenter une hyposensibilité à la douleur). Nous voulons donc étudier l’impact de l’absence de cette protéine Syn II sur les comportements nociceptifs et douloureux, ainsi que sur l'initiation et/ou le développement de douleurs chroniques. Le projet nécessitera 640 animaux et sera conduit en respectant la règle des 3R visant à réduire le nombre d’animaux ainsi qu’à optimiser les procédures. Les souris mâles et femelles seront étudiées en proportions équitables dans le cadre de ce projet.

Bénéfices attendus

A terme, ces données permettront de mettre en évidence, pour la première fois, l’importance des protéines synaptiques dans les circuits de transmission de la douleur et dans la physiopathologie des douleurs chroniques et ainsi trouver de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Un lot d'animaux subiront deux tests nociceptifs d’une durée de 10 min environ par jour pendant 10 jours puis ils recevront une injection sous anesthésie gazeuse d’agent inflammatoire dans une patte postérieure avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs qu’avant l’injection. Un second lot d'animaux subiront un test nociceptif d’une durée de 10 min environ par jour pendant 10 jours puis ils recevront une injection sous anesthésie gazeuse d’agent inflammatoire dans une patte postérieure avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs qu’avant l’injection, à raison de 3 tests maximum (espacés de 2h minium) par jour, pendant 22 jours maximum. Un autre lot d'animaux subiront un test nociceptif d’une durée de 10 min environ par jour pendant 10 jours puis ils subiront une chirurgie sous anesthésie générale avec incision de la patte avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 3 tests maximum (espacés de 2h minium) par jour, pendant 28 jours maximum. Un dernier lot d'animaux subiront un test nociceptif d’une durée de 10 min environ par jour pendant 10 jours puis ils subiront une chirurgie de la patte droite avant de réaliser les mêmes tests nociceptifs, à raison de 3 tests maximum (espacés de 2h minium) par jour, pendant 39 jours maximum.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux inclus dans ce projet induisent une douleur sur laquelle l'animal garde le contrôle: le retrait de la patte ou de la queue de l'animal met fin au test, ou l'animal change de compartiment pour un compartiment plus "confortable". Ces tests sont systématiquement arrêtés au seuil nociceptif, le cas échéant il est arrêté au point limité spécifique de chaque test (décrit dans chaque procédure). Dans les cas de modèle de douleur, les animaux vont développer des douleurs inflammatoires, post-chirurgicales ou neuropathiques selon la procédure car c'est le but de l'étude. Le développement de douleurs inflammatoires s'accompagne d'un développement d'un oedème au site d'injection de l'agent inflammatoire (patte). Cet oedème persistera maximum 5 jours avec la carragénine et 12 jours avec le CFA. De plus, l'utilisation d'antidouleurs de type anti-inflammatoire non stéroïdien ou opiacés n'est pas possible en post-chirurgical dans notres cas car cela interfèrerait avec la mise en place de la douleur que nous étudions. Néanmoins des échelles d'évaluation des points limites spécifiques à chaque modèle de douleur (grille de scoring) sont établie pour chaque animal.

Devenir

Etude sur les animaux naïfs puis étude sur les animaux après injection de carragénine dans la patte (développement d'une douleur inflammatoire): mise à mort à l'issue de la procédure - Etude sur les animaux après injection de CFA (complete freund's adjuvant) dans la patte (développement d'une douleur inflammatoire chronique): mise à mort à l'issue de la procédure. - Etude sur les animaux après une incision de la patte (développement d'une douleur post-chirurgicale): mise à mort à l'issue de la procédure. - Etude sur les animaux après la pose d'un manchon (Cuff) autour du nerf sciatique (développement d'une douleur neuropathique): mise à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

Au vu de notre objectif d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, la caractérisation de la douleur nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Ainsi, au regard des données de la littérature et de la variabilité phénotypique individuelle, en se basant sur notre power analysis, chaque étude de base comporte un groupe témoin et un groupe transgénique, de chaque sexe, de 20 sujets chacun soit 80 animaux. Les animaux n'étant pas consanguins, la variabilité phénotypique est considérablement augmentée. Un calcul statistique "power analysis" a également été réalisé pour s'assurer que les résultats obtenus sont valides sur le plan statistique. Le groupe transgénique est constitué d'animaux issus de la même souche que les sujets non modifiés génétiquement. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés, chaque étude de base regroupe un ensemble de tests comportementaux dont l'enchaînement est compatible avec le bien-être de l'animal, ce qui permet de réduire grandement l’effectif.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des animaleries dont le fonctionnement a été conçu pour maximiser le confort et limiter la souffrance des animaux. En particulier, les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations régulières tout au long de l'expérience, l'enrichissement est systématiquement appliqué à toutes les cages. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Des points limites spécifiques à chaque geste ont été établis. L’induction de modèle de douleur est réalisée sous anesthésie. En cas de nécessité des décisions seront prises en accord avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut pour stopper tout signe de mal-être de l’animal. Remarque : l'utilisation d'antidouleur de type anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et opiacés n'est pas possible en post-chirurgie dans notre cas. Les AINS tout comme les opiacés interfèrent avec les processus inflammatoires nécessaires au développement et au maintien de la douleur neuropathique.

Choix des espèces

Le but est ici de réaliser une étude sur différents paramètres nociceptifs et différents modèles de douleur afin de caractériser la lignée de souris transgéniques SynII (Synapsine 2). Nous ne pouvons pas utiliser un autre modèle que la souris car ce sont des souris transgéniques dont nous voulons connaître les caractéristiques nociceptives physiologiques et/ou éventuellement physiopathologiques. Des animaux adultes âgés d'au minimum 6 semaines (souris dont les poids est supérieur à 20g) seront utilisés car cette étude nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures.

Nées transgéniques, 250 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Chacune subit une chirurgie de trois à six heures sous anesthésie générale pour l'implantation d'équipements miniaturisés d'enregistrement et de stimulation, puis s'habitue en deux à huit jours à porter environ 3 g d'implant et d'équipement, avant des enregistrements menés jusqu'à l'âge de 35 semaines. Le porteur reconnaît que naître transgénique constitue un "potentiel effet indésirable", que le poids de l'équipement peut causer gêne et stress, et que le stress de la chirurgie ou de la contention peut rendre les souris agressives entre elles. Le projet doit aussi mesurer le rôle de la synchronisation cérébrale du sommeil profond dans la consolidation de la mémoire, sans que le porteur décrive aucune tâche d'apprentissage ni aucun test de mémoire.

Objectifs

Les objectifs de cette étude sont 1- d’élucider les mécanismes qui permettent la synchronisation des activités neuronales entre des aires cérébrales distantes pendant le sommeil profond et 2- de déterminer l’importance de cette synchronisation dans la consolidation de la mémoire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice direct de cette étude est l’amélioration des connaissances, dans deux domaines, 1- les mécanismes de base du sommeil profond, et 2- le rôle du sommeil profond dans les processus d’apprentissage et de mémoire. En plus de ce bénéfice direct, les bénéfices indirects de cette recherche fondamentales sont 1- découvrir une nouvelle région cible pour le traitement des troubles du sommeil profond, 2- mettre en évidence l’importance relative des différentes phases du sommeil pour l’apprentissage et la mémoire. 30% de la population européenne est en déficit chronique de sommeil et ceci a de nombreuses conséquences sociales et économiques. Le manque de sommeil est en effet associé à une augmentation des risques d’accidents, mais aussi a un risque accru de souffrir de nombreuses pathologies comme la dépression, l’anxiété, l’obésité, etc. D’autre part la majorité des troubles psychiatriques et des maladies neuro-dégénératives sont associées à des sommeils détériorés qui amplifieraient les symptômes. De plus en plus d’études suggèrent que le sommeil pourrait jouer un rôle important dans l’étiologie de ces pathologies. Il est donc de première importance de comprendre le fonctionnement du sommeil en conditions physiologiques et pathologiques pour ajouter une corde à l’arc thérapeutique.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie consistant en l'implantation d'équipements d'enregisterment et de stimulation miniaturisés. La chirugie d'implantation dure 3-6 heures. Une fois la chirurgie effectuée, les animaux seront hébergés en groupe et libres de leurs mouvements.

Impact sur les animaux

Cette étude sera effectuée grâce à l’utilisation de souris transgéniques. Le fait de naître transgénique est en soit un potentiel effet indésirable pour les animaux. Néanmoins, les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable, suggérant qu’elles ne souffrent pas de la présence du transgène. Les souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale. Le niveau de douleur de cette procédure est modéré et sera atténué par un analgésique pré-opératoire et des analgésiques pendant les 5 jours post-opératoires. La déshydratation pendant la chirurgie sera prévenue par injection de saline. Après les 5 jours post-opératoires, les animaux seront progressivement habitués à être restreint de leur mouvement pendant une brève période dans la main de l’expérimentateur. Une fois les animaux habitués à la contention, leur implant sera connecté au système d’enregistrement (caméra et/ou préamplificateur). Le poids total de l’implant + équipement est d'environ 3 g. Ce poids peut occasionner une gêne pour l’animal ainsi qu’un stress les premiers jours. Pour limiter cela, les animaux seront habitués sur 2-8 jours au port des équipements pendant des périodes de plus en plus longues 2-5 fois par jour. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés en groupe. Néanmoins, il est possible que le stress induit par la chirurgie ou la contention rende les animaux agressifs entre eux. Une manipulation très progressive sera effectuée afin de limiter au maximum les situations où les animaux devraient être séparés. Néanmoins, en cas d’agression, les animaux seront hébergés dans des cages larges avec une grille séparant deux compartiments qui permettent d’héberger deux animaux dans un environnement contigu tout en empêchant les agressions.

Devenir

A l'issue de ce protocole expérimental, les souris seront euthanasiées. En effet, il est essentiel de prélever leur cerveau afin d'effectuer des analyses complémentaires.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques se basant sur des linear mixed models qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. De plus, chaque animal sera enregistré en situation contrôle et de test afin de pairer les résultats ce qui les rend plus puissants.

Raffinement

Le haut niveau de complexité des chirurgies effectué sur ces animaux permet de générer un grand nombre de données par animal et de maintenir une haute qualité d’enregistrements pendant des mois. Dans ce projet, je combinerai les techniques d’imagerie chez l’animal libre de ses mouvements et les enregistrements électrophysiologiques ce qui permettra de réduire encore le nombre d’animaux et d’obtenir des données encore plus riches puisque combinant deux techniques de pointe sur le même animal. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés. En effet, le stress induit par les contentions et les enregistrements conduit souvent les animaux à devenir agressif et à se battre. Néanmoins, l’isolement est également un stress majeur pour les souris, j’ai donc raffiné les étapes d’habituation et de contention afin de limiter le stress des animaux, et ceci me permet de maintenir les animaux au minimum par deux.

Choix des espèces

Ce projet requiert l’utilisation de souris transgéniques. Il n’existe pas de méthode alternative pour étudier un phénomène physiologique aussi complexe que la synchronisation des oscillations cérébrales. La souris possède une architecture du sommeil très similaire à celle de l’humain avec l’alternance de phases de sommeil profond et paradoxal. Pendant le sommeil profond, on observe des phases de haut niveau de synchronisation très proches de celles observées chez l’humain. La diversité des modèles génétiques existants chez la souris permet tout un panel de manipulation de l’activité neuronal dans des types cellulaires donnés. Mon étude vise à déterminer comment différents types de cellules sont impliqués dans la synchronisation des oscillations. L’utilisation de souris transgéniques spécifiques permettra de répondre à ces questions. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines quand la boîte crânienne a atteint sa taille adulte. Les chirurgie seront effectuées entre 8 et 20 semaines et les enregistrements entre 10 et 35 semaines. En effet, ce projet vise à étudier les oscillations chez des animaux adultes non âgés.