Système nerveux

Portant des modifications génétiques ciblant le récepteur CB1 ou les neurones à POMC, 1 984 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 696 d'entre elles reçoivent une injection de particules virales dans le cerveau, 232 se voient implanter une lentille intracérébrale au cours d'opérations de 45 à 75 minutes, et 192 sont gavées de tamoxifène cinq jours d'affilée. Le protocole repose sur un conditionnement à la peur, dont le porteur reconnaît qu'il augmente le niveau de stress, complété par des tests qualifiés d'anxiogènes sans qu'aucun ne soit nommé. Toutes sont tuées à la fin, par dislocation cervicale ou par perfusion intracardiaque après sédation, pour prélever le cerveau et d'autres tissus.

Objectifs

Notre corps réagit à la peur en utilisant ses réserves d’énergie et en modifiant certaines fonctions internes pour nous aider à faire face à la situation. La peur influence notre cerveau de différentes façons, ce qui peut changer nos émotions et notre comportement. Elle peut parfois provoquer des réactions peu adaptées, comme manger de façon compulsive. Dans le cerveau, une zone particulière joue un rôle important dans le contrôle de l’alimentation. Certaines neurones de cette zone (appeler les neurones à POMC) aident normalement à réduire la sensation de faim. Une molécule bien connue, appelée récepteur CB1, intervient à la fois dans la manière dont nous réagissons à la peur et dans la façon dont nous régulons notre alimentation. Le but de ce projet est de comprendre si ce récepteur CB1 peut influencer à la fois la réaction à la peur et le comportement alimentaire dans ces cellules qui participent à limiter la prise de nourriture. Pour cela, nous avons deux objectifs : Voir si le récepteur CB1 modifie l’activité de ces cellules lorsque les souris ont peur et déterminer si ce même récepteur influence la façon dont les souris mangent lorsqu’elles vivent une situation de peur

Bénéfices attendus

Nous souhaitons souligner la nouveauté de ce projet, puisque le rôle de la POMC dans la réponse à la peur n'a jamais encore été étudié auparavant. Les neurones à POMC ont été largement explorés dans le domaine du comportement alimentaire, mais leur rôle dans la régulation de l'anxiété et celui de la peur n'a pas encore été étudié. Il est admis que le stress ou l'anxiété altère le comportement alimentaire, ce qui peut entraîner des troubles du comportement alimentaire et l'obésité. Cependant, les mécanismes moléculaires reliant ces deux phénomènes ne sont toujours pas clairs. Dans ce contexte, les neurones à POMC et le récepteur CB1, par leur capacité à réguler à la fois l'alimentation et la réponse au stress, semblent être de bons candidats pour expliquer l’interaction entre alimentation et comportement de peur.

Procédures

Au cours de ce projet, nous réaliserons des opérations chirurgicales sur des souris POMC*CB1, POMC-Cre et CRH-Cre afin d'injecter des particules virales dans le cerveau. Les souris POMC*CB1 subiront une seule injection de vecteur viral dans le cerveau (696 souris). Les souris POMC-Cre seront également utilisées pour implanter une lentille qui nous permettra d'étudier l'activité neuronale en temps réel (232 souris). Ces procédures durent entre 45 et 75 minutes et sont réalisées sous anesthésie locale et générale (traitement à la lidocaïne au site d'incision et isoflurane pendant la chirurgie). De plus, les souris recevront un traitement analgésique pendant la chirurgie et un traitement antiflamatoire 48h après la chirurgie pour éviter la douleur et assurer une bonne récupération après la procédure. L'état général des souris, ainsi que le poids corporel, seront évalués les jours suivant la chirurgie selon les points limites de définies dans l'annexe 2. Les souris POMC-Cre+ et CRH-Cre+ (96 souris) avec une injection intracérébrale de virus AAV contenant le DREADDS, 4 semaines après la chirurgie, lorsque le virus sera exprimé, nous effectuerons une injection du CNO soit 30 minutes avant le test par voie intrapéritonéale, soit 1 heure avant le test par voie sous-cutanée. Ces procédures seront effectuée seulement une seule fois par animal. Les souris POMC-vglut2 at POMC-GAD (192 souris) recevront une administration orale de tamoxifène pendant 5 jours. Le tamoxifène induit une réduction temporaire du tissu adipeux, entraînant une perte de poids réversible. Pour réduire le stress de l’animal au moment de la procédure, une période d’habituation sera réalisée 3 jours avant le début des 5 jours de gavage.

Impact sur les animaux

Pour les procédures chirurgicales, afin d'éviter toute douleur, nous utilisons des analgésiques en pre-opératoires et réalisons une anesthésie locale de la peau avant l'incision. Après la chirurgie, un traitement analgésique est administré pendant 48h, nous suivons le poids corporel quotidiennement et nous évaluons les animaux selon les points limites. Pour les tests anxiogènes, nous laisserons un intervalle de 7 jours entre les tests effectués sur les mêmes animaux pour leur permettre de récupérer. Nous effectuerons toujours le test le moins anxiogène en premier et avec un maximum de 2 tests chez les mêmes souris. Le test de conditionnement à la peur augmente le niveau de stress chez les souris. Les animaux ayant subi une peur conditionnée ne seront pas réutilisés pour ce même test ou pour un test anxiogène.

Devenir

Toutes les souris utilisées dans ce projet seront sacrifiées à la fin de l'expérience pour récupérer les tissus et réaliser des études moléculaires. Nous sacrifierons les souris de deux manières différentes : la dislocation cervicale pour le prélèvement de tissus frais et la perfusion intracardiaque sur cœur arrêté afin de fixer le cerveau pour les études histologiques. La persufion intracardiaque se fait après une injection intrapéritonéale de Xylazine à une dose de 20mg/kg pour la sédation. Une injection d’euthanasiant (pentobarbital à une dose de 400mg/kg) sera ensuite réalisée 10 à 20 minutes après. Nous attendrons que la souris ne présente plus de signe de coeur battant avant de procéder à l'ouverture de la cage thoracique pour la perfusion.

Remplacement

Pour évaluer l'implication des neurones à POMC et du système endocannabinoïde dans la régulation de la peur et du comportement alimentaire, il n'existe aucune alternative à l'heure actuelle que l'expérimentation animale. L'utilisation d'invertébrés ayant un système nerveux complètement ne serait pas approprié. Le niveau de complexité de l'étude que nous proposons de réaliser est tel qu’aucun modèle informatique ne pourrait remplacer l’animal.

Réduction

Nous avons déterminé, en utilisant un calcul de puissance statistique, que nous avons besoin de 12 à 29 animaux par groupe pour obtenir des données exploitables.

Raffinement

De manière générale, les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 semaines, en cages collectives, et seront manipulés de façon bi-hebdomadaire pendant au minimum une semaine avant le début des expériences. Ces manipulations permettront d’habituer les animaux aux expérimentateurs et de réduire le stress. Les animaux auront une période de récupération d’au moins une semaine entre chaque expérience afin de limiter le stress et l’angoisse. Les animaux soumis à un test de peur conditionnée ne seront pas utilisés pour un autre test stressant ou anxiogène, ils seront sacrifiés après le test. L’enrichissement se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnet en bois pour ronger et de tunnel en carton pour se cacher/manipuler les animaux. Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. Les souris seront hébergées en cages collectives, sauf lorsqu'elles auront à subir une chirurgie, et que la consommation de nourriture devra être consignée.

Choix des espèces

La peur et le comportement alimentaire sont depuis longtemps évalués chez la souris, qui représente une espèce pertinente pour ce type d’étude. La grande majorité des études portant sur les circuits cérébraux et les mécanismes de réponse à la peur, ainsi que l'étude du système endocannabinoïde sont réalisées chez la souris. L'organisation de base des circuits neuronaux est préservée chez les mammifères, ce qui implique que les résultats obtenus chez le rongeur seront transposable à l'humain, ce qui aura pour conséquence de faire avancer les connaissances dans ce domaine et à plus long terme de trouver de nouvelles voies thérapeutiques. Par ailleurs, les modèles génétiques dont nous avons besoin pour répondre à nos questions ne sont disponibles que chez la souris. Les expériences ne commenceront que lorsque les souris seront adultes (8 semaines). Mâles et femelles seront utilisés dans cette étude, car il a été montré que le système endocannabinoïde du cerveau de souris femelles est différent de celui des mâles, à la fois dans les conditions basales et lorsque les souris sont dans une situation de stress.

30 miniporcs adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un cathéter est glissé dans leur canal rachidien lombaire et relié à un boîtier fixé sur la douzième côte, lors d'une opération de deux heures, puis retiré par une seconde chirurgie après un suivi pouvant aller jusqu'à douze mois. Il s'agit de vérifier qu'un sécrétome plaquettaire humain, injecté directement dans le liquide céphalorachidien, peut être administré sans toxicité avant tout essai chez des malades de sclérose latérale amyotrophique. Le porteur attribue à ce produit une "immense activité neuroprotectrice" dans de nombreux modèles expérimentaux, et annonce comme retombée à court terme des publications scientifiques.

Objectifs

La SLA est une maladie neurodégénérative des neurones moteurs qui entraîne une paralysie progressive conduisant irrémédiablement au décès avec une médiane de trois ans. Nous ne disposons d’aucun traitement permettant d’améliorer de manière satisfaisante l’espérance de vie. Ainsi, nous avons développé une biothérapie à partir de plaquettes sanguines de sujets sains qui a démontré une immense activité neuroprotectrice dans de très nombreux modèles expérimentaux. Il s’agit d’un sécrétome plaquettaire qui est dépourvu de membrane plasmique et qui n’entraine donc aucune réaction contre l’hôte (l’administration de sécrétome plaquettaire humain peut être réalisée dans n’importe quelle espèce (humain, rat, souris, singe, porc, …)). Cependant, il ne passe pas la barrière digestive ni la barrière hématoencéphalique. Il nécessite donc une administration directe au niveau du système nerveux central. L’administration intrathécale permet la meilleure biodistribution au niveau du système nerveux central, et notamment de la corne antérieure de la moelle épinière, particulièrement atteinte dans la sclérose latérale amyotrophique. Avant de débuter l’essai thérapeutique, il est essentiel de valider la faisabilité et l’absence de toxicité dans des conditions les plus proches de l’humain. Le modèle de miniporc permet d’utiliser le même matériel que chez l’humain, ce qui n’est pas possible pour les animaux plus petits. Nous espérons améliorer de manière majeure l’espérance et la qualité de vie des personnes atteintes de SLA et ainsi insuffler un espoir thérapeutique pour une maladie mortelle actuellement incurable.Le projet vise à confirmer la sécurité et la tolérance du dispositif médical (DM) ainsi que la procédure d’implantation chez le miniporc, le bon fonctionnement du matériel implanté dans des conditions similaires à l’humain et la sécurité et la tolérance de la biothérapie chez le miniporc. L’utilisation de miniporcs est extrêmement intéressante afin d’obtenir une meilleure transposition des résultats chez l’homme , notamment sa taille et son espace au niveau du canal rachidien qui en fait un bon candidat pour cette étude.

Bénéfices attendus

A court et moyen termes, ce projet aboutira à plusieurs publications scientifiques internationales. A moyen et long termes, cette étude aboutira à la mise au point d'un sécrétome plaquettaire injectable par voie intrathécale pour ralentir l’évolution de la SLA.

Procédures

Tous les animaux de l'étude seront soumis à une procédure chirurgicale pour la mise en place du dispositif médical et une procédure chirurgicale finale afin d'extraire et d'étudier l'implant et son impact sur l'individu. Pour le miniporc, la chirurgie se tiendra sur une durée estimée de 2 heures maximum.

Impact sur les animaux

Chez le miniporc, les effets indésirables post-opératoires peuvent inclure une douleur ou un hématome au niveau lombaire où pénètre le cathéter intrathécal, de la paroi dorsale et sous-costal (le long du trajet du cathéter), ou au niveau du port qui sera fixé au niveau costal latérale (12ème côte). Une sensation de corps étranger ou une gêne locale liée au cathéter et au port est possible. Plus rarement, des infections superficielles des plaies ou une infection du dispositif peuvent survenir. A noter que la chirurgie se tiendra sur une durée estimée de 2 heures maximum. Les animaux seront suivis au maximum durant 12 mois

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car les prélèvements de biopsies ne sont pas compatibles avec la survie de l'animal

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation d’animaux est strictement limitée à cette étude où aucun modèle alternatif ne permettrait de répondre aux questions scientifiques posées. En amont, de nombreux tests in vitro sur neurones en culture et des expérimentations in vivo sur souris ont été réalisée afin de valider la pertinence et la sécurité de l’approche, réduisant ainsi le nombre d’expérimentations sur le miniporc nécessaires. Cependant, malgré ces efforts, le remplacement total des modèles animaux demeure actuellement difficile. Les interactions complexes entre le dispositif, le traitement et l’environnement biologique ne peuvent être entièrement reproduites par des modèles in vitro ou par des approches alternatives comme les organoïdes ou les simulations informatiques. Les études sur des modèles animaux sont donc indispensables pour évaluer la faisabilité et la tolérance de l’approche dans un organisme vivant, en tenant compte des paramètres neurologiques.

Réduction

Le protocole expérimental est conçu pour minimiser le nombre d’animaux utilisés. Les études seront rationalisées en intégrant plusieurs objectifs dans un même protocole. De plus, les observations seront effectuées en combinant différentes analyses afin d’exploiter chaque modèle au maximum de sa pertinence scientifique, réduisant ainsi le besoin de nouveaux groupes expérimentaux. 24 miniporcs sont prévus dans ce projet avec potentiellement 6 miniporcs supplémentaires en cas de problèmes lors des 3 études préliminaires soit 30 miniporcs au final maximum. Nous avons estimé qu’il s’agit du nombre minimal car en dessous de 4 animaux par sous-groupe de sexe aucune conclusion ne peut être tirée. Ce nombre est très classique pour les études de toxicologie sur les grands animaux comme chez le primate non humain. L’analyse est donc principalement descriptive en termes de surveillance clinique (effets indésirables) et en termes d’analyse histologique (pas d’altération des tissus : pas d’inflammation et pas de prolifération cellulaire notamment au niveau des racines rachidiennes). Il est attendu aucune anomalie pour la dose de 3,45 mL. Une dose supérieure est réalisée pour confirmer le seuil de tolérance et aider à l’interprétation d’éventuelles anomalies.

Raffinement

Afin d’optimiser le bien-être animal, des mesures de raffinement rigoureuses seront appliquées. Les conditions d’hébergement respecteront les normes réglementaires : logement individuel, cycle lumineux de 12 h et enrichissement adapté. Les miniporcs bénéficieront de balles, de Kongs garnis de bouillie, de luzerne et de friandises. Les procédures seront réalisées dans des salles dédiées, distinctes des espaces d’hébergement. Une prise en charge analgésique optimale sera assurée : Fentanyl transdermique (patch Durogésic jusqu’à 1 µg/kg/h, efficacité 3 jours), Buprénorphine (0,5 mL/10 kg IM toutes les 8h), Méloxicam (1 mL/10 kg IM, anti-inflammatoire). Les soins seront réalisés sous avis vétérinaire en cas de complications (infection des cathéters…). Un suivi quotidien, voire pluriquotidien, garantira une évaluation rigoureuse. L’échelle visuelle CNRS VetAgroSup aidera à ajuster les traitements antalgiques. Les critères de retrait immédiat incluront : Douleurs sévères non soulagées sous morphiniques (12 h), Perte de poids excessive (≥20 % chez le miniporc), Infections résistantes après 48h, Prostration, absence de réaction ou escarres. En cas d’infection locale, une réintervention sous anesthésie sera réalisée avec parage chirurgical et rinçage antiseptique. L’analgésie au fentanyl pourra être renforcée. Une infection généralisée nécessitera une antibiothérapie adaptée (amoxicilline/acide clavulanique, oxytétracycline, sulfamides/triméthoprime). Un antiémétique (métoclopramide) sera administré si besoin. Une phase d’adaptation de 10 jours précédera toute expérimentation. Un suivi minutieux de la cicatrisation assurera un rétablissement optimal, garantissant des conditions expérimentales rigoureuses et éthiques. Afin de limiter le risque, 3 animaux seront d’abord traités puis le reste des animaux seront inclus, ces 3 premiers miniporcs seront conservés dans l’étude principale si aucun effet secondaire n'est constaté durant l'étude préliminaire.

Choix des espèces

Il n’existe actuellement aucun modèle in vitro permettant d’éviter le recours aux animaux pour ce projet. Les essais in vivo sont menés sur des espèces décrites dans la littérature. Dans un premier temps, nous avons utilisé des rongeurs pour répondre aux principales questions d’efficacité et de sécurité. La faisabilité de l’implantation, du retrait et de la tolérance doit donc nécessairement être validée chez le miniporc. En effet, la transposition des résultats obtenus chez les rongeurs à l’homme est limitée par leurs différences anatomiques et physiologiques, tandis que le miniporc présente de nombreuses similarités avec l’humain et constitue un modèle bien établi. Contrairement aux miniporcs juvéniles, dont le métabolisme et la croissance rapide peuvent biaiser les résultats, l’utilisation de miniporcs adultes permet d’obtenir des données plus transposables à l’Homme. Nous utiliserons des miniporcs adultes de 20 kg à 30 kg.

Cinquante-six xénopes arrivent dans ce projet en ayant déjà subi une ou deux laparotomies lors d'un projet précédent. 80 femelles adultes au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 58 tuées à l'issue et 22 transférées vers un projet suivant. Chacune peut être ouverte au ventre jusqu'à six fois, sous anesthésie et à un an d'intervalle, pour prélever ses ovocytes, avec à chaque fois une douleur post-opératoire de vingt-quatre heures, une semaine d'isolement le temps de la cicatrisation et un risque d'infection des sutures. Le porteur affirme que la modélisation informatique rend mal compte de la membrane cellulaire et qu'il est "indispensable" de travailler sur cellules vivantes, tout en reconnaissant utiliser aussi des lignées cellulaires, moins robustes selon lui.

Objectifs

Les neurones, cellules du cerveau, communiquent entre eux par le biais de protéines appelées récepteurs. Ces récepteurs jouent un rôle central dans les processus tels que l’apprentissage et de la mémoire. La dysfonction de ces récepteurs est impliquée dans de nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, retard mental, autisme, schizophrénie). Il est donc important de comprendre comment ces récepteurs changent de forme pour s’activer et se désactiver, et comment ces mouvements sont affectés par des petites molécules appelées modulateurs. La compréhension de ces mécanismes est en effet une étape cruciale pour la conception de médicaments ciblant les maladies neurologiques et psychiatriques avec une meilleure efficacité et moins d’effets secondaires. De telles études requièrent l’utilisation de modèles cellulaires in vitro, permettant la caractérisation des récepteurs en conditions contrôlées, mais dans un environnement proche de leur environnement natif. Le projet consiste à utiliser les ovocytes de Xénope comme modèle cellulaire in vitro pour étudier les propriétés moléculaires et pharmacologiques d’une famille de récepteurs du cerveau. De par leur grand nombre, leur grande taille, leur robustesse et leur grande capacité à synthétiser des protéines membranaires, les ovocytes de Xénope sont en effet un modèle très puissant pour l’étude des récepteurs du cerveau. Ce projet devrait permettre des avancées scientifiques sur le fonctionnement de ces récepteurs, ainsi que sur la mise au point de nouveaux agents d’intérêt thérapeutique en neurologie et psychiatrie.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus qui constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Une grande majorité de ces troubles s’expliquent par un mauvais fonctionnement des récepteurs neuronaux. Actuellement, un grand nombre de molécules développées pour cibler ces récepteurs échouent en phase clinique à cause d’effets indésirables (somnolence, problèmes de mémoire, hallucinations, toxicité). Une meilleure compréhension des mécanismes induisant un mauvais fonctionnement de ces récepteurs, ainsi que de l’influence de l’environnement chimique de ces récepteurs sur leur fonctionnement permettrait d’améliorer l’efficacité des traitements et limiter les effets secondaires. En outre, ce projet permettra le développement de nouvelles molécules à visée thérapeutique ciblant les récepteurs du cerveau.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie abdominale pour prélèvement d’ovocyte sous anesthésie générale d’une durée d’environ 30 minutes. A la suite de cette procédure, les animaux seront hébergés individuellement durant 7 jours afin de contrôler la bonne récupération/cicatrisation. Cet acte pourra être réalisé au maximum 6 fois par animal avec une période de repos d’au moins une année entre deux actes.

Impact sur les animaux

Nous anticipons les nuisances suivantes sur les xénopes : (i) Hypothermie durant la période d’anesthésie ; (ii) Douleur post-opératoire dans les 24h suivant la laparotomie ; (iii) Inconfort (tiraillements) lié à la cicatrisation de la plaie pour une durée d’environ 7 jours post-chirurgie ; (iv) Dans de très rares cas, éventuelle infection des points de suture ; (v) Léger stress et inconfort lié à la manipulation lors des transferts de l’animal entre les bacs d’hébergement et les bacs d’expérimentation ; (vi) Léger stress lié à l’hébergement individuel post-chirurgie, le temps que la plaie cicatrise.

Devenir

58 animaux seront euthanasiés à l’issue du nombre maximal d’interventions chirurgicales fixé ou avant si leur état de santé ou la taille de leurs sacs ovariens ne permet pas d’atteindre ce nombre. 22 animaux n’auront pas le nombre maximal de chirurgies à la fin du projet et seront donc utilisés dans un projet ultérieur dans le cadre d’une utilisation continue.

Remplacement

Des expériences de modélisation moléculaire in silico seront réalisées pour prédire certaines propriétés moléculaires des récepteurs du cerveau ainsi que les modes de liaisons des composés pharmacologiques s’y liant. Ceci permettra de limiter le nombre d’expériences à réaliser sur les ovocytes de Xénope. Les études in silico ne prennent néanmoins pas en compte la complexité du milieu biologique. En particulier, elles prennent mal en compte la complexité de la membrane cellulaire dans laquelle les récepteurs sont intégrés, et qui joue un rôle fondamental dans le fonctionnement des récepteurs du cerveau. Il est donc indispensable de réaliser des études sur des cellules vivantes pour pouvoir étudier les récepteurs dans un environnement proche de leur environnement natif. Lorsque cela est possible, nous réaliserons aussi des expériences sur lignées de cellules in vitro. Cependant, nous avons constaté au laboratoire que nos récepteurs d’intérêt étaient beaucoup moins toxiques pour les ovocytes de xénopes que pour les lignées cellulaires. Le système ovocyte de Xénope permet donc d’obtenir dans notre cas une meilleure robustesse statistique et une meilleure reproductibilité des résultats scientifiques. En outre, du fait que chaque animal possède un grand nombre d’ovocytes, le modèle xénope implique l’utilisation d’un faible nombre d’animaux pour obtenir la quantité d’ovocytes nécessaires aux expériences.

Réduction

Les sacs ovariens récupérés lors des laparotomies seront divisés en plusieurs lots, conservés à 4 degrés et traités en fonction des besoins pour augmenter la durée de vie des ovocytes. A l’issue du traitement des sacs ovariens, plusieurs centaines d’ovocytes sont récupérés et mutualisés pour les différents projets scientifiques de l’équipe. Ces procédures permettent de limiter la fréquence des interventions. Nous estimons avoir besoin de faire 52 laparotomies par an (1 par semaine), soit 260 laparotomies sur toute la durée du projet. Cette fréquence des laparotomies a été établie sur la base de notre utilisation d’ovocytes au cours des dernières années : nous utilisons les ovocytes de xénopes en continu toute l’année et la durée de survie des ovocytes extraits est d’environ 7 jours. En considérant 56 animaux en utilisation continue depuis un projet précédent ayant subi 1 ou 2 laparotomies et un pourcentage d’animaux dont la procédure s’arrête avant le nombre maximal de laparotomies, nous estimons que le nombre d’animaux utilisés pour ce projet est de 80: 22 animaux resteront en utilisation continue pour un futur projet avec le même projet scientifique et impliquant la même procédure.

Raffinement

Hébergement : Les xénopes sont maintenus en groupes d’individus dans une pièce dont la luminosité et la température sont contrôlées. Les animaux sont hébergés dans un système de recirculation d’eau dont les paramètres de l’eau sont constamment surveillés et ajustés si nécessaire. L’état des animaux (appétit, mobilité, aspect général, état de la peau) est surveillé quotidiennement. Des tubes en plastique servant de cachettes sont mis dans les bacs comme enrichissement de leur milieu de vie. Les animaux sont nourris 3x par semaine avec des granulés pour truite et amphibiens et du cœur de bœuf. Tout animal présentant une altération de son état général est hébergé individuellement dans un bac d’eau saline, hors du système de recirculation pour éviter toute contamination aux autres animaux. Il est traité le cas échéant selon les recommandations du vétérinaire référent, et remis avec ses congénères lorsque son état s’est amélioré. Durant cette période l’état général des animaux hébergés dans le même bac que l’animal malade est surveillé étroitement. Procédure : L’anesthésique utilisé a un effet analgésique, permettant son utilisation unique durant la procédure de chirurgie. D’après nos observations, les xénopes présentent une mobilité normale dès leur réveil sans perte d’appétit ni altération de leur état général dans les jours qui suivent la chirurgie, suggérant une douleur post-opératoire limitée. Un analgésique sera néanmoins appliqué en cas de signes de douleurs post-opératoires. Des mesures non médicamenteuses seront utilisées pour limiter une éventuelle douleur post-opératoire : (i) récupération à l’anesthésie dans un bac avec une faible profondeur d’eau (ne couvrant pas les narines) pour éviter à l’animal de se lever pour respirer; (ii) récupération à l’anesthésie dans une eau saline de concentration proche du milieu interne du xénope, lui permettant de récupérer plus facilement. L’état général du xénope est régulièrement surveillé durant cette période et évalué selon une grille de cotation. Des points limites ont été établis. La taille du groupe de xénopes disponibles dans notre animalerie permet de limiter la fréquence des laparotomies pour chaque animal à une fois par an en moyenne (et maximum 1 fois tous les 6 mois), limitant ainsi les nuisances induites à chaque animal.

Choix des espèces

Le système d’expression en ovocytes de xénopes est très largement utilisé en laboratoire du fait de la grande taille et robustesse des ovocytes facilitant ainsi leur manipulation, et permettant la production de quantité importante de protéines. Le grand nombre d’ovocytes produit par chaque femelle et la robustesse des résultats expérimentaux issus de ce système permettent en outre une grande reproductibilité des expériences tout en utilisant un faible nombre d'animaux. Nous utiliserons des xénopes femelles adultes. Il est nécessaire d’utiliser de tels animaux pour prélever les ovocytes au bon stade de maturation.

Une chirurgie crânienne de quarante ou quatre-vingt-dix minutes, l'injection d'un virus dans le cerveau, puis deux mois d'apprentissage où l'eau n'est accessible que dans le dispositif expérimental : 564 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur range parmi les nuisances la frustration des animaux évacués du dispositif après un temps imposé, de dix secondes à dix minutes selon l'étape. L'objectif est de cartographier le cortex auditif pendant que les souris entendent les vocalises ultrasonores de leurs congénères, présentées comme un possible proto-langage éclairant la dyslexie ou la dysphasie humaines. Le cerveau de chaque animal est prélevé après la mise à mort, et le choix de la souris tient à la maturité des outils d'imagerie calcique et à sa petite taille, qui permet une immobilisation efficace sous le microscope.

Objectifs

Le langage est une fonction cognitive centrale dans le fonctionnement de notre cerveau, qui nous permet de communiquer en société. C’est aussi un élément essentiel de notre vie intérieure et de nos raisonnements. Si l’on connait les aires cérébrales impliquées dans la perception et la reconnaissance du langage chez l’homme, très peu de choses sont connues de l’architecture et du fonctionnement des réseaux de neurones qui les constituent. Quels sont les calculs élémentaires effectués par les cellules de ces réseaux pour identifier les sons spécifiques du langage et les distinguer des autres bruits ? Quels mécanismes au sein de ces assemblées de neurones permettent d’associer ces sons pour percevoir des syllabes, des mots ou des phrases ? Les réponses à ces questions nous permettraient de mieux comprendre l’origine des troubles du langage tels que la dysphasie de compréhension ou la dyslexie. Mais elles nécessiteraient d’être capable d’observer l’activité des cellules à l’échelle individuelles au sein de ces vastes réseaux de plusieurs milliers de neurones pour saisir la logique de leurs circuits. Aucune technique applicable à l’homme ne permet à l’heure actuelle ce type d’observation. Chez la souris en revanche, le développement intense au cours des dernières décennies de nouvelles techniques de microscopie a permis de mesurer l’activité d’ensembles constitués de 1000 à 10 000 cellules simultanément sur l’animal éveillé et en comportement. Les souris émettent elles aussi des vocalises de communication, dans les fréquences ultrasonores, dont la richesse dans différents contextes a été étudiée depuis plus de vingt ans, et qui suggèrent qu’il pourrait s’agir d’un proto-langage. Pourtant, l’existence au sein de leur cortex d’aires spécialisées dans la détection et l’interprétation de ces vocalises sociales reste encore à établir. L’objectif de ce projet consiste à mettre en évidence de telles aires chez la souris et de les imager à l’aide de ces nouvelles approches de microscopie dans un contexte comportemental riche. Il ouvrira ainsi la voie vers une compréhension précise des mécanismes mis en place dans les réseaux de neurones de mammifères pour filtrer et traiter ces sons socialement si importants, et aidera à comprendre à terme l’origine des pathologies du langage chez l’homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet relèvent tout d’abord des avancées en neurosciences fondamentales et indirectement pour les applications à la santé humaine. Le projet va permettre de cartographier pour la première fois l’activité des neurones dans le cortex auditif des souris en réponse aux vocalises sociales. Il va permettre d’identifier, si elles existent, des subdivisions au sein du cortex auditif qui pourraient traiter spécifiquement ces vocalises. Dans ces subdivisions, et grâce à la résolution cellulaire de la microscopie infra-rouge, le projet permettra d’identifier les circuits élémentaires qui détectent les caractéristiques telles que la richesse spectrale des vocalises, leurs rythmes saccadés, ou leurs combinaisons au sein de « phrases » élaborées. En offrant l’accès à ces circuits et la possibilité de les manipuler par opto-génétique, le projet ouvre la porte vers une meilleure compréhension des mécanismes d’encodage du langage ou des proto-langages, en contexte normal et pathologique. Du point de vue du développement des méthodes en expérimentation animale, et en particulier des méthodes d’imagerie optique de l’activité cérébrale chez le rongeur en comportement, les bénéfices attendus du projet sont, là aussi, majeurs. L’approche en boîte automatisée s’affranchit des interactions homme-animal, ce qui contribue à réduire le stress engendré chez les animaux (notion de Raffinement dans la règle des 3Rs). Cela contribue aussi à limiter la variabilité des résultats des expériences en éliminant une source importante de variabilité due à l’opérateur humain, et en réduisant le nombre des cohortes nécessaires (notion de Réduction dans la règle des 3Rs). L’entrainement en groupe avec maintien des relations sociales est aussi un facteur de raffinement. Enfin, l’efficacité des protocoles d’entrainement automatisés et collectifs développés dans le projet devrait rapidement les positionner comme méthode de référence chez la souris.

Procédures

Les animaux seront impliqués dans une chirurgie sous anesthésie et analgésie. Deux types de chirurgie, durant 40 minutes pour l’une et 90 minutes pour l’autre seront appliquées, chaque animal n’étant soumis qu’à un seul type de chirurgie. Après récupération, ils suivent un protocole d’apprentissage comportemental. Ce protocole a lieu dans un dispositif connecté à leur cage d’hébergement, dans lequel les animaux peuvent s’engager volontairement aux moments qu’ils choisissent, à la fréquence qui leur convient, et pour des sessions individuelles qui pourront durer de 10 secondes à 10 minutes. Pour une partie des animaux, des mesures d’imagerie sont effectuées pendant certaines sessions comportementales, à l’aide d’un microscope infra-rouge capable d’imager les milieux diffusants. Cumulées sur 24h, ces sessions d’imagerie dureront typiquement 20 minutes. D’autres sessions comportementales seront associées à des interventions optogénétiques susceptibles d’identifier les fonctions cognitives à l’œuvre lors de ces comportements. Ces interventions optogénétiques utilisent un mode « sans contact », uniquement basé sur l’application de lumière sur les animaux. Ces sessions optogénétiques cumulées sur 24h dureront environ 1 minute. Le protocole d’apprentissage, les sessions d’imagerie et d’optogénétique s’étaleront sur une période pouvant aller jusqu’à 2 mois.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus ou envisageables sont les suivants. Stress (estimé faible) lié à l’hébergement, à la manipulation pendant la période précédant le protocole comportemental, à la contrainte d’être maintenu immobile pendant certaines phases du protocole comportemental, à la gêne due à l’implant. Frustration des animaux due à leur évacuation imposée du système comportemental après un temps déterminé (10 sec – 10 min selon les étapes du protocole). Pendant la chirurgie, des évènements rares : anesthésie insuffisante, douleur, écart de température, saignement. En période post-opératoire, des évènements rares : douleur, écart de température, infection, notamment des plaies autour de l’implant, signes neurologiques dus à l’injection de virus. Avant l’anesthésie, des évènements rares : anesthésie insuffisante, douleur.

Devenir

L’euthanasie de tous les animaux dans toutes les procédures est nécessaire afin de permettre le prélèvement du cerveau pour les analyses histologiques post-mortem.

Remplacement

De très nombreux travaux ont été menés en mathématiques et algorithmique pour étudier les caractéristiques sonores de la voix, pour décomposer le langage en briques élémentaires (syllabes, mots, phrases…) et permettre une reconnaissance automatique du langage. Les progrès des approches basées sur l’intelligence artificielle en font aujourd’hui des outils utilisés par un très large public. Cependant l’architecture simplifiée des réseaux de neurones formels sur lesquels reposent ces approches est très éloignée de ce que l’on connait des réseaux de neurones biologiques constitutifs du cortex auditif, beaucoup plus complexes. Une compréhension du fonctionnement des circuits corticaux impliqués dans le traitement du langage et de leurs dysfonctionnents en contextes pathologiques ne peut être obtenue qu’en étudiant des organismes biologiques placés en situation de traitement des signaux vocaux. Il n’est donc pas possible de remplacer pour ce projet l’utilisation de souris en comportement par des systèmes in vitro ou in silico.

Réduction

Deux méthodes mises en œuvre : 1) Automatisation de l’apprentissage : élimination des interactions humaines, sources de variabilité (stress, fluctuations comportementales). Cela permet d’obtenir des résultats robustes avec moins d’animaux. 2) Microscopie à deux photons : mesure de plus de 1000 cellules par animal (dix fois plus qu’en électrophysiologie) permettant un suivi longitudinal des mêmes neurones qui augmente les données exploitables par individu et réduit le nombre d’individus nécessaires au projet. De plus, des analyses effectuées au fur et à mesure de l’obtention des mesures permettront d’ajuster les effectifs en les réduisant au minimum de ce qui s’avèrera nécessaire pour démontrer statistiquement les effets étudiés. Des analyses non paramétriques seront choisies pour leur robustesse statistique. Ainsi, le nombre total d’animaux impliqués dans les trois procédures ne devra pas excéder 564 souris.

Raffinement

Deux méthodes de raffinement principales seront mises en œuvre: 1) Automatisation de l’apprentissage : limitation des interactions homme-animal au minimum, contribuant à réduire le stress qui aurait pu être engendré chez les souris lors des manipulations. 2) Entrainement en groupe : maintenance des relations sociales. Autres mesures de raffinement mises en œuvre : Pour les chirurgies, une médication (anesthésie et analgésie) pré- et post-opératoire et un maintien de la condition d’homéothermie sont assurés. L'ensemble des interventions à pratiquer sur un animal sont regroupées afin de n’y opérer qu’une seule chirurgie. Le suivi post-opératoire est constitué de deux phases, le premier jusqu’au réveil complet de l’animal, le second, les jours suivants pour vérifier que l’animal récupère correctement (activité locomotrice, poids, aspect du pelage, activités sociales). Cette récupération aura lieu en dehors du dispositif de la boîte de comportement et de la cage d’habitation, durera deux semaines et sera effectuée dans des cages de stabulation en portoirs ventilés. Des points limites ont été définis et seront appliqués afin de garantir la minimisation de risque de souffrance des souris les atteignant. L’hébergement, pendant la récupération post-chirurgicale ou pendant l’apprentissage dans le dispositif de comportement, se fera dans des conditions conformes à la réglementation. La température (entre 20 et 24 degrés) et l'hygrométrie seront contrôlées et monitorées, le cycle jour nuit sera automatique (12h/12h). Pendant la phase de récupération, les souris auront un accès ad libitum à l’eau et la nourriture. Pendant la phase d’apprentissage, l’eau ne sera accessible que dans la boîte de comportement et la nourriture sera disponible ad libitum dans la cage d’habitation. Les souris seront hébergées par lots de 10 souris de même sexe. L’hébergement individuel des animaux ne sera mis en place transitoirement qu’en cas de nécessité d’isolement dû à des contraintes zootechniques, par exemple en cas d’agression entre congénères. Les hébergements lors de la récupération et de l’apprentissage auront un milieu enrichi pour la nidification (lanière kraft), la mastication (bâton), et la disponibilité de refuges (hutte). Durant l’apprentissage, une roue d’activité sera disposée dans la cage d’habitation. Pour les animaux en provenance d’un fournisseur extérieur, une période d’acclimatation d’une semaine sera prévue avant leur entrée dans l’une des procédures du projet.

Choix des espèces

La souris est un mammifère, dont l’architecture cérébrale est plus proche de celle de l’homme que celle des modèles aviaires chantants. Comparées aux autres mammifères sociaux vocalisants, comme les marmousets, la souris présente deux avantages. Premièrement c’est une espèce pour laquelle les outils d’imagerie calcique sont matures : les rapporteurs fluorescents d’activité neuronale y sont très optimisés et leur petite taille permet une immobilisation sous le microscope efficace. Deuxièmement la disponibilité de souris transgéniques offre des outils puissants pour identifier la composition des circuits neuronaux en manipulant certains types cellulaires (optogénétique), et comprendre leur rapport structure - fonction. La souris représente donc le meilleur compromis entre proximité avec l’architecture de mammifère du cerveau humain, et adaptation aux méthodes optiques d’enregistrement et de manipulation les plus puissantes. Les souris utilisées seront des souris adultes exclusivement, âgées de 8 semaines au moment des chirurgies et de 9-10 semaines au démarrage de l’apprentissage. Le projet vise à comprendre les mécanismes d'apprentissage de l'adulte, et cherche à cartographier les régions corticales auditives telles qu’elles existent chez l’adulte ayant développé une large gamme de vocalises sociales.

Pour étudier comment le cerveau perçoit le temps, 512 souris sont entraînées une à trois semaines dans des enceintes expérimentales, motivées par des récompenses alimentaires obtenues au prix d'une réduction contrôlée de leur ration. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Jusqu'à deux chirurgies de deux heures sous anesthésie générale servent à implanter le système d'imagerie que les animaux portent ensuite pendant les tests, encombrement dont le porteur reconnaît l'inconfort. Les souris qui ne peuvent pas être incluses dans les tests comportementaux seront, écrit le porteur, "valorisées" dans une expérience de mise au point d'outils d'analyse.

Objectifs

Dans notre vie quotidienne, nous évaluons constamment le temps : combien de temps avant que le feu passe au vert ? Quand avons-nous voyagé la dernière fois ? Ces processus sont fondamentaux pour notre mémoire, nos prises de décision et nos capacités d’adaptation. En effet, la perception du temps est une fonction cognitive essentielle permettant aux organismes d’interagir efficacement avec leur environnement. Que ce soit pour anticiper un événement imminent ou pour structurer des actions ou des expériences vécues sur des périodes étendues, la capacité à percevoir et encoder le temps joue un rôle clé dans la survie et l’adaptation. Des perturbations de ces processus peuvent altérer les capacités d’adaptation face au stress et contribuer à des troubles psychiatriques tels que la dépression, les troubles anxieux et de stress post-traumatique. La manière dont le cerveau représente et stocke les informations temporelles reste encore mal comprise. La perception et l’encodage du temps reposeraient sur des réseaux cérébraux complexes impliquant des régions comme l’hippocampe et le striatum. Cependant, ces régions n’encodent pas le temps comme un simple chronomètre : leur activité fluctue, se transforme au fil du temps et s’adapte en fonction de l’expérience, de l’apprentissage et de l’âge. Il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes associés, ceux permettant notamment d’estimer la durée de stimuli ou l’horodatage et les caractéristiques temporelles des expériences vécues. Ainsi, ce projet a pour objectif d’étudier les mécanismes cérébraux impliqués dans la perception du temps, à des échelles courtes (dizaines de secondes) et longues (heures à semaines), à travers l’étude du comportement des animaux dans différentes situations expérimentales . En outre, nous testerons dans une dernière expérience, les effets d’un mélange gazeux d'oxygène et de protoxyde d'azote, utilisé pour ses effets analgésiants, qui est actuellement développé comme alternative thérapeutique à action rapide dans certaines pathologies psychiatriques comme la dépression. Il est établi que le mélange gazeux affecte les états de conscience mais ses effets immédiats et différés sur la perception et l’encodage du temps ne sont pas connus alors qu’ils pourraient avoir un rôle important à jouer dans ses effets bénéfiques comportementaux et thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le premier objectif de ce projet est d’apporter des connaissances essentielles sur les mécanismes cérébraux sous-tendant l’encodage du temps à court-terme et dans la mémoire à long terme. Une meilleure compréhension de ces processus fondamentaux est cruciale pour comprendre les bases neuronales de la mémoire et les capacités d’adaptation cognitive. L’approche par imagerie calcique offre une précision inatteignable pour observer en temps réel le fonctionnement des populations neuronales du cerveau lors de la réalisation de tâches liées à la perception du temps et à la mémoire, permettant d’analyser des mécanismes auparavant inaccessibles. Ces découvertes seront d’autant plus précieuses que les zones du cerveau impliquées jouent un rôle central dans de nombreuses autres fonctions cognitives et sont affectés dans troubles comme la dépression, l’anxiété et les troubles de stress post-traumatiques. En outre, ce projet implique également l’évaluation des effets d’un mélange gazeux d’oxygène et protoxyde d’azote actuellement utilisé pour ces propriétés analgésiantes mais en cours de développement et d’évaluation comme alternatives thérapeutiques à action rapide dans la dépression.

Procédures

Les animaux seront soumis à des phases d’entrainement et de tests comportementaux sur des périodes allant de 1 à 3 semaines, selon l’expérience concernée. Ces phases correspondent à des explorations libres ou dirigées quotidiennes, dans différentes enceintes expérimentales (avec des récompenses alimentaires), d’une durée comprise entre 10 et 30 minutes par session et qui pourront être répétées selon l’expérience. Afin de maintenir la motivation pour la récompense alimentaire, certaines phases expérimentales incluront un contrôle alimentaire léger, consistant en une réduction contrôlée de l’apport alimentaire avant la session expérimentale sur une période de 1 à 3 semaine. La distribution est quotidienne et ajustée individuellement. Dans certaines expériences, les souris seront également soumises au maximum à 2 interventions chirurgicales, chacune d’une durée approximative de deux heures, réalisées sous anesthésie générale. Les animaux pourront être hébergés en cage individuelle de manière ponctuelle, notamment après les interventions chirurgicales (pendant 24 à 72 heures) et lors des périodes nécessitant un contrôle alimentaire individualisé (1 à 3 semaines)

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations/contentions ainsi que l’hébergement isolé en cage, l’isolement lors des tests de comportement et la restriction alimentaire peuvent engendrer du stress pour l’animal. L’intervention chirurgicale peuvent induire des douleurs post-opératoires légères avec un impact réduit dans le temps (quelques jours) sur le bien-être animal. Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les souris seront encombrées d’un système d’imagerie lors des tests, ce qui peut engendrer de l’inconfort.

Devenir

La totalité des animaux de l’étude seront mis à mort. Pour les besoins de l’étude, nous devons prélever le cerveau pour vérification histologique et investigation de l’expression de protéines d’intérêt.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée : l’étude des bases comportementales et neurales de la perception et l’encodage du temps et de leur mémoire à différentes échelles d’analyse. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale de fonction cognitive complexe comme dans notre étude repose sur l’observation directe du comportement de l’animal et de ses performances mnésiques tout en effectuant l’enregistrement de l’activité neuronale lors de la réalisation de ces tâches comportementales et de mémoires.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique permettant une réduction des effectifs optimisée selon les recommandations éthiques.

Raffinement

Les chirurgies sont réalisées par du personnel formé et expérimenté, sous anesthésie générale afin de garantir l’absence d’inconfort pendant les gestes réalisés. Des constantes physiologiques sont suivies pendant l’intervention et des précautions sont prises pour maintenir l’animal dans les meilleures conditions. Des mesures sont mises en place avant et après les interventions afin d’assurer un confort et une récupération rapide des animaux. Les animaux font l’objet d’une surveillance régulière pendant plusieurs jours afin de vérifier leur bon état général et leur reprise d’activité normale Les expériences comportementales incluent une phase d’habituation progressive à l’expérimentateur, aux dispositifs et conditions de test afin de réduire le stress. Les manipulations ne nécessitent pas de contentions. Lorsqu’un hébergement individuel est requis, il est limité dans le temps. Des enrichissements supplémentaires sont apportés (matériel de nidification, abris, des tubes et objets à mordiller). Les animaux sont regroupés dès que les conditions le permettent. Les animaux ne pouvant pas être inclus dans les expériences comportementales seront valorisés, en intégrant une expérience permettant la création de nouveaux outils d’analyses sans recourir à des animaux supplémentaires.

Choix des espèces

Le choix de la souris se justifie par la similarité entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, espèce modèle dans le domaine des études des bases neurobiologiques de la mémoire, de la formation des souvenirs et de dysfonctions de la mémoire. Les souris utilisées seront des individus adultes, l’étude ayant comme objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes normaux sous-tendant l’association temporelle de souvenirs et sa mise en mémoire dans des conditions normales. Il n’est pas nécessaire d’utiliser des stades plus spécifiques du développement par rapport à l'objectif scientifique de l'étude.

Le rat est retenu parce qu'il consomme spontanément la plupart des drogues d'abus et apprend vite les tâches qui lui en donnent accès. 800 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré: pose d'un cathéter intraveineux sous anesthésie, chirurgie crânienne de deux heures, puis jusqu'à vingt-cinq séances quotidiennes d'auto-administration d'héroïne de trois heures ou dix séances de cocaïne de six heures. Ils vivent seuls dès la première opération et jusqu'à la fin, isolement que le porteur présente comme reproduisant les conséquences négatives de la consommation de drogues. Tous sont tués à la fin de l'expérience pour que deux régions de leur cerveau soient analysées.

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie chronique, marquée par un risque important de rechute, c’est-à-dire la reprise de la consommation après une période d’abstinence. Ces rechutes sont souvent déclenchées par des situations, des lieux ou des contextes associés à la consommation passée. Elles seraient liées à des modifications durables du cerveau provoquées par les drogues. Des études chez l’animal montrent que le métabolisme du cholestérol dans le cerveau joue un rôle important dans les comportements addictifs et que manipuler le métabolisme du cholestérol dans le cerveau permettrait de réduire la recherche de drogue après une période d’abstinence. Cependant, les mécanismes précis à l’origine de cet effet restent mal compris. Une hypothèse est que cette diminution de la recherche de drogue serait liée à une baisse de la sensibilité aux contextes associés à la consommation, qui sont connus pour déclencher l’envie de consommer. Ce projet de recherche a trois objectifs principaux : 1. L’objectif est de déterminer le rôle respectif de deux zones cérébrales dans les effets bénéfiques de la manipulation du cholestérol, afin de mieux comprendre les mécanismes cérébraux impliqués. 2. Le projet vise également à déterminer si la modification du métabolisme du cholestérol dans ces régions du cerveau influence la réactivité aux contextes associés à la consommation de drogue. 3. Enfin, l’étude examinera si des effets similaires sont observés avec l’héroïne, une drogue appartenant à une classe différente de la cocaïne.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’apporter une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et comportementaux expliqués dans la vulnérabilité à la rechute dans le cadre d’une addiction à la cocaïne ou à l’héroïne. Ces expériences pourraient conduire à une meilleure prise en charge des personnes addictes et au développement de thérapies médicamenteuses pour réduire les taux de rechutes (nouvelles consommations) de cocaïne ou héroïne, en particulier celles déclenchées par le contexte.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter (durée : 15minutes par animal,) pour permettre l’auto-administration. - chirurgie crâniale pour moduler l’expression d’un gène : 1 fois (2 heures par animal) Sur animaux vigiles : - en amont de chaque chirurgie, 1 injection d'antalgiques et 1 injection d’analgésique - après la chirurgie, 2 injections d’antalgiques par animaux - 10 sessions d’auto-administration de cocaïne (1 session / jour, 6 heures par session) - 10 sessions d’auto-administration de saline (1 session / jour, 6 heures par session, contrôle de la cocaïne) - 25 sessions d’auto-administration d’héroïne (1 session / jour, 3 heures par session) - 25 sessions d’auto-administration de saline (1 session / jour, 3 heures par session, contrôle de l’héroïne)

Impact sur les animaux

Chirurgies : inconfort transitoire au réveil minoré par des antalgiques et une surveillance renforcée Implantation d’un cathéter intraveineux à demeure : risques d’infection ou démangeaisons Auto-administration de drogue (cocaïne ou héroïne) et abstinence : induction d’un stress léger à modéré Effets liés à la cocaïne : L’administration contrôlée de cocaïne peut induire des effets secondaires comportementaux (hyperactivité, stéréotypies, anxiété), sans atteinte somatique attendue à court terme. Une surveillance comportementale est prévue pour prévenir toute dérive. Effets liés à l’héroïne : L’administration contrôlée d’héroïne peut induire des effets secondaires comportementaux tels que sédation, hypoactivité locomotrice et modifications transitoires de la vigilance, sans atteinte somatique attendue à court terme dans les conditions expérimentales prévues. Une surveillance comportementale est mise en place pour prévenir toute complication. Isolement : peut induire un stress modéré, qui fait partie intégrante du protocole utilisé.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases comportementales, cellulaires et moléculaire du comportement de recherche de drogue et de l’apparition de nouvelles consommations chez les personnes addictes peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Les effectifs sont optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance et en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Chaque animal sera valorisé : il participe à des mesures comportementales, et son cerveau sera analysé à l’issue de l’étude, ce qui permet de combiner des données fonctionnelles et biologiques sans duplication des effectifs.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide à surveiller l’atteinte éventuelle des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée journalière pendant 3 jours après les chirurgies, journalière pendant les sessions de consommations et 1 fois par semaine pendant l’abstinence. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau ad libitum. Lors de l’entrée en procédure (première chirurgie, les animaux seront séparés pour être exposés à des conditions de vie reflétant les conséquences négatives de la consommation de drogues isolement social et ce pendant toute la durée de la procédure. Un contact visuel sera maintenu. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum. Lors des chirurgies un recours à une anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, ainsi que d’un maintien de la température par tapis chauffant sera effectué. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire pour une couverture totale de 72heures. Les animaux seront manipulés à partir du cinquième jour pour une habituation à l’expérimentateur.

Choix des espèces

Le rat est l’une des espèces les plus pertinentes et les plus utilisées pour l’étude des mécanismes d’addiction. Il présente une pharmacosensibilité aux substances addictives proche de celle observée chez l’humain, et consomme spontanément la plupart des drogues d’abus, dont la cocaïne et l’héroïne. Le rat apprend facilement des tâches opérantes complexes et développe des comportements addictifs reproductibles, ce qui n’est pas le cas d'autres espèces. Ceci en fait un modèle de choix pour étudier l’addiction et les rechutes. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.

Exposés à de la lumière bleue la nuit dès le sevrage, à trois semaines, 558 rongeurs diurnes reçoivent des injections dans l'œil, subissent des électrorétinographies d'une heure et des chirurgies cérébrales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun vit seul en cage à partir de vingt jours et jusqu'à la fin des procédures. Le porteur range cet isolement parmi les nuisances attendues, puis parmi ses mesures de raffinement, en précisant que les animaux se voient et s'entendent d'une cage à l'autre. Six tests comportementaux qu'il dit validés sont annoncés sans être nommés, et l'espèce n'est jamais précisée, désignée seulement comme un rongeur diurne de laboratoire, avant que tous soient tués pour prélever la rétine et le cerveau.

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 heures de l’environnement synchronise l’horloge biologique du cerveau. La lumière exerce à la fois des effets positifs et négatifs en fonction de ses caractéristiques (moment d’exposition, durée, intensité spectre, etc…). La littérature montre qu’une exposition aberrante à la lumière, c’est-à-dire une exposition la nuit notamment dans la région bleue du spectre, altère les rythmes de l’organisme et induit des états dépressifs chez l’animal et chez l'humain. Un candidat clé pour la médiation des effets de la lumière sont les cellules à mélanopsine localisées dans la rétine. En effet, la lumière pénètre dans l’organisme à travers la rétine et est captée par un type de cellules particulier : les cellules photoréceptrices à mélanopsine. Ces cellules permettent la conversion du signal lumineux en un signal biochimique, transmissible alors à d’autres cellules. Ici, le signal sera transmis jusqu’aux structures du cerveau qui régulent les rythmes biologiques et l’humeur. Les adolescents présentent un risque particulier à l’exposition nocturne à la lumière bleue car l'apparition de la plupart des maladies mentales survient avant l'âge de 25 ans et ils présentent une sensibilité plus importante à la lumière. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue la nuit de manière chronique, et ce dès l’adolescence, va contribuer au développement de troubles affectifs et visuels sur le long terme. Afin de vérifier cette hypothèse, notre étude sera réalisée sur un modèle de rongeur diurne la rendant plus pertinente que celles menées habituellement sur les modèles de rongeurs nocturnes utilisés en laboratoire tels que les rats ou les souris. Les objectifs sont de déterminer : 1) Impact de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur l'humeur à l'aide de différents tests comportementaux validés. 2) Conséquences de l’exposition à la lumière bleue nocturne sur la rétine, son fonctionnement et ses projections vers le cerveau. 3) Caractérisations des effets de la lumière bleue dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine, régulant l'humeur. Cette analyse multidimensionnelle, allant de la cellule au comportement de l’animal, aura des résultats déterminants aux niveaux fondamental et clinique.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition aberrante à la lumière bleue de manière chronique et sur le long terme, sur le développement direct de troubles affectifs et visuels chez un rongeur diurne. En effet, les études actuelles se concentrent davantage sur l’étude de la lumière bleue en se basant sur des modèles de rongeur type souris ou rat, en débit de leur physiologie nocturne et donc, éloignée de celle de l’humain. Les données obtenues sur le modèle diurne pourront donc permettre une réflexion translationnelle plus pertinente.

Procédures

Afin de définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte différents types d'interventions. Dans un cas, les animaux seront soumis à 6 tests comportementaux validés permettant d'étudier l'effet de la lumière sur leur humeur. La durée d'un test est variable, mais dure environ 10 minutes pour un animal. Afin d'étudier les effets de l’exposition lumineuse sur les cellules à mélanopsine de la rétine, les animaux seront soumis à des injections oculaires, qui se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’exploration de la fonction visuelle se fera par électrorétinographie (ERG), sous anesthésie. Les ERG durent environ 1h et auront lieu à 3 reprises : avant l’exposition, et à 2 âges post-nataux pertinents pour les cinétiques des autres expériences : P50 et P80. Enfin, afin de vérifier l'implication d'une structure cible du cerveau impliquée dans la régulation de l'humeur, nous allons réaliser une chirurgie sur animaux anesthésiés, La totalité de la procédure dure environ 1h. Une chirurgie terminale sera réalisée sous anesthésie générale afin de prélever les tissus d'intérêts.

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances listées ci-dessous : 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien et de l’humeur (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs, hébergés habituellement en groupes. 3) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 4) Les animaux seront soumis à des anesthésies, des injections dans l'oeil, ainsi qu'à des chirurgies cérébrales susceptibles d’induire une douleur modérée, un risque infectieux et/ou inflammatoire, une perte de poids, etc. Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…)

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière à partir de l’adolescence et sur le long terme chez l’adulte, sur l’humeur et la vision. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base de notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L’effet sur la vision sera évalué par une approche longitudinale à différents stades de l’exposition à la lumière. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification, tunnel et bâton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement, état des yeux) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur un modèle de rongeur diurne de laboratoire. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères à long terme d'une exposition aberrante à la lumière bleue commençant dès l’adolescence, afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'humain. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (dès le sevrage, c'est à dire à 3 semaines) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur l’humeur et la fonction visuelle.