Système nerveux

Une première chirurgie de 35 minutes injecte dans le cerveau de 598 souris un composé qui déclenche une épilepsie, parfois complétée par la pose d'électrodes crâniennes. Deux semaines avant, cinq jours après ou quatre à six semaines après, une deuxième chirurgie d'une heure délivre les facteurs de reprogrammation, et certaines souris en subissent une troisième de 45 minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Celles dont les crises sont enregistrées vivent seules en cage pendant trois mois, un isolement que le porteur qualifie de stress modéré. Toutes sont tuées par surdose d'anesthésique, entre deux et soixante jours après la dernière opération, pour prélever leur cerveau.

Objectifs

La reprogrammation cellulaire, qui consiste en la conversion de cellules non-neuronales du cerveau, c-à-d les cellules gliales, en nouveaux neurones dits induits (iNs), a récemment émergé comme une nouvelle stratégie thérapeutique afin de remplacer les neurones perdus et restaurer les fonctions cognitives. Ainsi, nous avons récemment démontré dans un modèle d’épilepsie chez la souris que les cellules gliales du cerveau pouvaient être reprogrammées en nouveaux neurones inhibiteurs et que les iNs ainsi générés permettaient une réduction de moitié des crises d’épilepsie. Ces résultats démontrent pour la première fois l’intérêt de la reprogrammation cellulaire pour le traitement des épilepsies. La stratégie de reprogrammation utilisée dans cette étude se basait sur l’utilisation de rétrovirus permettant de cibler l’expression des facteurs de reprogrammation spécifiquement aux cellules gliales en division lors des stades précoces du développement de la maladie. Néanmoins, une telle stratégie ne pourrait pas être envisageable pour une application clinique où une stratégie thérapeutique basée sur la régénérescence des neurones perdus devra être mise en place lors de la phase chronique, c-à-d une fois la maladie diagnostiquée. Nos premiers résultats révèlent que les cellules gliales de la phase chronique ont cessé de se diviser. Le présent projet vise donc à étudier la possibilité de reprogrammer les cellules gliales en phase chronique de la maladie à l’aide d’autres outils viraux, les lentivirus, qui ne nécessitent pas une division cellulaire de la cellule d’intérêt pour intégrer leur génome à celui de la cellule gliale. Un autre projet actuellement en cours vise à étudier si la division des glies est nécessaire à leur reprogrammation. Dans le cas où celle-ci s’avérait nécessaire, nous incluons dans ce projet des expériences visant à stimuler la division des glies en phase chronique de la maladie. Le projet s’organise en 4 axes : 1) Validation de la stratégie de reprogrammation à l’aide de lentivirus en étudiant si ces outils permettent de cibler avec efficacité les cellules gliales 2) Comparer l’efficacité de reprogrammation de rétrovirus et lentivirus en phase aigüe et chronique de l’épilepsie 3) Valider une stratégie permettant de stimuler la division des glies en phase chronique 4) Etudier l’impact de la stimulation de la division des glies en phase chronique sur l’efficacité de reprogrammation et l’impact fonctionnel des iNs sur les crises d’épilepsie.

Bénéfices attendus

Le cerveau adulte étant incapable de se régénérer, le développement de stratégies thérapeutiques visant à remplacer les neurones perdus en cas de traumatisme ou de maladie cérébrale pourrait avoir à terme un fort impact dans le domaine de la santé. Nous avons précédemment démontré que la reprogrammation cellulaire permettait de réduire les crises dans un modèle d’épilepsie réfractaire aux médicaments chez la souris. Ces résultats sont très encourageants et représentent une première preuve de concept de l’utilisation de la reprogrammation pour le traitement des épilepsies. Cependant, de nombreuses limites doivent être surmontées avant de pouvoir envisager une thérapie en clinique. Notamment, le présent projet nous permettra de déterminer si la stratégie de reprogrammation des glies en neurones peut aussi être adaptée en phase chronique de l’épilepsie, moment le plus adéquat pour son application chez l’homme. La démonstration que les glies de la phase chronique peuvent être reprogrammées avec efficacité, même en absence de division, permettrait également d’envisager la généralisation de la reprogrammation cellulaire à d’autres pathologies, comme les maladies neurodégénératives, où la mort neuronale n’est pas accompagnée d’une division des glies.

Procédures

Le présent projet implique un modèle d’épilepsie chez la souris générée par injection d’un composé chimique. Ainsi, la totalité des animaux impliqués dans le projet subiront une chirurgie sous anesthésie générale et anesthésie locale renforcée afin d’injecter le composé (durée : 35 min). Pour certaines souris, nous profiterons de cette injection pour procéder dans le même temps à l’implantation d’électrodes pour enregistrement électroencéphalographique (EEG). Tous les animaux recevront une 2ème chirurgie sous anesthésie générale (durée : 1h) pour délivrer les facteurs de reprogrammation 2 semaines avant, 5 jours après ou 4-6 semaines après l’induction de l’épilepsie. Enfin, certaines souris impliquées dans l’étude recevront une 3ème injection (durée : 45 min), 6-8 semaines après la 2ème. Certains des animaux recevront une molécule par gavage (1X/jour sur une durée de 2-7 jours), 4 à 6 semaines après leur dernière chirurgie, afin d’induire la reprogrammation. Enfin, les animaux seront euthanasiés par surdose d’anesthésique entre 2 et 60 jours après la dernière chirurgie.

Impact sur les animaux

Au sortir de la chirurgie permettant de générer le modèle d’épilepsie, les animaux sont en « état de mal épileptique » non convulsif, c’est-à-dire que des décharges sont enregistrées sur un EEG dans leur cerveau. Cet état n’est pas douloureux mais induit des périodes d’immobilisation spontanée qui peuvent entraîner une perte de poids transitoire (48h), les animaux tendant à moins s’alimenter durant cette période. Par la suite, les animaux épileptiques peuvent présenter quelques légers troubles de mémoire et une faible élévation de l’anxiété. Toutes les procédures impliquent une deuxième chirurgie, une procédure implique quant à elle 3 chirurgies successives. A la suite de chaque chirurgie, malgré les mesures de raffinement, certains animaux peuvent rarement présenter de légères douleurs, une faible perte de poids ou un risque d’infection au site d’incision. L’administration par gavage nécessite d’introduite une canule de gavage dans l’œsophage de l’animal. Le maintien de l’animal et l’introduction de la canule peuvent induire un inconfort et un stress transitoires. Les animaux chez lesquels l’enregistrement EEG des crises est prévus seront hébergés en cages individuelles. L’isolement social (durée : 3 mois) peut induire un stress modéré.

Devenir

Les expériences réalisées dans ce projet nécessitent de prélever le cerveau pour soit (1) isoler les cellules afin d’analyser quels gènes sont exprimés, soit (2) effectuer des analyses histologiques directement sur tranches de cerveau. Ces différentes analyses n’ont pas d’alternative qui éviterait la mise à mort des animaux.

Remplacement

Ce projet vise à démontrer la possibilité de reprogrammer les cellules gliales de la phase chronique de l’épilepsie en neurones induits matures, capables de s’intégrer dans les réseaux neuronaux et de réduire les crises d’épilepsie. L’étude de l’impact fonctionnel des neurones ainsi générés sur les symptômes épileptiques nécessite donc de se placer dans un modèle animal. Ce projet vise aussi à identifier la capacité des glies à être reprogrammées dans un contexte pathologique, celui de l’épilepsie, et ce à différents stades de la maladie. Reproduire complètement in vitro la complexité de la structure cérébrale d’intérêt ainsi que la cinétique des changements s’opérant en conditions pathologiques est pour l’heure impossible. Par ailleurs, cette étude se situe dans la continuité directe d’expériences précédentes et nécessite de pouvoir intégrer les résultats avec ceux déjà obtenus afin de tirer des conclusions robustes. Pour ce faire, celle-ci doit donc être réalisée dans le même modèle murin que précédemment.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec le nombre minimal d’animaux permettant de garantir des résultats robustes, nombre qui a été déterminé préalablement grâce à des calculs statistiques et basé sur les données de la littérature. Ce projet implique par ailleurs des expériences permettant d’analyser les modifications de l’expression des gènes dans les glies en phase chronique selon qu’elles se divisent ou non. Ces expériences vont générer un grand nombre de données dont l’analyse s’étendra au-delà de ce projet. Des analyses comparées de ces données avec d’autres présentes dans la littérature et celles issues d’autres projets devraient permettre d’étudier un certain nombre de questions sans passer par l’utilisation de nouveaux animaux. Enfin, nous avons défini des points d’arrêt à différentes étapes du projet nous permettant d’évaluer si nous devons procéder ou non à la suite des expériences en fonction des résultats déjà obtenus. Ceci permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés le cas échéant.

Raffinement

Toutes les chirurgies se dérouleront sous anesthésie générale et analgésie locale renforcée pour éviter toute douleur ou souffrance durant l’opération. Pour éviter toute douleur après l’opération, les animaux recevront par ailleurs plusieurs injections d’anti-douleurs. Une surveillance sera mise en place avec un suivi renforcé dans les 72h post-chirurgie. Les animaux seront scorés selon une grille d’évaluation des signes clinique adaptée à notre étude afin de mettre en place les traitements adéquats en cas de besoin (anti-douleur, nourriture liquide et enrichie pour pallier à une éventuelle perte de poids, application d’antiseptique, etc..). L’interruption des expériences et l’euthanasie des animaux interviendra pendant la chirurgie ou en postopératoire dans le cas d’apparition de signes indicatifs de gêne/douleur sévères. Conditions d’hébergement : Une fois que les animaux ont récupéré de la chirurgie, ils sont regroupés avec leurs congénères. Les animaux bénéficient d’un milieu d’hébergement enrichi (nid en fibres de coton, tunnels en carton, igloos teintés en polycarbonate). Pour pallier à la légère augmentation de l’anxiété observée chez les souris épileptiques, celles-ci seront toujours manipulées et changées par le même expérimentateur. De même, les animaux seront hébergés au calme et avec une luminosité réduite. Ces mesure de raffinement ont pour but de compenser l’augmentation des comportements de dominance entre animaux observés chez les souris épileptiques et éviter les combats qui nécessiteraient de les isoler.

Choix des espèces

Ce projet fait suite à un projet précédent réalisé dans un modèle d’épilepsie chez la souris et vise à déterminer si les glies de la phase chronique de la maladie peuvent être reprogrammées avec la même efficacité que celles se divisant en phase aigüe. Pour ce faire, et afin que les résultats obtenus soient directement comparables aux données précédemment générées, ce projet doit donc être réalisé dans le même modèle. Ce modèle d’épilepsie généré chez la souris que nous utilisons reproduit la plupart des aspects de la pathologie humaine et a été amplement validé. Les injections seront réalisées chez des souris adultes d’au moins 8 semaines afin de rester dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées dans les études précédentes, pour permettre une comparaison directe entre les résultats obtenus dans nos précédentes études et les résultats générés lors de ce projet.

Une douleur chronique et un état anxio-dépressif sont installés chez 3 100 souris, qui subissent deux chirurgies sous anesthésie générale espacées de deux semaines, un jeûne de 24 heures et un isolement de 24 heures. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et se terminent par une chirurgie terminale, tous les animaux étant tués. Le porteur écrit que cette douleur et ce phénotype "ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude", tout en détaillant par ailleurs habituation, enrichissement et points limites. Les cerveaux sont prélevés pour comprendre pourquoi certains patients résistent à une neurostimulation déjà en essai clinique chez l'être humain.

Objectifs

La douleur chronique est étroitement liée aux troubles émotionnels et constitue la première cause d’invalidité dans le monde, impactant fortement la qualité de vie des patients. Elle représente également un enjeu socio-économique majeur, avec des coûts estimés à plus de 800 millions d’euros en Europe. Environ 30 % des personnes souffrant de douleur chronique développent des troubles anxieux ou dépressifs, soulignant la nécessité de stratégies thérapeutiques plus efficaces et adaptées. Cette étude vise à évaluer l’impact de la neuromodulation du cortex moteur et du cortex cingulaire antérieur comme approche thérapeutique sur un modèle murin de douleur associée à un état anxio-dépressif. Le protocole de stimulation utilisé est directement inspiré d’essais cliniques en cours chez l’humain, incluant deux modalités distinctes de neurostimulation, afin de favoriser la transposabilité des résultats. Ce projet financé par l’UE vise à adopter une approche de reverse translationnelle, c’est-à-dire partir des observations cliniques pour orienter les études précliniques. L’objectif est de mieux comprendre les mécanismes d’action impliqués et, à terme, d’améliorer les stratégies thérapeutiques. Les données cliniques préliminaires obtenues par nos collaborateurs indiquent une efficacité potentielle de ces approches, bien que certains patients demeurent résistants au traitement. Le recours à un modèle animal se justifie par la nécessité d’explorer les mécanismes neurobiologiques responsables de cette variabilité de réponse, d’identifier précisément les structures cérébrales et les populations neuronales impliquées et, in fine, d’optimiser les protocoles de neuromodulation pour une application clinique améliorée. Inscrit dans une démarche de recherche translationnelle, ce projet vise à rapprocher les modèles expérimentaux des pratiques cliniques. Il permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action, les voies de signalisation impliquées et d’affiner les paramètres de stimulation. À terme, ces connaissances contribueront à orienter les choix thérapeutiques des cliniciens et à améliorer la prise en charge des patients souffrant de douleur chronique et de troubles émotionnels.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à approfondir la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans deux protocoles de neuromodulation actuellement en phase d’essais cliniques, dans le but d’en optimiser l’efficacité thérapeutique et, in fine, d’améliorer la prise en charge des patients présentant une douleur chronique associée à des troubles émotionnels.

Procédures

- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. - Les niamux subissent deux chirurgies espacées de 2 semaines. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1h. - Les animaux subissent 3 tests évaluant la douleur (15 minutes en moyenne - stimulation courte de maximum 20 secondes) et 6 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test). - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental et un isolement unique de 24h pour un autre test avec un délai minimal d’une semaine entre les 2 tests. - Les animaux subissent une chirurgie terminale pour prélèvement de tissus sous anesthésie profonde pour une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

- La présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. - Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h. - La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort et le tissu cérébral est prélevé pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxio-dépressive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe sociaux de 3 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.

Une artère cérébrale bouchée pour provoquer un AVC, une thrombolyse vingt minutes plus tard, une injection de traitement au bout de 24 heures : 96 souris subissent cette séquence, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent ensuite une ou deux séances d'IRM et des tests de récupération fonctionnelle de cinq minutes, avant d'être tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur ramène les nuisances attendues à des signes de douleur dans les premières heures et à un affaiblissement passager de la patte avant gauche. Il justifie le choix de la souris par la proximité de sa circulation cérébrale avec celle de l'humain et, autant, par le volume de travaux déjà publiés sur ce modèle.

Objectifs

L'accident vasculaire cérébral (AVC) est l'une des principales causes d'invalidité et de décès dans le monde. L’AVC ischémique (AI) représente environ 85% des AVC, il est majoritairement causé par une thrombose ou une embolie entrainant une diminution de l’afflux sanguin vers le cerveau. Peu après l'apparition de l'AI, des phénomènes d’hypoxie et inflammatoires entrainent une dégénérescence neuronale et l’ouverture de la barrière hématoencéphalique (BHE), responsable de l’infiltration des cellules immunitaires dans le parenchyme cérébral. La cortistatine (CST) est un neuropeptide avec des effets inhibiteurs sur l'activité neuronale. Elle est principalement exprimée dans le système nerveux central, où elle joue un rôle dans la modulation de l'excitabilité neuronale, du sommeil et de l'inflammation. Dans le contexte de l’AVC ischémique, la CST présente un intérêt particulier en raison de ses propriétés neuroprotectrices et anti-inflammatoires. Elle pourrait atténuer les lésions cérébrales en limitant la réponse inflammatoire et en réduisant l’excitotoxicité. Étudier son rôle dans l’AVC ischémique pourrait donc ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cascades de dommages secondaires. Dans ce projet, nous examinerons les effets de l’administration de la CST sur le volume de lésion, les déficits comportementaux, les phénomènes d’activation endothéliale et d’ouverture de la BHE à la phase aiguë (2 jours) et subaiguë (7 jours) post-AVC.

Bénéfices attendus

Étudier le rôle de la cortistatine dans l’AVC ischémique, ce qui pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les cascades de dommages secondaires.

Procédures

Tous les animaux subiront une ischémie cérébrale +/- Thrombolyse à 20 minutes +/- Traitement (injection intrapéritonéale) à 24 heures après l’occlusion artérielle. Les animaux utilisés pour la procédure 1 (48 souris) auront à J2 et J7 une évaluation par IRM (durée

Impact sur les animaux

Chirurgie AVC : Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement transitoire de la patte avant gauche (correspondant à la zone cérébrale lésée par l'AVC) qui disparaît dans la première semaine après l'AVC.

Devenir

A l'issue de toutes les procédures, les animaux seront mis à mort pour récupération de leur cerveau pour analyses ultérieures.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans l'étude de la réponse immunitaire en post-AVC au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, de nos travaux précédemment publiés, de la littérature et de tests statistiques de puissance avec calcul de la taille d’effet par un test d de Cohen. Le calcul du nombre de souris comprend un pourcentage de perte (15%). De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Nous avons indiqué pour chaque procédure expérimentale les points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par l’expérimentateur pendant toute la durée du projet. Nous avons raffiné dans notre laboratoire nos techniques et nos protocoles pour pouvoir suivre les souris de façon longitudinale, ce qui rajoute de la robustesse à nos résultats car chaque animal est son propre contrôle et permet, à long terme, de réduire le nombre de souris utilisées. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l'accès à l'eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l'angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu'à la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires et en immunologie. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. Le fonctionnement du système immunitaire de la souris se rapproche de celui de l'homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la dynamique de microglie dans les AVC ischémiques. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 12 semaines et auront un poids d'environ 30 g. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC. Les animaux (souris C57Bl/6) utilisés seront âgés de 8 à 12 semaines et auront un poids d'environ 20 g. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.

Déplacées à pied entre quatre établissements utilisateurs, dans une cage fermée glissée dans un double emballage opaque, les souris de ce volet passent d'un site à l'autre selon l'étape du protocole. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester la modulation d'un gène de cellules non neuronales dans deux modèles d'ataxie cérébelleuse. Prélèvement de tissu à l'oreille dans les deux premiers établissements, chirurgie d'une heure et injection d'un vecteur dans le cervelet dans le troisième, tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, puis injection d'un fixateur dans le quatrième pour une partie des animaux. 52 femelles rejoignent un projet d'élevage pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres sont tuées pour prélèvement de tissus.

Objectifs

Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.

Bénéfices attendus

Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).

Impact sur les animaux

Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.

Réduction

Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.

Raffinement

Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.

Pour démontrer le rôle d'un gène exprimé dans des cellules non neuronales du cervelet, deux lignées de souris reproduisant l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l'ataxie de Friedreich sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 360 souris sont concernées par ce volet. Chacune subit un prélèvement de tissu à l'oreille, une chirurgie d'une heure sous anesthésie pour injecter un vecteur dans le cervelet, puis des séries de tests comportementaux répétés jusqu'à cinq fois, et une partie d'entre elles une dernière chirurgie d'injection de fixateur. 52 femelles sont réutilisées pour la reproduction avant d'être tuées, les 308 autres tuées pour prélèvement de tissus. Les tests comportementaux, que le porteur qualifie d'indolores et sans dommage durable, ne sont jamais nommés.

Objectifs

Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.

Bénéfices attendus

Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).

Impact sur les animaux

Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.

Réduction

Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.

Raffinement

Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.