Système nerveux

Biopsie de l'oreille, chirurgie d'une heure sous anesthésie, puis pour une partie des animaux une seconde chirurgie avec injection d'un fixateur pour prélever les organes : 360 souris passent par ces étapes réparties sur quatre établissements utilisateurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 308 sont tuées à l'issue, 52 femelles étant d'abord réutilisées pour la reproduction dans un projet d'élevage avant d'être tuées elles aussi. Le projet porte sur deux modèles d'ataxie cérébelleuse, dont l'un perd du poids dès vingt semaines d'âge. Les tests comportementaux, répétés jusqu'à cinq fois, sont qualifiés de non invasifs et indolores sans qu'aucun ne soit nommé.

Objectifs

Les ataxies cérébelleuses sont un groupe de maladies neurodégénératives caractérisées par des troubles de la marche, une perte d'équilibre et de coordination motrice. Ces troubles sont causés par la dégénérescence des neurones du cervelet. Du fait de la faible prévalence de ces maladies, la mise en place d'études cliniques s'est avérée difficile et, à ce jour, aucun traitement curatif n'est disponible et très peu de médicaments sont proposés aux patients. Au fil des années, des modèles murins reproduisant les symptômes de plusieurs formes d'ataxie cérébelleuse ont été développés. Chaque modèle reproduit les principales caractéristiques génétiques, la dégénérescence cellulaire et les symptômes observés chez les patients. Au sein de ce projet multi-établissement (effectués dans 4 établissements utilisateurs, nommés ici EU1/EU2/EU3/EU4) nous avons sélectionné deux modèles murins d'ataxie cérébelleuse pouvant servir de paradigme pour ce groupe de maladies : l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 (SCA1) et l'ataxie de Friedreich (AF). En fait, ces maladies couvrent l'hétérogénéité de ce groupe en termes de mode de transmission, de type de mutation génétique et de fonction de la protéine mutée. Nous avons récemment réalisé une analyse du cervelet afin d'identifier les principaux dysfonctionnements impliqués dans ces maladies. Nous avons constaté que la perte neuronale peut être influencée par des anomalies de certains types cellulaires non neuronaux qui contribuent au bon fonctionnement des neurones. Parmi ces anomalies, nous avons identifié un gène dont l'expression est plus faible chez les souris malades que chez les souris saines, dans les deux modèles de maladie. Ce projet vise donc à rétablir l'expression de ce gène au même niveau que chez les souris saines afin de démontrer son rôle dans la maladie. Dans cette optique, nous injecterons dans le cervelet de souris anesthésiées un vecteur portant un fragment génétique destiné à augmenter l'expression du gène spécifiquement dans un type particulier de cellules non neuronales, avant l'apparition des symptômes. En surveillant le comportement des souris et en réalisant des analyses moléculaires et histologiques ultérieures, nous espérons améliorer ou retarder l'apparition des symptômes chez les souris injectées. En complément, la seconde partie de notre projet tend à démontrer que la diminution d’expression de ce gène à elle seule suffit à faire apparaître les symptômes moteurs de la maladie chez des souris saines.

Bénéfices attendus

Par la modulation d'un gène spécifique et la combinaison de tests comportementaux, d'analyses histologiques, moléculaires et biochimiques, ce projet vise à élucider le rôle des cellules non neuronales dans l'ataxie cérébelleuse. Plus précisément, grâce à deux modèles murins paradigmatiques d'ataxie cérébelleuse, nous cherchons à démontrer la fonction cruciale d'une protéine produite par les cellules non neuronales pour protéger la fonction neuronale et ainsi prévenir les symptômes neurologiques. Ce projet pourrait prouver l'intérêt de ce gène pour le développement de futurs médicaments applicables à plusieurs types d'ataxies cérébelleuses.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à un prélèvement de tissus à l’oreille unique, procédure prenant environ 5 secondes au sein de l’EU1 et de l’EU2. Par la suite, un traitement sera administré par une intervention chirurgicale unique durant 1 heure et qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie au sein de l’EU3. Des tests comportementaux, dont la durée totale est de 15 minutes, seront réalisés sur les animaux (au maximum 3 répétitions par test, EU3). En fonction du traitement reçu, ces tests seront réalisés soit 1 fois sur les animaux soit 5 fois (au maximum). Pour finir, une partie des animaux recevra une dernière chirurgie avec injection d’un fixateur sous anesthésie et analgésie pour prélèvements d’organes (intervention prenant 10 minutes au sein de l’EU4).

Impact sur les animaux

Un des deux modèles murins de ce projet commence à perdre du poids à partir de 20 semaines d’âge accompagné de symptômes ataxiques. Le second modèle de ce projet ne présente pas de symptômes ataxiques avant 9 mois mais à partir de 4 à 5 mois des symptômes légers de défaut de coordination motrice sont visibles lors de tests comportementaux. Les tests comportementaux ne sont pas invasifs, sont indolores et n’impliquent qu’un court et léger stress ne causant donc aucun dommage durable aux animaux. La procédure chirurgicale d’injection est accompagnée des mesures d’anesthésie et analgésie nécessaires en amont et lors de l’opération. Il est toutefois possible que les animaux soient soumis à de la douleur post-opératoire pendant les jours suivant la procédure. En prévision de cela, nous optons pour un traitement analgésique post-opératoire pour tous les animaux ayant reçu une injection.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Une partie des animaux produits (femelles) sera réutilisée pour reproduction au sein d’un projet d’élevage déjà en place dans l’EU2 avant mise à mort. Le reste sera étudié puis mis à mort pour prélèvement de tissus et analyses histologiques, moléculaires et biochimiques.

Remplacement

Ce projet comprenant un axe d’études comportementales, il n’est pas possible de se passer du modèle animal. De plus, il n’est pas possible à l’heure actuelle de reproduire en culture cellulaire des réseaux neuronaux complexes comme ceux que nous allons étudier.

Réduction

Toutes les procédures ont été conçues pour réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés, sans compromettre la fiabilité des résultats des expériences. Les analyses statistiques ont été prévues en amont pour déterminer les tailles d’effectifs adéquates. De plus, afin de minimiser le nombre d’animaux, les mêmes individus seront utilisés pour les analyses comportementales, histologiques, moléculaires et biochimiques Des animaux des 2 sexes seront utilisés car l'ataxie spinocérébelleuse de type 1 et l’ataxie de Friedreich affectent de manière égale les mâles et les femelles. Ceci nous permet de générer moins d’animaux pour former nos groupes expérimentaux.

Raffinement

Le transport court des animaux entre les différents établissements utilisateurs sera réalisé à pied et de préférence en début de journée, pour limiter l’impact sur la phase de repos des animaux, dans une cage fermée placée dans un double emballage opaque et fermé. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur avant le début des manipulations pour minimiser leur stress. Nous utiliserons des méthodes de contention peu stressantes, comme des tunnels ou le fait de simplement prendre les souris dans la paume de la main au lieu de les prendre par la queue. Les animaux seront aussi habitués aux dispositifs pour tests comportementaux en amont de la réalisation des tests. De plus, nous effectuons un marquage temporaire de couleur à la base de la queue avec un feutre non toxique afin de différencier plus facilement les souris sans avoir besoin de contention pour les identifier lors du comportement. Les animaux seront surveillés tout au long de l’étude à l’aide d’une liste de points limites adaptés et précoces. Pour la prise en charge de la douleur péri-opératoire, nous avons mis en place un protocole analgésique complet accompagné d’une grille de score adaptée pour surveiller le bon rétablissement des animaux. En complément, une grille de score est mise en place afin de surveiller l’état de santé des animaux et de pouvoir mettre en place un traitement précoce et adapté à l’apparition de symptômes.

Choix des espèces

Dans ce projet, nous avons choisi d'utiliser des modèles murins parce que ces derniers présentent des similitudes anatomiques et physiologiques avec le tissu humain : les mêmes types de cellules avec une organisation tissulaire similaire. Ces similitudes entre le cerveau de la souris et celui de l'homme sont cruciales pour disposer de connaissances solides qui pourront être transférées à l'avenir pour soigner l'homme. Il n'existe pas encore d'outils cellulaires capables de récapituler l'état de développement et la complexité de la structure du cerveau animal. La souris est actuellement l’animal de laboratoire sur lequel nous disposons des plus nombreux outils génétiques et moléculaires pour travailler. Les deux modèles utilisés au sein de ce projet sont déjà bien caractérisés ce qui nous permet de prévoir et gérer l’apparition des symptômes ataxiques ainsi que de tester un traitement par modulation génique avant apparition des symptômes. Les tests comportementaux seront effectués à l’âge où les symptômes ataxiques sont significativement visibles afin de mesurer l’efficacité de notre traitement.

Pour mesurer si des LED rouges ou proches infrarouges soulagent la neuropathie provoquée par les anticancéreux, 96 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent huit injections de paclitaxel en vingt-cinq jours sous sédation légère, puis passent cinq minutes par séance dans un box de plexiglas, appareil allumé pour la moitié des groupes et éteint pour l'autre. Le porteur écrit que l'induction de la neuropathie est "une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l'étude", et suit chaque semaine par des tests comportementaux l'allodynie tactile et thermique qu'elle provoque. Une grille de points limites explore diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratation, perte de poids, pelage et locomotion, et retire du projet pour mise à mort rapide les rats dont le score l'exige.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques (taxanes, sels de platine…). La neuropathie périphérique chimio-induite se caractérise par des symptômes sensitifs distales et symétriques (picotement, douleur neuropathique, engourdissement), altérant la qualité de vie des patients, et pouvant perdurer longtemps après la fin des traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique est très limitée, car aucun traitement préventif n’est recommandé et seule la duloxétine est modérément recommandée pour traiter les douleurs neuropathiques associées. La littérature scientifique souligne aujourd’hui l’intérêt de la photobiomodulation dans le traitement des douleurs neuropathiques et de la neuropathie périphérique chimio-induite. La photobiomodulation est une technique non invasive qui utilise des lumières rouges ou proches infrarouges de faible intensité (LED), pour stimuler l’activité cellulaire en agissant principalement sur les mitochondries ; cette lumière déclenche une série de réactions biochimiques bénéfiques telles que l’augmentation de la production d’énergie cellulaire, la modulation de l’inflammation, la stimulation de la régénération tissulaire et de la synthèse de collagène, sans effet thermique ni endommagement des tissus. L’objectif du projet sera de mesurer les effets préventifs et analgésiques de la photobiomodulation sur un modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier une nouvelle stratégie de prise en charge de la neuropathie périphérique chimio-induite utilisant la photobiomodulation. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge de la neuropathie périphérique chimio-induite est très limitée, avec aucune stratégie préventive recommandée et seule la duloxétine avec un niveau de recommandation modérée pour le traitement des douleurs neuropathiques associées. Ainsi ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement et de prévention des neuropathie périphérique chimio-induite, avec une technique non-invasive.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections intraveineuses sous sédation légère. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours, et pour une durée des injections de 10 secondes (max). Tous les animaux seront exposés à la procédure de photobiomodulation (2 groupes d’animaux avec un appareil éteint et 2 groupes d’animaux avec un appareil allumé). La procédure de photobiomodulation durera 5 min, et durée pendant laquelle les animaux seront dans des box en plexiglass transparent permettant aux animaux de se toiletter, de se voir et de se sentir. Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront en moyenne 5 à 10 min par animal. Il n’y aura aucun prélèvement sanguin durant les procédures. Un seul prélèvement sanguin total sera réalisé en fin de procédure sous anesthésie profonde et avec analgésie, à la suite de quoi les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

L’induction de la neuropathie périphérique chimio-induite chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La neuropathie périphérique chimio-induite sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet (allodynie tactile et thermique). Les administrations répétées de paclitaxel seront responsables d’une réduction du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement dans le cadre des administrations d’anticancéreux (dose en mg/kg et mesure bi-hebdomadaire), et permettra de contrôler la tolérance des animaux au paclitaxel. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille (voir annexe), et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide.

Devenir

Les expérimentations conduiront à l'euthanasie des animaux pour permettre des analyses biologiques sanguines et tissulaires afin d'optimiser l'emploi des animaux à des fins de recherche.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur des cellules souches humaines de neurones ou organoïdes. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de la neuropathie périphérique chimio-induite, qui n'est-elle-même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'une étude sur la douleur neuropathique, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer, évaluer et valider les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité à 12 par groupe, afin de respecter le principe de réduction tout en garantissant la robustesse scientifique de l’étude. Dans ce type d’étude exploratoire, une diminution plus importante du nombre d’animaux ferait courir un risque élevé de ne pas pouvoir conclure, ce qui entraînerait une perte de valeur scientifique et une utilisation inutile des animaux. Le nombre retenu permet de réaliser des analyses statistiques fiables, fondées sur des tailles d’effet attendues suffisamment larges pour mettre en évidence des différences pertinentes entre les groupes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe avec un enrichissement de l’environnement (cylindres en plastique et en carton) afin de favoriser les interactions sociales et les comportements de jeu, contribuant ainsi à améliorer leur bien-être tout au long de l’étude. Les injections de produits à l’étude seront réalisées sous sédation légère. L’exposition des animaux à la photobiomodulation n’imposera aucune contention. Les animaux seront dans des box individuels en plexiglass et sans contention pendant 5 minutes. Les box seront transparents et ouverts, permettant aux animaux de se voir et se sentir, ce qui limitera l’isolement des animaux. Enfin, lors du prélèvement sanguin en point final, les animaux seront sédatés profondément avec une analgésie.

Choix des espèces

Le choix du rat plutôt que la souris se justifie d’abord par sa taille, qui permet de prélever une quantité plus importante de matériel biologique par individu et donc de limiter le nombre total d’animaux nécessaires tout en répondant aux objectifs scientifiques. La souche Sprague-Dawley, connue pour son comportement calme et sa bonne maniabilité, est particulièrement adaptée aux tests comportementaux de la douleur, contrairement à des souches plus actives comme Lou ou Wistar qui peuvent introduire davantage de variabilité dans les mesures. L’utilisation de cette souche s’appuie également sur l’expertise existante et des données antérieures au sein du laboratoire, ce qui renforce la robustesse et la comparabilité des résultats. Les animaux seront utilisés à un âge correspondant à de jeunes adultes (environ 9 semaines), ce qui est cohérent avec la plupart des études publiées et facilite la comparaison avec la littérature ainsi qu’avec les données internes. Le recours à des animaux plus âgés pourrait mieux refléter la situation clinique en oncologie (cancers touchant majoritairement des sujets seniors), mais leur coût élevé et leur moindre utilisation dans les modèles précliniques limitent cette option. Des mâles et des femelles seront inclus afin de refléter la réalité clinique des traitements par paclitaxel, administrés aussi bien chez les hommes que chez les femmes, et de prendre en compte d’éventuelles différences liées au sexe dans les réponses aux traitements.

Manipulés deux à trois fois par semaine pendant quinze jours, habitués une semaine aux gestes d'injection, puis traités un à sept jours de suite par piqûre intrapéritonéale, sous-cutanée ou gavage : 840 souris et 840 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La corticostérone administrée par voie orale leur fait prendre du poids et déclenche anxiété et stress, et le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer infections, inflammations et irritations au point de piqûre, les gavages des fausses routes et des irritations de l'œsophage. Aucune mesure n'est faite sur l'animal vivant : les 1 680 rongeurs sont anesthésiés à l'isoflurane puis décapités, et c'est sur des tranches de leur cerveau que l'activité électrique est enregistrée. Le porteur écrit avoir besoin de réseaux neuronaux "natifs et connectés", ce que seule la mise à mort permet d'obtenir.

Objectifs

L’objectif de ce projet sera d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules destinées à réduire les effets du stress chronique. Pour cela, nous utiliserons un modèle chez le rongeur dans lequel un état de stress prolongé sera reproduit en administrant une hormone du stress, la corticostérone. Grâce à ce modèle et à nos mesures d’activité électrique du tissus nerveux nous pourrons mieux comprendre si les molécules testées peuvent corriger les effets du stress chronique, et d’identifier les traitements potentiels les plus prometteurs pour des études ultérieures.

Bénéfices attendus

Notre projet permet de caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments dans ce modèle. Nos techniques, mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation de leurs effets sur le tissu nerveux vivants constitue une bonne approche car elle permet : - Dans un modèle de la pathologie chronique une analyse fine de l’effet de la molécule ; - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons, ex vivo); Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement des composés testés avant de lancer les premières étapes précliniques.

Procédures

Les animaux sont manipulés 2 à 3 fois par semaine les 15 premiers jours puis habitué aux futures manipulations d’injection pendant une semaine et enfin à chaque injection les jours suivants. Ils sont traités entre une fois par jour pendant un jour ou 7 jours maximum soit 1 à 7 injections. Ces traitements peuvent être soit une injection intrapéritonéale, soit une injection sous cutanée ou soit un gavage oral. Chacun dure moins d’une minute. Et enfin une anesthésie à l’isoflurane durant 5 min maximum.

Impact sur les animaux

La projet peut générer des effets indésirables. : *-Du stress peut être induit par la manipulation régulière d’un animal ; *-la prise de poids importante, l’anxiété et le stress sont déclenchés par la prise orale de corticostérone ; *-des infections, inflammations, irritations peuvent apparaitre lors des administrations répétées au site d’injections. *-de fausses routes et irritations de l’œsophage peuvent apparaitre lors des gavages répétés.

Devenir

Ce projet nécessitant une analyse fine de l'efficacité des molécules à tester sur tranche de cerveau, nous devons mettre à mort tous les animaux de ce modèle.

Remplacement

Nos évaluations nécessitent de pouvoir réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Il n’est pas envisageable de réaliser sur l’Homme les tests que nous proposons. Nous devrons donc utiliser des animaux vivants pour cela. En effet, nos tests, permettent d’évaluer des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un organisme vivant. De plus, nous utilisons des tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions anormales ou perturbées observées lors d’un état de stress chroniques.

Réduction

Un test statistique a été utilisé pour calculer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour ce projet. Ce nombre est de 84 animaux maximums pour la réalisation de ce protocole lors d’une étude. Notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, une analyse précise à l’échelle du tissu tout en s’affranchissant des problèmes de passage dans le système nerveux et des problèmes de disponibilité dans l’organisme, mais aussi d’analyser rapidement l’impact sur le fonctionnement électrique du tissus nerveux d’un composé dans ce modèle de stress chronique.

Raffinement

Tous les animaux bénéficient de trois groupes d’enrichissement tournants adaptés pour contrecarrer l’anxiété des animaux. Les animaux utilisés seront habitués, dès le départ, aux contentions à réaliser pour limiter le plus possible les stress futurs liés à ces gestes techniques. Une attention particulière sera portée aux animaux pour repérer chaque signe de dispute/bagarre et isoler au plus tôt les agresseurs. Une vigilance spéciale autour des animaux injectés de façon répétée est posée, pour que lors de ces injections répétées, les sites d’injection soient modifiés dans la zone cible en surveillant tout problème éventuel d’inflammation, au lieu d’injection. Les points limites sont aussi adaptés aux effets possibles dus à cette induction de stress. Lors de la mise à mort par décapitation rapide, les animaux adultes sont au préalable anesthésiés grâce à une induction à l’isoflurane par du personnel qualifié et formé.

Choix des espèces

Le développement de ce modèle inductible de stress et la grande quantité d’informations scientifiques disponibles sur le fonctionnement du système nerveux des souris et rats, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique et au développement de techniques d’enregistrement de l’activité cérébrale sur explants vivants font de ces espèces un modèle de choix pour la préparation de tranches de tissu nerveux et l’évaluation de l’efficacité de futur médicament. Pour ces raisons, nous n’utilisons que ces rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 6 et 16 semaines post natal afin de permettre une comparaison avec des résultats précédemment publiés.

Jusqu'à trois heures d'acquisition par séance sous sédation continue, et trois séances par souris à 3, 6 et 12 mois : 260 souris et 60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit d'abord une chirurgie de la tête d'une à deux heures pour marquer, lire puis inactiver les cellules qui relient les neurones aux vaisseaux sanguins, geste dont le porteur indique qu'il peut provoquer des douleurs et une perte de poids les jours suivants. L'objet est de calibrer des marqueurs d'IRM fonctionnelle capables de suivre l'évolution des maladies des petits vaisseaux cérébraux, que l'imagerie anatomique ne renseigne pas sur la gravité. Le porteur retient des rongeurs de 8 semaines à 18 mois pour couvrir tous les stades, du jeune adulte à l'animal vieillissant, et les cerveaux sont prélevés après la mise à mort pour examen au microscope.

Objectifs

Les maladies des petits vaisseaux cérébraux (MPVC), qui affectent les vaisseaux intracrâniens de moins de 500 microns de diamètre, sont responsables de 20 à 30 % des accidents vasculaires cérébraux ischémiques (mauvaise irrigation du cerveau) et de 90 % des hémorragies intracérébrales. Elles peuvent entraîner un déclin cognitif allant de légères altérations des fonctions exécutives jusqu'à une démence sévère. À un stade avancé, elles favorisent également des difficultés de marche et d'équilibre, des troubles de l'humeur et des changements de comportement. Comme d'autres maladies neurodégénératives, les MPVC n'ont actuellement pas de traitements pharmacologiques. Le diagnostic de ces maladies repose sur l'identification de lésions caractéristiques par imagerie par résonance magnétique (IRM) anatomique. Bien que l'IRM soit utile pour le diagnostic, elle ne permet pas de définir la gravité de la pathologie, étant donné que le nombre et l'étendue des lésions varient dans le temps de manière quasi indépendante de la gravité. Elle ne permet donc pas de suivre l’évolution de la maladie. Notre premier objectif est de voir si une modalité d’IRM cette fois-ci dynamique, l’IRM fonctionnelle cérébrale (IRMf), pourrait permettre de collecter des données renseignant finement sur l’évolution de la maladie, en mesurant presque en temps réel les changements locaux de flux sanguin. Chez les souris, en alternative à l'IRM fonctionnelle, nous utiliserons l'écho-encéphalographie fonctionnelle, qui a démontré une meilleure sensibilité et une résolution temporelle supérieure, tout en fournissant des signaux similaires à ceux de l'IRMf. Pour y parvenir, nous aurons recours à plusieurs modèles animaux des MPVC qui ont été développés au cours des dernières décennies. Ces modèles génétiques ou pharmacologiques, nous permettront de comprendre l’origine des altérations vasculaires et notamment de faire la différence entre des altérations des vaisseaux eux-mêmes et des altérations de l’environnement cellulaire de ces vaisseaux.

Bénéfices attendus

Nos recherches visent à identifier et calibrer de nouveaux outils diagnostiques basés sur l'IRMf pour évaluer la présence et la gravité des MPVC. Actuellement, le diagnostic de ces maladies ne s'effectue qu'à partir des symptômes ou par analyses génétiques. Ces approches ne répondent pas aux besoins des patients, car elles ne fournissent pas d'éléments sur la gravité de la maladie et n'informent que sur les stades les plus avancés de celle-ci. Des outils diagnostiques capables de détecter les phases précoces et de produire des données quantitatives sur la gravité ouvriront la voie aux tests de différents traitements pharmacologiques déjà validés sur des modèles de souris. A plus long terme, l’obtention de marqueurs fins de la maladie et de son évolution devrait permettre de développer des premiers traitements efficaces pour ces maladies.

Procédures

Les animaux recevront un antidouleur et une anesthésie générale avant de subir une quelconque intervention. Certaines souris avec des mutations transgéniques activables via l'administration de substances spécifiques, recevront le traitement par applications transdermiques de la durée de quelques minutes, le temps pour faire absorber la solution sur la peau, pendant 5 jours consécutifs. Tous les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ une heure (et pas plus de 2 heures) réalisée au niveau de la tête– pour : I) marquer les cellules qui participent aux interactions entre les neurones et les vaisseaux sanguins, II) pour "lire" les signaux provenant des cellules marquées, III) pour « inactiver » ces cellules avec des substances spécifiques, déjà largement utilisées dans des expériences précédentes sur des rongeurs. La lecture et l'inactivation des cellules d'intérêt seront effectuées pendant les séances d’IRM ou par l'écho-encéphalographie, mais ces imageries ne provoquent aucune douleur ni gêne aux animaux, d’autant plus qu’ils seront sédatés. Avant les sessions d'imagerie un cathéter sera posé sur le dos de animaux pour leur administrer en continue une molécule qui induit une sédation. Une fois le cathéter positionné, les animaux seront ensuite positionnés dans un berceau compatible avec l’IRM ou avec les ultrasons fonctionnels pour 3h maximum d’acquisition. Il n’y aura pas plus de 3 séances d’acquisition par souris, à 3, 6 et 12 mois. Une seule séance pour les rats.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour préparer les animaux aux expériences d'IRM pourra entraîner des douleurs et/ou une perte de poids dans les jours suivants l’expérimentation. L’anesthésie mise en place lors du protocole d’acquisition IRM pourra fragiliser les animaux en induisant une modification de leur comportement et/ou une perte de poids. Pendant les applications sur la peau des substances d’intérêts, les souris peuvent réagir brièvement à la sensation de froid de l'éthanol, mais aucune douleur durable ni lésion tissulaire n'a été observée par des études précédents. Les animaux seront gardés isolés pendant quelques minutes dans une cage, au chaud, après chaque session d'IRM pour qu'ils se réveillent. Dans ce cas, un mouchoir en papier sera ajouté à la cage pour servir de nid et une partie de la litière de la cage d'origine sera ajoutée pour rendre l'environnement moins étranger à l'animal.

Devenir

La suite du projet prévoit des analyses approfondies des différents tissus du cerveau. Les animaux seront donc mis à mort en fin de procédure pour prélever leurs cerveaux et pour les étudier par microscopie.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier la dynamique vasculaire grâce à l’IRM fonctionnelle et de mettre en place de nouvelles méthodes diagnostiques de la MPVC chez l’humain. Il n’existe pour l’instant pas de modèles in vitro suffisamment robustes et complexes pour reproduire la dynamique vasculaire cérébrale. Seul un organisme vivant suffisamment proche de l’humain possède les mêmes caractéristiques d’organisation et de complexité. Cette caractéristique du cerveau n’est présente que dans le cerveau vivant au repos. C’est pour cette raison qu’il n’est pas possible de remplacer les animaux par une autre alternative non animale.

Réduction

Nous effectuerons des recherches constantes dans la littérature scientifique pour vérifier que des études similaires à la nôtre soient publiées entre-temps. Dans ce cas, nous suspendrons les investigations qui pourraient dupliquer inutilement des résultats déjà publiés, sauf s'il y a des besoins évidents de vérification des résultats ou des doutes fondés sur la qualité des résultats publiés. En outre, tous les groupes expérimentaux ont été soigneusement calculés a priori, sur la base d'études antérieures similaires, dans le but d'utiliser le nombre minimum d'animaux, tout en permettant une analyse statistique rigoureuse des résultats.

Raffinement

Tous les animaux seront surveillés tout au long de la procédure. Pendant les interventions chirurgicales les animaux sont anesthésiés et reçoivent un analgésique ainsi que des injections d’anesthésique locales. Pour le suivi post chirurgie des modèles pharmacologiques, nous utiliserons une grille de score dans laquelle des points limites sont déterminés. Les IRM seront réalisées par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous anesthésie générale. Un monitoring de la respiration et température est prévu tout au long de la séance IRM. Si un animal présente un signe de douleur persistant il sera retiré du protocole et euthanasié. Les animaux seront hébergés en groupe. Un enrichissement avec des balles de papiers pour réaliser un nid et une maisonnette en plastique seront prévus pour chaque cage. De par notre expérience passée sur des protocoles similaires, la probabilité qu’un animal présente des signes importants de stress ou de souffrance (à cause d’une blessure par exemple) sera très faible. Néanmoins, un système d’observation rigoureux des animaux sera mis en place afin de repérer rapidement d’éventuels signes de stress ou de souffrance. Des points limites adaptés ont été définis, permettant d’identifier ces rares cas. Dans une telle situation, une évaluation précise de l’état général de l’animal sera réalisée, et les interventions nécessaires seront mises en œuvre, conformément aux recommandations vétérinaires.

Choix des espèces

Notre projet repose sur l'utilisation des modèles suffisamment proches de l’humain d’un point de vue organisation générale (des organes, des tissus, des types cellulaires et des fonctions). Les rongeurs constituent un modèle adapté pour les expériences proposées, où l'unité neuro-vasculaire complètement fonctionnelle est requise. Nous utiliserons également des modèles de souris issus de lignées génétiquement modifiées disponibles, ayant une reproduction bien maitrisée. Les souris et les rats sont très couramment utilisés en recherche sur les MPVC, et de nombreux modèles expérimentaux existent déjà. Les MPVC sont des maladies qui se déclenchent à l’âge adulte. Cependant, l’intérêt de cette étude est de pouvoir mettre en place des biomarqueurs détectables à tous les stades de la maladie (d’un stade précoce à un stade âgé). Les animaux utilisés seront donc des animaux adultes âgés de 8 semaines à 18 mois afin d’avoir un panel élargit allant de jeunes adultes à rongeurs âgés.

Tués à l'issue du projet pour prélever leurs organes, sauf s'ils en sont retirés sur avis vétérinaire, 4 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun porte un collier de capture posé sous tranquillisation, une puce de température et une chambre implantée sous la peau, apprend à rester en chaise de contention pendant au moins trois semaines, puis traverse six à neuf études de 72 heures ponctuées de huit prélèvements sanguins le premier jour. L'objet est de mesurer combien de temps des vecteurs censés faire franchir la barrière hémato-encéphalique à un médicament survivent dans le sang, avant d'en retenir un pour y coupler un oligonucléotide. Le porteur décrit cette étape comme "incontournable" dans le développement préclinique, et indique qu'elle vise à proposer la technologie à l'industrie pharmaceutique.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et à développer des petites entités, dénommées vecteurs, pour faire pénétrer dans le cerveau des médicaments dont l’accès est proscrit par la présence d’une barrière biologique appelée Barrière Hémato-Encéphalique (BHE). Cette barrière est constituée par une paroi extrêmement étanche des vaisseaux sanguins du cerveau. Cette barrière laisse passer uniquement les composés du sang nécessaires au fonctionnement cérébral et le protège des agressions extérieures mais, ce faisant, en empêche l’accès à certains médicaments. Il existe un système de transport naturel de molécules au niveau des vaisseaux sanguins et nos vecteurs sont capables de s’y attacher pour être amenés vers le cerveau. Couplés à des médicaments ces vecteurs leurrent se système de transport comme un cheval de Troie. Cette thématique de recherche a donc un potentiel révolutionnaire pour le traitement des pathologies du cerveau comme Parkinson et Alzheimer. Nous venons d’optimiser une série de nouveaux vecteurs et dans ce projet nous souhaitons dans un premier temps étudier leur durée de vie dans le sang pour sélectionner celui qui aura le potentiel à amener le plus efficacement un médicament dans le cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières études chez le primate non-humain ont démontré l’innocuité de nos composés et tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et optimiser notre technologie pour améliorer ou prolonger l’effet de cette stratégie chez le macaque. Nous comptons tout d’abord étudier la durée de vie dans le sang de 6 à 9 candidats vecteurs seul (sans impact pour les animaux) pour sélectionner le meilleur puis le coupler à une molécule thérapeutique pour évaluer son efficacité pharmacologique. Ce projet est une étape essentielle vers le développement d’un futur médicament et c’est pour cela qu’il s’effectue chez le primate non-humain.

Bénéfices attendus

Grâce à ces études nous pourrons envisager de meilleurs effets thérapeutiques dans le traitement de nombreuses pathologies du cerveau (neurodégénératives notamment) et d’optimiser ces traitements pour des maladies rares ou pour la médecine personnalisée. La molécule thérapeutique utilisée ici appartient à la classe des acides nucléiques ou oligonucléotides thérapeutiques. Dans notre cas c’est une molécule qui va permettre l’inhibition de la synthèse d’une protéine par les cellules du cerveau responsable dans notre cas du syndrome Lesch-Nyhan mais cette technologie peut-être couplé à n’importe quel oligonucléotide permettant de corriger à la baisse ou à la hausse n’importe quel type de protéines et donc de pathologies.

Procédures

Les 4 animaux seront dotés d'un collier de capture sous tranquillisation chimique. Durée pose inférieure à 1 minute. Ils seront ensuite habitués à être manipulés en chaise (au minimum 3 semaines). S'en suivra l’implantation d'une puce pour mesurer leur température corporelle et de port-à-cath (chambre d'administration et de prélèvement sanguin sous la peau) sous anesthésie générale (1h d’anesthésie générale par individu). Une série de 6-9 études débutera ensuite en vigile pour évaluer la durée de vie dans le sang des différents vecteurs (durée de chaque étude 72h) suivie d’une pause de 15 jours post administration. Au cours de ces études un vecteur sera administré (1 min) et des prélèvements sanguins auront lieu le 1er (8 prélèvements de 5 min chacun), le 2eme (1 prélèvement de 5 min) et le quatrième jour (1 prélèvement de 5 min) suivit d’une période de “rinçage” (élimination naturelle) par l’organisme pendant 10 jours. Enfin un entretien des chambres sera réalisé dans la 2eme semaine post administration (20 min par dispositifs). Après cette série d’étude, nous sélectionnerons le meilleur vecteur pour y coupler la molécule thérapeutique. Ce composé sera alors administré (1 min) aux animaux et le même nombre de prélèvements sanguins et d’entretien des dispositifs implantables seront effectués (actes de mêmes durées qu’explicité ci-dessus). Mais ici après les 2 semaines post-administration, les animaux seront mis à mort sous anesthésie générale (induction anesthésie 15 min et administration euthanasiant : 5 min pour confirmer l’arrêt cardiaque) pour procéder à la récupération des tissus et ainsi évaluer l'efficacité thérapeutique.

Impact sur les animaux

Acclimatation et entraînement à la contention : source de stress générée par le changement d’environnement qui sera réduit au fur et à mesure par l’habituation aux expérimentateurs et par l’apport de récompenses. La pose de colliers, d’une puce de monitoring de la température et l’implantation des ports à cath se fera sous anesthésie générale. Un stress sera notable à l’induction de l’anesthésie, de même que lors du réveil en phase post-opératoire et accompagné d’antalgiques pour réduire la souffrance. L’entretien des port-à-cath : les interventions se feront en vigiles, sans douleur ni stress notables. Le seul geste invasif sera la piqûre de l’aiguille à travers la peau qui sera accompagnée par une analgésie de la peau si nécessaire. La procédure de nettoyage de la peau peut engendrer irritation. Malgré les procédures d’entretien, le dispositif peut se boucher. A cette occasion une et une seule réimplantation par dispositif sera envisagée Suivi de la durée de vie dans le sang : les prélèvements et administration sont réalisés avec une seule insertion de l’aiguille dans les dispositifs par jour. Aucun effet délétère n’est attendu à l’issue des administrations, de même qu’aucune toxicité d’origine pharmacologique (données de toxicité antérieures). L’administration des composés peut engendrer une légère augmentation de température et une modification très transitoire d’un type cellulaire sanguin, les réticulocytes. Selon nos données antérieures chez cette espèce cela reste sans impact sur les animaux. Etude terminale d’efficacité : Ici pas de nouvelles sources de stress, ni d’effets indésirables supplémentaire étant donné que la molécule thérapeutique supplémentaire a déjà été testée avec succès chez cette espèce lors d’une précédente étude.

Devenir

Si le projet arrive à son terme, les 4 animaux seront mis à mort pour prélèvement des organes/tissus d’intérêt. Si les animaux sont sortis du projet sur avis vétérinaire (en relation avec les points limites), ils seront soit Réutilisés ou Replacés par la structure d'accueil (si l'avis vétérinaire y est favorable), soit Adoptés (en cas d'avis vétérinaire contredisant une Réutilisation/Replacement).

Remplacement

L’évaluation de l’efficacité et de la sécurité des produits de santé destinés à l’humain doit être réalisée chez une espèce « rongeur » et une espèce « non rongeur » avant de faire une demande d’investigation chez l’humain en clinique. La capacité de nos vecteurs conjugués à amener un médicament dans le cerveau a déjà été démontrée sur différents modèles cellulaires in vitro puis confirmée in vivo chez le rongeur ainsi que chez le rongeur humanisé pour le récepteur ciblé. Afin de pouvoir proposer à l'industrie pharmaceutique cette technologie, nous devons maintenant établir la preuve de son efficacité et innocuité chez une large espèce non rongeur proche de l’humain, le macaque. Ce projet s’inscrit donc dans une étape incontournable de développement préclinique.

Réduction

La conception de ce projet a non seulement visé à réduire au maximum le nombre d’animaux inclus (4) tout en optimisant le nombre d’études et de prélèvements pour réduire au maximum le stress occasionné, mais aussi pour limiter les interventions à des manipulations transitoires, peu invasives. L’expérience acquise chez la souris permet de réduire le nombre de primate dans chaque groupe à n=3 pour les études de durée de vie dans le sang (nombre défini en amont par nos modélisateurs), puis à n=4 (3+1) pour l’étude d’efficacité en point final. Sur cette dernière étude, nous resterons sur un groupe extrêmement restreint de 4 animaux (n=2 : composé testé et n=2 : groupe contrôle). D’après nos données internes sur cette espèce c’est le plus petit n permettant d’obtenir des résultats interprétables. Fort de cette expérience et de la reproductibilité de nos résultats nous avons donc décidé de passer à un n=2 par groupe.

Raffinement

- Hébergement : Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales pendant toute la durée du projet. Pendant toute cette période, les animaux seront logés dans des enclos avec d’autres congénères. Une grande volière ensoleillée munie de perchoirs sera également en accès libre hors périodes de manipulation. - Alimentation : un régime alimentaire spécifique adapté pour primates sera délivré sans restriction. – Enfin, au cours de toutes les étapes du projet, des récompenses ainsi que des enrichissements (jouets, dispositifs de recherche de nourriture et enrichissements audio-visuels) seront délivrés de façon quotidienne aux animaux. - Enfin, une attention toute particulière portera sur l’anesthésie et l’analgésie avec des méthodes extrêmement conservatives en tout point similaires à l’homme et en relation avec le respect strict des points limites énoncés.

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit dans une démarche de fin de développement chez le modèle animal avant une transposition à l'humain, un modèle de large espèce est donc requis. Le modèle Primate Non-Humain est préconisé par rapport à d’autres modèles, comme le chien/cochon. En effet les paramètres d'appariement de nos vecteurs au récepteur présent au niveau des vaisseaux sanguins cérébraux est optimal chez cette espèce. Cette "affinité" est de plus similaire à celle de l'humain pour une meilleure transposabilité (ce qui n'est pas le cas pour d'autres comme le ouistiti). Les animaux utilisés dans cette étude seront tous de jeunes adultes, >2 ans et d’environ 6-7kg. L’utilisation de jeunes adultes s’explique par le compromis entre le poids de l’animal, la quantité de molécule à administrer, ainsi que par le volume total sanguin permettant de réaliser les prélèvements sanguins sans impact pour l'animal.