Système nerveux
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Caractérisation des évènements vasculaires précoces par imagerie à ultrasons et de super-résolution au cours de l’AVC ischémique et de l’AVC hémorragique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Un caillot provoqué dans une artère cérébrale par injection de thrombine ou application de chlorure de fer, la rupture d'un vaisseau par éclatement de microbulles: 920 souris subissent l'induction d'un accident vasculaire cérébral. 540 d'entre elles sont anesthésiées puis tuées sans reprise de conscience, 180 sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 200 dans des procédures sévères. L'objet réel du travail est la validation d'une imagerie par ultrasons de super-résolution, avec 800 souris passant deux séances d'échographie de 140 minutes et 80 d'entre elles portant une plaque métallique posée sur le crâne, habituées sept jours d'affilée à l'imagerie sur animal éveillé. Le porteur indique qu'aucun animal ne sera gardé vivant, jugeant qu'il n'est pas concevable de réhabiliter des souris ayant subi une induction d'AVC, et que leurs cerveaux serviront à l'analyse histologique.
Objectifs
Chaque année, environ 17 millions de personnes dans le monde auront un Accident Vasculaire Cérébral (AVC) pouvant entraîner des séquelles plus ou moins graves voir la mort de l’individu. Il existe deux types d’AVC : l’AVC ischémique, le plus courant (80%), est dû à l’obstruction d’une artère cérébrale et l’AVC hémorragique induit par la rupture d’un vaisseau sanguin cérébral. Actuellement, moins de 10% des patients peuvent bénéficier de traitement (injection intraveineuse d’un médicament pour dissoudre le caillot sanguin (l’activateur tissulaire du plasminogène ou tPA) parfois accompagné d’une intervention pour le retirer (thrombectomie)). L’AVC est un problème de santé publique majeur et nécessite le développement de nouvelles techniques d’imagerie pour mieux les comprendre, les diagnostiquer et les traiter efficacement améliorant la prise en charge des patients. Ce projet vise à valider une nouvelle technique d'imagerie par ultrasons superrésolutive qui caractériserait les évènements vasculaires survenant au plus proche de l'AVC, et observer la stabilité de caillots de composition différente et l’efficacité du traitement. Ce projet permettra d’évaluer son potentiel diagnostic pour détecter précocement les AVC (au plus près de la prise en charge du patient) et confirmer rapidement le diagnostic, l’efficacité du traitement et le retour de la circulation sanguine dans la zone atteinte. La comparaison des données obtenues en imagerie et en histologie permettra de mieux comprendre les modifications vasculaires et ces conséquences. Nous allons d’abord tester cette approche d'imagerie chez l’animal anesthésié pour éviter les mouvements qui compliquerait les analyses. Puis une étude où l'imagerie sera réalisée chez l’animal éveillé et l’induction de l’AVC effectuée sous anesthésie. Ce projet inclura également l’AVC hémorragique, plus rare, mais dont il est important d’améliorer le diagnostic et la compréhension. Pour cela, nous mettrons au point un modèle d’AVC hémorragique induit par l’éclatement de microbulles sensibles aux ultrasons dans la circulation sanguine induisant la rupture d’un vaisseau sanguin de manière non invasive et focalisé dans une région cérébrale donnée, reproduisant différents profils observés en clinique. La diversité des modèles employés recréera celle observées en clinique. Ce projet pourrait offrir des perspectives intéressantes pour l’étude du réseau vasculaire et faire progresser la compréhension de l'AVC et des traitements.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu de ce projet est de mieux comprendre ce qui se passe dans les vaisseaux sanguins survenant très tôt après le début d'un AVC pour comprendre comment cela affectent la formation d’un AVC ischémique (caillot sanguin) ou hémorragique (rupture de vaisseau). Avec de nouvelles approches d'imagerie, nous pourront mieux comprendre les effets à long terme des AVC et aider à améliorer les traitements. Nous utiliserons différents modèles pour simuler les situations réelles rencontrées en clinique. Dans ce but, nous proposons de caractériser les évènements vasculaires survenant au cours d’un AVC ischémique, en créant des caillots sanguins de compositions différentes et présentant une diversité des zones cérébrales atteintes de part une localisation aléatoire des caillots sanguins formés, comme cela est le cas en clinique. Le bénéfice de ce projet serait donc de caractériser et étudier les évènements vasculaires survenant lors d’un AVC ischémique et au plus près de sa survenue par une nouvelle approche d’imagerie. Nous développerons également un modèle d’AVC hémorragique avec une approche peu invasive où la rupture du vaisseau sanguin est induite de manière ciblée par des microbulles. Ceci nous permettrait également de comprendre les changements vasculaires survenant au plus près de l’AVC et amènerait ainsi l’opportunité de déboucher sur des études cliniques et la possibilité d’augmenter le succès de transpositions de résultats précliniques à la clinique humaine. Une des grandes innovations de ce projet est l’utilisation d’une nouvelle technologie d’imagerie à ultrasons, qui offre une meilleure résolution et pourrait être utilisée directement au chevet du patient. Cela permettrait d’étudier les vaisseaux sanguins en 3D, avec une plus grande précision, et de l’appliquer à différents types de maladies. In fine, ce projet offrirait la possibilité d’adapter les pratiques cliniques en modifiant la prise en charge et/ou le traitement de patients et adopter une approche d'imagerie plus accessible en clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis a: 1- Pose d’un cathéter intraveineux pour injection de traitements ou agent de contraste (n=920, durée de la procédure : 15 minutes), 2- Pose de plaque métallique crânienne (n=80, durée de la procédure: 60minutes), 3- Approches chirurgicales : (n=680 souris au total): 2.1- Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par injection de thrombine (n=220, durée de la procédure: 45 minutes), 2.2- Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale focale par application de FeCl2 (n=220, durée de la procédure :45 minutes) 2.3- Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale par formation d'un caillot périphérique carotidien (n=80, durée de la procédure : 1.5 heures) et 2.4- Modèle d’ischémie thromboembolique cérébrale par formation d'un caillot périphérique carotidien avec sang autologue (n=80, durée de la procédure : 30minutes), 4- Approche d’induction d’hémorragie intracérébrale (n=60, durée de la procédure : 45 minutes), 5- 2 procédures d'imagerie par échographie ultrasonore (n=800, durée de la procédure : 140 minutes), 6- Un protocole d'habituation à l'imagerie éveillée par jour pendant 7jours consécutifs avant et après chirurgie, avec des sessions de durée croissante progressivement (n=80) et 7- Procédure chirurgicale terminale (n= 680, durée de la procédure : 15 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d'apparaitre chez les animaux lors de la procédure seraient : - une perte de poids après les anesthésies et l'AVC, - des douleurs per-opératoires lors de la pose du cathéter et la chirurgie d’induction de l’AVC sous anesthésie - des douleurs post-opératoires après l'induction de l'AVC sous anesthésie, - un stress lors des premières sessions d'habituation à l’imagerie éveillée, - des douleurs post-opératoires après la pose de plaque métallique crânienne, - des déficits fonctionnels à la suite de l'AVC hémorragique (diminution ou perte de fonctions motrices (perte de force dans les membres ou démarche peu assurée), de fonctions sensorielles (vision et sensibilité des vibrisses affaiblies)). Ces effets sont connus dans l’expérimentation au laboratoire. Une surveillance accrue sera réalisée à chacune de ces étapes. L’animal sera gardé en vie uniquement si l’état de bien-être de l’animal est correct suite à chaque étape de la procédure
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans ce projet (920) seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Il a été décidé de ne garder aucun animal en vie car il n’est pas concevable pour leur bien être de réhabiliter ou réutiliser des souris ayant subi une procédure telle que l’induction d’un AVC ischémique ou hémorragique. De plus, les tissus générés permettront une étude histologique de l’intégrité cérébrale et vasculaire ainsi que les altérations induites par l’AVC (localisation des caillots ou hémorragies notamment).
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, il s’agit d’étudier un modèle in vivo avec tous les mécanismes vasculaires physiopathologiques associés, survenant lors d'un l'AVC. La mise au point de l’imagerie de super-résolution pour comprendre les évènements vasculaires survenant au plus près de l’AVC ne peut être investiguée autrement que via un modèle in vivo dynamique afin d’assurer des résultats les plus proches de la réalité et favoriser le passage en clinique de cette approche d’imagerie. Ce projet concerne les modèles animaux les plus utilisés dans le cadre d’étude sur l’AVC. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes formes d’AVC. De plus, la mise au point de cette nouvelle méthodologie d’imagerie de super-résolution pourra être utilisé dans le cadre d’études d’autres processus physiologiques cérébraux tels que la douleur, le sommeil, la maladie d’Alzheimer ou des malformations artério-veineuses.
Réduction
Conformément à la règle des 3R, avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour obtenir des résultats significatifs en réduisant le plus possible les effectifs. Ainsi, les procédures décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Un nombre minimal d’animaux sera utilisé dans le respect du principe de réduction tout en permettant la fiabilité des résultats. Une partie de mise au point du protocole est indispensable dans ce projet. Afin de limier l’utilisation d’animaux, ceux ayant permis de déterminer le protocole d’anesthésie le plus adapté à la réalisation d’imagerie de superrésolution pourront permettre également de valider le protocole de stimulation sensorielle (moustache et visuelle) non invasif sous anesthésie lors de l’acquisition en imagerie. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cages conformes aux normes européennes (type III ; Directive 2010/63/UE) en petits groupes sociaux stables (n=3/5) dans des conditions environnementales contrôlées. Les animaux seront hébergés en groupe de 3 ou 5 et les cages seront enrichies ( papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid, ainsi qu’un tunnel et des morceaux de bois). Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux seront gardés en acclimatation avant expérimentation pendant 1 semaine. Puis ils seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. Lors des différentes procédures, les animaux auront une anesthésie quand cela est nécessaire et recevront des anti-douleurs adaptés à la sévérité du geste pour éviter toute douleur avant, pendant et après la réalisation de l'acte.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans les neurosciences, et notamment dans le développement de thérapies et d'outils diagnostiques. C’est également l’espèce de référence pour étudier l’inflammation, l’hémorragie et l’ischémie cérébrale dans la littérature. Les connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l’AVC ischémique et hémorragique. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L'étude se déroulera sur deux souches de souris présentant des profils de collatérales différentes, et des réponses physiologiques à l'ischémie différentes, comme observé chez l'humain. De plus, ces deux souches sont régulièrement utilisées pour la recherche, d'où l'intérêt de valider ce modèle sur ces dernières. Les souris utilisées seront de jeunes adultes, entre 5 et 9 semaines (5 semaines lors du début du protocole, et 9 semaines arrivées à la fin du protocole). Nous réaliserons nos modèles sur des jeunes adultes soit des animaux de même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC nous permettant ainsi de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données obtenues au laboratoire sur les modèles d’AVC. Les animaux seront commandés à l'âge de 5 semaines afin de leur laisser un temps d'acclimatation à leur nouvel environnement.
Plateforme de phénotypage de souris atteintes de troubles auditifs et vestibulaires
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Toutes les souris subissent une chirurgie préliminaire de vingt minutes, puis deux séances de trente minutes de vidéo-oculographie sur animal éveillé pour mesurer leurs réflexes de stabilisation du regard. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole. Beaucoup sont sourdes et tournent en rond sans arrêt, ce que le porteur classe en "phénotype dommageable" tout en affirmant qu'elles sont "parfaitement capables de se nourrir et de se reproduire normalement" et ne demandent pas de soins particuliers. Le projet ne poursuit pas de question scientifique propre, il met une plateforme de mesure à disposition d'équipes extérieures qui y font phénotyper leurs lignées de souris sourdes ou vestibulaires.
Objectifs
Ce projet porte sur la quantification comportementale des réflexes vestibulaires et de souris présentant des suspicions de troubles vestibulaires et auditifs. Les pathologies vestibulaires sont caractérisées par des épisodes imprévisibles de vertiges accompagnés de déséquilibres oculomoteurs et posturaux. Les pathologies vestibulaires chroniques sont très invalidantes et conduisent à un isolement psychologique et social. La prévalence des vertiges en clinique est très importante, de l'ordre de 20 à 30%, et augmente avec l'âge. Les vertiges vestibulaires peuvent être liés à des atteintes du système nerveux périphérique et notamment des organes vestibulaires de l'oreille interne ou du nerf cochléo-vestibulaire. Les pathologies touchant l’oreille interne ont souvent des conséquences auditives et vestibulaires. Alors que les surdités partielles ou totales sont facilement identifiées et mesurées expérimentalement chez la souris, les troubles vestibulaires sont difficiles à identifier et rarement quantifiés. Chez l’homme, le meilleur test consiste à mesurer les réflexes vestibulo-oculaires par vidéo-oculographie, une pratique réalisée dans la plupart des centres ORL. Chez la souris, cette même technique qui permet la quantification des troubles vestibulaires est une expertise rare qui demande du matériel couteux. De nombreuses équipes travaillant sur des pathologies ORL nous contactent donc afin de bénéficier de notre expertise et de notre plateforme intégrée de vidéo-oculographie permettant de réaliser des tests comportementaux vestibulaires. Ce projet générique destinée à permettre le phénotypage de différentes souris sur notre plateforme expérimentale utilisera un total maximum de 720 souris sur 5 ans. Ce nombre permettra de couvrir les besoins d'au moins 7 études sur la période.
Bénéfices attendus
Les pathologies vestibulaires sont très invalidantes. De nombreuses pathologies congénitales d'origine génétiques conduisent chez l'enfant à des surdités qui sont détectées et traitées par des implants cochléaires, et depuis peu par thérapie génique. Dans la plupart des cas, seule la partie auditive de ces pathologies est prise en compte par l'entourage et les médecins, les aspects vestibulaires étant imparfaitement diagnostiqués et évalués. Alors que de nombreux modèles murins sont développés pour mimer les pathologies humaines et font l'objet de tests de thérapie génique, il est essentiel d'évaluer si ces thérapies peuvent également fonctionner sur les organes vestibulaires et permettre in fine une récupération des fonctions sensorimotrices et cognitives associées à ces déficits congénitaux.
Procédures
Tous les animaux (n=720) seront soumis à des chirurgies préliminaires d'une durée de 20 minutes sous anesthésie gazeuse. Les animaux sont phénotypés à l'aide de tests sensorimoteurs: les réflexes de stabilisation du regard sont mésurées par vidéo-oculographie afin de mesurer précisément les fonctions vestibulaires et oculomotrices. Ces tests durent 2 fois 30 minutes et sont effectués chez la souris éveillée. Des tests locomoteurs et posturaux d'une durée totale de 6 minutes sont également effectués 2 fois chez la souris éveillée, afin de mesurer leur équilibre.
Impact sur les animaux
Les souris génétiquement déficientes vestibulaires présentent parfois des hyper activités ou locomotion anormales (circling) ce qui constitue des nuisances les classant en phénotype dommageable. Elles sont également fréquemment sourdes ou mal entendantes. Elles sont cependant parfaitement capables de se nourrir et de se reproduire normalement et ne nécessitent pas de soins particuliers. Ces déficits auditifs et locomoteurs constitent un point d’attention pour la gestion et le cas échéant le suivi plus particulier de ces animaux. Le traitement spécifique pour réduire ces nuisances consiste en une restauration de la fonction vestibulaire par thérapie génique qui fait l'objet d'une partie de l'étude de phénotypage, mais qui ne s'appliquera qu'à une partie des lots.
Devenir
Les souris, le plus souvent mutants génétiques et sujets de thérapie génique, doivent être euthanasiées en fin de protocole. Le cas échéant, après la mise à mort, des analyses post-mortem validant les effets des traitements seront réalisés.
Remplacement
Afin d'évaluer les déficits sensorimoteurs associés à des pathologies de l'oreille interne et de tester l'efficacité de thérapie génique, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.
Réduction
Des tests statistiques seront effectués en cours de protocole afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre des différences significatives entre les différents groupes testés. Le nombre de souris estimé l’a été en considérant que 20% des souris pourraient ne pas compléter l'ensemble des tests. Le nombre de souris correspond à une estimation du maximum de souris qui pourraient être nécessaires, et une estimation des capacités maximales de tests offertes par notre plateforme, il est donc susceptible d'être revu à la baisse au cours du projet.
Raffinement
Les souris sont maintenues par groupes de 4. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est controlé régulièrement pendant les phases de tests. Chaque animal bénéficie tout au long de l’étude d’une attention et de soins de qualité par du personnel qualifié, afin d’assurer un bien-être optimal. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites objectifs sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative visant à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau des mammifères, c'est le modèle animal privilégié pour les études génétiques et la mise au point de traitement de thérapie génique. L'utilisation de lignées génétiquement altérées permet de reproduire les pathologies génétiques conduisant à des surdités et pathologies vestibulaires congénitales chez l'homme, afin de développer des thérapies ciblées. Les tests sensorimoteurs sont effectués sur des animaux plus âgés que 6 semaines. Les réflexes oculomoteurs et locomoteurs étudiés se développent en effet au cours des 4 premières semaines de développement post-natal, et sont considérés comme acquis et matures chez l'ensemble des individus après 6 semaines.
Mécanismes de la plasticité des centres auditifs après une perte auditive et effets de certaines drogues pour restaurer un niveau d’inhibition centrale
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
210 cobayes vont être utilisés, dont 90 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun exposé à un bruit de une à quatre heures destiné à abîmer son audition. Quatre-vingt-dix d'entre eux subissent six à huit heures d'enregistrement cérébral sous anesthésie, ou la pose d'un porte-électrode suivie de séances de deux heures deux fois par semaine pendant un mois, avec un risque d'arrachement du bloc de ciment fixé sur leur crâne. Tous sont tués pour prélever la cochlée et le cerveau. Le bénéfice annoncé, traiter un jour les acouphènes et l'hyperacousie chez l'être humain, reste renvoyé au long terme, alors que la perte auditive infligée aux cobayes est le point de départ du protocole.
Objectifs
La perte d’audition entraîne deux conséquences principales. La première est de rendre la compréhension de la parole difficile, voire impossible dans les cas les plus sévères. La deuxième est de provoquer des changements dans le fonctionnement du cerveau, en particulier dans les zones qui traitent les sons (les centres auditifs). Ces changements peuvent être à l’origine de troubles gênants comme les acouphènes (perception de sons inexistants, par exemple des bourdonnements) ou l’hyperacousie (perception exagérée ou douloureuse des sons). L’objectif de notre projet est de mieux comprendre ces changements cérébraux après une perte auditive. Nous nous intéressons à une protéine particulière, appelé KCC2, qui joue un rôle essentiel dans le bon fonctionnement des neurones inhibiteurs du cerveau. Nos travaux précédents ont montré qu’après une perte auditive liée à un traumatisme sonore, cette protéine est moins présente dans les neurones des centres audifis, ce qui pourrait provoquer une activité anormale des neurones. Dans ce projet réalisé sur le cobaye (modèle animal dont le système auditif est proche de celui de l’humain), nous allons étudier à quel niveau de perte auditive ces changements apparaissent, et comment ils influencent l’activité des neurones. Nous étudierons aussi comment cela se reflète dans l’activité spontanée des neurones (hypothèse potentielle liée aux acouphènes) ou dans l’activité provoquée par un son (hypothèse potentielle liée à l’hyperacousie). Enfin, nous testerons des substances capables d’augmenter la présence ou l’efficacité des KCC2, pour voir si elles peuvent réduire ces troubles auditifs.
Bénéfices attendus
Ce projet présente un double objectif. Le premier est de mieux comprendre comment le cerveau se réorganise après une perte d’audition, en s’intéressant à un transporteur particulier appelé KCC2, qui joue un rôle clé dans l’équilibre de l’activité des neurones. Le second objectif est de tester des molécules suceptibles de de rétablir le bon fonctionnement de ces KCC2. À plus long terme, l’idée est que ces traitements pourraient aider à réduire ou supprimer des troubles auditifs très invalidants, comme les acouphènes (bourdonnements ou sifflements perçus sans son extérieur) et l’hyperacousie (hypersensibilité douloureuse aux sons), qui seraient liés à une activité excessive des neurones.
Procédures
Les interventions consistent en : - des expositions sonores de 1 à 4 h (210 animaux, éveillés), - des tests auditifs rapides sous anesthésie générale (210 animaux, ≈20 min), - des enregistrements ponctuels dans le cerveau plus longs (90 animaux, 6–8 h, sous anesthésie générale), - La mise en place d’un porte électrode pour des suivis chronique (90 animaux, 1h30, sous anesthésie générale) - des suivis chroniques avec électrodes implantées dans le cerveau (90 animaux, 2 h par séance d’enregistrement pendant 1 mois) - la collecte finale des tissus cérébraux et des cochlées (210 animaux, ≈30 min, sous anesthésie ou après euthanasie). - des injections intrapéritonéales de composés chimiques capables de renforcer l’action des KCC2 ou son expression, pour tester leur efficacité dans la réduction des troubles auditif (180 animaux, 15secondes)
Impact sur les animaux
- Stress lié à la manipulation des animaux ou la perte auditive. - Perte auditive du au traumatisme sonore - Mesure des réponses auditives du tronc cérébral (30min/animal), et enregistrements électrophysiologique aigu (6 à 8h/animal) sont réalisés sous anesthésie générale - La mise en place d’un porte électrode pour des enregistrements électrophysiologiques chronique se fait sous anesthésie générale (1h30/animal) - Stress pendant enregistrement électrophysiologique sur animal éveillé grâce au porte électrode. Durée 2h/max 2x par semaine (tous les 3-4 jours), animal non contraint - Effets secondaires de l’anesthésie (par exemple déshydratation) - Douleur ou inconfort chronique au niveau du site d’implantation des électrodes (Grattage ou secouement répété de la tête, diminution de la mobilité, baisse d’activité générale). - Risque d’infection au niveau de la zone opérée - Arrachement du chapeau de ciment orthopédique fixant le porte-électrode - 2 injections IP (0,3ml) par semaine pendant 4 semaines des composés pharmacologiques modulant l’activité ou l’expression des KCC2 (aucun effet attendu au niveau comportemental)
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de pouvoir récupérer les tissus d’intérêts pour notre projet à savoir la cochlée (organe auditif de l’oreille interne) et le cerveau pour des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est actuellement indispensable pour ce projet, car nous étudions les réponses neuronales centrales et leurs modifications après une perte auditive. Les effets de molécules pharmacologiques sur ces réseaux sont hautement complexes et non linéaires, ce qui rend les modèles purement informatiques (« in silico ») incapables, à ce jour, de reproduire fidèlement la dynamique réelle du cerveau. Cependant, les données obtenues dans ce projet permettront d’améliorer les futurs modèles informatiques du système auditif. À terme, ces modèles permettront de mieux simuler les conséquences d’une perte auditive et d’anticiper l’effet de traitements potentiels, ce qui réduira progressivement le recours à l’animal.
Réduction
Notre volonté est de réduire au plus juste le nombre d’animaux utilisés pour des raisons éthiques mais aussi pour des raisons de cout. Le nombre d’animaux utilisés dans notre projet est calculé au plus juste, en fonction de notre expérience, de la littérature, des contraintes expérimentales qui sont les nôtres, et des effets attendus, notamment sur l’état d’excitabilité des neurones centraux après une perte auditive (calcul de puissance à partir des résultats déjà obtenus par notre équipe sur le cobaye). Par ailleurs, les calculs de puissance pour ce projet ont été effectués en tenant compte de la taille d’effet anticipée (moyen), afin de garantir la pertinence statistique tout en limitant le nombre d’animaux. Si les premiers résultats montrent des effets importants et clairement détectables, une réévaluation à la baisse du nombre d’animaux sera effectuée. Nous utilisons notamment des tests statistiques non-paramétriques, dits de permutation, qui permettent de tester l’activité neuronale entre deux groupes sans faire aucune hypothèse sur la distribution des données.
Raffinement
Nous mettons tout en œuvre pour limiter au maximum la souffrance et le stress des animaux. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale, complétées par une analgésie locale avant chirurgie, afin d’éviter toute douleur pendant la procédure. Au réveil, les animaux reçoivent des soins attentifs, notamment une alimentation hydratée facile d’accès et une surveillance rapprochée 1 fois par jour pendant les 5 premiers jours. Nous insistons sur le fait que toutes nos procédures sont maitrisées depuis plusieurs années et que la souffrance animale est minimisée. Une partie de nos expériences est réalisée sans réveil des animaux, ce qui élimine tout risque de souffrance post-opératoire. Lorsque les animaux sont implantés avec des électrodes chroniques, une attention particulière leur est accordée, avec une surveillance quotidienne (1 fois par jour durant les 5 jours suivant la chirurgie) de leur état général, de leur poids, de leur comportement et du site opératoire. Nous suivons une grille de points limites prédéfinis qui permet d’identifier rapidement tout signe de douleur ou de détresse (perte de poids, infection, comportement anormal, difficultés à se déplacer). En cas de problème, des mesures correctrices adaptées sont immédiatement mises en place (traitement antidouleur, soins locaux, antibiotiques). Si malgré cela l’animal ne récupère pas, nous procédons à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance inutile. Enfin, des précautions spécifiques sont prises pour prévenir les complications liées aux implants (protection du dispositif, nettoyage régulier) et pour limiter le stress lors des enregistrements en éveil (habituation progressive, durée limitée des sessions).
Choix des espèces
Le cobaye est l’espèce de choix en audition (même si d’autres espèces sont utilisées) pour deux raisons. La première est que l’audition des cobayes (100 Hz – 32 kHz) est globalement déplacée d’une octave vers les hautes fréquences par rapport à l’audition humaine (50 Hz – 16 kHz). L’audition des cobayes est donc relativement proche de l’audition humaine. La deuxième raison est que l’oreille moyenne et en particulier la fenêtre ronde est aisément accessible chez cette espèce, permettant d’accéder facilement à la cochlée pour différentes applications (stimulation électrique ou ultrasonore de la cochlée, enregistrement de l’activité du nerf auditif, administration de substances ototoxiques etc.). En conclusion, pour les raisons listées ci-dessus, un grand nombre de laboratoires en audition dans le monde utilisent le cobaye. Les données disponibles chez cette espèce représentent donc la justification de l’utilisation de cette espèce pour nos recherches. Nous utiliserons des cobayes Hartley adultes (400–800 g). Ce choix est motivé par le fait que leur système nerveux est arrivé à maturité, ce qui permet d’évaluer les effets d’une perte auditive dans des conditions comparables à celles observées chez l’humain adulte. L’utilisation d’animaux immatures n’est pas appropriée, car leur cerveau est encore en phase de développement et soumis à une plasticité spécifique à cet âge, ce qui biaiserait les résultats. À l’inverse, l’utilisation d’animaux vieillissants introduirait d’autres variables non souhaitées, comme une perte auditive naturelle liée à l’âge (presbyacousie), des comorbidités possibles et une variabilité interindividuelle plus importante
Etude des troubles du sommeil et du rythme circadien dans un modèle murin de lésion cérébrale du prématuré
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souriceaux de un à cinq jours reçoivent deux injections quotidiennes d'un produit inflammatoire dans l'abdomen, sans anesthésie ni sédatif, puis une électrode leur est implantée dans la nuque et ils sont séparés de leur mère une heure et demie. 308 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur signale que ces injections peuvent provoquer une hémorragie abdominale interne ou la mort dans 5 à 10 % des cas, tout en les décrivant comme un acte peu douloureux ne nécessitant pas d'anesthésie. Tous les souriceaux sont tués à cinq ou huit jours de vie pour des analyses moléculaires, après une heure d'enregistrement pendant laquelle ils respirent de l'air enrichi en gaz carbonique puis appauvri en oxygène.
Objectifs
La prématurité est la première cause de mortalité et de handicap chez les enfants de moins de 5 ans. On sait aujourd'hui qu'une infection maternelle peut déclencher un accouchement prématuré. L'inflammation du cerveau chez le bébé prématuré est appelée encéphalopathie du prématuré. Ceci est lié à un risque élevé de troubles du développement comme les troubles du spectre autistique. Nous avons identifié chez le souriceau une altération des voies moléculaires régissant le rythme circadien (cycle jour/nuit). Des études récentes suggèrent que lorsque ce rythme est perturbé, le cerveau devient plus vulnérable aux effets de l'inflammation. Le sommeil et le rythme circadien pourraient ainsi jouer un rôle dans l'apparition des troubles. Nous testerons l’hypothèse selon laquelle l’architecture du sommeil et/ou le rythme circadien sont perturbés dans un modèle murin de lésion cérébrale du prématuré. Nous essayerons de confirmer les modifications moléculaires, d’étudier les corrélations avec le rythme circadien, de caractériser le sommeil des animaux et d’évaluer l’impact sur le contrôle ventilatoire, une fonction qui suit un rythme circadien.
Bénéfices attendus
L’apparition du trouble du sommeil et du rythme circadien durant la maturation cérébrale peut avoir des répercussions sur la santé physique et mentale des enfants. Le sommeil peut être un marqueur pertinent du risque d’évolution vers un trouble psychiatrique. Cette dimension est particulièrement notable dans les troubles du neurodéveloppement, où les altérations du sommeil sont fréquentes. De plus, la perturbation du rythme circadien peut augmenter la susceptibilité aux réponses inflammatoires dans le cerveau. Cette étude permet d’appuyer l’importance du sommeil et du cycle circadien dans la prise en charge notamment des enfants prématurés. Chaque année, environ 13 millions de naissances prématurées sont recensées dans le monde. Environ 40 % des naissances prématurées se produisent dans un contexte inflammatoire (infection maternelle, septicémie néonatale) d’où la nécessité d’identifier les mécanismes communs pour développer des stratégies thérapeutiques ciblées.
Procédures
Il n'y a pas de prélèvements sur animaux vivants sans anesthésie ni sédatif (vigiles). Pour induire l'inflammation, on applique un protocole validé : Injections bi-quotidienne de P1( un jour de vie) à P4 et injection unique à P5 de produit induisant l'inflammation pour le groupe traité et injection du solvant pour le groupe contrôle. L'injection dure moins de 30 secondes par animal. Insertion sous anesthésie (moins de 10 min) d'électrodes pour l'enregistrement de l'activité du muscle de la nuque à P5 ou à P8. Séparation maternelle d'1h 30 à P5 ou à P8 pour l'enregistrement des paramètres évaluant l'architecture du sommeil et la ventilation. L’enregistrement dure une heure au cours duquel es animaux respirent de l'air pendant 30 min + de l'air enrichi en gaz carbonique CO2 (hypercapnie) pendant 5 min + retour en air (normoxie) pendant 15 min + de l'air appauvri en oxygène (hypoxie) pendant 3 min et un retour en air pendant 7 min (total 1h).
Impact sur les animaux
Les injections réalisées sur les souriceaux durant les 5 premiers jours de vie peuvent causer une douleur transitoire et locale. La séparation avec leur mère le temps des injections peut causer un stress transitoire. Les injections de produit induisant l'inflammation peuvent causer une déshydratation, les souriceaux peuvent montrer un retard de croissance par rapport aux souris contrôles. Les injections en général peuvent également, mais rarement, entraîner une hémorragie abdominale interne chez les souriceaux, ou leur mort dans 5 à 10% des cas. Pour cette raison, l'apparition d'hémorragie sera particulièrement surveillée entre P1 et P5. L’implantation d’électrodes pour l’enregistrement de l’activité du muscle de la nuque génère également un stress et une douleur à l’installation (moins de 10 minutes). Implantation une seule fois par animal à P5 ou à P8 pour la procédure 1.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés (Jour 5 ou 8/9) pour les analyses moléculaires, pour fin des procédures ou en cas de points limites terminaux.
Remplacement
L’étude de la complexité de la réponse inflammatoire au niveau cérébral requiert l’utilisation d’un organisme vivant. Il est important de maintenir l’activité de l’organisme dans un état dynamique (c'est à dire en mouvement et fonctionnel) dans le cadre d’une étude à plusieurs stades de développement. Ainsi, nous pourrions comprendre les dysfonctionnements dans un contexte anormal ou morbide suite à une perturbation, comme l'inflammation par exemple. Pour cela, cette étude n’est envisageable qu’in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence biologique statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Procédure 1 : Pour tenir compte de la variabilité inter-individuelle des mesures des paramètres ventilatoires, nous avons déterminé un lot expérimental de 20-30 animaux soit 4 portées par groupe d'injection. Nos études publiées sur les variables respiratoires valident l’effectif de 20-30 animaux pour obtenir une puissance statistique satisfaisante. Cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires un effectif plus faible permet de tester les hypothèses. Pour la procédure 2 : enregistrement vidéo par une caméra infrarouge de l’activité de la mère et de sa portée pendant 24h à P5 à la fin de la dernière injection puis à P8. Réutilisation des mêmes animaux sur les deux âges.
Raffinement
On optimisera l’acceptation des souriceaux par la mère en enrichissant l’hébergement avec du papier doux absorbant pour le nid. L’injection pour l’induction de l’inflammation est effectuée dans l'abdomen sur animal vigile (sans sédatif ni anesthésie), c’est un acte peu douloureux ne nécessitant pas d’anesthésie. Des points limites suffisamment prédictifs sont proposés. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, on surveillera l’apparence de la peau/du corps, la recoloration des extrémités après injection, et le tonus ; à distance de l'inflammation on réalisera une surveillance régulière de la prise de poids, de l'absence de troubles du comportement (isolement). Procédure 1 : Pour l’enregistrement de l’activité nucale, les souriceaux sont anesthésiés puis l’électrode est insérée au niveau de la nuque sécurisée grâce à un matériau d’empreinte. L’induction est rapide et la récupération est d’environ 10min. Après la récupération à l'anesthésie (10 min), les paramètres ventilatoires, l’activité musculaire de la nuque et l’activité motrice sont mesurés pendant une heure à la température ambiante de 32-34°C. Pour la procédure 2 : enregistrement vidéo par une caméra infrarouge de l’activité de la mère et de sa portée pendant 24h à P5 à la fin de la dernière injection puis à P8.
Choix des espèces
Ce modèle a été choisi car il présente les lésions du cerveau et des troubles du comportement similaires à ceux observés chez les enfants prématurés atteints de troubles du développement cérébral. Il a l'intérêt de modéliser le cerveau en développement d'un prématuré de moins de 28 semaines, car un souriceau à 1 jour de vie correspond à un prématuré de 28 jours, par ailleurs, cette correspondance a l'avantage de ne pas impliquer d'intervention in utero. Induction pour le modèle d'inflammation : P1 à P5 (période équivalent au 3ème trimestre de grossesse d'un point de vue neurodevelopmental chez l'humain) Mesure de la ventilation, de l'activité nucale et de l'activité circadienne des souriceaux à P5 et à P8. P5 pour la période aigüe de l'inflammation P8 : début de résolution progressive de l'inflammation Ces âges permettent d'étudier l'architecture du sommeil dans un contexte inflammatoire et à la résolution progressive de celle-ci.
Étude des interactions entre système nerveux et système immunitaire dans les troubles du comportement
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Pour relier la dépression humaine à l'inflammation chronique, des souris sont rendues durablement inflammatoires puis soumises à des tests censés mesurer un phénotype dépressif. 8 799 souris vont être utilisées, dont 4 440 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever tissus et organes vitaux. Elles reçoivent des composés jusqu'à trois fois par semaine pendant cinq à quatorze semaines, subissent des chirurgies pouvant atteindre deux heures, des poses d'implants, jusqu'à quatre ponctions sanguines et un hébergement individuel de un à sept jours après chirurgie. Le porteur qualifie ces tests comportementaux de non invasifs sans dire lesquels, et signale que certains imposent une privation de nourriture ou de boisson pouvant aller jusqu'à seize heures.
Objectifs
Nous étudierons comment les signaux pro-inflammatoires, notamment certaines molécules, affectent le cerveau et le comportement. Des valeurs sanguines élevées de molécules pro-inflammatoires sont associées à la dépression chez l’être humain. De plus, il existe un groupe de maladies rares caractérisées par la production incontrôlée de molécules pro-inflammatoires, à l’origine d’un état inflammatoire chronique pouvant être associé à des troubles psychiatriques. Par conséquent, notre projet permettra de découvrir les mécanismes responsables qui relient la perturbation de l’humeur à un contexte inflammatoire chronique. Nous poursuivrons trois objectifs principaux qui structurent l’ensemble du projet : 1. Objectif 1 : Étudier les effets sur le comportement, le tissu cérébral et le système immunitaire, de l'administration ponctuelle, ou répétée, de molécules pro-inflammatoires. 2. Objectif 2 : Examiner le rôle des principales voies de communication entre périphérie et cerveau dans l’expression des phénotypes identifiés dans l’objectif 1. En particulier, nous étudierons les composants du système immunitaire, les nerfs périphériques et les barrières immunitaires du cerveau. 3. Objectif 3 : Tester l’efficacité de différentes approches pharmacologiques pour contrecarrer les effets des molécules étudiées sur le comportement, en ciblant les relais périphériques déterminés avec l’objectif 2. En particulier, nous évaluerons des antidépresseurs standard et alternatifs, et également des stratégies novatrices visant à réactiver le système immunitaire et réduire l’infiltration des cellules immunitaires dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Les approches conventionnelles pour l’étude des troubles de l’humeur et du comportement se focalisent sur des facteurs internes au cerveau, comme les niveaux des neurotransmetteurs, ou des facteurs externes, comme le stress. De manière innovante, notre projet propose d’examiner des facteurs présents à la périphérie du cerveau, en tant que déclencheurs de la dépression. Les expériences proposées permettront une avancée significative dans les connaissances scientifiques concernant la communication bidirectionnelle entre périphérie et cerveau, en général, et plus particulièrement ceux impliqués dans les troubles de l’humeur. À court et moyen terme, les données collectées permettront de découvrir des nouveaux mécanismes pathologiques et marqueurs diagnostiques ou pronostiques de la dépression dans un contexte inflammatoire. Il s’avère que cette forme de dépression est résistante aux traitements de première ligne et constitue ainsi un besoin médical non satisfait à ce jour. À long terme, nos recherches poseront les bases pour le développement de nouvelles thérapies et contribueront à atténuer la stigmatisation qui accompagne les maladies mentales.
Procédures
Dans ce projet, les souris seront soumises à différents types d’interventions, séparément ou parfois en combinaison : 1. Administration répétée de composés, au maximum trois fois par semaine, pour une durée de 5 à 14 semaines selon le traitement. 2. Procédures chirurgicales sous analgésie/anesthésie. Ces interventions ne durent pas plus de deux heures par souris. 3. Tests comportementaux non-invasifs pour évaluer le phénotype dit dépressif. Les tests seront effectués à raison de 2 tests par jour, chaque test ayant une durée limitée entre 5 minutes et 4 heures. Ces tests seront effectués sur une durée maximale de 2 semaines (5 jours, pause de 2 jours puis 5 jours). Les tests pourront être répétés pour évaluer la progression du phénotype et minimiser le nombre d’animaux nécessaires. 4. Ponction sanguine, environ 1 min par souris. Les prélèvements pourront être répétés au maximum 4 fois par individu, avec un intervalle d’au moins une semaine entre chaque prélèvement. 5. Hébergement individuel. Un hébergement individuel pourra faire suite aux procédures chirurgicales, pour un maximum de 1 à 7 jours en fonction des procédures.
Impact sur les animaux
Le projet implique la mise en place de modèles de dépression chez l’animal, soit par administration de composés pharmacologiques, soit par l’application de facteurs environnementaux stressants, et ceci durant plusieurs semaines. Ces conditions sont source d’angoisse pouvant nuire au bien-être et à l’état général des animaux. Cette nuisance est considérée comme sévère. Les procédures chirurgicales prévues ont une sévérité globale qualifiée de modérée. Certaines peuvent entraîner une période de récupération jusqu’à deux semaines. Après chaque chirurgie, les souris recevront les soins post-opératoires appropriés (thérapie antalgique, désinfection de la plaie) et seront surveillées pour la manifestation des points limites spécifiques. D’autre part, les animaux pourront être soumis à des gestes pouvant causer une détresse ou une douleur légère : 1. Administration des traitements pharmacologiques, y compris les anesthésiques/antalgiques et les solutions physiologiques. La piqûre d’aiguille pour les injections provoque une douleur légère de courte durée. Le gavage provoque un inconfort léger de courte durée. Selon le traitement, les injections pourraient être répétées plusieurs fois par semaine, pour une durée maximale d’environ quatre mois. 2. Implants. La présence des implants pourrait créer de l’inconfort. La durée maximale de l’expérience sera d’environ quatre mois. 3. Tests comportementaux. La manipulation des souris pourrait causer un stress léger. Pour le minimiser, les souris seront habituées à l’expérimentateur et à la pièce où les tests seront conduits. La durée maximale des tests sera d’environ deux semaines. Certains tests comportementaux prévoient une privation de nourriture ou de boisson jusqu’à 16 h avant la réalimentation. Cela induit un stress physique et une détresse modérée. 4. Prélèvement sanguin au niveau de la joue. La piqûre comporte une douleur légère de courte durée. Le prélèvement sanguin peut entrainer un stress physique léger ou modéré temporaire. 5. Anesthésie gazeuse. Elle peut provoquer un inconfort de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour évaluer les phénotypes histologiques et moléculaires, ce qui nécessite le prélèvement de tissus et organes vitaux.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe pas de stratégies alternatives aux études in vivo pour l’étude du système immunitaire, du fonctionnement du cerveau et du comportement, ainsi que pour évaluer la complexité des interactions entre périphérie et cerveau. Les approches in vitro comme les cultures cellulaires ne reproduisent que des aspects particuliers du phénomène en question et peuvent manquer des connections anatomiques et fonctionnelles qui jouent un rôle clé dans ce projet ancré sur le thème des interactions cerveau-corps. Les modèles in silico que nous envisageons à moyen terme, nécessitent d’abord une validation expérimentale pour optimiser leur valeur prédictive.
Réduction
Les expériences ont été conçues pour comprendre un nombre d’animaux minimal mais suffisant pour évaluer les différences de comportement entre les divers groupes expérimentaux (avec la prise en compte de paramètres statistiques nécessaires pour estimer la taille de l’échantillon comme la puissance, le niveau de significativité, la taille de l’effet et de variations dans la population). Étant donné que le comportement animal est susceptible de variations inter-individuelles, et que nous souhaitons tester plusieurs paramètres à partir des mêmes animaux en utilisant une batterie de tests comportementaux choisis sur la base de la littérature et de notre expérience, nous avons estimé un nombre minimum de souris de 10 individus par sexe par groupe expérimental. Pour minimiser le nombre de souris, les tests pourront être répétés sur les mêmes individus après un intervalle de deux à quatre semaines. Le nombre de souris par groupe s’élève jusqu’à 15 pour les procédures qui peuvent entraîner l’exclusion d’individus pour des raisons techniques (par exemple, implants mal positionnés, expression hors cible ou sous-optimale d’un transgène). Les échantillons biologiques prélevés provenant des mêmes souris post-mortem fourniront des données anatomiques, physiologiques et/ou moléculaires qui pourront être corrélées à la performance comportementale mesurée.
Raffinement
Les procédures expérimentales ont été conçues afin de minimiser tout inconfort, douleur ou souffrance prolongée de l’animal. Dans ce but, nous utiliserons des points limites précoces et spécifiques prédéfinis. Pour les tests de comportement, les souris seront habituées à l’expérimentateur et, si possible, à la pièce expérimentale avant les tests. Pour les procédures qui comprennent une chirurgie, les souris seront surveillées attentivement en post-opératoire pour la fermeture des plaies, les signes d’inconfort, douleur ou souffrance prolongée et leur bien-être général. Les interventions incluent la désinfection des plaies, la thérapie antalgique, l’administration de solution saline pour réhydratation, le renforcement de l’enrichissement des cages et/ou chauffage (dôme en papier, morceaux de coton ou papier), la séparation des souris agressives des souris blessés en cas d'agressivité répétée.
Choix des espèces
Le recours à la souris en tant que modèle animal est justifié par leur proximité génétique, physiologique, anatomique et bio/neurochimique par rapport à l’être humain. L’incomparable quantité de données présente dans la littérature scientifique sur ce modèle permet la comparaison, l’intégration et la validation des connaissances de notre projet, ainsi que l’optimisation des expériences prévues pour minimiser le nombre d’animaux nécessaires et maximiser leur bien-être. Sur un plan neuroanatomique, le modèle murin permet l'étude des circuits neuronaux et des modifications synaptiques associées aux comportements, ce qui est essentiel pour comprendre les bases biologiques de la dépression humaine. Enfin, au niveau comportemental, il existe plusieurs tests bien établis pour évaluer des comportements analogues à la dépression chez la souris. Collectivement, ces tests aident à identifier les comportements dépressifs et à évaluer l'efficacité des antidépresseurs. Nous utiliserons des souris adultes, à partir de 6 semaines après la naissance, car nous étudions l’impact des dysfonctions du système immunitaire sur le comportement et l’humeur à l’âge adulte.
Exploration d’un traitement expérimental chez un modèle souris des troubles neurodéveloppementaux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Deux minutes de sédation gazeuse, dix secondes de contention, une injection de deux secondes : 420 souris subissent ce protocole sous anesthésie et sont tuées avant tout réveil, leurs tissus servant ensuite à des tests ex vivo. L'objectif déclaré est de mesurer l'effet d'une nouvelle molécule sur des neurones porteurs d'altérations génétiques liées à l'autisme. Le porteur présente cette molécule comme un "réel espoir" pour les 700 000 personnes concernées en France, tout en rappelant que les molécules précédentes ont été abandonnées faute de spécificité et à cause de leurs effets secondaires. Il affirme que le modèle animal est "absolument nécessaire" et retient la souris comme seul mammifère dont le génome se modifie en routine pour fabriquer des modèles de maladies humaines.
Objectifs
Les troubles du spectre autistique sont le résultat d’anomalies du développement du cerveau et touchent environ 700 000 personnes en France. À ce jour, il n’existe aucun traitement pharmacologique ciblé visant les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à cette condition. Ce projet vise à tester l’effet d’une nouvelle molécule en tant que piste thérapeutique permettant de traiter certains symptômes clés de cette condition. L’objectif de cette étude est d’approfondir nos connaissances sur l’effet thérapeutique de cette molécule sur des neurones portant des altérations génétiques liées à l’autisme.
Bénéfices attendus
Malgré des premières études prometteuses, les recherches menées sur des molécules précédemment développées dans le traitement des symptômes des troubles du spectre autistique ont été arrêté par manque de spécifité de l'action de ces traitements et l'apparition d'effets secondaires. Cette nouvelle molécule, aux propriétés améliorées, montre des résultats prometteurs dans les traitements des troubles du spectre autisque. Aucun traitement pharmacologique efficace n'ayant été développé jusqu'à présent, cette nouvelle molécule représente donc un réel espoir dans la prise en charge des troubles du spectre autistique.
Procédures
Les animaux subiront une sédation par inhalation d’un produit anesthésique gazeux (durée : environ deux minutes). Lors de cette sédation, ils seront brièvement mis en contention (durée : environ 10 secondes) et recevront une injection (durée : environ 2 secondes).
Impact sur les animaux
Les animaux subiront une sédation, qui pourrait engendrer un stress léger. Lors de cette sédation, ils recevront une injection intrapéritonéale lors d'une brève contention. Nous ne pouvons pas évaluer si la douleur liée à cette injection sera ressentie par l’animal, mais un léger inconfort est possible.
Devenir
Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mise à mort et leurs tissus utilisés pour les tests ex vivo
Remplacement
Le modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité des interactions neuronales nécessaire au traitement de l’information qui demande un système intact. Le remplacement par les méthodes in vitro ou in silico ne sont pas possible à ce jour.
Réduction
L'estimation de la taille de l'échantillon nécessaire s’appuie sur les études précédentes effectuées au sein de notre équipe utilsant les mêmes méthodes expérimentales. Selon cette étude, le nombre d’animaux nécessaire par groupe afin de procéder à des tests statistiques fiables et concluants pour ce type de données expérimentales est de 12. Nous avons ajouté une marge d’erreur de 15% si des problèmes techniques devaient être rencontrés . Réduction: nous procèderons à l’évaluation précoce de nos données, qui sera au fur et à mesure des la collecte de données afin de s'assurer qu'un nombre minimal d'animaux sera utilisé pour l'obtention de résultats fiables et solides. Cette procédure d'analyse nous permettra également d’abandonner un groupe expérimental si les premières données récoltées avec cette concentration ne montraient aucun effet probant.
Raffinement
Avant les expérimentations, les animaux seront inspectés quotidiennement afin de s'assurer le bien-être (pelage, posture etc.). Les indicateurs de leur bien-être correspondront aux points limites généraux appliqués durant leur hébergement dans la zone expérimentale. Si une dégradation de leur état est détectée, des mesures appropriées et adaptées seront mises en place immédiatement, soit par l’expérimentateur, soit par les zoo-techniciens de la zone. Du matériel pour la construction d'un nid ainsi que des tubes de carton seront mis à disposition dans les cages afin d'optimiser les conditions d'hébergement.
Choix des espèces
Les rongeurs possèdent un système sensoriel très développé et sont considérés comme étant une espèce modèle pour les études du système cérébral sensoriel. De plus, à ce jour la souris est la seule espèce de mammifère pour laquelle il est possible, en routine, de modifier le génome afin de créer des modèles de maladies humaines. Tel est actuellement le cas pour les modèles génétiques de l'autisme. Afin de comparer les résultats de ce nouveau traitement avec les autres études pharmacologiques menées auparavant dans l'équipe, des animaux de 4-6 semaines seront utilisés. Ainsi, nous seront capables d'évaluer la pertinence et l'efficacité de ce traitement sur l'activité neuronale afin de déterminer si cette molécule présente de réelles avantages thérapeutique.
Impact de l’activation immunitaire maternelle sur les infections congénitales par le cytomégalovirus – MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Une injection chez la rate gestante, un prélèvement de sang trois heures plus tard, puis une opération de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale pour atteindre les embryons et injecter le cytomégalovirus dans leur cerveau. Les ratons naissent, sont tatoués aux pattes le premier jour, pesés et testés chaque jour pendant deux semaines par le réflexe de retournement et celui d'éloignement du vide, le porteur ayant déjà observé chez eux des hyperextensions des membres et des crises d'épilepsie généralisées déclenchées par la manipulation. Vers le trentième jour, certains reçoivent une électrode implantée sous anesthésie et sont enregistrés trente minutes éveillés, d'autres passent à l'âge adulte des tests d'anxiété, de mémoire spatiale et de sociabilité. 1 828 rats sont concernés, dont 120 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les mères étant tuées faute de pouvoir être réutilisées et la descendance mise à mort pour analyses. L'ajout de deux traitements à étudier a fait passer l'effectif déclaré de 996 à 1 828 animaux.
Objectifs
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du développement cérébral, pouvant notamment causer surdité, paralysie cérébrale, épilepsie, déficience intellectuelle, etc. Une influence sur la survenue ultérieure d'autisme ou de schizophrénie a aussi été évoquée. En dépit de leur fréquence et de leurs conséquences médicales et socio-économiques, les mécanismes des troubles neurologiques liés aux infections congénitales au CMV restent peu étudiés et mal connus. Ainsi, les options préventives et thérapeutiques restent limitées. L’étude de modèles animaux pertinents, notamment chez le rongeur, et utilisant les CMVs spécifiques de ces espèces, représente une approche indispensable pour appréhender ces mécanismes évolutifs, liés aux développements respectifs du système immunitaire cérébral et des réseaux neuronaux, et à leurs interactions réciproques, dans un contexte ou gestation et statut immunitaire maternel doivent aussi être pris en compte. L'objectif principal de ce projet est d'explorer chez le rat l'impact de l’immunité maternelle sur les conséquences de l'infection du cerveau en développement par le CMV, à différents niveaux d’analyse : aux niveaux moléculaire et cellulaire, au niveau des conséquences neurologiques pendant la période postnatale précoce, et à plus long terme sur la cognition, le comportement et la survenue d'activités épileptiques. MODIFICATION : L’étude de deux traitements supplémentaires nécessite une modification du projet initial, avec l’ajout de 832 animaux.
Bénéfices attendus
Les infections congénitales à cytomegalovirus (CMV) concernent environ 1% des naissances et représentent une cause majeure de troubles du développement cérébral, avec des conséquences médicales sévères et un impact socio-économique important. Cependant, les mécanismes restent mal compris et peu abordés, et l'impact à long terme notamment reste mal connu. De ce point de vue, notre projet doit apporter des informations importantes pour apprécier ces conséquences, tout en ouvrant la possibilité de les prévenir en ciblant des altérations précoces du cerveau en développement.
Procédures
Une injection périphérique est pratiquée chez des femelles gestantes puis un prélèvement sanguin est réalisé 3h après l’injection. Après plusieurs jours de récupération, les mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale, afin d’accéder aux embryons et d’injecter le CMV dans les cerveaux embryonnaires. Dépendant du nombre d’embryons, la chirurgie dure de 30 à 45 minutes ; le muscle et la peau sont suturés. Au premier jour postnatal, les ratons d’une même portée sont tatoués au niveau des pattes avant et/ou arrière, et suivis quotidiennement pendant les deux premières semaines de vie (mesures de masse corporelle, réalisation de tests sensorimoteurs (test du réflexe de retournement lorsque l’animal est placé sur le dos, test du réflexe d’éloignement du vide lorsque la tête de l’animal est dans le vide, l’animal étant posé sur une plateforme élevée d’environ 8 cm), observation de la survenue de crises généralisées d’épilepsie) ; chaque session de tests dure environ 2-3 minutes. Autour du 30e jour postnatal, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter une électrode permettant d’enregistrer les activités corticales précoces. Ces enregistrements sont réalisés chez l’animal éveillé pendant environ 30 minutes, puis sous anesthésie générale légère pendant au maximum 2 heures. Au stade adulte, d’autres animaux sont évalués au cours de test cognitifs et comportementaux non-invasifs, sans restriction d'eau ni de nourriture (anxiété, reconnaissance et mémoire spatiales, sociabilité). Des sessions d’entrainement sont réalisées afin de minimiser le stress. Une fois ces tests terminés, une chirurgie sous anesthésie générale est réalisée sur certains animaux pour implanter un système sans fil permettant d’enregistrer les activités corticales. Ces explorations fonctionnelles (durée 72h) sont réalisées une semaine après la chirurgie chez l’animal vigile en activité dans sa cage. MODIFICATION : Deux traitements supplémentaires visant à éliminer un type cellulaire précis dans les cerveaux en développement sont pratiqués mais ils ne modifient pas les nuisances décrites ci-dessus : d’une part, un composé ajouté à la nourriture est administré pendant 4 jours consécutifs aux femelles gestantes ; d’autre part un composé est mélangé au CMV pour injection dans les cerveaux embryonnaires.
Impact sur les animaux
Le composé injecté aux femelles gestantes peut déclencher une réaction transitoire (hyperthermie, hypoactivité, et hypophagie) qui se normalise après 24h. Un prélèvement sanguin est réalisé à 3h post-injection. Après plusieurs jours de récupération, ces mêmes femelles sont opérées sous anesthésie générale pour accéder aux embryons et réaliser des injections dans les cerveaux embryonnaires. L'anesthésie des femelles gestantes peut engendrer des dépressions respiratoires, une hypothermie, une déshydratation. La chirurgie elle-même peut engendrer de rares et faibles hémorragies vaginales, des avortements partiels, une inactivité, une perte de poids, une inflammation des sutures. Les femelles gestantes sont isolées lors de la période post-opératoire jusqu’à la mise bas. Leur bien-être après chirurgie est évalué quotidiennement par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques. La majorité des femelles gestantes (>97%) récupèrent très bien après la chirurgie et la gestation se poursuit jusqu’à la mise bas. Chez les ratons nés après l’infection cérébrale au CMV in utero, un ensemble de phénotypes est attendu. Leur suivi quotidien au cours des deux premières semaines de vie postnatale a mis en évidence la survenue : d'hyperextension des membres inférieurs ; de crises d'épilepsie généralisées tonico-cloniques déclenchées par la manipulation ; d’un défaut de développement de réflexes sensorimoteurs évalués par le test d'éloignement du vide et le test de retournement. A plus long terme, nous anticipons des altérations fonctionnelles et comportementales chez les rats infectés par le CMV in utero, e.g. des activités épileptiques spontanées, des troubles du cycle veille/sommeil, des troubles cognitifs (mémoire spatiale) et des troubles de la sociabilité, mais cela doit être exploré et validé.
Devenir
Les femelles sont euthanasiés car elles ne peuvent pas être réutilisées. La descendance est mise à mort pour analyses post mortem.
Remplacement
Les mécanismes neuropathologiques des infections congénitales par le CMV reposent sur des interactions développementales multiples, entre la dynamique de l'infection virale elle-même, celle des réseaux neuronaux, et celle du système immunitaire cérébral, ceci dans un contexte de grossesse et d'un statut immunitaire maternel modifié. Il est évident que la plupart de ces évènements, leur évolution, ainsi que leur complexité et leurs relations réciproques, ainsi que leurs conséquences à long terme comme envisagé dans le projet, ne peuvent être modélisés in vitro y compris en utilisant des cérébroïdes, et encore moins in silico. Cette constatation est évidente pour les études cognitives et comportementales. Une partie de nos expériences d'enregistrements des activités épileptiques sera réalisée in vitro (coupes cérébrales), afin de réduire l’expérimentation sur l’animal vivant.
Réduction
Nous avons basé le nombre minimal d'animaux nécessaires sur la base de nos résultats antérieurs, et sur des calculs classiques de puissance statistique pour les tests les plus usuels. Nous optimisons la réduction des animaux utilisés de plusieurs manières : - chaque gestation et tous les embryons injectés in utero sont utilisés. - par ailleurs, le principe de réduction sera appliqué, car un animal jeune adulte passera à la fois les tests cognitifs et comportementaux, puis les enregistrements EEG ; les tissus cérébraux étant prélevés à l'issue de ces analyses. Ceci aura de plus l'avantage de permettre d'établir d'éventuelles corrélations entre plusieurs anomalies chez les mêmes animaux ayant passé l'ensemble des tests.
Raffinement
Le bien-être des animaux est évalué par des mesures de paramètres cliniques, comportementaux ou biologiques adaptés, y compris les weekends et jours fériés, qui sont consignées dans un registre (avec une fiche de suivi post-opératoire pour les femelles gestantes, qui permet d'établir un score, et une fiche de suivi des cohortes de ratons injectés au CMV). Chaque rate et sa portée est hébergée dans une cage avec nourriture et eau à volonté. L’environnement est enrichi avec des matériaux souples (papier foisonnant, litière en carrés de cellulose vierge) et un tunnel en carton permettant la confection d’un nid. Les femelles gestantes subissent une intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale, sur un tapis chauffant. Le rythme respiratoire des animaux est surveillé en permanence, et une injection intra-péritonéale de sérum physiologique est réalisée en fin d’intervention. Après leur réveil, les femelles sont placées sur un tapis chauffant pendant au moins 30 minutes. Un suivi post-chirurgical est réalisé : surveillance de la cicatrisation (nettoyage de la plaie et nouvelles sutures si détérioration), d’absence d'hémorragie vaginale, de la mise bas (euthanasie si retard de la mise bas supérieur à 24h), de la perte de poids (euthanasie si > à 20%), de l'hypothermie (froid au touché), des signes de douleur (prostration, agressivité, absence de réaction aux stimuli). En fonction du score obtenu, une injection d'analgésique ou d’anti-inflammatoire peut être pratiquée. Les ratons sont également suivis avec notamment une surveillance de leur état général et de leur prise de poids, et de l’apparition des phénotypes caractéristiques de notre modèle. Ces mesures sont quotidiennes pendant les 2 premières semaines postnatales. Au delà, seul le poids sera mesuré, d’abord quotidiennement jusqu’au 20e jour postnatal, puis 1 fois par semaine jusqu’au sevrage (au 30e jour postnatal). Ensuite, les animaux seront regroupés par sexe à 2-3 individus par cage dans un environnement enrichi (rouleaux de papier foisonnant et tunnel en carton). Le poids sera suivi une fois par semaine. Au stade adulte, les tests comportementaux seront effectués, ils seront précédés de plusieurs sessions d’habituation pour minimiser les effets du stress.
Choix des espèces
Les animaux que nous utilisons, en l'occurrence les rats, sont des rongeurs de petite taille et d’élevage facile, avec une gestation d'une durée adaptée aux exigences des travaux de recherche. Ils possèdent un système nerveux central dont le développement présente de nombreuses similitudes avec celui du système nerveux humain, et dont l’organisation, certes simplifiée, est cependant suffisamment complexe pour être représentative. D'une manière générale, ils constituent des modèles de choix pour l’étude des mécanismes pathologiques du développement cérébral. Le rat est particulièrement adapté à des études électrophysiologiques, cognitives et comportementales. Dans le projet présenté ici, le choix de l'espèce est aussi orienté par l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus de rat recombinante, car les cytomégalovirus, y compris ceux de rat, sont spécifiques d'espèce. Les rates gestantes seront âgées d'environ 10 semaines à 6 mois. Les infections in utero seront réalisées au début du dernier tiers de gestation, ce stade d'infection tenant compte de l'état de développement cérébral, d'impératifs méthodologiques, et conduisant à reproduire les conséquences neurologiques postnatales rappelant la pathologie humaine modélisée ici. L’étude des activités épileptiformes in vitro sera réalisée autour du 15e jour postnatal, période classique où le cerveau immature, correspondant à la période néonatale chez l'homme, présente une plus forte susceptibilité aux activités épileptiques. Les enregistrements des activités corticales précoces seront réalisés autour du 30e jour postnatal, une période classiquement utilisée pour ce type d’enregistrements. La recherche d'effets à plus long terme du CMV sera réalisée chez des jeunes rats (40e jour postnatal et au delà), permettant la réalisation efficace de tests cognitifs et comportementaux, ainsi que des enregistrements électro-encéphalographiques sur plusieurs jours consécutifs.
Etude des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de méningites bactériennes chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Âgées de trois semaines, les souris utilisées servent à reproduire la méningite de l'enfant, et certaines lignées génétiquement déficientes portent un risque accru d'infection. 3 700 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune reçoit une injection bactérienne sous anesthésie générale d'environ trois minutes, puis jusqu'à deux injections supplémentaires de trente secondes, le porteur indiquant que l'infection peut provoquer douleur, prostration et retrait du groupe social pendant seize heures au plus. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau et analyser la réponse inflammatoire, seul moyen selon le porteur d'identifier les molécules qui abîment le cerveau au cours de l'infection.
Objectifs
La méningite est une infection du cerveau qui est associée à un taux de mortalité élevé ou laisse chez 30 à 50 % des survivants, des séquelles neurologiques. Lorsqu'un microorganisme envahit le cerveau, une réponse immunitaire est déclenchée afin de combattre l’infection. Cependant,cette réponse peut aussi causer des dommages au cerveau responsable en partie des séquelles neurologiques. Notre objectif est de caractériser la réponse immunitaire du cerveau lors de l’infection et d’identifier des molécules inflammatoires qui pourraient jouer un rôle néfaste sur le cerveau.
Bénéfices attendus
L'identification de ces molécules inflammatoires impliquées dans les dommages au cerveau lors de la méningite accélérera le développement de thérapies visant à réduire les séquelles neurologiques à long terme.
Procédures
Les animaux seront infectés par injection sous anesthésie générale (1 injection pour une durée totale d'environ 3 min). Des injections supplémentaires permettant l'administration de traitement ou d'anesthésie seront réalisées (jusqu'à 2 injections/animaux durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
Les injections causent un stress de courte durée (quelques secondes). L'infection est susceptible de générer douleur, prostration, et une mise en retrait du groupe social (16h maximum). Certaines souris génétiquement déficientes qui seront élévées présentent un risque accru de développer une infection.
Devenir
Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de reproduire la complexicité du cerveau et du système immunitaire in vitro. L'analyse de la réponse inflammatoire du cerveau nécessite le prélevement des organes justifiant la mise à mort des animaux.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas l'étude de la réponse inflammatoire du cerveau qui peut mettre en jeux de nombreux types de cellules. Aussi, le modèle animal est indispensable à ce projet qui permettra d'identifier l'ensemble des cellules et molécules inflammatoires impliquées dans ce processus et également d'analyser l'impact de l'inflammation systémique sur le déclanchement de la neuroinflammation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum mais suffisant pour permettre une analyse statistique fiable. Chaque expérience indépendante comportera au moins un groupe témoin d'animaux et un groupe test et les différences entre les souris test et les témoins seront analysées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
L’infection se fera sous anesthésie générale. Les animaux bénéficieront d’un hébergement adapté et d'un milieu enrichi. Nous avons optimisé les inocula bactériens et les temps d’étude de manière à minimiser les effets de l’infection sur les animaux. Ce protocole inclut des points limites spécifiques au projet qui permettront d'évaluer les animaux, à l'aide d'une grille de score. En cas de point limite atteint, les animaux seront mis à mort de façon anticipée. Dans le cas où certains animaux peuvent être malades, des croquettes imbibées d’eau sont systématiquement introduites directement dans la cage pour favoriser la prise alimentaire. Pour les souris immunodéprimées, un hébergement sans orgganismes pathogène sera mis en place;
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire la physiopathologie de l'infection tels qu’ils peuvent se développer chez l'enfant. Nous utiliserons des souris juvénile de 3 semaines qui constituent notre modèle d'étude de méningite. D’autre part, les modèles animaux comme la souris offrent la possibilité d’investiguer des cibles spécifiques in vivo à l’aide d’animaux génétiquement modifiés, ce qui permet d'approcher ou d'élucider de plus près les mécanismes impliqués
Décontamination de lignées murines d’intérêt par transfert d’embryons
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Importées d'autres établissements ou déjà hébergées sur place, les lignées de souris concernées doivent changer de statut sanitaire, ce qui passe par la mort de toutes les femelles servant au transfert d'embryons. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les donneuses, âgées de quatre à six semaines, reçoivent deux injections hormonales à deux jours d'intervalle avant d'être tuées pour la récolte des embryons, les receveuses subissent une chirurgie de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale puis partent chez un prestataire où elles sont tuées pour vérifier leur statut sanitaire. Celles chez qui la réimplantation échoue sont tuées faute de pouvoir être réutilisées, et le porteur affirme qu'un tel projet ne peut pas se faire sans souris, l'étude du cerveau étant selon lui hors de portée des modèles in vitro.
Objectifs
Les recherches réalisées dans l'établissement portent sur les maladies neurologiques telles que la maladie de Parkinson, Alzheimer, la sclérose en plaques et sur les maladies psychiatriques telles que la schizophrénie ou les troubles de l’humeur. Ces projets de recherche visent à développer les connaissances sur ces sujets et identifier des axes thérapeutiques innovants pour améliorer la prise en charge des patients. Les lignées murines nécessaires pour ces projets sont élevées en interne. Afin de pouvoir importer de nouvelles lignées d’intérêt possédant des caractéristiques génétiques précises il est parfois nécessaire de les décontaminer, de même pour certaines lignées déjà hébergées sur place mais nécessitant un statut sanitaire plus strict, notamment pour leur élevage. La décontamination des lignées et leur hébergement dans une zone protégée (exempte d’agent pathogènes et opportunistes pour les souris, ou SOPF) permettra un meilleur contrôle de leur statut sanitaire et une amélioration de leurs conditions d’hébergement. La décontamination se fera par la technique de transfert d’embryons se basant sur le principe que l’embryon est protégé de tout contaminant présent chez sa mère. Les embryons à transférer seront récoltés, puis lavés et réimplantés chez une femelle dite receveuse (pseudogestante) dans la zone protégée de l’animalerie dans le but d’obtenir des souriceaux de statut sanitaire SOPF.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer les conditions d’élevage des lignées murines concernées, grâce à un meilleur contrôle du statut sanitaire des animaux et de leurs conditions d’hébergement. En effet la zone protégée bénéficie d’un accès très restreint et donc un environnement plus calme, permettant aux animaux de ne pas être exposés au stress lié aux nombreux passages de personnes fréquentant l’animalerie, mais également aux pathogènes pouvant être amenés via ces mêmes personnes. Les animaux d’élevage seront donc placés dans des conditions optimales pour se reproduire. Les petits générés dans cette zone protégée pourront ensuite être récupérés par les chercheurs dans la zone expérimentale pour participer aux projets de recherche et donc contribuer à l’avancée de la recherche pour différentes pathologies du cerveau telles que la maladie d’Alzheimer, de Parkinson, la sclérose en plaques, l’épilepsie, les tumeurs cérébrales, etc…
Procédures
Des souris femelles recevront 2 injections d’hormones à 2 jours d’intervalle (durée quelques secondes par injection, souris vigile) pour obtenir une superovulation. D’autres souris femelles auront une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour réimplanter les embryons (durée environ 45 minutes, une fois).
Impact sur les animaux
Lors des injections les animaux ressentiront une légère et brève douleur au niveau des zones de piqûre. La chirurgie sera associée à un risque de douleur et d’inconfort post-opératoire. L’anesthésie générale nécessaire pour la réaliser sera associée à des risques d’hypothermie, de sécheresse oculaire et plus rarement un risque de difficultés cardiaque et, ou respiratoire. Il est possible que certaines lignées à transférer soient à phénotype dommageable. Pour la majorité de ces lignées le phénotype dommageable ne s’exprimera qu’à partir de l’âge adulte (plus de 8 semaines, exemples : perte de poids, apparition de tumeurs, difficultés motrices, etc.), ici nous utiliserons des femelles jeunes (moins de 6 semaines), les phénotypes dommageables que nous prévoyons de rencontrer pour ces jeunes animaux pourraient consister en des tremblements, des anomalies cognitives ou une différence de poids par rapport aux souris non génétiquement modifiées.
Devenir
Toutes les souris utilisées pour la production des embryons seront euthanasiées pour pouvoir récupérer ces embryons. Les souris réimplantées avec succès seront transférées à un prestataire pour la confirmation de leur statut sanitaire, ceci nécessitera leur euthanasie afin de réaliser des prélèvements d'intérêt post-mortem pour les différentes analyses nécessaires à la validation du statut sanitaire. Les femelles pour lesquelles la réimplantation n'aura pas fonctionné seront euthanasiées car elles ne pourront pas être réutilisées.
Remplacement
Ce projet consistant à décontaminer des lignées murines il ne peut se faire sans l’utilisation de souris. Cette décontamination intervient dans le contexte de souris utilisées pour des projets de recherche dédiés à l’étude du cerveau. Ces études ne peuvent s'effectuer que sur des modèles animaux car les modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires ne suffisent pas à représenter les interactions complexes mises en jeu au niveau cérébral. De plus lorsqu’il est nécessaire d’étudier des composantes comportementales ou motrices, notamment pour certaines maladies du système nerveux, il est indispensable de recourir à l’utilisation de modèles animaux car cela ne peut pas être représenté in vitro.
Réduction
Nous utiliserons au total 600 souris pour ce projet. Nous avons défini cet effectif par rapport à notre expérience de la technique et au taux de réussite de chaque étape. Ainsi nous avons estimé que 6 souris donneuses étaient nécessaires pour obtenir un nombre suffisant d’embryons fécondés et viables à réimplanter. Ces femelles recevront un traitement de stimulation hormonale pour augmenter le nombre d’embryons récoltés permettant ainsi de réduire le nombre de femelles donneuses nécessaires pour chaque transfert. Pour les femelles receveuses nous avons défini qu’il nous faudrait 4 femelles maximum afin de prendre en compte le risque lié à la chirurgie et le risque de perte de la portée lié aux aléas de l’élevage. Nous avons choisi une souche de souris spécifique comme receveuses car elle permet d’avoir un bon rendement de réimplantation et présente un comportement maternel fort permettant ainsi de réduire le nombre de femelles à réimplanter pour obtenir un nombre de souriceaux suffisants. Nous estimons que nous aurons au maximum 12 lignées à décontaminer par an. Les mâles vasectomisés ne sont pas soumis à déclaration dans ce projet, mais, à titre informatif ils seront conservés pendant 10 mois afin de participer à plusieurs sessions de transfert dans un souci de réduction plus global.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu avec un carré de coton et un bâtonnet de bois à ronger au minimum, complétés par une maisonnette pour les femelles gestantes. Les animaux en provenance extérieure bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum avant leur entrée en procédure. La chirurgie s’effectuera sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésique adaptée. Un gel oculaire sera appliqué sur les yeux des animaux pour éviter toute sécheresse oculaire. Leur température corporelle sera maintenue grâce à l’utilisation de chambres d’induction et de réveil chauffées et d’un tapis chauffant thermorégulé. Le réveil des animaux sera surveillé, et des croquettes et de l’hydrogel seront mis à disposition dans le fond de la cage pour faciliter leur récupération la première journée. Une évaluation de leur état général sera assurée en période post-chirurgicale. Tous les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie, celle-ci est transmise à la structure chargée du bien-être animal (SBEA), au vétérinaire et à notre équipe afin d’assurer la meilleure prise en charge des animaux. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance. Il est possible que certaines lignées à transférer soient à phénotype dommageable, pour les femelles génétiquement modifiées qui pourraient être impliquées dans ce projet (cas des mutations génétiques complexes) nous nous assurerons que le phénotype ne soit pas impactant pour la reproduction et, ou, qu’il ne soit pas encore exprimé. Nous utiliserons des femelles très jeunes à un âge auquel nous ne devrions observer (au maximum) que des signes cliniques légers en lien avec ces phénotypes dommageables.
Choix des espèces
Ce projet portant sur le transfert d’embryons de lignées de souris transgéniques, il est impératif de conserver la même espèce. Le choix de cette espèce sera justifié dans les différentes demandes d’autorisation de projet afférentes aux lignées utilisées dans ce projet. Les femelles donneuses d’embryons seront utilisées à un jeune âge de 4 à 6 semaines. A cet âge la maturité sexuelle n’est pas complète et la souris n’est pas cyclée. Ainsi le traitement hormonal déclenche une maturation folliculaire massive et une ovulation. Les femelles receveuses seront utilisées à un âge compris entre 2 et 8 mois afin d’être sexuellement matures mais pas trop âgées pour conserver de bonnes capacités reproductives et maternelles. Cet âge permet également à la femelle de bien supporter la chirurgie.
Implantation d’un biomatériau régénératif comme stratégie thérapeutique innovante dans un modèle rat d’AVC. Suivi de l’évolution du tissu cérébral par IRM et histologie. EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le crâne ouvert deux fois, une heure pour créer la lésion cérébrale puis une heure pour poser l'implant, chaque rat passe ensuite trois IRM d'une heure sous anesthésie. 84 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit une douleur aiguë liée à l'incision du cuir chevelu, à la trépanation et à la manipulation du tissu cérébral, des saignements intracrâniens possibles, des œdèmes cérébraux et des crises d'épilepsie soudaines, et compte pourtant parmi les bénéfices attendus une "réduction des interventions multiples" qui diminuerait le stress et la souffrance des animaux non-humains. Tous sont tués pour que leur cerveau soit analysé et le biomatériau observé en place.
Objectifs
L’objectif scientifique de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique innovante visant à favoriser la régénération des voies nerveuses motrices après une lésion du cortex moteur. Les effets de cette approche seront évalués à la fois sur le plan tissulaire, par imagerie IRM et analyses histologiques, et sur le plan fonctionnel, au moyen de tests moteurs spécifiquement adaptés. Ce projet se déroule dans 2 établissements utilisateurs (EU)
Bénéfices attendus
Ce projet vise à démontrer l’intégration d’un nouveau biomatériau dans le tissu cérébral et à évaluer son potentiel à favoriser la récupération structurelle et fonctionnelle de la composante motrice. Les principaux bénéfices attendus sont : - Restauration tissulaire ciblée : le biomatériau pourrait stabiliser la matrice extracellulaire et soutenir la reconstruction des circuits corticospinaux. - Amélioration fonctionnelle : en favorisant la régénération neuronale et la réorganisation synaptique, il pourrait améliorer la mobilité et la coordination motrice. - Réduction des interventions multiples : un implant efficace limite le recours à des traitements répétitifs ou invasifs, réduisant le stress et la souffrance des animaux. - Avancée méthodologique : le suivi longitudinal par IRM et tests comportementaux permet d’observer l’évolution de la récupération chez le même animal, augmentant la robustesse des données et réduisant le nombre d’animaux nécessaires.- - Impact translational potentiel : les résultats pourraient guider le développement futur de thérapies régénératives pour les AVC ou traumatismes cérébraux, combinant implants biomimétiques, facteurs de croissance et thérapie cellulaire. En résumé, le projet allie compréhension fondamentale de la régénération cérébrale et perspective thérapeutique.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à 2 chriurgies sous anesthésie (réalisation de lésion (durée 1h) puis pose de l'implant (durée 1h)) au niveau cérébral (EU 1/2). Une IRM cérébrale sous anesthésie (durée 1h) sera réalisée 3 fois aprés la lésion (EU 2/2). La mise à mort sera réalisée pour la récupération des tissus cérébraux (EU 1/2).
Impact sur les animaux
Nuisances liées à la chirurgie: La procédure chirurgicale elle-même constitue une source importante de gêne pour l’animal. Elle peut provoquer une douleur aiguë immédiate liée à l’incision du cuir chevelu, à la trépanation et à la manipulation du tissu cérébral. Malgré l’utilisation d’anesthésie générale et d’analgésiques adaptés, un risque résiduel d’inconfort ou de douleur persiste, notamment lors de la phase de réveil. La chirurgie comporte également des risques de complications, tels que : - Saignements intracrâniens - Infections post-opératoires - Réactions inflammatoires locales - Œdèmes cérébraux pouvant altérer le bien-être de l’animal et interférer avec la récupération attendue Conséquences post-opératoires et facteurs additionnels de stress Après l’intervention, les animaux peuvent présenter un inconfort prolongé lié à la cicatrisation et à l’adaptation physiologique post-lésion. Cela peut se traduire par : - Altération de la motricité - Diminution de l’appétit - Modification du comportement exploratoire - Apparition de crises d’épilepsie soudaines Les premiers tests comportementaux réalisés après récupération peuvent également induire un stress psychologique, en raison de la nouveauté des situations expérimentales et de la contrainte de manipulation.
Devenir
La procédure se termine par la mise à mort des animaux afin de pouvoir étudier leurs tissus cérébraux. Cette étape est nécessaire pour observer directement comment le biomatériau s’intègre dans le cerveau, et pour mesurer la reconstruction des zones touchées et la récupération des cellules et des circuits moteurs. Les informations obtenues permettent également de mettre en relation les changements observés dans le cerveau avec les performances motrices mesurées chez l’animal, donnant ainsi une vision complète de l’efficacité du traitement.
Remplacement
L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une maladie grave causée par l’obstruction ou la rupture d’un vaisseau sanguin dans le cerveau, entraînant des séquelles neurologiques. Malgré les progrès de la recherche en laboratoire, les modèles actuels ne permettent pas encore de reproduire la complexité du cerveau humain, en particulier sa vascularisation et les réactions biologiques qui suivent un AVC. Pour mieux comprendre ces phénomènes et tester de nouvelles thérapies, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal. Ce projet vise à évaluer une stratégie innovante basée sur l’implantation de biomatériaux dans la zone lésée du cerveau, afin de favoriser la régénération. Les effets seront suivis à la fois par des tests fonctionnels (motricité, force, comportement) et par imagerie cérébrale (IRM). Après avoir obtenu des résultats encourageants avec d’autres biomatériaux chez le rat, nous allons maintenant tester un nouveau biomatériau biodégradable, plus proche des conditions physiologiques humaines et offrant un meilleur potentiel régénératif.
Réduction
L’utilisation de méthodes non invasives comme l’IRM et les évaluations motrices permet de suivre les mêmes animaux dans le temps, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaires. Nous prévoyons d’utiliser 84 animaux adultes, mâles et femelles, sur une période de 5 ans, et nous réutiliserons, lorsque possible, les données d’animaux témoins provenant de protocoles antérieurs. Les animaux seront répartis en différentes catégories : animaux non lésés, animaux ayant subi une chirurgie factice (sham lésion), animaux avec implantation factice (sham-implant), et hémisphères sains des animaux lésés. Le suivi longitudinal de chaque animal permettra d’évaluer la récupération motrice ainsi que les changements observés à l’IRM et en histologie, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le principe fondamental des 5 libertés est strictement respecté tout au long de l’étude. Les rats sont hébergés dans des cages ventilées, par groupes de deux individus (espèce grégaire), dans une salle dédiée exclusivement à cette espèce. L’alimentation est disponible ad libitum, y compris pendant les phases d'entraînement et d’évaluation motrice, sans jeûne ni restriction alimentaire. Le suivi de l’état de santé général est assuré par les expérimentateurs et le personnel de zootechnie : les animaux sont pesés chaque semaine et bénéficient de contrôles vétérinaires réguliers. Une attention renforcée est portée aux animaux opérés, qui font l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel formé. Cette surveillance comprend l’observation de l’appétit, du poids, de la mobilité, de l’état du pelage, du comportement général, et s’appuie sur un score clinique. Ce score guide les décisions à prendre : mise en place d’un traitement visant à diminuer la douleur, renforcement du suivi, retrait de l’étude ou mise à mort si nécessaire. La prise en charge de la douleur repose sur des protocoles stricts et validés, en cohérence avec les principes de nociception et leur impact potentiel sur le bien-être animal et la qualité scientifique des données (cf. paragraphe sur les chirurgies). Un enrichissement environnemental est systématiquement mis en place, incluant des éléments cognitivement stimulants (tunnels, boules de fouille, boules traversantes, odeurs naturelles variées…) ainsi qu’une stimulation sociale via une arène de rencontre intercage. les animaux sont conditionnés de manière progressive aux tâches motrices, à l’aide de renforcements positifs. Cette procédure est conçue pour être peu anxiogène et respectueuse du bien-être animal. Le transport des animaux de l’EU 1/2 à l’EU 2/2 (trajet routier de 10 km) est également encadré avec attention. Les cages sont sécurisées pour le transport, les biberons sont retirés afin d’éviter l’humidification de la litière, les animaux ont accès à des croquettes et à une coupelle de nourriture molle, les couvercles sont scotchés pour prévenir toute ouverture accidentelle, les cages sont placées dans des sacs isothermes afin de limiter les variations thermiques, les chocs et les nuisances sonores.
Choix des espèces
Le rat constitue un modèle privilégié pour l’étude de la récupération fonctionnelle de la motricité du membre supérieur après lésion cérébrale et implantation de biomatériaux. En effet, la mobilité et la force du membre antérieur représentent des fonctions motrices essentielles, dont la récupération est déterminante pour l’autonomie des patients cérébrolésés dans les activités de la vie quotidienne. De plus, des tests comportementaux validés et adaptés chez le rat permettent d’évaluer l’amplitude des mouvements, la force musculaire ainsi que la sensibilité des membres supérieurs. Enfin, le suivi longitudinal de la progression tissulaire est réalisé grâce à des examens d’imagerie (IRM) non invasifs, indolores et pratiqués sous anesthésie, garantissant le bien-être de l’animal. Pour l'IRM, la taille du cerveau de rat est privilégiée par rapport à la souris. Les expériences sont conduites sur des animaux adultes âgés d’environ 3 mois, ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et se rapproche de la tranche d’âge à laquelle surviennent majoritairement les AVC ischémiques.
Développement d’un traitement innovant des douleurs chroniques liées aux cancers
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Injectés de cellules cancéreuses puis soumis à des chimiothérapies, 720 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes. Chaque animal reçoit une injection hebdomadaire de la molécule à tester pendant six à huit semaines, sous la peau, dans une veine ou dans le canal rachidien, et son hypersensibilité est mesurée chaque jour, la sensibilité thermique trois fois au cours de l'étude. L'objectif déclaré est de fixer la dose et la fréquence optimales d'un candidat médicament dont le porteur indique qu'il a déjà montré son efficacité in vitro et in vivo. Tout traitement antalgique reste proscrit une fois le modèle de douleur établi, alors que le porteur décrit par ailleurs une acclimatation, un enrichissement des cages et une grille de score censés limiter la souffrance.
Objectifs
Les cancers qui touchent 18 millions de personnes par an dans le monde conduisent chez plus de 50% des patients à des douleurs chroniques. Les douleurs chroniques liées aux cancers sont de type neuropathique et/ou inflammatoire et sont soit induites par la tumeur et les métastases soit provoquées par les traitements du cancer. La prise en charge de ces douleurs est difficile car elles sont persistantes et rebelles aux traitements usuels. Les médecins sont donc démunis devant les patients en souffrance, d’où la nécessité de trouver de nouvelles cibles et stratégies thérapeutiques. Le projet consiste à tester l’efficacité d’une molécule médicament que nous venons de développer pour traiter différents types de douleurs liées aux cancer. Notre molécule médicament a déjà démontré son efficacité pour le traitement des douleurs chroniques dans une étude in vitro et in vivo préalable. Aujourd’hui notre objectif est de tester in vivo son efficacité pour soulager les douleurs chroniques liées aux cancers et de déterminer la dose et la fréquence optimales du traitement. Des injections de la molécule médicament seront effectuées sur 2 types de modèle de douleurs liées aux cancers : les douleurs cancéreuses liées à une tumeur et les douleurs consécutives à une chimiothérapie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de démontrer l’efficacité de notre molécule thérapeutique pour soulager les douleurs liées aux cancers et nous espèrons ainsi pouvoir proposer une nouvelle piste thérapeutique pour les patients atteints de cancer qui souffent de douleurs chroniques conséquentes à cette maladie. Les résultats précliniques de ce projet pourront soutenir la mise en place d’un essai clinique avec cette molécule.
Procédures
Il est prévu d’utiliser 720 rats pour ce projet. Les animaux seront soumis à deux types d’intervention : des injections de cellules cancéreuses et des chimiothérapies. Notre molécule thérapeutique, dont nous souhaitons évaluer l’efficacité pour soulager les douleurs chroniques liées aux cancers, sera injectée une fois par semaine soit en sous-cutané soit en intraveineux soit en intrathécal durant 6 à 8 semaines. Chaque type d'injection dure entre 2 à 3 min par animal. Les animaux seront anesthésiés pendant les injections. Une surveillance post-injection sera assurée par l’expérimentateur et les zootechniciens. Les animaux seront ensuite observés quotidiennement au cours de l'expérimentation et nous utiliserons une grille de score d'évaluation de la douleur et/ou souffrance pour évaluer l'état général et la douleur des animaux. Différents paramètres sont observés tels que l'apparence, l'alimentation, le comportement naturel et la respiration. Les animaux seront pesés et leur hypersensibilté sera évaluée quotidiennement à l'aide de tests de référence, la duré de ces gestes techniques est de maximum 4 min par animal. La sensibilité thermique aux températures sera quant à elle évaluée trois fois au cours de l’expérience, en début, après induction de la douleur et en fin de l’étude. Cette dernière évaluation dure 3 minutes par animal. Les jours où la sensibilté thermique est évaluée, les tests d'hypersensibilité ne sont pas réalisés.
Impact sur les animaux
Ce projet porte sur la douleur est nécessite l’utilisation de procédures sévères pour induire des douleurs neuropathiques et/ou inflammatoires. Il est donc attendu que les animaux présentent des symptômes de sensibilité douloureuse. L’objectif du projet étant l’évaluation du soulagement de ces symptômes douloureux par notre molécule médicament, l'utilisation de médicaments anti-douleur suite à l'établissement du modèle de douleur est proscrite. Une surveillance post-injection sera assurée par l’expérimentateur et les zootechniciens. En effet, une tuméfaction au point d’injection des cellules cancéreuses pourrait apparaitre.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés et les organes seront prélevés pour analyses.
Remplacement
- Remplacer : la douleur est une réponse de l’organisme entier face à une agression. Ce phénomène ne peut donc être étudié autrement qu’en utilisant l’organisme entier lui-même. Il n’est actuellement pas possible de remplacer le modèle animal pour ce type d'analyse. Néanmoins, il est possible d’étudier in vitro certains mécanismes utilisés par la réponse douloureuse et c’est ainsi que nous avons pu identifier le gène cible du traitement. Nous développons un modèle in vitro de cellules souches humaines différenciées en neurones sensoriels pour mieux comprendre le fonctionnement de notre gène cible dans les neurones de la douleur. Cependant, pour étudier le rôle de cette molécule dans la réponse douloureuse globale, le recours à l’animal est obligatoire.
Réduction
- Réduire : le nombre de rats utilisé sera réduit au minimum afin de limiter l’utilisation d’animaux vivants mais de manière à avoir des effectifs compatibles avec les tests statistiques utilisés. Le nombre d’animaux par lot est basé sur la littérature où un effet statistiquement significatif est mis en évidence à partir d’un seuil de 6 mâles et 6 femelles par lot. L’étude nécessitant de nombreuses cohortes associé au fait que notre étude précédente avec cette molécule médicament donnait des résultats très homogènes dans un même lot, nous avons choisi de constituer des lots de 6 animaux par sexe pour réduire au maximum le nombre d’animaux et respecter la règle des 3R.
Raffinement
- Raffiner : pour limiter l’angoisse due aux tests pratiqués, une acclimatation est réalisée durant laquelle les animaux à leur arrivée sont laissés 5 jours dans les cages pour qu’ils s’habituent aux locaux de notre animalerie. Durant une semaine, les animaux sont ensuite manipulés et présentés aux différents appareils de tests comportementaux qui seront utilisés dans l’étude, mais aucun test n’est pratiqué, afin que les animaux s’habituent à l'expérimentateur ainsi qu’aux différents équipements de test. Cette étape d'habituation permet aux animaux de s’habituer à l’environnement, à l'expérimentateur et de limiter le stress lié à la procédure. Les cages auront un enrichissement du milieu. Ce milieu est constitué d’un tunnel cylindrique pour procurer un sentiment de sécurité à l’animal, du papier cartonné pour stimuler les instincts naturels de nidification et de jeu et des copeaux de pin pour réchauffer les rats en cas d’hypothermie. Les points limites sont répertoriés dans une grille de score d’évaluation avec une notation de 0 à 2 pour chaque point limite. Un suivi journalier des animaux sera effectué. En cas de score égal ou supérieur à 4, une observation attentive de l’animal sera effectuée et des soins appliqués lorsque cela est possible. Un animal avec un scoring entre 4 et 6 est observé de manière attentive c’est à dire 4 fois par jour par l’expérimentateur et l’équipe de zootechnie jusqu’à 3 jours. Si aucune amélioration n’est observée les animaux sont sortis du projet et euthanasiés par asphyxie au CO2. Les animaux avec un score inférieur à 4 sont observés 1 fois par jour, tous les jours. Et les animaux avec un scoring supérieur à 6 sont sortis du projet et euthanasiés par asphyxie au CO2.
Choix des espèces
Pour l'étude pharmacologique, la formulation chimique de notre molécule médicament est spécifique du génome du rat et de l’homme et nécessite des tests comportementaux chez le rat plutôt que chez la souris pour l'obtention de résultats transposables à l'homme. Ce projet nécessite d’utiliser des animaux au stade adulte qui correspond au stade d’expression optimale de notre cible thérapeutique. Tous les animaux arriveront au sein de l’animalerie au stade post-natal de 5 semaines. Ce stade a été déterminé par nos expériences antérieures. En effet, en arrivant à 5 semaines au laboratoire et après la période d’acclimatation et d’habituation, les animaux sont alors à un stade adulte de 6,5/7 semaines adéquat pour la réalisation des différentes procédures.
Comprendre et moduler les mécanismes neuronaux de l’attention chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie sans réveil pouvant durer huit heures, jusqu'à quarante-cinq injections en neuf semaines et onze semaines de rationnement alimentaire avec un test d'attention d'une heure par jour : 1 190 rats vont subir ces procédures, 176 tués sans reprendre conscience, 1 014 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à la fin pour que leur cerveau soit analysé. Le porteur qualifie de léger chacun des effets qu'il énumère, du stress de l'isolement après l'implantation d'électrodes à la perte de poids qui suit la chirurgie. Il retient une lignée de rats issue de croisements peu consanguins pour mieux refléter la variabilité humaine, sans donner le moindre chiffre à l'appui des 1 190 animaux qu'il demande.
Objectifs
Le principal objectif de ce projet est de mieux comprendre comment une substance dans le cerveau, appelée l’acétylcholine participe à la concentration. Elle agit surtout dans une partie du cerveau appelée le cortex frontal, qui est important pour l’attention. Le projet consiste à observer le fonctionnement de ces neurones pendant une tâche d’attention, à modifier temporairement leur activité pour évaluer les effets sur la concentration, et à enregistrer leur activité électrique afin de mieux comprendre leur rôle. Il s’agira également d’identifier précisément les connexions de ces neurones avec d’autres régions du cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans le contrôle de l’attention. En identifiant plus précisément le rôle de certaines cellules nerveuses et de leurs connexions dans le cerveau, il sera possible de mieux comprendre comment ces circuits peuvent dysfonctionner dans certaines maladies. À long terme, ces résultats pourraient orienter le développement de nouvelles approches pour prévenir ou traiter des troubles attentionnels ou des problèmes liés à l’attention dans des pathologies psychiatriques. Les connaissances obtenues pourront également enrichir la recherche fondamentale sur le fonctionnement du cerveau, en particulier sur la manière dont il adapte son activité pour maintenir l’attention au cours du temps.
Procédures
Des animaux vigiles réaliseront un test comportemental d’une durée d’une heure chaque jour pendant onze semaines. La réalisation de ce test nécessite une mise en situation de léger rationnement alimentaire : lors de la première session, le rationnement alimentaire s’étendra sur onze semaines. Des animaux, anesthésiés et sous couverture antalgique, subiront une chirurgie intracérébrale d’une durée d’environ 1 h 30. En amont et après la chirurgie, tous les animaux vigiles recevront deux injections d’antalgique (durée d’administration : environ 15 secondes). Certains animaux recevront des injections (ligand/saline) quotidienne avant le test d’attention (durée d’administration : environ 15 secondes) à raison d’un maximum de 45 injections sur 9 semaines Parmi ces animaux, certains subiront une chirurgie sans réveil d’une durée maximale de huit heures pour l’enregistrement des neurones, tandis que d’autres auront une chirurgie terminale d’une durée d’environ cinq minutes.
Impact sur les animaux
Le test comportemental peut induire un léger stress transitoire dû à l'isolement de l'animal au cours de la réalisation du test. Le rationnement alimentaire nécessaire pour ce test provoque un léger stress dans les 3 premiers jours. La chirurgie stéréotaxique induit une légère perte de poids durant les 2 jours suivant la chirurgie et un stress léger de quelques minutes au réveil de l’animal suite à l’anesthésie gazeuse. L’isolement des animaux suite à l’implantation du système d’électrodes entraine également un léger stress des animaux durant les premiers jours d’isolement. Les injections peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. Les différentes manipulations/contentions peuvent générer un léger stress pour les animaux.
Devenir
Tous les animaux des procédures seront mis à mort en fin afin de récupérer les cerveaux pour analyse.
Remplacement
Nous nous intéressons à l'intégration et aux modifications de réseaux neuronaux et de systèmes entiers et à l'impact sur le comportement ce qui ne peut pas être étudié, en l'état actuel des technologies et techniques, par des approches de modélisations informatiques in silico ou basées sur des cultures cellulaires in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été calculé à l'aide d'un test statistique qui tient compte de la variabilité du vivant et permet d'obtenir des résultats robustes. La standardisation des conditions expérimentales et la maitrise des facteurs environnementaux décrits dans le paragraphe raffinement contribuent à limiter la variabilité.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (médicamentation définie avec le vétérinaire référent). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. La couverture antalgique sera de 48h post chirurgie. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances, appelés points limites terminaux sont définis. Les animaux sont hébergés avec eau et nourriture ad libitum et par 2 jusqu’à la chirurgie. Pour les procédures 2 à 5, les animaux sont remis par 2 après la chirurgie. Un enrichissement avec des bâtons de bois est mis dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger ainsi qu’un tunnel (sauf procédure 1, le dispositif implanté sur la tête du rat est incompatible avec cet enrichissement). Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude Lors de l’isolement des animaux, un sur-enrichissement sera proposé dans leur cage en plus du carré de nid. Une rotation des enrichissements sera mise en place sur une période de deux semaines, avec un changement hebdomadaire : un bâton à ronger et un bâton à ronger en T à suspendre dans la cage. Cette rotation permettra de maintenir l’intérêt des animaux et de favoriser leur bien-être pendant la période d’isolement.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le rat. La lignée de rat a été choisie en raison des données déjà disponibles pour les tâches attentionnelles. De plus, ces rats viennent de croisements entre différentes familles, ce qui réduit la consanguinité (ils ne sont pas tous très proches génétiquement). Cela permet de maintenir une diversité génétique, offrant ainsi un meilleur reflet de la variabilité observée chez l’Homme. Les animaux utilisés seront des animaux adultes (7 semaines) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes neuronaux entièrement développés.