Système nerveux

Choisies à six à dix semaines parce que la graisse et le tissu fibreux des animaux plus âgés gêneraient la visibilité sous échographie, 180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Un marqueur neuronal leur est injecté à la microseringue près de la crosse aortique sous anesthésie, geste dont le porteur reconnaît le risque de pneumothorax, puis un régime enrichi en adénine leur provoque pendant vingt-huit jours une maladie rénale accompagnée d'une altération de l'état général et d'une perte de poids. Cinq à six semaines après l'injection, elles sont tuées pour prélever leurs organes et mettre leurs neurones en culture. Sur le remplacement, le porteur affirme que les alternatives non animales n'existent pas pour étudier la communication entre le sang et le cerveau.

Objectifs

L'insuffisance rénale chronique touche près de 700 millions d'adultes dans le monde, avec des taux plus élevés dans les pays les plus développés. Les complications liées aux maladies rénales chroniques incluent notamment l’hypertension artérielle, qui est la cause principale des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Les patients atteints de la maladie rénale chronique souffrent également de nombreuses complications neurologiques, notamment d'anxiété, de dépression, d'anomalies motrices, de troubles du sommeil et de troubles cognitifs. Il a été montré que la maladie rénale chronique, à la fois chez les patients et dans les modèles murins de cette maladie, entraîne des dysfonctionnements des mécanismes de régulation de la pression artérielle. Ces mécanismes réflexes modulent le diamètre des veines et des artères, ainsi que le rythme et la contractilité cardiaque, afin de contrôler la pression sanguine. La détection de la pression artérielle est initiée par des neurones dont les terminaisons, sensibles à l’étirement des vaisseaux sanguins, se situent dans des structures particulières des grosses artères : les sinus carotidiens (au niveau du cou) et la crosse aortique (à la sortie du coeur). Cette sensibilité à l’étirement leur est conférée par l’expression de protéines similaires à celles qui sont impliquées dans le toucher et dont notre équipe est spécialiste. Notre projet vise donc à caractériser les spécificités fonctionnelles et moléculaires des neurones aortiques chez la souris en conditions physiologique, et leurs modifications dans le modèle de la maladie rénale chronique. Nous pourrons ainsi évaluer si ces modifications participent à l’hypertension observée dans la maladie.

Bénéfices attendus

Notre étude pourrait être à l'origine de l'identification de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans la régulation de la pression artérielle. L’utilisation du modèle de maladie rénale chronique nous permettra de mieux comprendre comment les neurones à l’origine de la régulation de la pression artérielle sont affectés au cours de la maladie et de déterminer si ceux-ci peuvent être à l’origine de l’hypertension qui accompagne les maladies rénales chroniques. De là, pourra être envisagé le développement de nouvelles stratégies pharmacologiques.

Procédures

1) Injection guidée par échographie de marqueurs dans la crosse aortique. Les souris seront anesthésiées pour être positionnées sous l'échographe. Pour éviter toute douleur liée à l’injection, nous administrerons préalablement un analgésique par voie sous-cutanée. La zone d’injection sera épilée puis désinfectée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi de paramètres cardiorespiratoires ainsi qu’un suivi de la température. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de la procédure. A l'aide d'une microseringue, nous injecterons aux environs de la crosse aortique 1 microlitre d'une solution contenant un marqueur neuronal. La procédure durera 15 à 20 minutes maximum. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce de surveillance post-examen, chauffé, avec eau et nourriture. 2) Visualisation du marquage de la crosse aortique. 4 à 5 jours après l’injection, les souris seront anesthésiées pour vérifier la présence d’un marquage au niveau de la crosse aortique grâce à un appareil d'imagerie in vivo. La manipulation durera 10 min maximum. 3) Les animaux seront soumis à un régime alimentaire spécifique induisant le modèle de maladie rénale (28j). 4) 5 à 6 semaines après l’injection, les souris seront mises à mort pour prélever les organes et procéder à des cultures de neurones et prélèvement d’organes.

Impact sur les animaux

Les risques sont liés à 1) l’anesthésie : stress de la manipulation, déshydratation, détresse respiratoire et perte de poids ; 2) à l'injection bien que celle-ci soit guidée par échographie : risque de pneumothorax (douleurs diffuses et intenses dans la région du thorax, difficultés à respirer, respiration très rapide, faiblesse générale) et risque d’infection au point d’injection. Il n'y a aucun effet indésirable lié aux molécules injectées. L’induction d’une maladie rénale par un régime spécifique provoque une altération de l’état général et un stress de l’animal qui peut se manifester par une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort au terme de la procédure. Les organes seront prélevés pour réaliser des analyses et des cultures neuronales.

Remplacement

Le marquage des neurones de la crosse aortique ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les marqueurs neuronaux fonctionnent chez la souris. Les alternatives non animales n'existent pas. Nous étudions une communication entre organes : le système sanguin et le cerveau, qu'il est impossible de modéliser in vitro ou à l'aide de modèles informatiques. Cette étude ne peut pas être faite chez l'humain.

Réduction

Comme évalué dans des études préliminaires concernant l’injection guidée sous échographie et le modèle murin de maladie rénale chronique, des lots de 35 et de 20 animaux sont nécessaires afin d’obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats. Nous utiliserons des tests statistiques spécifiques pour comparer deux lots entre eux ou pour comparer plusieurs (>2) lots.

Raffinement

Les injections sous échographie se feront sous anesthésie. Pour éviter toute douleur liée à la procédure, nous administrerons deux analgésiques par voie sous cutanée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante permettant le suivi des paramètres cardiorespiratoires ainsi qu’un suivi de la température. Le gel d’échographie sera chauffé préalablement à son application sur l’animal. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de l'examen. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce post-examen, chauffé, avec eau et nourriture ad libitum. Suite à la chirurgie, nous utiliserons une grille d'évaluation du bien-être des animaux tous les jours pendant 3 jours puis 2 fois par semaine. L'évaluation sera dépendante de plusieurs critères dont chaque modification sera cotée. En fonction du score total, les animaux pourront être placés sous traitement analgésique et/ou il y aura arrêt de l’expérimentation par mise à mort de l’animal. L’environnement des animaux sera enrichi avec des dômes autoclavables, des morceaux de bois à ronger et des nids à base de coton.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle souris car le marquage des neurones de la crosse aortique par injection sous échographie est une méthode que nous avons validée au sein du notre laboratoire. De plus, nous maîtrisons le modèle de maladie rénale chronique par régime riche en adénine validé chez la souris. Enfin, cette espèce permet également le recours à des techniques validées de quantification moléculaire, permettant de répondre à nos hypothèses. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 10 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ne présentent pas encore d'accumulation de tissus graisseux et/ou fibreux qui pourraient nuire à la visibilité des structures sous échographie.

Caractériser l'effet de molécules à visée thérapeutique sur la cognition : 960 souris et 960 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour contrôle histologique. Chacun subit une chirurgie d'implantation de deux à trois heures sous anesthésie générale, puis des tâches comportementales pouvant atteindre une séance quotidienne de 25 minutes pendant quatre semaines, avec hébergement individuel, tête restreinte et restriction hydrique ou alimentaire. Ni les molécules ni les tâches comportementales ne sont nommées. Le porteur annonce des soins postopératoires sans douleur tout en listant un risque de douleur aiguë après la chirurgie, et justifie l'effectif de 1 920 animaux par "la force de notre hypothèse" et des années d'expérience, sans calcul rapporté.

Objectifs

Le présent projet s’inscrit dans un contexte de recherche préclinique visant à caractériser l’effet de molécules à visée thérapeutique sur la cognition et le fonctionnement cérébral. Les techniques utilisées incluent l’enregistrement et la modulation de l’activité neuronale chez l’animal anesthésié ou vigile et libre de ses mouvements. Ces approches permettent d’évaluer en temps réel l’impact potentiel d’un traitement thérapeutique sur les fonctions neuronales, cognitives et comportementales. Le modèle animal est indispensable pour étudier le potentiel thérapeutique de composés pharmacologiques avant leur éventuel développement clinique. Les rongeurs (souris et rats) sont classiquement utilisés pour la recherche préclinique en santé humaine, notamment dans des études de molécules susceptibles de modifier l’activité neuronale, le comportement et/ou la cognition. Les procédures employées suivent des standards établis dans les laboratoires de recherche publique, garantissant la fiabilité et la reproductibilité des données expérimentales.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est d’accompagner des études précliniques combinant approches comportementales et neurophysiologiques afin de mieux comprendre les effets de composés pharmacologiques à visée thérapeutique. Ce projet permettra de caractériser de manière précise l’impact de ces composés sur la cognition, le comportement et le fonctionnement cérébral, en fournissant des données fiables et reproductibles sur leurs effets neuronaux et cognitifs. Ces informations contribueront à identifier les cibles thérapeutiques pertinentes et à orienter le développement de nouveaux traitements dans un contexte préclinique.

Procédures

Les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale d’une durée approximative de 2 à 3 heures, permettant l’enregistrement de l’activité neuronale dans une région cérébrale d’intérêt. Selon les études, les animaux effectueront différentes tâches comportementales adaptées aux molécules et aux régions cérébrales étudiées. Un ensemble de tâches standardisées est utilisé, dont la récurrence et la durée peuvent varier d’une séance unique de 15 minutes jusqu’à une séance quotidienne de 25 minutes sur environ 4 semaines. Cette approche combinant mesures neurophysiologiques et évaluation comportementale permettra de mieux caractériser l’impact des composés pharmacologiques sur la fonction cérébrale et la cognition. L’hébergement individuel sera appliqué uniquement aux animaux porteurs d’implants ou soumis à un contrôle hydrique ou calorique,(de quelques jours à plusieurs semaines, maximum 1 mois), tandis que la restriction hydrique ou alimentaire sera mise en place sur la période expérimentale correspondante afin de mesurer individuellement les apports (de quelques jours à une semaine).

Impact sur les animaux

Nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux Les procédures postopératoires et l'analgésie se feront sans douleur. Le stress sera limité avec une habituation progressive à l'expérimentateur. Toutes les procédures ont été régulièrement utilisées en laboratoire. Les expérimentateurs auront une solide expérience dans l'exécution des procédures. Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/Un risque de perte de poids trop importante durant le contrôle calorique, en cas de perte de poids l'animal est nourri ad libitum pendant 48H. 3/ un risque de perte d’implant lié aux chirurgies implantatoire 4/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après les procédures comportementales, en vue de la réalisation de contrôles histologiques.

Remplacement

L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus cognitifs/comportementaux. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus l'espèce humaine. 3) De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que le sujet est éveillé et soumis à des tests comportementaux : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles.

Réduction

Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e. mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique.

Raffinement

À chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de carton, leur permettent de construire des nids, de jouer et de ronger. Leur soin est confié à du personnel qualifié et expert. Il surveille quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suivent les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures chirurgicales. L’expérimentateur possède une solide expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter toute souffrance animale, avec la mise en place de mesures pour les soulager, comme la réhydratation, le réchauffement et une nourriture adaptée.

Choix des espèces

La souris et le rat : -sont des mammifères étroitement liés à l'espèce humaine sur le plan phylogénétique, et certains de leurs comportements peuvent être comparés à ceux de l'humain. Ces rongeurs sont fréquemment utilisés dans les études électrophysiologiques, utilisant la technique de fiber photométrie, ainsi que dans les manipulations optogénétiques. -permettent des approches in vivo pour étudier les effets de composés thérapeutiques sur le système nerveux central, ainsi que leurs corrélations avec les fonctions cognitives, à travers l'analyse comportementale. Les animaux seront utilisés au stade adule, soit à partir de 10 semaines, un âge qui correspond à la maturité des circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées. De plus, les rongeurs adultes sont plus résistantes et récupèrent plus rapidement après la chirurgie que les plus jeunes.

Les souris M83 sont modifiées génétiquement pour produire une forme humaine de l'alpha-synucléine et développent entre 8 et 22 mois une maladie qui évolue vers la paralysie du train postérieur. 150 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, maintenues jusqu'à l'atteinte des points limites, toutes tuées. La démarche saccadée et la perte d'équilibre servent de signal, leur confirmation déclenchant la mise à mort avant la paralysie, et le seul acte décrit est une ponction cardiaque de deux minutes sous anesthésie. Le porteur présente cette mise à mort comme compassionnelle, quand elle sert aussi à prélever le sang dans lequel chercher des vésicules extracellulaires neuronales.

Objectifs

Le projet vise à identifier des biomarqueurs sanguins dans un modèle de souris modifiées génétiquement pour développer une maladie associée à l’agrégation de l’alpha-synucléine, une protéine qui est le constituant principal des lésions cérébrales dans la maladie de Parkinson. Les vésicules extracellulaires sont des petites structures libérées par les neurones et qui sont retrouvées dans le sang. Leur présence dans le sang de souris offre une fenêtre non invasive sur l'état du cerveau. L'étude des vésicules extracellulaires neuronales dans le sang de ces souris M83 par des méthodes biochimiques permettrait d'identifier des biomarqueurs de maladie. Ces derniers sont des indicateurs biologiques de l'état pathologique du cerveau de la souris, et ils peuvent être utiles au diagnostic précoce de maladies neurodégénératives ou refléter l’existence de maladies différentes sur le plan lésionnel et clinique chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le projet vise à rechercher si de nouveaux marqueurs moléculaires de la maladie peuvent être identifiés dans ce modèle expérimental à partir d’un prélèvement de sang. Réalisable par simple prélèvement sanguin et au cours de l’incubation de la maladie, cette identification ouvrirait la voie à des recherches de marqueurs précoces de la maladie.

Procédures

Les animaux sont soumis à une anesthésie, ainsi qu'à une ponction cardiaque d'une durée de 2 minutes au maximum.

Impact sur les animaux

L’apparition des signes cliniques moteurs se manifeste par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort compassionnelle des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort, en fonction de points limites adaptés, afin de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet qui vise à rechercher des biomarqueurs dans le sang ne peut être réalisé que sur animal vivant. Il n'existe pas aujourd'hui de méthode alternative pour évaluer le potentiel de ce type d'approche.

Réduction

Le projet complet prévoit un total de 150 souris, maintenues jusqu’à l’atteinte des points limites définis. La quantité de prélèvements issus de ces souris est jugée suffisante pour permettre la réalisation d’extraction de vésicules extracellulaires neuronales, et mener à bien nos analyses.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans un portoir ventilé par groupe de 5 souris de même sexe, et originaires de la même portée, et maintenus dans un environnement enrichi (dômes en plastique, buchettes en bois et éléments de nidification) pendant toute la durée de l’expérimentation. Ces enrichissements sont renouvelés chaque semaine, et la litière en rafle de maïs changée de façon bi-hedomadaire. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. Le test de suspension par la queue montre une dégradation de l’écartement des pattes postérieures. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés selon les critères et le scoring prévu en annexe et justifiant la mise à mort de l’animal. Lors de la ponction intracardiaque, une analgésie est réalisée 30 minutes avant l'anesthésie.

Choix des espèces

Les souris M83 sont des souris modifiées génétiquement et qui produisent une forme de la protéine alpha-synucléine humaine entraînant le développement d’une pathologie de cette protéine accompagnée d’une symptomatologie motrice. Elles développent une maladie qui se manifeste cliniquement par l’apparition d’une paralysie lors du vieillissement, entre 8 et 22 mois. Elles constituent un modèle pertinent de la maladie de Parkinson chez l'homme.

337 rats vont être utilisés, chacun sous restriction alimentaire pendant quatre-vingts jours au maximum et soumis jusqu'à soixante-dix sessions d'apprentissage sur dix semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 241 d'entre eux passent deux heures de chirurgie sous anesthésie pour l'implantation d'un dispositif d'enregistrement neuronal, et 87 restent seuls en cage jusqu'à la fin du projet. Trois jours de suite, tous reçoivent une injection de chlorure de lithium qui provoque des crampes intestinales pendant une dizaine de secondes, pour les détourner d'un choix appris. Le projet est présenté comme une piste pour aider à terme les personnes addictes à reprendre le contrôle de leurs actions, quand la restriction alimentaire, la chirurgie et l'isolement sont immédiats et que tous les rats finissent tués pour analyse du cerveau.

Objectifs

Dans notre vie quotidienne, nous adoptons deux grands types de comportements : ceux que nous faisons de manière volontaire pour atteindre un but, et ceux que nous faisons automatiquement, par habitude. Les comportements orientés vers un but sont conscients et flexibles : on réfléchit à ce qu’on veut faire et pourquoi. Mais ils demandent du temps et de l’énergie. À l’inverse, les comportements habituels sont des actions que l’on répète jusqu’à ce qu’elles deviennent automatiques, comme se brosser les dents ou attacher sa ceinture. Ils ne demandent plus d’effort mental et nous permettent d’économiser nos ressources. Ces deux formes de comportement doivent être équilibrées pour s’adapter au mieux à notre environnement. Pourtant, cet équilibre est parfois altéré dans certaines maladies mentales, où la personne agit de manière trop automatique, même si cela devient inadapté ou nuisible. Les chercheurs ont déjà bien étudié comment un comportement devient une habitude dans le cerveau, notamment en identifiant certaines régions cérébrales impliquées dans ce processus. Mais on sait encore peu de choses sur la manière dont on peut interrompre une habitude pour revenir à un comportement plus réfléchi, surtout lorsque les circonstances changent. Une autre limite des recherches actuelles est que les études chez l’animal sont souvent menées dans des environnements très simples, où l’animal n’a qu’un seul choix possible. Cela ne reflète pas la complexité du monde réel. Pour mieux comprendre le fonctionnement de l’équilibre entre action réfléchie et habitude, il faut donc étudier les comportements dans des situations plus variées et plus proches de la vie naturelle. C’est l’objectif de ce projet : explorer comment le cerveau équilibre ces deux types de comportements, et comment il s’adapte lorsque les habitudes ne sont plus efficaces. Pour cela, nous répondrons à 3 sous-objectifs : 1. Comprendre comment les comportements orientés vers un but et les habitudes se mettent en place et s’influencent mutuellement. 2. Observer l’activité cérébrale lorsqu’un individu passe d’un comportement automatique à un comportement plus réfléchi, à l’aide d’une technique pour enregistrer un groupe de neurones. 3. Approfondir cette observation avec une autre technique qui permet d’enregistrer l’activité de neurones individuels.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment le cerveau équilibre comportements automatiques et actions réfléchies, un mécanisme essentiel dans notre vie quotidienne, mais qui peut devenir problématique dans certaines maladies comme l’addiction. En identifiant les bases cérébrales qui permettent de rompre avec des habitudes devenues inadaptées, ce travail ouvrira la voie à de nouvelles stratégies pour aider les personnes à reprendre le contrôle sur leurs actions. À terme, ces recherches pourraient améliorer la prévention et le traitement des troubles liés à une perte de flexibilité comportementale, comme les addictions.

Procédures

Tous les rats seront sous alimentation restreinte pendant 80 jours maximum et seront pesés 5 fois par semaine. Tous auront accès à des récompenses plaisantes après avoir exécutés et appris des tâches simples (appui sur des leviers) dans des cages de comportement. Les sessions d'apprentissage et de détection des habitudes s'étaleront sur 10 semaines (70 session maximum). Les animaux seront soumis à 3 séances de 10 minutes en présence de la récompense suivi d'un stimulus aversif (injection d'une solution provoquant des crampes intestinales pendant quelques dizaines de secondes) à raison d'une séance par jour pendant 3 jours consécutifs. Les injections ne durent que quelques secondes. 241 rats suivront une chirurgie sous anesthésie générale (durée 2 heures) afin d’implanter un dispositif pour mesurer ou modifier l’activité neuronale. Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, 87 rats seront hébergés seuls dans leur cage. Pour mesurer l'activité neuronale, 241 rats vigiles seront placés pendant 1 heure dans une cage spéciale ; dans cette cage les rats sont libres de leur mouvement. Les rats auront 20 sessions de mesure de l'activité neuronale. Tous les rats recevront 3 injections d’un agent aversif pour les détourner de leur choix.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont : - Restriction alimentaire : peut induire un léger stress. - l’injection intra-péritonéale peut engendrer une douleur au niveau du site d’injection. - Le chlorure de lithium induit des contractions abdominales transitoires pendant une dizaine de secondes. - Léger stress transitoire due à la contention de l’animal lors des injections - Chirurgies : inconfort transitoire au réveil et douleur post-opératoire minorée par des antalgiques - Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’expérience - Isolement nécessaire dès lors que l’animal est équipé avec le dispositif de mesure de l’activité cérébrale (électrodes d’enregistrement, procédure 3): stress

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses moléculaires sur le cerveau ou pour des vérifications histologiques (expression du virus, localisation de l’implant, …etc).

Remplacement

Ce type de recherche, visant à comprendre les bases du comportement habituel, peut uniquement être menée sur un animal vivant. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier. Les connaissances acquises dans ce projet devraient permettre dans le futur d’apporter des connaissances pour développer des algorithmes permettant de modéliser le comportement. Ces algorithmes pourraient à terme constituer des outils de remplacement.

Réduction

Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, nous utiliserons un maximum de 337 animaux sur 5 ans pour répondre à nos objectifs.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés et compétents. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ses points limites gradés précis sont définis dans une grille de suivi (perte de poids, apparence, comportement de l’animal). Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape avec une pesée 5 fois par semaine. Dès leur arrivée à l’animalerie et pour toute la durée du projet, les animaux seront hébergés à deux par cage en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) et en cycle inversé avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger ; tunnel pour se cacher) et accès à l’eau ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux récompenses qui sont similaires à celles de l’Homme et ils peuvent apprendre à s’auto-administrer toutes les drogues abusées par l’Homme, ainsi que les récompenses sucrées, de façon spontanée. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur de déclin cognitif lié au vieillissement.

En cas de douleur manifeste ou de blessure persistant trois jours, les souris sont tuées par perfusion intracardiaque. 1 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont privées d'abri et de matériel de nidification pendant quatre à sept semaines pour induire un stress, mises à jeun dix-huit heures, aspergées de sucrose sur le dos pour déclencher une heure de toilettage intense, puis placées seules dans une cage inconnue fortement éclairée, avec deux gavages qui exposent à une blessure de l'œsophage et à une fausse route. Il s'agit de savoir si des récepteurs à la sérotonine portés par la microglie conditionnent les effets de la fluoxétine, un antidépresseur inefficace chez un tiers des patients pour des raisons que le porteur dit indéterminées.

Objectifs

La dépression et l’anxiété représentent les troubles psychiatriques les plus répandus à l’échelle mondiale, touchant environ 332 millions de personnes. Les traitements de première intention appartiennent à la famille des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine (ISRS), mais leur efficacité est très variable, et 1/3 des personnes traitées y sont insensibles pour des raisons encore indéterminées. Les ISRS, tels que la fluoxétine, augmentent les concentrations extracellulaires de sérotonine en bloquant sa recapture. Chez la souris, un traitement chronique de fluoxétine provoque à la fois une diminution de l’anxiété et des processus de plasticité dont une augmentation de la neurogenèse adulte dans l’hippocampe. Il a par ailleurs été montré que cette neurogenèse adulte est diminuée dans les modèles murins de dépression et qu’elle est nécessaire pour permettre les effets anxiolytiques de la fluoxétine. La microglie, c'est-à-dire les cellules immunitaires du cerveau, joue un rôle important dans la régulation de la neuroinflammation. En situation de stress, d’infection ou de lésion, elle adopte un phénotype pro-inflammatoire qui favorise la défense immunitaire. À l’inverse, lorsque la menace est résolue ou pour maintenir l’homéostasie, elle adopte un phénotype anti-inflammatoire qui soutient la réparation tissulaire, et favorise la neurogenèse adulte. Toutefois, une persistance de l’état pro-inflammatoire peut se produire, et un nombre croissant d’études suggère que cet état pourrait contribuer à la pathophysiologie de la dépression. Corrélativement, il a été montré que la fluoxétine peut réduire l’activation pro-inflammatoire de la microglie, suggérant une régulation de ces cellules par la sérotonine. Ce lien entre neuro-inflammation et dépression oriente la recherche vers des traitements ciblant la microglie et l’inflammation cérébrale, en particulier pour les patients résistants aux antidépresseurs classiques. La modulation de la microglie, sans supprimer son activité essentielle, pourrait représenter une stratégie pour améliorer les symptômes ou limiter les dégâts liés à la maladie. Dans ce cadre, nous nous intéresserons à des récepteurs à la sérotonine spécifiquement exprimés par la microglie. Notre projet a pour objectif de déterminer si l’expression de ces récepteurs par la microglie est nécessaire pour permettre les effets de la fluoxétine sur l’anxiété et la neurogenèse adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre le rôle de la microglie, et de sa régulation par la sérotonine, dans les effets des antidépresseurs qui modulent les niveaux de sérotonine dans le cerveau. Cette étude permettra de mieux comprendre comment la sérotonine, un neurotransmetteur clé dans la régulation de l’humeur, influence la microglie, et donc d’apporter de nouvelles connaissances sur les interactions neurones - cellules immunitaires dans le cerveau. Elle pourrait également permettre d’identifier, de nouvelles cibles thérapeutiques dans la dépression, notamment pour les patients qui présentent des résistances aux traitements pharmacologiques classiques.

Procédures

Dans ce projet, des animaux âgés de 4 à 6 semaines vont recevoir par gavage oral un composé pharmacologique pour bloquer l’expression d’un récepteur dans un type cellulaire spécifique. 2 prises espacées de 48h sont nécessaires. L’acte est réalisé sur animal vigile et dure moins de 30 secondes. Les animaux seront hébergés sans enrichissement environnemental (absence d’abri et de matériel pour faire un nid) afin d’induire un stress basal modéré pour une durée totale de 4 à 7 semaines selon la procédure et seront répartis dans 4 lots différents. Dans le lot 1, ils recevront un traitement pharmacologique antidépresseur via l’eau de boisson pour une durée totale de 5-7 semaines. Au cours du traitement, ils seront soumis à 2 tests comportementaux : un qui mesure l’anhédonie (un marqueur de la dépression) sur une durée d’1 heure, et un qui mesure l’anxiété pendant une durée maximum de 10 minutes, avec 7 jours d’intervalle entre les 2 tests. Dans le lot 2, ils recevront un traitement anxiolytique par une injection unique sur animal vigile (geste durant moins de 20 secondes), et seront soumis à un test mesurant l’anxiété sur une période de 10 minutes maximum. - Dans le test d’anhédonie, les animaux sont aspergés sur le dos avec une solution de sucrose, ce qui déclenche une activité intense de toilettage pendant environ une heure, et la qualité du toilettage du pelage sera mesurée à l’aide d’un score dans l’heure qui suit, ainsi que 24h après. - Dans le test d’anxiété, les animaux préalablement soumis à un jeûne alimentaire la veille (durée du jeûne : 18 heures), sont placés individuellement dans une cage inconnue et fortement illuminée. La latence pour aller manger une croquette située au centre de la cage est mesurée sur une période de 10 min. - Dans les lots 3 et 4, les animaux seront hébergés sans enrichissement environnemental afin d’induire un stress basal pour une durée totale de 4 semaines, pendant laquelle ils recevront un traitement pharmacologique antidépresseur via l’eau de boisson, également pendant 4 semaines. Ils recevront soit une unique injection intrapéritonéale d’un marqueur de division cellulaire (geste durant moins de 20 secondes), soit 2 injections à 2h d’intervalle et réalisées de chaque côté de l’animal pour limiter les douleurs répétées au même site d’injection. Enfin, une chirurgie sans réveil sous anesthésie et analgésie sera réalisée à l’issue des 2 procédures. Ce geste dure moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

L’hébergement sans enrichissement environnemental, le jeûne alimentaire de 18h ainsi que le test comportemental associé à ce jeûne (test suppression de la prise alimentaire par la nouveauté) vont provoquer un stress modéré. Lors de l’administration d’un composé pharmacologique par gavage, il y a un stress lié à la contention de l’animal, un risque de blessure au niveau de l’œsophage lors de l’insertion de la sonde de gavage, et un risque mineur de “fausse route”. Le traitement pharmacologique dans l’eau de boisson peut entraîner une baisse de la consommation hydrique. L’injection IP peut générer une douleur légère et transitoire au point d’injection, avec un risque de péritonite si l’acte est répété. L'anesthésie peut induire dans de rares cas une hypothermie, une détresse respiratoire voire un arrêt cardiorespiratoire.

Devenir

Nous devons euthanasier les animaux à l’issue de la procédure pour pouvoir prélever leurs organes (ici, le cerveau) et réaliser des analyses qui sont nécessaires à la compréhension des mécanismes de plasticité cérébrale et du lien entre microglie et effets des antidépresseurs et anxiolytiques.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les modifications des cellules microgliales, induites par un traitement antidépresseur, sur la neurogenèse adulte et sur le comportement. De manière à réduire le nombre d’animaux utilisés, leur remplacement par une approche cellulaire est toujours privilégié, comme des cultures primaires de neurones lorsque la question scientifique posée le permet. Nous pourrions envisager de mettre en place des cultures in vitro composées de microglies (cellules immunitaires du cerveau), de neurones sérotoninergiques et de cellules souches neurales (cellules peuvent donner naissance à des nouveaux neurones), afin d’observer l’effet des antidépresseurs sur ces différents types cellulaires, mais cette méthode ne permettrait pas de reproduire la complexité des interactions entre cellules et des circuits impliqués dans les effets des antidépresseurs, surtout au stade adulte. Par ailleurs, l’anxiété est un état qui se mesure par le comportement d’un animal éveillé, qui doit pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (odorat, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir, via les hormones de stress, plusieurs types de cellules, dont neurones et microglie, mais on ne peut modéliser fidèlement les interactions ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment la microglie participe aux effets des antidépresseurs de type ISRS.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux est optimisée de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés pour le projet, tout en conservant une puissance statistique suffisante pour pouvoir obtenir des résultats reproductibles. Pour l’analyse des résultats, nous utiliserons des tests statistiques adéquats tels que des ANOVA pour des comparaisons multiples afin de comparer nos différents groupes de génotypes et de traitement, ou des t-test. Sur la base de résultats d’expériences et de publications utilisant des techniques similaires, nous pouvons déterminer la taille des groupes. Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet est de 1104 sur 5 ans.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Dans nos expériences, les enrichissements seront retirés à l’âge de 10-12 semaines et ce pendant une durée de 4 à 7 semaines selon la procédure, pour générer un stress permettant d’obtenir un effet antidépresseur ou anxiolytique des composés pharmacologiques qui font l’objet de notre étude. Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum la douleur et/ou le stress en termes de durée et d’intensité. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation (cf points limites ci-dessous). Les administrations sont effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Concernant le traitement antidépresseur, nous avons pris l’initiative d’administrer notre traitement dans l’eau de boisson (prise hydrique volontaire de l’animal), au lieu de l’injecter par voie intra-péritonéale, ce qui diminue considérablement la manipulation des animaux et évite les actes douloureux. Concernant la perfusion intracardiaque, les animaux sont injectés avec l'anesthésique et l’analgésique dans une pièce séparée de la salle de perfusion, et apportés dans la salle juste pour la perfusion, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé régulièrement conformément aux réglementations, et de manière rapprochée pendant le déroulement de la procédure. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien (posture, aspect du pelage, poids corporel, avant/après intervention), de sorte à administrer un traitement adapté si besoin (nourriture plus appétante, injection de solution saline et/ou glucosée), et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste ou blessure, persistant 3 jours, les animaux seront euthanasiés par perfusion intracardiaque pour être utilisés dans les mises au point.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent pour nos études car en tant que mammifère, son système nerveux présente des homologies importantes avec l’homme. En effet, l’organisation des structures cérébrales et des différentes voies qui les connectent sont similaires entre ces 2 espèces. Les voies sérotoninergiques ainsi que les récepteurs à la sérotonine, sont bien décrites chez la souris, et comparables avec ceux décrits chez l’homme. La souris adulte est le modèle standard pour l’évaluation des effets neurobiologiques des antidépresseurs de type ISRS et les paradigmes comportementaux sont validés. Utiliser la souris est essentiel pour garantir la comparabilité et la reproductibilité avec des études effectuées précédemment. De plus, il existe dans cette espèce des lignées modifiées génétiquement, qui permettent d’étudier le rôle de certains gènes et de certaines cellules de manière précise. On peut en effet invalider des gènes précis spécifiquement dans un type cellulaire donné et à un stade ou âge donné. Dans notre étude, les animaux auront un développement normal, puis nous induirons à l’âge de 4 semaines, l’invalidation d’un gène spécifiquement dans la microglie. Cela nous permet d’élever les animaux dans un état où les modifications génétiques sont silencieuses, sans effet, jusqu’au moment de l’expérience. Les animaux seront ensuite traités à partir de 10 semaines avec un antidépresseur, classiquement donné en médecine humaine pour soigner les troubles dépressifs et anxieux.

Maintenir en animalerie la production d'une lignée de souris immunodéficientes, disponible pour d'autres projets : 545 souris NOD SCID vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun acte expérimental ne leur est infligé, la souffrance vient du phénotype lui-même. Leur système immunitaire génétiquement affaibli les rend vulnérables aux infections, elles peuvent développer un lymphome spontané qui limite leur vie à huit mois environ, un diabète chez certaines femelles, une perte progressive d'audition dès trois mois et des difficultés de cicatrisation. Une partie sera tuée dès qu'un point limite est atteint, les autres gardées vivantes pour la reproduction de la lignée ou versées à un projet déjà autorisé.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de maintenir la production d'une lignée immunodéficiente en animalerie avec un statut sanitaire stricte

Bénéfices attendus

Les animaux utilisés dans ce projet possèdent une particularité importante : ils ne réagissent pas contre certaines cellules étrangères qu’on leur greffe. Cela permet d’introduire des cellules provenant d’un autre animal, ou même de l’humain, sans provoquer de rejet. Cette caractéristique est essentielle pour pouvoir étudier dans de bonnes conditions le devenir de ces cellules dans le corps. Les animaux seront gardés en vie pendant une période limitée, jusqu’à un maximum de 5 mois, car au-delà, ils peuvent développer une maladie naturelle à leur état fragile. Cette précaution est prise pour garantir leur bien-être, aussi bien pour les souris utilisées à des fins de reproduction que pour celles destinées à d’autres projets expérimentaux. Ce projet permettra de maintenir cette lignée fragile dans notre animalerie, afin qu’elle soit disponible pour des recherches futures, dans un autre cadre déjà autorisé.

Procédures

Les animaux ne subiront aucune intervention directe autre que celle liée à leur phénotype particulier. En effet, cette lignée est porteuse d’un phénotype dommageable, ce qui signifie qu’elle peut développer, avec l’âge, des troubles graves comme un lymphome thymique spontané. Pour éviter cela, les animaux sont utilisés sur une période 6 mois, avant l’apparition de ces signes, et suivis cliniquement chaque jour.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ce projet sont très fragiles. Leur système de défense est génétiquement affaibli, ce qui les rend très vulnérables aux infections. Ils peuvent aussi développer spontanément une forme de cancer du système lymphatique (lymphome) à partir d’un certain âge, ce qui limite leur durée de vie à environ 8 mois. Chez certaines femelles, du diabète peut aussi survenir, ce qui peut réduire leur capacité à se reproduire. Certaines souris peuvent développer un faible niveau de cellules immunitaires fonctionnelles, ce qui peut affecter les résultats des études si cela n’est pas surveillé. Enfin, une perte progressive de l’audition dès l’âge de 3 mois, ainsi que des difficultés de cicatrisation en cas de blessure peuvent survenir. Toutes ces fragilités sont bien identifiées et seront surveillées de près.

Devenir

Certains animaux seront mis à mort lorsqu’un point limite est attaint, afin d’éviter toute dégradation de leur état de santé. D’autres animaux seront gardés en vie, soit pour être utilisés dans un projet expérimental déjà autorisé ainsi que pour assurer la reproduction et le maintien de la lignée dans l’animalerie. Ces décisions seront prises en fonction de l’état des animaux, de leur âge, et des objectifs de suivi dans les projets associés.

Remplacement

La lignée immunodéficiente est indispensable dans ce projet car aucun autre modèle murin ni aucune méthode in vitro ne permet de reproduire ses propriétés immunologiques. Ces souris sont dépourvues de lymphocytes T et B fonctionnels, ce qui rend possible la greffe stable de cellules allogéniques ou xénogéniques (notamment humaines) sans rejet. Cette tolérance est une nous permettant l’étude des effets neurofonctionnels à moyen terme de cellules greffées dans notre région cérébrale d’intérêt. Le recours à un système in vitro ou à un autre modèle murin immunocompétent exigerait une immunosuppression pharmacologique, ce qui pourrait interférer avec les résultats que nous obtiendrons en affectant les fonctions neuronales, gliales et vasculaires. De plus, aucun modèle computationnel ou organoïde ne permettrait d’évaluer de manière fiable l’impact des cellules greffées sur l’organisme in vivo. Ainsi, la lignée immunodéficiente ne peut être remplacée dans ce projet, car elle est la seule à permettre une analyse intégrée, physiologiquement pertinente et immunologiquement stable des greffes cellulaires dans le cerveau vivant.

Réduction

La production est strictement adaptée aux besoins expérimentaux et à la fragilité de la lignée. Seuls les animaux nécessaires sont élevés, avec une planification par petites cohortes. Le nombre de reproducteurs est limité, et renouvelé régulièrement en raison de la courte durée de vie reproductive des femelles. Cette organisation permet d’éviter toute surproduction tout en assurant une disponibilité continue des animaux pour les projets autorisés.

Raffinement

Bien que le phénotype dommageable associé à cette lignée ne s’exprime pas durant la période expérimentale prévue, des mesures spécifiques de raffinement sont mises en œuvre pour anticiper toute expression subclinique et garantir le bien-être des animaux. Les souris sont hébergées en conditions barrière, dans des portoirs individuellement ventilés, sous un tatut sanitaire strict, afin de minimiser l’exposition à tout agent pathogène. Leur environnement est enrichi avec des matériaux de nidification, des cachettes et des objets à ronger, afin de réduire le stress chronique, facteur aggravant dans les lignées immunodéficientes. La densité d’animaux par cage est limitée : pour la reproduction, un maximum de deux femelles avec leur portée est autorisé. Ces conditions strictes sont indispensables pour garantir la survie, le bien-être et la validité scientifique des données obtenues chez ces animaux vulnérables. Une surveillance clinique quotidienne est effectuée, intégrant des grilles d’observation standardisées portant sur l’état du pelage, la respiration, le comportement spontané et le poids corporel. Des points limites sont définis a priori. Une euthanasie immédiate sans attendre de dégradation supplémentaire sera envisagée une fois un point limite atteint.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille, à développement rapide, modifiables génétiquement et qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Pour notre projet, l'utilisation d'un modèle murin est la seule approche permettant d’observer directement une corrélation entre les cellules qui nous intéresse et sa fonctionnalité. La souris est également est un modèle animal qui permet de disposer de lignées immunodéprimées, indispensables pour les séries d’expérimentation qui vont être effectuées. Celles-ci sont décrites dans une autre DAP Les souris seront mises en expérimentation après le sevrage, entre P21 et P25. La reproduction se fera entre 6 et 8 semaines d’âge, en restant attentif à l’éventuelle apparition de diabète chez les femelles, généralement observée entre 10 et 14 semaines.

Trépanés pour une chirurgie intracérébrale sous anesthésie générale, 520 rats reçoivent ensuite jusqu'à cinq injections d'un médicament activant les cellules ciblées, puis passent des enregistrements d'activité de vingt-quatre heures et un test d'anxiété en labyrinthe surélevé. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et durent de six à douze semaines après l'opération, tous les rats étant tués pour l'analyse post-mortem de leur cerveau. Il s'agit de savoir si perturber un circuit cérébral de la récompense augmente la consommation d'aliments gras et sucrés après un sevrage forcé, ce qui reproduit une rechute. Le porteur décrit une douleur de trépanation "généralement transitoire mais parfois prolongée" tout en la présentant comme "efficacement minorée", et héberge les rats seuls tout en qualifiant ce stress d'atténué par les contacts entre cages voisines.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle d’un circuit cérébral impliqué dans le contrôle de la récompense et de la motivation, dans la régulation des comportements alimentaires compulsifs et dans la rechute après un sevrage d’aliments très appétissants (riches en graisses et en sucres) chez le rat. Ces comportements reflètent des situations observées dans l’hyperphagie boulimique et l’obésité, deux troubles alimentaires fréquents où le système de récompense du cerveau est perturbé et où le risque de rechute est élevé. Dans des travaux préliminaires, nous avons montré que perturber sélectivement ce circuit entraîne une augmentation marquée de la consommation de graisses, aussi bien lors d’un accès continu à un régime gras et sucré qu’après une période de sevrage, ce qui reproduit un phénomène de rechute. Ces résultats suggèrent que ce circuit joue un rôle essentiel dans le contrôle des comportements alimentaires compulsifs et leur réapparition après une abstinence forcée, ce qui en fait une cible d’intérêt pour mieux comprendre et prévenir ces troubles chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera des connaissances nouvelles sur les circuits cérébraux impliqués dans la surconsommation d’aliments très appétissants et la rechute après une période de sevrage. L’étude ciblée de ce circuit, grâce à une approche pharmacogénétique (c’est-à-dire une méthode permettant d’activer ou d’inhiber temporairement certaines cellules cérébrales grâce à un médicament spécifique), permettra de préciser son rôle dans la modulation des comportements alimentaires compulsifs et dans les réponses émotionnelles et motrices associées.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie intracérébrale, réalisée sous anesthésie générale avec analgésie multimodale. Ils recevront ensuite plusieurs injections d’une solution neutre ou d’un médicament permettant d’activer temporairement les cellules ciblées, d’une durée de quelques secondes chacune, réalisées au maximum cinq fois pendant la période expérimentale. Les animaux participeront également à des tests comportementaux : enregistrements d’activité locomotrice de 24 h (réalisés à plusieurs reprises selon la procédure) et un test d’anxiété dans le labyrinthe en croix surélevé (5 min). La durée totale de la procédure varie selon les groupes expérimentaux, entre environ douze semaines post-chirurgie pour les groupes comprenant un régime prolongé et environ six semaines post-chirurgie pour ceux comprenant une période expérimentale plus courte.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue est liée à la chirurgie intracérébrale, pouvant entraîner une douleur principalement due à la trépanation osseuse, généralement transitoire mais parfois prolongée, et dont l’intensité est efficacement minorée par l’administration d’antalgiques. Un inconfort peut également survenir lors du réveil post-anesthésie. Des effets secondaires mineurs peuvent apparaître à la suite des injections répétées, tels qu’un stress léger ou un inconfort transitoire. Un stress modéré lié à la période d’hébergement individuel est également possible, bien qu’atténué par les contacts visuels, olfactifs et auditifs entre congénères.

Devenir

À la fin des procédures, les animaux seront mis à mort pour permettre l’analyse post-mortem des cerveaux.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené à bien par l’utilisation de modèles in vitro, d’organoïdes, ou par simulation informatique et intelligence artificielle. Les comportements d’hyperphagie boulimique, le développement d’une obésité, et la rechute alimentaire sur des aliments hautement palatables reposent sur des interactions dynamiques entre circuits cérébraux et processus métaboliques, dont l’organisation et la contribution exacte restent à ce jour insuffisamment élucidées.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés sur la base de nos données préliminaires, de la littérature et d’analyses statistiques de puissance, afin d’assurer la robustesse scientifique tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux par groupe est fixé de manière à garantir la validité des analyses comportementales et histologiques, sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. Dans un cadre de formation, les effectifs sont volontairement restreints au minimum requis pour assurer l’apprentissage des gestes expérimentaux. Une progression expérimentale stricte sera appliquée : les étapes ultérieures ne seront pas conduites si les résultats obtenus permettent de conclure, ce qui contribuera à réduire le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront de soins appropriés pour optimiser leur bien-être, indispensable à la validité scientifique de l’étude. Les chirurgies cérébrales seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse, associée à une analgésie complète incluant des traitements locaux et généraux pour prévenir la douleur et l’inflammation. Les pertes hydriques seront compensées par une réhydratation adaptée. Un suivi post-opératoire rapproché est mis en place : examen clinique et pesée quotidiens pendant la première semaine, puis trois fois par semaine en l’absence de complications. Les critères de suivi sont consignés dans une grille spécifique, avec application stricte de points limites prédéfinis. Une habituation progressive est réalisée durant la deuxième semaine d’acclimatation et avant les tests : manipulation quotidienne par du personnel expérimenté afin de réduire la réactivité et de faciliter les gestes expérimentaux. Les rats sont hébergés individuellement pour permettre des mesures précises, mais les cages sont disposées côte à côte pour maintenir les contacts visuels, sonores et olfactifs, et enrichies avec des éléments non nutritifs. Lors des mesures prolongées, ces conditions sont conservées. Des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute souffrance inutile

Choix des espèces

Le choix du rat se justifie par la continuité avec nos travaux antérieurs portant sur le rôle d’un circuit cérébral impliqué dans la régulation de la motivation et de la récompense dans l'obésité, déjà étudié dans cette espèce. Le rat constitue un modèle particulièrement pertinent pour l’analyse des comportements alimentaires pathologiques, tels que l’hyperphagie boulimique, la rechute alimentaire et l’obésité. Il possède un répertoire comportemental riche, permettant de reproduire des altérations comparables à celles observées chez l’humain. De plus, les structures cérébrales impliquées dans la régulation motivationnelle et émotionnelle présentent une forte homologie avec celles de l’homme. Ces circuits étant absents ou très simplifiés chez des organismes plus simples, le rat représente un modèle préclinique indispensable pour l’étude des mécanismes neurobiologiques des troubles alimentaires et pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Les rats Wistar mâles seront utilisés au stade de jeune adulte. Ils arrivent à 8 semaines et bénéficient de 2 semaines d’acclimatation, de sorte que les interventions chirurgicales sont réalisées à environ 10 semaines. Dans la procédure 1, les animaux sont suivis de 10 à environ 22 semaines, incluant les phases de récupération post-chirurgicale, d’exposition au régime palatable, de sevrage et de rechute. Dans la procédure 2, ils sont suivis de 10 à environ 15 semaines, incluant la récupération, les tests comportementaux et deux semaines de régime intermittent. Le choix de ce stade, utilisé également dans nos travaux antérieurs sur les comportements alimentaires et la modulation des circuits de la récompense, assure la comparabilité et la reproductibilité scientifique.

120 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles boivent pendant dix mois, de trois à douze mois d'âge, une eau contenant la mémantine associée à une seconde molécule, et passent trois fois deux tests de mémoire de dix minutes ainsi que trois fois un test de navigation spatiale étalé sur cinq jours. Le porteur indique isoler les souris, un stress qu'il justifie par le risque de blessures répétées voire de mort en cas d'agressivité après plusieurs mois d'hébergement en groupe. Il présente l'étude comme une preuve de concept "capitale" pour la mise sur le marché, et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'évaluer un effet sur la cognition, qui repose selon lui sur l'observation du comportement de l'animal vivant.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative la plus fréquente après 65 ans, et représente un enjeu majeur en santé publique en raison du vieillissement de la population, de son impact sur les patients et leurs proches, ainsi que de son coût économique considérable. Malgré des avancées thérapeutiques, les traitements actuels restent peu efficaces, rendant nécessaire le développement de nouvelles approches plus performantes. Un nouveau traitement a été conçu en associant deux substances aux propriétés complémentaires : l’une, déjà utilisée en clinique, aide à ralentir la progression de la maladie, tandis que l’autre possède des effets protecteurs sur le système nerveux. Leur combinaison a montré un effet renforcé en laboratoire, en particulier sur la mort neuronale, et l’innovation repose sur un dosage optimisé pour en maximiser les bénéfices. Pour confirmer son efficacité, des études précliniques seront menées sur un modèle animal reproduisant les caractéristiques de la maladie, afin d’évaluer son impact sur la protection des cellules nerveuses et les capacités cognitives.

Bénéfices attendus

Cette étude constituera une première validation de l’efficacité pré-clinique de ce nouveau traitement dans un modèle animal de maladie d'Alzheimer. L’étude permettra en outre d’évaluer l’étendue de l’effet observé et la présence d’un effet dose potentiel, ainsi que des effets potentiels à contrecarrer la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer. Il s’agira d’une étude preuve de concept, capitale pour envisager le développement clinique de la molécule et aboutir in fine à la mise sur le marché de ce traitement pour l’amélioration du pronostic de la maladie.

Procédures

Tous les animaux seront exposés à deux tests de mémoire d’une durée de 10 minutes par test, trois fois pour chaque test sur toute la durée du projet. Un autre test (navigation et mémoire spatiale) nécessite plusieurs sessions de 5 minutes d’apprentissage par jour, pendant 5 jours. Ce test sera également répété 3 fois. Les traitements pharmacologiques seront administrés dans l'eau de boisson, quand les souris sont agées de 3 à 12 mois, soit pendant 10 mois. L'isolement des souris est un stress pour l'animal, mais permet d'eviter les blessures repetees voire la mort en cas d'aggressivite des souris entre elles, ce qui est tres previsible au bout de plusieurs mois d'hebergement en groupe.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux peuvent engendrer du stress lié à la manipulation des animaux et leur isolement ponctuel durant ces tests. Le traitement ne devrait pas entraîner d'effets secondaires notables, d'après les données existantes. À partir du 8e mois de vie, les souris transgéniques utilisées développent des caractéristiques pathologiques associées à la maladie d'Alzheimer. Cela inclut principalement la formation de plaques amyloïdes dans le cerveau, qui peuvent entraîner des troubles cognitifs et comportementaux. Ces troubles peuvent se manifester par des déficits de mémoire et des difficultés d'apprentissage.

Devenir

Afin d'etudier l'effet du traitement sur les marqueurs histopathologiques de la maladie d'Alzheimer,tous les animaux seront mis a mort a la suite de l'unique procedure du projet.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée, a savoir l’efficacite d’un traitement sur la cognition qui repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant.

Réduction

Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique en tenant compte de la variabilité interindividuelle. Le calcul de la taille d’échantillon indique qu’un total de 60 animaux est nécessaire, soit environ 12 animaux par groupe. Afin d’assurer la représentativité biologique et d’examiner d’éventuelles différences liées au sexe, les expériences seront faites sur une cohorte de souris males, et une cohorte de souris femelles, ainsi l’effectif sera doublé avec un total de 120 animaux soit environ 24 animaux par groupe.

Raffinement

Les conditions d’élevage seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes, et/ou tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences pour l’acclimatation. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Un suivi du poids des souris et d’hydratation sera effectué de façon hebdomadaire, et une vigilance sera accrue sur la prise de boisson (pesee des biberons) pour s’assurer que le traitement ne perturbe pas la prise alimentaire et hydrique. Dans le cas peu probable ou la prise de boisson est pertubee par le traitement, un additif sucré sera ajouté à la preparation. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués pour éviter toute souffrance inutile des animaux.

Choix des espèces

L'étude utilisera l’un des modèles de souris transgeniques les plus utilisés dans la littérature pour l’évaluation de l’efficacité de traitements pour la maladie d'Alzheimer. Il est bien connue que le phénotype associé, ainsi que les lésions cérébrales typique de celle-ci, se manifestent aux alentours de 8 mois de vie et sont encore davantage prononcés à 12 mois de vie. Les animaux adultes seront testés selon une chronologie bien decrite dans la literature pour ce modele transgénique.