Système nerveux

Nourris six semaines de gras et de sucre, isolés en cage individuelle pour que leur consommation soit mesurée, puis sevrés quatre semaines de cette nourriture, des rats subissent enfin une chirurgie terminale sous anesthésie, sans réveil. 720 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour analyse post-mortem. Le projet cherche à décrire les adaptations du système endocannabinoïde dans le circuit cérébral de la récompense, chez les mâles comme chez les femelles. Le porteur annonce deux tests d'anxiété pendant le sevrage sans dire lesquels, et affirme que l'isolement en cage ouverte n'interfère pas avec le bien-être des rats "dans nos conditions".

Objectifs

Les troubles du comportement alimentaire se définissent par une relation dysfonctionnelle avec l’alimentation, souvent orientée vers la consommation excessive d’aliments hautement palatables, riches en graisses et en sucres. Ces comportements, au-delà de leur dimension psychologique et comportementale, sont associés à des conséquences sanitaires majeures telles que les maladies cardiovasculaires, l’obésité et le diabète. Dans ce cadre, nous avons développé un modèle murin de consommation excessive de sucre et de gras et nous examinerons les adaptations de neuromodulateurs impliqués dans la motivation et la prise alimentaire dans des régions du circuit cérébral de la récompense. Ces investigations seront menées sur des rats des deux sexes, afin d’identifier d’éventuelles différences intersexuelles, déjà décrites chez l’humain dans le contexte des troubles alimentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet combinant technologies innovantes et comportement permettra de mieux comprendre la plasticité cérébrale du système endocannabinoïde dans les comportements addictifs en lien avec la consommation de nourriture palatable. Les résultats attendus, en particulier ceux concernant le système endocannabinoïde impliqué dans le sevrage et la rechute, permettront d’approfondir la compréhension des mécanismes biologiques sous-jacents à ces troubles alimentaires. De plus, l’impact d’un tel régime a été très peu étudié chez les femelles. En outre, à long terme, ces travaux précliniques fourniront une base scientifique pour le développement de stratégies hygiéno-diététiques innovantes et mieux adaptées à la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à un régime alimentaire riche en gras et en sucre pendant 6 semaines. Une partie des animaux sont soumis à une phase de sevrage de 4 semaines, sans nourriture palatable. Parmi eux, un certain nombre sera ré-exposé 24h à la nourriture palatable à l’issue de cette période de sevrage. Les animaux en sevrage subissent deux tests comportementaux pour évaluer le niveau d’anxiété (1x, 1j/test). Les animaux subissent également une injection pour l’anesthésie pour la chirurgie terminale sans réveil d’une durée d’environ 20 secondes.

Impact sur les animaux

Consommation excessive de nourriture palatable : les animaux ont le choix entre de l’eau normale et de l'eau sucrée, et de la nourriture standard et du gras, pendant 2h ou 24h selon le groupe expérimental, pendant 6 semaines. Nous n’avons à ce jour pas mis en évidence de pathologies chroniques dans notre modèle, mais justement, nous poursuivons notre caractérisation et le suivi de différents paramètres afin de suivre l’évolution chez les animaux. Des troubles de l'humeur sont envisageables chez les animaux consommateurs de boisson sucrée, et le but de l'étude est d’éventuellement les mettre en évidence, notamment pendant le sevrage. Nous devons évaluer précisément la consommation individuelle des rats et nous avons montré que l’isolement nécessaire (en cage ouverte permettant un contact auditif et olfactif) n’interfère pas avec le bien-être des animaux dans nos conditions. L’injection d’anesthésique avant la chirurgie terminale sans réveil peut engendrer une douleur aigüe de courte durée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem

Remplacement

La compréhension des mécanismes de mises en place et des conséquences des troubles du comportement alimentaire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal entier, vigile. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus neuronaux mis en jeu. Le rat est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines. Il nous est donc impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d'animaux pour permettre des analyses statistiques à la fois pour les analyses comportementales et moléculaires. Les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. De plus, les prélèvements d’organes permettront de décrire les altérations provoquées par le régime alimentaire autant au niveau cérébral que périphérique. D’autres dosages pourront être envisagés sur les tissus prélevés.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des rats sera assurée. De plus, une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (nourriture/sucre/gras/eau), permettant de s’assurer du bien-être des rats. Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel formé. Des points limites spécifiques ont été définis pour l'état général. Les tests comportementaux sont réalisés dans une pièce dédiée à laquelle les animaux sont habitués

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec le rat car certains résultats ont déjà été obtenus chez le rat mâle et nous pourrons comparés les résultats obtenus avec les femelles. Rats jeunes adultes (8 semaines en début de régime). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires

Modifiées génétiquement pour rendre leurs vaisseaux lymphatiques visibles et pour permettre d'éteindre certains gènes au moment voulu, 1 846 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent d'une à quinze injections en étant vigiles, des instillations dans le nez, et une à deux injections après incision de la peau sous anesthésie. Le projet vise à décrire comment se met en place, après la naissance, le réseau lymphatique qui draine le cerveau. Toutes sont tuées à l'issue, le porteur précisant que l'irritation liée aux incisions dure les deux heures qui séparent le réveil de la mise à mort.

Objectifs

Les vaisseaux lymphatiques ont pour fonction le nettoyage des tissus en drainant les fluides et les déchets dans les différents organes. Ils participent aussi à la réponse immunitaire. Nous nous intéresserons aux vaisseaux lymphatiques autour du système nerveux central. Ils sont capables de drainer les débris, les antigènes cérébraux et le liquide céphalorachidien. Leur implication a été démontrée dans de nombreux modèles de pathologies neurologiques. Ce réseau se développe après la naissance chez la souris et est à l’heure actuelle peu étudiée. Nos objectifs sont d'étudier le développement postnatal des vaisseaux lymphatiques drainant le cerveau et d'identifier les mécanismes qui contrôlent leur fonction.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la mise en place des vaisseaux lymphatiques et leur fonction. Les mécanismes biologiques seront caractérisés dans le but développer des outils moléculaires capable de moduler les différentes fonctions des vaisseaux lymphatiques méningés et de la réponse immunitaire. À long terme, les informations recueillies grâce à ce projet pourraient contribuer au développement de nouvelles thérapies pour les troubles neurologiques.

Procédures

Injections de molécules sur souris vigiles : entre 1-15 injections, durée geste: entre 1 et 10 min. Incisions cutanées et injections sous anesthésie : 1-2 injections, durée geste: entre 10 et 15 min

Impact sur les animaux

L'anesthésie, les instillations intranasales et les injections de modulateurs et de traceurs peuvent provoquer une légère douleur et un certain stress au moment de leur administration. Les incisions cutanées peuvent entraîner une irritation modérée pendant les deux heures séparant le réveil de l'anesthésie de la mise à mort des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure afin de réaliser des études des vaisseaux lymphatiques méningés et du cerveau des animaux.

Remplacement

Les médiateurs de croissance des vaisseaux lymphatiques que nous caractériserons dans ce projet ont été sélectionnés parmi un ensemble de médiateurs candidats en fonction de leur capacité à moduler de manière reproductible la migration des cellules endothéliales lymphatiques in vitro. Afin d'étudier leur rôle spécifique dans le drainage lymphatique cérébral et leur potentiel thérapeutique, le recours à des modèles animaux est indispensable. Cependant, à chaque fois que ce sera possible, l’étude des mécanismes moléculaires identifiés in vivo sera approfondie sur des cellules lymphatiques in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. La taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats a été déterminée à partir de données collectées au cours d’expériences précédentes, ainsi que par utilisation de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichie. Ils sont anesthésiées pour toute intervention. Nous avons défini une grille de score avec des points limites adaptés. En cas d'une altération modérée ne répondant aux critères de mise-à-mort, les soins à apporter seront définis avec la personne responsable du bien-être animal. Pour les incisions cutanées, les souris sont maintenues sur un tapis chauffant thermostatée. Du gel ophtalmique est appliqué sur les yeux pour éviter l’assèchement. Les souriceaux seront placés dans une chambre de réveil chauffée et hydratée afin de faciliter leur rétablissement post-opératoire.

Choix des espèces

Notre objectif est d'identifier les mécanismes moléculaires du remodelage et de fonction lymphatiques. Le modèle animal est donc indispensable à notre recherche. L’existence de modèles génétiques permettant de visualiser les vaisseaux lymphatiques et d’inactiver de manière temporelle et spatiale des gènes d'intérêt fait de la souris le modèle de choix pour décrypter les mécanismes contrôlant les différentes fonctions des vaisseaux lymphatiques. Les souris seront analysées à différents jours après la naissance et chez l’adulte pour étudier les effets de nos gènes d’intérêt et/ou des agents activant ou bloquant les voies de signalisation impliquées dans la mise en place et le maintien du réseau vaisseaux lymphatiques.

Dès qu'une souris atteint trois points sur la grille de score clinique, elle est mise à mort. 160 souris porteuses d'une mutation mitochondriale vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements post-mortem. Elles reçoivent deux immunosuppresseurs dans leur nourriture à partir du sevrage, avec pesée, température rectale et notation clinique au moins trois fois par semaine, et passent trois séances de dix minutes sur rotarod à quarante jours, alors que le porteur situe le début des difficultés à se mouvoir vers quatre semaines. L'objectif déclaré est de vérifier si deux molécules déjà testées sur un autre modèle murin du syndrome de Leigh agissent aussi sur celui-ci, donc de généraliser un résultat publié à un second gène.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement disponible pour la plupart des maladies mitochondriales, maladies génétique du métabolisme entraînant un handicap grave et une mort prématurée. Le syndrome de Leigh en est une des formes plus graves. Il est causé par des mutations dans de nombreux gènes différents affectant la fonction des mitochondries, les centrales énergétiques de nos cellules. Cliniquement, cette maladie affecte généralement le cerveau et les muscles. Une étude récente a rapporté un effet positif de deux médicaments agissant sur l'inhibition du système immunitaire chez un modèle de souris développant un syndrome de Leigh suite à l'inactivation d'un gène mitochondrial particulier. Le but de notre projet est de tester ces deux molécules sur un deuxième modèle de souris du syndrome de Leigh, impliquant un autre gène, afin de déterminer si ces deux traitements peuvent être généralisable à tous les patients atteints par cette maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier l'implication du système immunitaire en tant que mécanisme principal à l'origine du syndrome de Leigh et la possibilté d'approches thérapeutiques le ciblant . Si les résultats sont solides et montrent des améliorations significatives, cela devrait permettre le développement de traitements cliniques pour le syndrome de Leigh et potentiellement pour d’autres maladies mitochondriales.

Procédures

Traitement pharmacologique: administration de deux molécules thérapeutiques dans la nourriture, de l'âge de 21 jours jusqu'à la mise à mort de l'animal basée sur l'observation de signes cliniques. Basé sur une publication sur un modèle similaire, le traitement pourrait s'étendre sur 6 mois. Test de coordination motrice: les souris seront placées sur une machine (rotarod) permettant de vérifier leur capacité à coordonner les mouvements de leurs pattes. Il y aura une phase d'entrainement à l'âge de 30 jours, puis une phase de mesure à 40 jours. Basé sur des publications scientifiques, les souris restent en moyenne 10 minutes sur le rotarod, par mesure. Trois mesures seront effectuées, espacées de 15 minutes de récupération.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sur ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (vers 4 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir, et enfin des difficultés respiratoires peu avant le décès (à 7-8 semaines). Les traitements pharmacologiques en question ont été déjà appliqués dans des études scientifiques publiés qui ne semblent pas attribuer effets indésirables spécifiques.

Devenir

Tous les animaux prévus sur ce projet seront mis à mort en fin de protocole expérimental en vue de prélèvements post-mortem

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle en absence d’autre modèles cellulaires qui permettent d’étudier la réponse du système nerveux à des immunotraitements in vivo. De plus, les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique et les effectifs ont été calculés à l'aide d'un logiciel. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les analyses cliniques, pathologiques et moléculaires.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien-être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Pour limiter l’inconfort lié aux procédures, les manipulations seront réalisées par des personnes compétentes et expérimentées. Le bien-être des animaux fera l’objet d’un contrôle quotidien par le personnel de l'établissement utilisateur et du laboratoire. De plus, dans le cadre du protocole expérimental, à partir du début du traitement à lâge de 3 semaines, le poids corporel, la température rectale, la consommation alimentaire, l’état clinique seront évalués en aveugle au moins trois fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Une pesée supplémentaire sera effectuée le dimanche à partir de l’âge de 6 semaines. Un score sera attribué aux signes cliniques. Dès que les souris obtiendront un score de 3 points, elles seront mises à mort (point limite).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de ses gènes est très similaire à celle de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, cela permettra de tester l'efficacité de molécules thérapeutiques sur le syndrome de Leigh à l'échelle d'un organisme par des observations concrètes sur la survie et l'évolution pondérale. Le début du traitement commencera dès le sevrage des animaux à 21 jours car les molécules testées étant dans la nourriture, il faut que les souris puissent se nourrir seules. Le traitement continuera jusqu'au moment de la décision d'euthanasier les souris, basée sur notre grille de score, car le critère principal d'efficacité du traitement pharmacologique est la survenue plus tardive des signes cliniques pathologiques.

Exposées à un son intense à 18 jours de vie, puis chaque jour pendant une semaine à partir de 23 jours, les souris convulsent immédiatement après chaque exposition, jusqu'à trois crises par jour. Opérées du crâne pendant deux à trois heures, certaines passent ensuite 31 jours en sessions d'imagerie tête fixée, une à deux heures par jour. 382 souris vont être utilisées dans ces procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour identifier les circuits cérébraux qui transforment une perception sonore en décharge épileptique. Toutes sont tuées à la fin, le porteur indiquant qu'après de telles interventions elles ne peuvent être ni réutilisées, ni placées, ni adoptées.

Objectifs

Le but du projet est d’approfondir la connaissance des mécanismes par lesquels une stimulation sensorielle peut déclencher une crise épileptique. Ce phénomène est bien connu dans les épilepsies humaines, avec notamment le principe de photosensibilité (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente), qui reste mal compris, notamment en ce qui concerne le site cérébral, où se réalise ce processus et où est générée la décharge épileptique. Les dynamiques d’activation lors d’une crise déclenchée par un son sont également mal élucidées. Ce projet permettra d’étudier comment une perception sensorielle conduit à la génération d’une activité neuronale pathologique. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation, actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus dans le domaine médical et clinique sont une meilleure connaissance des épilepsies dites « réflexes » (déclenchées par une stimulation sensorielle), incluant des phénomènes tels que celui de photosensibilité, bien connu dans les épilepsies humaines (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente). L’ensemble de ces épilepsies avec composante réflexe représente environ 5% des épilepsies (soit environ 30 à 50.000 patients en France) bien que ce chiffre soit probablement sous-estimé par défaut d’évaluation systématique. Les déterminants physiopathologiques des épilepsies réflexes sont encore mal connus, en particulier en ce qui concerne le site anatomique d’où sont générées ces crises, et les dynamiques d’activation et de propagation neuronale. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier, à long terme, des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation (invasive ou non invasive), actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Ceci impliquera au préalable une phase de translation de ces résultats aux patients, par exemple via l’imagerie fonctionnelle ou d’autres études invasive ou non-invasive. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.

Procédures

Les souris seront soumises à: - une exposition sonore à l’âge de 18 jours, pour une durée maximale de 60 secondes (un jour) - une exposition sonore à l’âge de 23 jours, quotidienne pendant 7 jours, pour une durée maximale de 60 secondes. Ces expositions sonores déclenchent une crise convulsive immédiatement après l’exposition. - une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie à l’âge de 1, 3 et 56 jours. La durée de la chirurgie est de 2 à 3 heures. - pour certains 10 expositions sonores déclenchant des crises convulsives. Chaque animal subira un maximum de 3 crises par jour. -pour certains animaux des sessions d’1 à 2 heures d’imagerie en contention, quotidiennes sauf le weekend sur 31 jours, après une phase d’entraînement à la contention de 7-15 jours. Les nuisances attendues sur les souris sont essentiellement liées au stress généré par les expositions sonores et les crises épileptiques, ainsi qu’aux lésions réalisées lors des gestes chirurgicaux et aux douleurs que celles-ci peuvent entraîner.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les souris sont : -L’exposition sonore à une intensité contrôlée peut entraîner une douleur légère de courte durée (durée maximale de 60 secondes) -La survenue d’une crise convulsive après l’exposition sonore ou la stimulation lumineuse peut entraîner dans les suites une douleur musculaire modérée et de courte durée (pas de souffrance pendant la crise du fait de la perte de connaissance). Les souris ne subiront pas plus de 3 crises par jour. -L’injection de certains composés à l’âge de 1 ou 3 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères et de courte durée. -La réalisation de 4 orifices crâniens à l’âge de 56 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères pendant 1 à 2 jours selon les observations faites dans des protocoles similaires. -Pour certains animaux, la réalisation une autre chirurgie craniale se fait sous anesthésie et analgésie et peut entraîner des douleurs post-opératoires modérées pendant 1 à 2 jours. -Pour certains animaux, la réalisation de sessions d’imagerie en contention, tête fixée, sur une durée maximale de deux heures par jour pendant 31 jours, peut entraîner un inconfort modéré pendant la durée de la contention. -Le maintien en place d’un dispositif crânien pour envelopper les électrodes intracrâniennes peut entraîner une gêne légère pour les souris, sur une durée totale d’1 à 2 mois.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet ces animaux auront subi des procédures invasives ne permettant pas de réutiliser les animaux au-delà des expériences décrites ci-dessus et auxquelles ils ont été initialement destinés, ni de les adopter en dehors de ce contexte expérimental.

Remplacement

Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons appariés (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.

Réduction

Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.

Raffinement

L’utilisation de protéines excitables par stimulation lumineuse à travers la boîte crânienne permet d’éviter une procédure de chirurgicale additionnelle. Pour toutes les procédures chirurgicales, plusieurs mesures supplémentaires seront prises. Pendant la chirurgie, une réhydratation sera mise en place. Le volume de réhydratation sera ajusté en fonction de la durée de la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux en récupération sont placés en cage de réveil sur une plaque chauffante, puis replacés dans leur cage qu’il sera possible de continuer à chauffer par des chaufferettes, et reçoivent une analgésie supplémentaire. De l’eau gélifiée sera ajoutée dans les cages suite à la chirurgie pour faciliter l’hydratation des souris. L’environnement de la cage sera enrichi. Les animaux sont suivis quotidiennement, s’il y a des signes de douleur, des doses d’antalgiques sont ajoutées, s’il y a des signes d’infection un traitement antibiotique est mis en place. La phase de récupération est de 7 jours au minimum pendant lesquelles l’animal n’est pas manipulé sauf pour le suivi post-opératoire en première semaine. Des points limites spécifiques et précoces sont définis, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort si les traitements associés ne permettent pas de diminuer la douleur ou l’inconfort sous 24h. Ils sont basés sur des indicateurs de poids, la persistance pendant plus de deux jours d’une réduction de la mobilité avec dos voussé, d’une piloérection marquée, d’un manque de toilettage ou toilettage excessif ; ou encore la survenue de signes de détresse. Lors d’une crise épileptique prolongée au-delà de 2 minutes, l’animal sera placé sous un masque à oxygène. Pour diminuer le stress et l’angoisse pendant l’imagerie en contention, nous avons mis en place un protocole d’habituation progressive. La souris est placée en contention le premier jour pendant 30min puis le second et le troisième jour pendant 1h. Si à la fin de l’entrainement l’animal montre des signes de stress et d’angoisse, l’animal sera ré-entrainé le jour suivant au palier inférieur et le protocole décalé en fonction. Si ces signes perdurent l’expérience sera arrêtée pour l’animal.

Choix des espèces

Ce projet implique l’utilisation d’organismes vivants dotés d’un système nerveux central permettant l’intégration des perceptions sensorielles. Ces organismes vivants doivent par ailleurs pouvoir présenter des crises épileptiques. La souris est un modèle adapté qui répond à ces deux critères. Par ailleurs, l’utilisation de souris comme modèle animal est nécessaire pour permettre l’application des outils de manipulation ciblée des circuits neuronaux qui nous permettront d’avancer dans la compréhension des mécanismes de l’épilepsie. Ces outils sont mieux établis chez cet animal que dans d’autres espèces. Par ailleurs le modèle souris possède un système auditif similaire à l’homme et est suffisant pour l’exploration de mécanismes fondamentaux. Le stade de développement est un point crucial dans la susceptibilité des souris aux crises audiogènes. La susceptibilité maximale des souris étudiées à la procédure de « priming » (procédure qui confère la susceptibilité aux crises audiogènes après une exposition à un son bref et intense au cours de leur développement) entre 13 et 25 jours post-natal, et idéalement au 18ème jour. Il existe également une fenêtre temporelle de susceptibilité au « kindling » (expansion progressive du réseau épileptique par expositions sonores répétées) se situant entre le 21ème et le 30ème jour post-natal. Ainsi, nous réaliserons le « priming » au 18ème jour et le « kindling » au 23ème au 30ème jour. Une injection intracérébrale sera réalisé chez le souriceau à P1-P3, sous anesthésie générale, pour permettre une expression homogène et diffuse. La procédure chirurgicale principale sera réalisée à la 8ème semaine post-natale, et les expériences d’activation ou d’inhibition des différentes structures, couplées à la neurophysiologie, seront réalisées 5 semaines plus tard (environ 13ème semaine post-natale).

Stressées dix minutes par jour pendant cinq jours, ou privées de sommeil six heures d'affilée, des souris sont ensuite opérées du cerveau sous anesthésie pendant une heure à une heure trente. 410 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. L'objectif déclaré est de fabriquer un modèle murin de la bascule entre dépression et manie, en manipulant à la fois l'horloge circadienne et le circuit de la récompense. Le porteur annonce des tests comportementaux répétés une à trois fois par animal pour caractériser leur état affectif, sans dire lesquels.

Objectifs

Les troubles affectifs (TAs), tels que le trouble dépressif majeur (TDM) et le trouble bipolaire (BD), se caractérisent par d'importantes perturbations de l'humeur. Les TA sont les formes les plus répandues de maladies mentales et représentent un fardeau énorme pour la société. Les principaux états affectifs sont la dépression (tristesse, perte d'intérêt pour les activités) et la manie (exaltation euphorique, hyperactivité et troubles cognitifs). Les transitions entre les états affectifs se produisent épisodiquement et peuvent être exacerbées par des altérations au niveau génétique, cellulaire et des circuits neuronaux, conduisant à des épisodes durables dans les troubles affectifs. Les mécanismes à l'origine des transitions restent mal compris. Les altérations du sommeil et des rythmes journaliers sont des caractéristiques communes des troubles affectifs. La privation de sommeil (PS) et les traitements chronobiologiques peuvent déclencher des épisodes maniaques chez les patients atteints de trouble bipolaire et/ou inverser les épisodes dépressifs, ce qui suggère que la perte de sommeil induit un changement global des états affectifs. En outre, des modifications du système impliqué dans la récompense ont été largement impliquées dans les troubles affectifs et la régulation du sommeil. La manipulation des gènes régulateurs des rythmes journaliers et du système de récompense dans les circuits cérébraux impliqués pourraient générer des états comportementaux dépressifs, maniaques ou mixtes. Il est donc important d'élucider les voies neurobiologiques qui sous-tendent les changements physiologiques dans les états affectifs pour comprendre les mécanismes impliqués dans la pathogenèse des troubles affectifs et développer de nouvelles approches thérapeutiques. Les objectifs de ce projet sont de générer et de caractériser fonctionnellement et comportementalement des modèles de souris pour les transitions d'états affectifs (manie ou dépression) en manipulant le cycle veille-sommeil, les rythmes et le système de la récompense.

Bénéfices attendus

Les troubles affectifs sont des troubles psychiatriques graves caractérisés par un phénotype comportemental complexe, une pathophysiologie peu claire et un traitement difficile. Un modèle animal adéquat servant d’outil utile pour faire progresser les connaissances fait toujours défaut. Ce projet permettra la génération et la caractérisation fonctionnelle et comportementale d'un nouveau modèle de souris pour la transition d'état dans les troubles affectifss. Ce nouveau modèle qui combinera simultanément les deux principales hypothèses de la pathologie - troubles des rythmes et du système de la récompense. Son but ultime est d'améliorer notre compréhension de la neurobiologie des troubles affectifs et de déboucher sur de potentielles nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Deux modèles de trouble affectif seront mis en place sur animal vigile: un état dépressif induit par exposition répété de l'animal à une situation stressante 10 minutes/jour pendant 5 jours) ou un état maniaque (privation de sommeil pendant 6 heures une fois).Les animaux seront ensuite soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée (durée 1h à 1h30). Une partie de ces animaux opérés sera ensuite soumise à un traitement administré soit par injection (1 injection/animal vigile, durée quelques secondes) ou via l'eau de boisson (durée 7j). Pour finir les animaux vigiles seront soumis à des tests comportementaux visant à caractériser leur état affectif. Ces tests seront répétés de 1 à 3 fois /souris et ils durent en moyenne 5 à 10 minutes. Enfin les animaux surbiront une chirurgie terminale (durée 10 minutes) réalisée sur animal anesthésié.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet subiront un paradigme de stress ou une privation de sommeil ou un traitement pharmacologique afin d’induire soit un état tde ype dépressif, soit un état de type maniaque . Les conséquences des deux états inclueront une perturbation des rythmes biologiques des souris comme le rythme veille/sommeil, de l’anxiété, une perte d’appétence pour le plaisir, du desespoir mais également de l’hyperactivité et des troubles cognitifs. Certaines substances pharmacologiques injectées pourront également induire une production accrue d'urine ou un gain de poids . Les injections en elles-mêmes pourront générer une douleur aigue. La chirurgie réalisée sur certains animaux pourra induira une douleur modérée et occasionner , bien que très rarement, inflammation ou infection. Le placement en cage individuelle de certains animaux sur une courte durée, pour réaliser une partie de l'étude, pourra induire un stress léger.

Devenir

La mise à mort des souris de ce projet est nécessaire pour le prélévement de tissus nécssaires aux analyses moléculaire et histologiques.

Remplacement

La complexité du cerveau des mammifères est unique. Bien qu'il soit maintenant possible d'étudier de nombreux problèmes neurobiologiques sur des cellules isolées ou des cultures de tissus, l'utilisation de modèles animaux ne peut être remplacer dans ce projet puisqu'il s'agit de modéliser des troubles affectifs. Les connaissances sur ces troubles et les changements d’état qu'ils génèrent (état dépressif et maniaques) sont bien trop limités, et de fait aucun modèle in silico ou in vitro n’existe pour les modéliser dans toute leur complexité. En effet, il s’agit d’une maladie complexe, faisant probablement intervenir plusieurs types cellulaires spécifique et régions du cerveau. En outre, l’étude du comportement animal est primordiale pour comprendre les troubles affectifs.

Réduction

La taille des échantillons a été déterminée sur la base d'une vaste expérience de laboratoire et a été vérifiée par une analyse statistique de puissance. Dans des travaux antérieurs, aucune différence n’a été observée entre les mâles et les femelles ce qui permet d'optimiser l'utilisation des portées des lignées de souris génétiquement modifiées utilisées dans ce projet.

Raffinement

2 semaines d’acclimatation à la salle d’hébergement sont mises en place avant toutes procédures. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux dans des cages enrichies leur permettant d’exprimer les comportements naturels de l’espèce : matériel de nidification et à ronger. Un tunnel sera ajouté pemrettant de réduire le stress lors des transferts de cage au cours du change. La chirurgie est réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée multi-modale. La températuire corporelle des animaux est maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. De plus, une pommade ophtalmique sera appliquée sur les yeux empêchant la déshydratation oculaire. En fin de chirurgie, l'animal sera réhydraté et réchauffé jusqu’à son réveil complet. L'accès à la nourriture sera facilitée par ajout de nourriture gélifiée et de croquettes dans la cage. Suite à la chirurgie, un traitement post-opératoire analgésique sera mis en place pendant plusieurs jours et l'état de santé des animaux sera suivi quotidiennement et objectivés grâce à une grille d'évaluation de plusieurs paramètres algiques, comportementaux et physiologiques. Lors des tests comportementaux des mesures sont mises en place pour limiter l'impact de ces tests sur le bien-être des animaux. De plus, des points limites ont été établis pour pouvoir interrompre les procédures afin de limiter la souffrance animale en mettant en place des mesures correctives adaptées.

Choix des espèces

Les cerveaux murin et humain possèdent de nombreuses similitudes, des régions et circuits analogues mais aussi une réponse au stress, permettant de modéliser des réactions et phénotype proche des troubles affectifs. L’utilisation de modèles de stress largement établis chez la souris ainsi que de tests comportementaux pour mesurer le stress/anxiété/manie est également un énorme atout, tout comme les modèles génétiques permettant une étude approfondie des mécanismes moléculaires impliqués. de plus, les souris réagissent de manière prévisible aux traitements antidépresseurs et anxioliytiquesqui sont utilisés chez l'humain. Notre étude sera effectuée chez l'adulte jeune (8-14 semaines). L’étude repose sur l'exploration des comportements et nécessite que les systèmes neurobiologiques soient totalement mâtures.

149 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélèvement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de deux à trois heures sous anesthésie pour recevoir des injections virales dans le cortex et un dispositif d'enregistrement implanté, puis, une semaine plus tard, des séances de locomotion fine pouvant durer une heure, précédées d'une injection sur animal vigile. Certaines sont isolées vingt-quatre à quarante-huit heures, et le porteur signale une perte de poids ainsi que des démangeaisons aux sutures dans les jours qui suivent l'opération. L'objet est de distinguer le rôle des neurones venus du cortex moteur de ceux venus du cortex sensoriel dans le contrôle de la marche, un circuit que le porteur juge impossible à modéliser numériquement parce que les propriétés des éléments en jeu sont encore méconnues.

Objectifs

Chez les rongeurs, la marche et les mouvements de base peuvent être générés par la moelle épinière seule. Cependant, pour des actions plus complexes, comme franchir des obstacles ou marcher sur une échelle horizontale, le cerveau, et en particulier le cortex sensorimoteur, est indispensable pour ajuster et affiner les mouvements. La voie corticospinale, qui relie directement le cortex à la moelle épinière, joue un rôle central dans cette coordination. Des études précédentes ont montré que cette voie est essentielle pour le mouvement, mais elles ne distinguaient pas les neurones provenant du cortex moteur (M1) de ceux du cortex sensoriel (S1). Or, des travaux récents suggèrent que ces deux populations ciblent des circuits différents dans la moelle épinière et pourraient donc contribuer différemment au contrôle des mouvements et à la perception sensorielle. Notre projet vise à comprendre de manière précise le rôle spécifique des voies corticospinales issues de M1 et de S1.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera plusieurs bénéfices, à court et à long terme. À court terme, il permettra de mieux comprendre comment les différentes parties du cortex contrôlent les mouvements en fonctions de leur difficulté. À long terme, ces avancées pourraient avoir des retombées pour la recherche médicale. En comprenant mieux le fonctionnement de la voie neuronale qui va du cortex jusqu’à la moelle épinière, ce projet pourrait ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour traiter certaines affections neurologiques, comme la sclérose amyotrophique latérale, qui affecte particulièrement ces neurones.

Procédures

Les animaux subiront, sous anesthésie, une chirurgie d’environ deux à 3 heures pour injections virales et implantation de dispositif d’enregistrement. Au minimum 1 semaine après la chirurgie, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine. Ces tâches durent une dizaine de secondes et sont répétées pendant un maximum 1h. 30min avant le début de la tache comportementale, vigiles, ils subiront une injection de substance active de quelques secondes. Une à 2 sessions comportementales, espacées d’une semaine, sont prévues.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entraînent inévitablement un stress et des douleurs modérées et transitoires chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entraîner une gêne ou des démangeaisons qui disparaît également en quelques jours. Les tests comportementaux envisagés peuvent également être source de stress pour les animaux, ainsi que les contentions et les injections effectuées pendant les tests. Certains animaux devront être isolés pendant 24 à 48h, ce qui est également un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Le projet porte sur le rôle de l’inhibition présynaptique dans le contrôle de la locomotion, c’est-à-dire un circuit comprenant une sortie physiologique complexe. Un tel circuit est impossible à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doit être intact pour pouvoir être étudié. Il est impossible à modéliser numériquement car les propriétés des différents éléments sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini mathématiquement au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement fiables et robustes. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et obtenir des résultats spécifiques de genre. Les expériences seront effectuées de façon séquentielle, afin de finaliser les expériences de mise au point des différents outils avant d’effectuer les expériences de comportement, ce qui permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Un temps d’habituation à la pièce et au dispositif d’enregistrement est prévu, sur 20-30 minutes pendant deux jours consécutifs. Pendant les tests comportementaux, une couverture de 5cm de mousse souple est placée sous le dispositif expérimental, afin d’amortir une éventuelle chute de l’animal. Des animaux qui ne subissent pas les chirurgies sont hébergés avec les animaux tests. Ils sont présents sur la plateforme d’arrivée des tests de comportements, réduisant ainsi le stress des animaux tests et les motivant à faire les tâches sans qu’une restriction hydrique soit nécessaire. Du coton de nidification est prélevé dans la cage d’hébergement, et frotté sur le dispositif expérimental afin de diminuer le stress des animaux. Les animaux sont manipulés grâce à une petite coupelle en plastique, afin d’éviter la préhension répétitive par la queue.

Choix des espèces

Pour étudier comment certains neurones contrôlent les mouvements, nous utilisons la souris. Ce choix est justifié car la souris permet de cibler très précisément des neurones grâce à des outils scientifiques avancés. Cela aide à comprendre comment les signaux vont des différentes zones du cortex jusqu’à la moelle épinière et in fine pour contrôler les muscles. La souris permet aussi de moduler l’activité des neurones tout en observant les animaux bouger librement, ce qui est difficile à faire avec d’autres animaux. De plus, beaucoup d’études existent déjà sur les circuits nerveux de la moelle épinière de la souris, ce qui facilite l’analyse des résultats. Nous travaillons avec des souris d’au moins 21 jours, car à cet âge les circuits de contrôle des mouvements sont complètement développés et stables. Cela garantit que les résultats ne sont pas influencés par la croissance.

1 467 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines passant cinq jours seules en cage de mesure du métabolisme et recevant sept micro-prélèvements de sang par test. Nourries dès la gestation de leur mère avec un régime imitant l'alimentation ultra-transformée et additionné de polluants, elles subissent des tests d'anxiété et de mémoire, puis un faisceau infrarouge appliqué quatre fois trente secondes sur la patte, répété après l'injection d'un composé qui la fait rougir et gonfler. Le porteur annonce une prise de poids, des désordres métaboliques et des symptômes rappelant le diabète. Le modèle informatique de prédiction et les nouvelles réglementations alimentaires espérés restent à moyen et long terme, quand l'exposition aux polluants commence, elle, dès la vie intra-utérine.

Objectifs

Les plastiques présents dans notre environnement représentent une source inquiétante de pollution. Les micro et nanoparticules issues de l'abrasion des plastiques transportent des substances chimiques polluantes qui se diffusent dans les tissus biologiques. Les aliments ultra-transformés, quant à eux, présentent non seulement une composition déséquilibrée (teneurs élevées en sel, sucres raffinés et graisses saturées), mais contiennent également un nombre important de substances chimiques nocives, ajoutées ou formées lors de la transformation industrielle. Les substances chimiques présentes dans les aliments ultra-transformés s'ajoutent aux polluants provenant des particules de plastiques. La consommation d'aliments ultra-transformés représente plus de 60 % des calories consommées dans certaines régions d'Europe. Dans une étude récente de notre groupe, où des hommes ont été exposés à une alimentation ultra-transformée, nous avons découvert que cette consommation dégrade l'humeur, altère la fonction reproductive et la sécrétion d’hormone par le cerveau. Dans cette même étude, nous avons observé que la consommation d’une alimentation ultra-transformée pouvait engendrer un taux de polluants élevés dans le sang. Nous émettons donc l'hypothèse que la consommation d'aliments ultra-transformés détériore les fonctions cérébrales par l'action de polluants chimiques associés. Les résultats de cette première étude chez l’Homme ont servi de base à l’élaboration de ce projet, dans lequel une nourriture présentant les caractéristiques d’une alimentation ultra-transformée telle qu’elle peut être trouvée chez l’Homme additionnée de polluants candidats sera administrée à des souris jeunes et adultes afin de déterminer leurs effets sur le fonctionnement du cerveau et le comportement.

Bénéfices attendus

A moyen terme, nous souhaitons créer un modèle informatique qui permettra de prédire les effets des additifs et polluants sur la fonction et la santé du cerveau. Le bénéfice attendu à long terme est de participer à fournir les preuves scientifiques nécessaires à l'établissement de nouvelles réglementations pour l'industrie alimentaire et les décideurs politiques.

Procédures

La moitié des animaux est exposée à un régime de type ultra-transformé (riche en graisse, sucre et sels, pauvre en fibres) pendant un minimum de 8 ou 16 semaines. - Les animaux du groupe dont le métabolisme énergétique est analysé sont hébergés individuellement pour une durée maximum de 5 jours. Pour la détermination de leur composition corporelle, ils sont placés dans le tube d’analyse de l’appareil pendant quelques minutes. - Le groupe d’animaux sur lequel les analyses comportementales sont réalisées effectue un test de quelques minutes par jour pendant trois jour (tests d’anxiété). Le test de mémoire consiste en 5 jours d’entrainement (4 x 10 minutes par jour) et un jour de test (quelque minutes). - Le groupe d’animaux subissant les tests métaboliques reçoit une injection (15 secondes) et 7 micro-prélèvements de sang (environ 30 secondes par geste) pour chacun des 2 tests réalisés. Pour la réalisation de ces tests, la nourriture est retirée pendant 6h ou 15h (selon le test) avant le début des expériences. Pour le test de sensibilité thermique cutanée, les animaux sont placés dans une enceinte individuelle puis soumis à un faisceau lumineux infrarouge entraînant une augmentation ponctuelle de la température de la peau au niveau de la patte (30 secondes x 4 ; répété après l’injection d'un composé inflammatoire (30 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux soumis à un régime de type ultra-transformé (riche en graisse, sucre et sels, pauvre en fibres) sur une longue période peuvent présenter une prise de poids plus importantes que les animaux soumis à un régime standard, ainsi que des symptômes rappelant le diabète (désordres métaboliques, troubles du comportement alimentaire, anxiété). L’analyse du métabolisme requiert que certains animaux soient hébergés individuellement pour une durée maximum de 5 jours, pouvant générer un stress. Pour la détermination de la composition corporelle des animaux, ils sont placés dans le tube d’analyse de l’appareil pendant quelques minutes, pouvant générer un stress. Pour les tests métaboliques, une douleur légère de courte durée associée aux injections et aux micro-prélèvements de sang est attendue. Les analyses comportementales peuvent stresser les animaux. Celles-ci sont de courte durée (quelques minutes pour chaque test). Pour le test de sensibilité, les animaux sont placés dans une enceinte individuelle puis soumis à un faisceau lumineux infrarouge entraînant une augmentation de la température de la peau au niveau de la patte (30 secondes x 4 ; répété après l’injection d'un composé entraînant une rougeur et un gonflement au niveau de la patte).

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des procédures afin de collecter les tissus et organes pour analyses biologiques.

Remplacement

Les études impliquant l’analyse des effets de la nutrition sur l’organisme nécessitent l’utilisation d’un modèle animal, plusieurs tissus et systèmes intégrés étant affectés et interragissant au cours de la réponse (cerveau, foie, graisse, système immunitaire). A ce jour il est impossible de récréer ces conditions sans l'utilisation d'un organisme vivant. Cependant l’objectif de notre étude est de collecter suffisamment de données afin de créer un modèle informatique pouvant prédire l'effet des polluants qui devrait permettre l’utilisation de moins d’animaux à l’avenir.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Pour estimer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé un logiciel de calcul de taille d'échantillon. Chaque fois que cela est possible nous utiliserons un groupe de souris contrôles commun à plusieurs séries d'études. Nous optimiserons également la collecte de tissus postmortem à l’issue de chaque procédure afin de créer une « bibliothèque d’échantillons » pouvant être utilisés pour de futures analyses.

Raffinement

Avant le début de l’étude, les souris sont acclimatées au cycle de lumière inversée (allumage de 19h à 7h ; obscurité de 7h à 19h) pendant 2 semaines, cela permet de se conformer au cycle normal des animaux, les souris étant actives pendant la phase nocturne. Une lumière rouge, invisible pour les souris, est utilisée pour visiter les animaux. La température est maintenue à 26°C, proche de la zone de thermoneutralité des souris et facilitant la régulation de leur température corporelle. Elles seront également habituées à être manipulées pendant cette période, pour réduire toute forme de stress par la suite. Les polluants seront administrés aux animaux incorporés dans une gelose et au travers d’une administration orale volontaire, qui aura fait l’objet d’un entraînement préléalable. Les cages utilisées pour analyser la calorimétrie permettent aux animaux de conserver un contact visuel et olfactif et sont équipées de façon à fournir des occasions accrues d’interaction avec l’environnement (litière, mangeoire, biberon et maisonnette suspendus, roue) afin de compenser le fait que les animaux doivent être hébergés seuls pendant ce laps de temps. Pour le test de préférence au sucrose, une cage avec lecteur de puces (permettant d'indentifier individuellement les souris) permet d’héberger les animaux en groupe. Les prélèvements sanguins effectués en fin d’étude seront réalisés sous anesthésie. Pour les tests métaboliques, les animaux sont mises au calme dans la salle 1h avant le début de l'expérimentation. En cas d'hypoglycémie sévère pendant un test, du glucose est injecté et le test est immédiatement arrêté. Dans les tests de sensibilité cutanée, l‘animal échappe lui-même à la douleur en retirant sa patte. Dans tous les cas, la patte de l‘animal n‘est jamais exposée plus de 30 secondes à la chaleur. Cette exposition n‘entraîne aucune brulure ni lésion tissulaire. Des points limites ont été définis et seront appliqués afin de limiter la douleur et l’angoisse des animaux au minimum.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence dans les études métaboliques, nous pouvons donc bénéficier d’un grand nombre de ressources et de données préliminaires existantes. Les animaux seront exposés aux régimes et polluants pendant la gestation de la mère, pendant l'allaitement et après le sevrage jusqu’à l’âge adulte afin de récréer au mieux les conditions d’une exposition tout au long de la vie et en particulier l’exposition à un très jeune âge. Les tests (comportementaux, métaboliques, physiologiques) seront eux tous réalisés sur des animaux adultes (à l'âge de 8 ou 16 semaines).

Des chocs électriques répétés dans un test de peur contextuelle, six injections sous la peau du crâne en deux semaines, ou huit jours d'injections d'interféron provoquant une sensation de maladie : 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de savoir si les macrophages des méninges influencent la mémoire et le comportement, en les éliminant ou en les empêchant de produire une molécule. Le porteur écrit qu'aucune des procédures ne sera "particulièrement douloureuse", après avoir décrit ces chocs électriques et l'inconfort provoqué par l'interféron. Les souris sont tuées dans les heures qui suivent les tests comportementaux, pour prélever leurs méninges et leur cerveau.

Objectifs

Ces dernières années, la recherche a commencé à mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans les membranes qui entourent le cerveau, appelées les méninges. On sait maintenant que certaines cellules immunitaires présentes à cet endroit ne servent pas seulement à nous protéger contre les infections, mais peuvent aussi influencer le fonctionnement du cerveau et le comportement. Parmi ces cellules, ce sont surtout les cellules dites « lymphoïdes » qui ont été étudiées jusqu'à présent. Elles produisent des molécules (les cytokines) capables d'agir sur le cerveau, en influençant par exemple la naissance de nouveaux neurones ou l’activité des circuits neuronaux. Cependant, le rôle d’un autre type de cellule immunitaire, les macrophages méningés, reste encore mal compris. Ces macrophages sont pourtant très nombreux aux frontières du cerveau et produisent aussi de nombreuses molécules qui pourraient avoir un impact sur son fonctionnement. Des recherches préliminaires menées dans notre laboratoire suggèrent qu’une molécule appelée Pf4, produite par ces macrophages, pourrait favoriser la formation de nouveaux neurones et stimuler l’activité neuronale dans une région du cerveau appelée l’hippocampe. Cela pourrait indiquer un lien direct entre ces cellules immunitaires et certaines fonctions du cerveau. Par ailleurs, on sait que lors d’une infection, notre comportement change souvent (fatigue, baisse de motivation, repli sur soi, etc.). Ces réactions, appelées « comportement de maladie », pourraient aussi être liées à l’activation des macrophages méningés, qui sont parmi les premières cellules à détecter l’inflammation venant du reste du corps. Le but de ce projet est donc de mieux comprendre comment les macrophages méningés influencent le comportement et les capacités mentales, à la fois dans des situations normales et en cas d’inflammation. En identifiant les mécanismes impliqués, ce travail pourrait aider à mieux lutter contre les problèmes cognitifs causés par l’inflammation, comme ceux observés dans certaines maladies chroniques ou avec le vieillissement.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de ce projet est de comprendre comment les macrophages méningés communiquent avec le cerveau et contribuent à réguler l'activité neuronale dans des conditions homéostatiques et inflammatoires. Compte tenu de la complexité de ces processus biologiques, qui sont encore loin d'être modélisés par des systèmes in silico ou in vitro, ce projet s'appuiera principalement sur l'utilisation de modèles in vivo. La caractérisation de cet axe neuro-immunitaire ouvrira potentiellement de nouvelles voies dans notre capacité à sauvegarder l'intégrité fonctionnelle du cerveau pendant les conditions inflammatoires ou à stimuler les performances cognitives dans le cas de conditions progressives telles que les maladies neurodégénératives et le vieillissement . En effet, ce projet vise à obtenir deux avantages principaux : 1) le bénéfice à moyen terme d'une meilleure caractérisation de la fonction des macrophages dans la neurogenèse et dans autres activités neuronales avec des implications dans la mémoire et le comportement et 2) le bénéfice à long terme de l'identification de médiateurs candidats qui favorisent les fonctions cérébrales, conduisant à des approches pharmaceutiques innovantes qui tirent parti des macrophages pour agir sue les maladies neurologiques.

Procédures

Les souris utilisées dans cette étude recevront différents traitements selon leur groupe. Chez les souris de type sauvage, une injection sera faite sous la peau au niveau du crâne, tous les deux jours pendant deux semaines (soit six fois au total). Ce traitement vise à éliminer spécifiquement les macrophages présents dans les méninges. Les souris génétiquement modifiées recevront un autre type de traitement : • Pour la première lignée, les injections (également tous les deux jours pendant deux semaines) contiendront une substance appelée tamoxifène, qui empêchera les macrophages méningés de produire la molécule Pf4 • Pour la seconde lignée, les souris recevront pendant huit jours consécutifs une injection d’interféron alpha (IFN-α), une molécule qui induira une inflammation généralisée mais pas aigue. Une fois les traitements terminés, toutes les souris passeront une série de tests pour évaluer leurs capacités de mémoire et de comportement.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises à anesthésie gazeuse, de sorte qu'elles ne ressentiront pas de douleur pendant la procédure, alors qu'elles pourraient en ressentir au niveau du site d'injection à leur réveil. Même si les souris se familiarisent avec l'opérateur et s'habituent aux paramètres expérimentaux, elles peuvent encore ressentir un stress modéré lors de certains tests comportementaux. En particulier le test de la peur contextuelle va engendrer de la légère douleur à travers des chocs électriques rapides mais répétés. Quant aux souris transgéniques, l'injection intrapéritonéale de IFN peut provoquer une légère sensation de douleur au point d'injection, tandis que l'effet systémique d'une faible dose de IFN provoque une sensation de maladie et d'inconfort chez les souris. Aucune des procédures effectuées dans le cadre de ce projet ne sera particulièrement douloureuse. Néanmoins, nous surveillerons quotidiennement l'état de santé des souris, afin d'évaluer en particulier leur réaction aux traitements. Concernant les deux modèles transgéniques, l’identification (tatouage) et le génotypage (prélèvement de poils) seront réalisé grâce à procédures non-invasives.

Devenir

Les animaux seront mis à mort dans les premières heures suivant les tests comportementaux afin de pouvoir prélever des échantillons biologiques qui nous permettront d’étudier des processus qui se déroulent dans les méninges et le cerveau.

Remplacement

L'objectif principal de ce projet est de comprendre comment les macrophages méningés peuvent moduler les activités neuronales et finalement contribuer à la modulation du comportement et de la cognition. Cependant, l'interaction entre les systèmes immunitaire et nerveux que nous voulons étudier ne peut pas être isolée de l'environnement tissulaire complexe où elle a lieu, qui représente une partie essentielle du système. Ce niveau de complexité n'a été atteint par aucune plateforme technologique disponible à ce jour, c'est pourquoi les modèles in vivo restent essentiels pour étudier de manière fiable l'interaction entre les systèmes immunitaire et nerveux et absolument irremplaçables pour évaluer les caractéristiques comportementales. Une fois que le lien fonctionnel entre les macrophages méningés et l'activité neuronale aura été établi et que des mécanismes moléculaires candidats auront été mis en avant, des expériences complémentaires seront menées à l'aide de systèmes in vitro, tels que des essais de neurogenèse sur des cellules souches.

Réduction

Toutes les expériences seront effectuées de manière pertinente et complète afin de limiter au minimum le nombre d’animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, nous allons utiliser les mêmes souris pour plusieurs tests (deux groupes de tests comportementaux). Cette réutilisation pourrait contribuer à augmenter le niveau de stress de l'animal mais devrait nous permettre de réduire considérablement le nombre d'animaux nécessaires. 25 animaux seront utilisés pour chaque condition expérimentale pour chaque groupe de tests comportementaux, soit un total de 700 animaux en 5 années de projet. Les résultats seront analysés à l'aide du test statistique le plus adapté. Nous essaierons de réduire encore le nombre d'animaux nécessaires si les données collectées, les analyses statistiques et les données de la littérature nous permettent d'adapter nos estimations au cours du projet. Après les tests comportementaux, le cerveau et les méninges seront prélevés sur chaque souris afin de réaliser plusieurs études à plusieurs niveaux.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques. Les souris seront suivies régulièrement et des points limites adaptés et précoces permettront en cas de souffrance de prendre les mesures adéquates en concertation avec notre vétérinaire référent ou notre structure chargé du bien-être animal.

Choix des espèces

Comme de nombreux mécanismes biologiques sont similaires chez la souris et chez l’être humain, nous utiliserons différentes souches de souris, dont certaines ont été modifiées génétiquement. Ces lignées transgéniques ont été conçues pour permettre d’observer et de manipuler plus précisément le rôle des macrophages méningés, nôtres cellules immunitaires d’intérêt. Grace à ces modèles, on pourra tester plus rapidement et de manière plus ciblée nôtres hypothèses. L’utilisation de ces souris transgéniques est donc essentielle pour comprendre comment les macrophages méningés participent à la régulation de processus cérébraux complexes. Pour toutes ces raisons, la souris représente le modèle le plus adapté à ce type d’étude. Les tests comportementaux seront réalisés sur des souris âgées d’environ 60 jours, c’est-à-dire à l’âge adulte, lorsque leurs capacités cognitives (mémoire, apprentissage, etc.) sont complètement développées.

Les souris utilisées portent un phénotype dommageable, avec perte de poids, déficits olfactifs et cognitifs, risque accru de crise d'épilepsie et mortalité précoce. 1 560 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées. Chacune reçoit une injection dans les jours qui suivent sa naissance, une partie subit ensuite une injection dans le cerveau d'une heure, une autre une seconde injection suivie de la mise à mort avant tout réveil, l'ensemble s'étalant selon les lots de un mois à un an. La mise à mort sert à vider les vaisseaux de leur sang, qui gênerait l'immunofluorescence, et le porteur signale que manipuler les souriceaux avant le sevrage peut conduire la mère à les rejeter.

Objectifs

Parmi les défis actuels en santé publique, la maladie d’Alzheimer (MA) tient une place importante de par sa fréquence et l’absence de traitement. Le rôle des astrocytes, cellules gliales majoritaires du cerveau qui contactent à la fois les neurones et les vaisseaux sanguins, dans la MA a été récemment déterminé. Cependant, l’impact de la maladie d’Alzheimer (MA) et de sa progression sur les contacts entre les astrocytes et les vaisseaux sanguins demeure mal connu, en particulier au niveau de l’interface appelée unité gliovasculaire (UGV). Le rôle éventuel de cette interface dans la physiopathologie de la maladie reste également à déterminer. Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle des astrocytes et de l’unité gliovasculaire dans la maladie d’Alzheimer à différents stades de progression de la pathologie, dans le but d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Il nécessite l’utilisation de 1560 animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur la contribution des astrocytes et de l’unité gliovasculaire dans la maladie d’Alzheimer, dans le but d’explorer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux recevront tous une première injection quelques jours après leur naissance durant 1 minute maximum. Puis, un premier lot d’animaux recevra quelque temps plus tard (entre 1mois et 1 an plus tard) une seule injection supplémentaire avant d’être mis à mort juste après celle-ci (temps total 45 min), un second lot subira dans un premier temps une injection dans le cerveau (1h) avant quelque mois plus tard de recevoir eux aussi une seule injection suivit de la mise à mort comme le précédent lot. Enfin un dernier lot d’animaux recevra une injection dans le cerveau (1h).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées pour nos expériences ont un phénotype dommageable, notamment marqué par une perte de poids, des déficits olfactif et cognitif, une augmentation du risque de crise épileptique et une mortalité précoce. Certains lots de souris subiront une injection non douloureuse mais pouvant entraîner une légère irritation au point d'injection pendant quelques heures maximums. Certains lots de souris subiront une seconde injection pouvant entrainer une irritation mais celle-ci est suivie de la mise à mort des animaux avant leur réveil. Certains lots souris subiront une injection dans le cerveau qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie pouvant durer 2-3 jours. La manipulation des souriceaux avant sevrage peut entrainer leur rejet par la mère.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour les analyses histologiques. Ces analyses nécessitent que les vaisseaux sanguins ne contiennent plus de sang car sa présence interfère avec l'expérience d'immunofluorescence.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets entre les différents groupes selon le génotype et les stades de développement seront évalués. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la sur-utilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Pour nos questions, il faut obtenir des observations sur 5 animaux indépendant par condition. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité connue intrinsèque au modèle. En effet, la formation des plaques amyloides peut varier d’une souris à l’autre pour un même stade. Une marge de 5% a été ajouté au nombre total afin de pallier aux potentielles pertes liées au geste chirurgical ou à l’anesthésie.

Raffinement

Les souris subissant une opération feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure de chirurgie et les jours suivants. L'intervention pouvant générer de l'inconfort et de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. Une grille graduée pour la surveillance post opératoire des animaux est mise en place afin de définir des point limites précoces et des points d’intervention intermédiaires. Des analgésiques sont prévus et coadministrés pour limiter la souffrance pendant et après la chirurgie. Les souriceaux sont manipulés au minimum et l'environnement de la cage est enrichi après les manipulations pour éviter le rejet des petits par la mère. Les souris présentant un phénotype dommageable seront surveillés (poids et comportement social) et les animaux présentant des signes d'inconfort (amaigrissement, isolement du groupe) seront euthanasiés sous anesthésie profonde avec une analgésie adaptée.

Choix des espèces

La souris partage 98% de son génome et permet ainsi dans la majorité des cas de pouvoir mimer une pathologie humaine via des modèles génétiquement modifiés. De plus cette espèce de petite taille présente une courte durée de gestation et génère un grand nombre de petits dans ses portées, ce qui en fait un modèle mammifère idéal. Nous souhaitons étudier l’UGV à différents stades de progression de la MA, qui est caractérisée par le dépot progressif d'aggrégats amyloïdes. On utilisera les souris à 1 mois, 3 mois (stades sans dépôts amyloïdes), 6 mois, 9 mois et 1 an (stade présentant des dépôts amyloïdes).