Système nerveux
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Effets d’une carence gestationnelle en vitamine A sur la transmission dopaminergique mésocorticolimbique dans le contrôle de la prise de décision MODIFICATION
- Recherche fondamentale
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- Oncologie
- Système nerveux
306 souris reproductrices sont carencées en vitamine A pendant la gestation, puis tuées au sevrage de leurs portées, dont les descendants forment l'essentiel de l'effectif. 1 326 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de régions cérébrales, 546 sans jamais se réveiller, 480 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 300 un niveau modéré. Les descendants passent douze semaines en restriction alimentaire pour un conditionnement opérant, certains reçoivent des injections d'amphétamine, d'autres subissent une chirurgie stéréotaxique, et 120 sont soumis à des tests d'anxiété que le résumé ne nomme pas. Sur la réduction, le porteur explique multiplier les mesures sur un même animal, sans jamais indiquer d'où vient le chiffre de 1 326.
Objectifs
La carence en vitamine A au cours de la période périnatale, causée par un régime appauvri en vitamine A, reste un enjeu majeur de santé publique dans les pays en voie de développement. En effet, l’acide rétinoïque (AR), métabolite actif de la vitamine A est indispensable au développement cérébral du foetus et du nouveau-né mais joue également un rôle très important dans les fonctions cérébrales à l’âge adulte. En se fixant sur ses récepteurs nucléaires les RARs (Retinoic Acid Receptors) et les RXRs (Retinoid X Receptors) qui jouent le rôle de facteur de transcription, l’AR régule l’expression de nombreux gènes impliqués dans les processus de plasticité cérébrale. Ainsi, de faibles apports en vitamine A pendant la période périnatale conduiraient à une hypoactivité de la voie de signalisation de l’AR et des modifications d’expression de certains gènes comme le récepteur dopaminergique D2 (D2R) avec des conséquences néfastes sur les fonctions cérébrales associées (fonctions exécutives, planification motrice). Nous faisons l’hypothèse qu’un déséquilibre d’apports alimentaires en vitamine A durant la période périnatale altère le développement de la transmission dopaminergique et pourrait participer à l’étiologie de pathologies neurodèveloppementales qui impliquent des déficits des fonctions exécutives et motrices.
Bénéfices attendus
cette étude vise à proposer de nouvelles stratégies pour la prise en charge des maladies psychiatriques dont l’arsenal thérapeutique reste insuffisant. Ce projet va permettre de tester l’effet potentiellement protecteurs de molécules d’intérêts et donc de proposer de nouvelles stratégies curatives dans le contexte des maladies psychiatriques. Il va aussi permettre d’explorer les mécanismes par lesquels ces métabolites influencent la fonction cérébrale et le comportement. Cela permettra donc d’accroitre les connaissances dans un champ de recherche nouveau et prometteur.
Procédures
306 souris reproductrices seront euthanasiées au sevrage des animaux et 120 souris descendantes seront euthanasiés pour réaliser des enregistrements électrophysiologiques (426 sans réveil). 660 souris descendantes seront soumises à un conditionnement opérant (classe légère). Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Sur les 660 souris descendantes ayant été soumises au conditionnement opérant , 60 seront soumises à des injections intrapéritonéales d'amphétamine (classe modérée) et 240 seront soumises à des chirurgies stéréotaxiques (classe modérée). Afin d’évaluer le comportement de type anxieux, 120 souris descendantes seront soumises à des tests comportementaux qui peuvent engendrer un stress aigü (classe légère). Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. 240 souris descendantes (dont 120 soumises au conditionnement opérant) seront perfusées pour réaliser des analyses immunohistochimiques (classe légère). Cette intervention dure 15 min par souris (480 classe legère).
Impact sur les animaux
De part sa nature et son objectif les tests comportementaux évaluant le comportement de type anxieux que nous allons utiliser entraine un stress aigü chez la souris. Néanmoins l’état général de la souris n’est pas altéré. Les souris seront de toute façon suivies comme suit : les animaux en cours de protocole sont surveillés chaque jour par l’expérimentateur et 2 fois par semaine par les animaliers. Pour le test de conditionnement opérant, les animaux seront maintenus en restriction alimentaire légère (moins de 10% de perte par rapport au poids ad libitum) pendant toute la durée des expériences comportementales (12 semaines). Pour cela, les animaux seront pesés chaque jour et la quantité de nourriture ajustée en fonction. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération.
Devenir
En fin de procédure 1, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires. En fin de procédure 2, tous les animaux seront euthanasiés pour collecter des tissus fixés afin de réaliser de l'immunomarquage sur les tranches de cerveau. En fin de procédure 3 tous les animaux seront euthanasiés et le cerveau sera prélevé (comme tissu frais) afin de réaliser des enregistrements électrophysiologiques. En fin de procédure 4, tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires. En fin de procédure 5 et 6 , tous les animaux seront euthanasiés et différentes régions cérébrales seront prélevées (comme tissu frais) et congelées pour des analyses moléculaires.
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques d’une carence gestationnelle en vitamine A . Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la cognition reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. L’objectif à long terme du projet étant de tester les effets comportementaux d’une supplémentation nutritionnelle en vitamine A dans le contexte des maladies neurodéveloppementales. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié
Raffinement
Concernant le raffinement différentes approches seront mises en œuvre. Les animaux seront hébergés en cages collectives avec un environnement enrichi (bâton à ronger, igloo, sizzle nest). Les animaux seront observés quotidiennement et pesés au moins 1 fois par semaine. Les animaux seront inspectés et si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin et coton), les animaux recevront une injection sous-cutanée d'analgésique si nécessaire et seront surveillés deux fois par jour. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Si l’animal apparaît malade ou avoir des douleurs (voir définition des points limites dans les procédures expérimentales), il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera mis à mort dans les 24h. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur. Par ailleurs pour les procédures induisant de la douleur comme la perfusion intracardiaque nous utiliserons des associations d’anesthésiques et analgésiques afin de limiter la douleur chez l’animal. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Enfin, les protocoles réalisés sur les animaux sont au préalable soumis puis approuvés par l'équipe en charge de l'animalerie afin d'assurer les bonnes conditions d'expérimentation.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris car ce sont des animaux de petite taille et peuvent donc être facilement hébergés à l’animalerie dans de bonnes conditions d’élevage. Les expériences de comportement et d’électrophysiologie sont facilement mises en oeuvre d’un point de vue technique sur les souris. La souche de souris utilisée (C57/Bl6J) constitue un modèle d’étude particulièrement intéressant et informatif dans le cadre des études sur l'impact des carences gestationnelles de nutriments sur la prise de décision , de ce fait les résultats de ce projet seront donc plus faciles à intégrer dans la littérature déjà existante. Nous choisissons de travailler chez la souris plutôt que chez le rat car de nombreuses souris transgéniques sont disponibles ce qui n’est pas le cas chez le rat, ce qui sera nécessaire pour la continuité du présent projet.
Etude et traitement thérapeutique des défauts cérébraux dans 2 modèles de souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
6 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus, chacune pouvant recevoir jusqu'à cinquante-six injections intrapéritonéales ou cinquante-six gavages en un mois. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré pour 3 840 d'entre elles et sévère pour 2 176, 240 étant tuées sans réveil. L'épilepsie est déclenchée par une injection de kaïnate qui provoque une détresse sévère pouvant aller jusqu'à la mort, et le gavage expose à la perforation de l'œsophage et au passage du produit dans les poumons. Le bénéfice mis en avant reste interne à la recherche, il s'agit de disposer de modèles animaux permettant de tester ensuite des médicaments déjà utilisés en clinique pour d'autres maladies.
Objectifs
Ce projet étudie deux gènes impliqués dans la formation du cil primaire, une petite antenne présente dans la plupart des cellules de l’organisme captant des signaux chimiques et mécaniques. Une anomalie de ce cil primaire entraine des maladies sévères affectant la plupart des organes. Ce projet vise à comprendre si les mutations de ces deux gènes chez la souris entrainent des défauts cérébraux ou des épilepsies. Enfin, ce projet évaluera 4 traitements médicamenteux sur le développement de ces défauts cérébraux.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est d’étudier si les mutations de 2 gènes importants pour la formation du cil primaire (petite antenne cellulaire présente sur la plupart des cellules de l’organisme) entrainent des troubles cognitifs et comportementaux. Ceci nous permettra de développer des modèles animaux sur lesquels nous pourrons tester des médicaments qui sont déjà utilisés en clinique pour d’autres applications ou qui ont montré un effet bénéfique dans d’autres pathologies chez la souris.
Procédures
- Contention et anesthésie (injection ip): 5 secondes, 1 fois/animal. - Chirurgie terminale sous anesthésie pour perfusion intracardiaque: 4 minutes, 1 fois/animal. - Injections ip de composés thérapeutiques : 10 secondes, maximum 2 fois/jour pendant 1 mois (max 56 injections ip/souris) - Administration orale de composés thérapeutiques : 30 secondes, maximum 2 fois/jour pendant 1 mois (max 56 gavage/souris) - Induction d’une épilepsie par injection ip de kainate : 2 heures, 1 fois/animal
Impact sur les animaux
- Contention : peut causer un stress léger de courte durée. - Chirurgie terminale sous anesthésie pour perfusion intracardiaque: douleur modérée - Injection ip : douleur légère et passagère ainsi qu’une irritation de la zone d’injection - Administration orale : risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. - Induction de l’épilepsie : provoque une détresse sévère chez l’animal pouvant induire une mort potentielle dépendant de la sévérité des crises.
Devenir
Tous les animaux utilisés seront mis à mort à la fin de l'étude pour prélèvement de tissus et analyses phénotypiques et génétiques.
Remplacement
Les questions scientifiques étudiées dans ce projet ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux. Il s’agit ici d’études sur le développement et le fonctionnement du cerveau, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère. Aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de son développement dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part. De plus ce projet étudiant l’épilepsie nécessite une approche qui n’est réalisable qu’à l’échelle de l’organisme entier.
Réduction
Les expériences sont réalisées avec le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'obtention d'un résultat significatif déterminé par une approche statistique en utilisant un test approprié pour comparer les groupes d’animaux.
Raffinement
Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. L’application stricte des points limites spécifiques aux expériences réalisées conduira à une prise en charge de la souffrance éventuelle des animaux. Les animaux subissant un prélèvement de sang recevront une analgésie préalable à l’anesthésie générale. Afin de limiter la souffrance due aux injections, celles-ci seront réalisées avec des seringues à Insuline très fine qui donnent une injection quasi indolore. Afin de réduire les risques de perforation de l’œsophage liés aux administrations orales, des sondes adaptées seront utilisées. L’induction de l’épilepsie s’effectue dans le calme dans une pièce dédiée afin de diminuer au maximum le stress occasionné.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction et elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyse ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, la souris partage avec l’homme un développement du cortex cérébral et un fonctionnement du système nerveux similaires. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades juvéniles (avant la fin de maturation du cerveau) ou à l’âge adulte (quand la maturation du cerveau est bien finie).
Architecture fonctionelle thalamocorticale de la prise de décision adaptative chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six heures de chirurgie cérébrale par animal, pour injecter des composés dans le cerveau et y implanter à demeure des électrodes et une fibre de verre. 60 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 10 d'entre eux et modéré pour 50, dix seulement pouvant être adoptés à l'issue, les autres étant tués pour prélèvement. Pendant jusqu'à quatre mois, chaque rat travaille une tâche de prise de décision de vingt minutes à une heure quinze par jour, maintenu trois mois durant à 90 ou 95 % de son poids pour que la faim entretienne sa motivation. Le porteur qualifie cette restriction d'impact très faible sur le bien-être, et retient le rat parce que des épreuves comportementales y modélisent des aptitudes cognitives complexes qu'il juge transposables à l'être humain.
Objectifs
La prise de décision est un processus essentiel du comportement humain. Ce processus complexe nécessite d’apprendre de son environnement afin d’emmagasiner des connaissances mais également de s’adapter aux changements. Une prise de décision adaptée nécessite ainsi un équilibre entre les comportements d’exploitation (utilisation des connaissances acquises) et d’exploration (recherche d’options plus favorables) qui peuvent être fidèlement modélisés chez le rat afin d’en établir les bases neurales. Le projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent une prise de décision adaptée dans un environnement changeant chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de voies connues pour être impliquées dans la prise de décision mais dont le role précis n’est pas encore décrit. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre les différentes régions, puis nous testerons leur implication fonctionnelle en procédant à des déconnexions réversibles, afin de déterminer leur rôle précis.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de préciser la connectivité des voies impliquées dans la prise de décision ainsi que de préciser le rôle d’une population neurone de cette voie. Une hypothèse majeure actuelle est que la prise de décision mal adaptive qui caractérise un grand nombre de pathologies mentales (par exemple la schizophrénie) est associée à un syndrome de dysconnectivité de ces régions, ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une tâche comportementale dont les sessions durent entre 20mn et 1h15 par jour pour une durée maximale de 4 mois. Ils seront soumis également à un rationnement alimentaire léger (permettant de conserver 90-95% de leur poids initial) qui durera maximum 3 mois. Les animaux des procédures 2-4 subiront une chirurgie d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation à demeure d’électrodes d’enregistrements et d'une fibre de verre très fine d’une durée maximale de 6 heures.
Impact sur les animaux
Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en régime alimentaire spécifique (90 à 95% de maintien du poids), ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire).
Devenir
Procédure 1 : les animaux pourront être adoptés à l'issue de la procédure et suivant l'avis vétérinaire Procédure 2 à 4 : les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures pour prélèvement biologique
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce projet. En effet, ce projet combine une étude du comportement chez le rat pendant une tâche comportementale faisant intervenir des formes de prise de décision complexes et des enregistrements simultanés de plusieurs aires cérébrales. Il est à ce jour impossible de mimer des comportements aussi complexes impliquant le traitement d’informations fluctuantes dans aucun modèle vivant complexe tels que les organoïdes qui de plus ne sont pas encore assez aboutis pour reproduire les connexions entre les différentes aires cérébrales.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit grâce à l’utilisation de tests statistiques qui permettent de prendre en compte à la fois les mesures répétées sur le même animal et les mesures effectuées entre les animaux. Ces tests puissants permettent d'inclure des animaux même en cas de données manquantes et de réduire le nombre d'animaux grâce aux mesures répétées.
Raffinement
Le haut niveau de complexité des chirurgies effectuées sur ces animaux permet de générer un grand nombre de données par animal et de maintenir une haute qualité d’enregistrement pendant plusieurs jours consécutifs. Dans ce projet, les enregistrements et modulations optogénétiques seront combinés à une tâche comportementale complexe qui a été validée dans l’équipe de notre collaborateur ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux. Dans la grande majorité des études, les animaux implantés sont isolés pour protéger les implants. Or, l’isolement représente un stress majeur pour les rats. Nos étapes d’acclimatation et d’isolement ont donc été raffinées afin de limiter le stress des animaux, et ceci nous permet de maintenir les animaux au minimum par deux. Enfin, la prise en charge de la douleur pendant la chirurgie et en post-chirurgie est optimisée pour que les animaux ne ressentent aucune douleur et une habituation lente et progressive est effectuée afin de réduire au maximum le stress de l’animal. Des points limites clairs et objectifs ont été définis afin de limiter au maximum toute souffrance.
Choix des espèces
D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille entre individus.
Prélèvements « invasifs » en routine pour la caractérisation génétique d’une lignée de souris transgénique d’un récepteur impliqué dans la régulation du poids corporel
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Créer et entretenir une lignée de souris porteuses d'une mutation humaine liée à l'obésité et au diabète de type 2, telle est la seule finalité déclarée de cette première phase. 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans aucune expérience métabolique à ce stade. Chaque souriceau subit entre le septième et le dixième jour la section d'un millimètre de queue sous anesthésie locale, pour le seul génotypage, et se trouve séparé de sa mère quelques minutes. Le champ réglementaire ne déclare aucun animal gardé vivant, alors que le texte annonce des reproducteurs conservés pour la lignée et des descendants triés par sexe et génotype pour alimenter les expériences suivantes.
Objectifs
L’obésité affecte une personne sur 8 dans la population mondiale et constitue un facteur de risque majeur pour plusieurs comorbidités, en particulier le diabète de type 2. Au Mexique, les taux d’obésité sont particulièrement élevés, quel que soit l’âge. Une mutation spécifique d'un gène impliqué dans la régulation de l'appétit, retrouvée uniquement chez les personnes d’origine mexicaine et présente chez environ 1 % de cette population, a été identifiée comme un facteur génétique important favorisant l’obésité et le diabète de type 2. Cette première phase du projet vise à établir une lignée de souris mimant une mutation humaine impliquée dans la satiété, l'obésité et le diabète de type 2. L'objectif direct ici est donc de générer et caractériser génétiquement la lignée de souris afin de disposer d'animaux correctement identifiés. Cette phase conditionne la production d'animaux d'intérêt pour les futures analyses métaboliques et comportementales à venir. Elle constitue donc un prérequis essentiel à la réalisation des objectifs scientifiques du projet global.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étape sont (1) la constitution d’une colonie reproductrice, comportant les trois génotypes d’intérêt et (2) la caractérisation génétique complète des animaux produits, permettant une gestion optimisée des élevages. Ces souris serviront à mieux comprendre le lien entre gènes, obésité et diabète, et à explorer les mécanismes biologiques qui influencent la régulation du poids et de la satiété. A terme, ces travaux contribueront à améliorer les connaissances scientifiques sur les causes génétiques de l'obésité et à mieux cibler les stratégies de prévention et traitement.
Procédures
Toutes les souris seront soumises à une procédure invasive consistant en un prélèvement tissulaire caudal réalisé entre J7 et J10 sous anesthésie locale dans le but exclusif du génotypage. Aucune autre intervention, traitement ou manipulation n’est prévue dans le cadre de cette procédure. Les reproducteurs seront ensuite uniquement utilisés pour la reproduction, tandis que les descendants génotypés seront orientés vers les futurs groupes expérimentaux.
Impact sur les animaux
- section d’1 mm de l’extrémité de la queue entre J7 et J10 - séparation transitoire (quelques minutes) de la portée et de la mère
Devenir
Les reproducteurs seront maintenus pour assurer la continuité et la gestion de la lignée, les descendants génotypés seront répartis selon leur sexe et leur génotype afin d’être utilisés dans des projets expérimentaux ultérieures.
Remplacement
L’étude des effets de cette mutation spécifique d'un gène impliqué dans la régulation de l'appétit nécessite un modèle vivant capable de reproduire l’ensemble des interactions entre le métabolisme, le comportement, l’inflammation et le système hormonal. À ce jour, aucune méthode sur cellules, organoïdes ou modèle informatique ne permet de recréer ces mécanismes complexes de façon réaliste. L’utilisation d’un modèle murin est donc essentielle pour comprendre ces processus dans leur globalité, et la gestion de cette lignée vise à disposer d’animaux fiablement caractérisés sur le plan génétique pour les futures études expérimentales.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires aux phases expérimentales futures a été estimé à l’aide d’un logiciel de calcul statistique adapté aux élevages de lignées transgéniques, en tenant compte des futurs groupes expérimentaux (3 génotypes, 2 sexes, 3 régimes alimentaires et 3 stades d’âge). Le calcul prédictif indique qu'un effectif de 11 animaux par groupe expérimental est suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives sur les paramètres étudiés. Cette phase du projet concerne uniquement la mise en place et la gestion de la colonie de souris nécessaires aux futures études. L’inclusion systématique des deux sexes permet d’éviter de dupliquer les expérimentations, et la répartition des tests sur les mêmes individus maximise la quantité de données collectées par animal, tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés.
Raffinement
À leur arrivée, les souris parentes auront deux semaines pour s’habituer à leur nouvel environnement avant le début des accouplements. Elles seront hébergées dans des cages confortables et ventilées, dans une animalerie maintenant des conditions stables de température et d’humidité. Les accouplements se feront en duo (un mâle et une femelle par cage). Les femelles gestantes resteront hébergées dans les mêmes conditions, avec une attention particulière pendant la gestation et la lactation. Les manipulations seront limitées au strict nécessaire pour ne pas perturber les mères. Après le sevrage, les jeunes souris seront hébergées en petits groupes de quatre par cage, avec différents éléments d’enrichissement (matériel pour faire des nids, abris, tunnels, morceaux de bois à ronger) afin de favoriser leur bien-être et leurs comportements naturels. L’état et le comportement des animaux seront observés chaque jour grâce à une grille de suivi validée dans l’établissement, permettant de repérer rapidement tout signe de malaise ou de souffrance.
Choix des espèces
Ce projet nécessite la génération et la gestion d’un modèle murin génétiquement modifié porteur d'une susceptibilité à l'obésité. La souris constitue l’espèce modèle de référence pour ce type d’approche, en raison de sa facilité de reproduction, de la disponibilité d’outils génétiques adaptés et à la validation internationale des protocoles métaboliques et comportementaux. Les adultes reproducteurs seront utilisés à maturité sexuelle (6-7 semaine d’âge) pour réaliser les accouplements nécessaires à la production des portées expérimentales tout au long du projet. Les souris seront génotypées entre J7 -J10 à partir d’un prélèvement caudal, puis sevrées à J21.
Empathy
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
68 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de tissus cérébraux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le régime riche en graisses court sur toute la durée de l'expérience, avec des manipulations quotidiennes de cinq minutes et des incisions de la queue pour les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, cinq prélèvements par test après six heures de jeûne. Le protocole couvre la gestation et la lactation, l'objectif déclaré étant de mieux comprendre l'anorexie et la boulimie chez l'être humain, sans qu'aucun mécanisme précis ne soit avancé. Sur le remplacement, le porteur se contente d'écrire que la souris est "l'espèce de choix" pour étudier le système nerveux des vertébrés et que le protocole "nécessite l'utilisation d'animaux", tandis que sa rubrique raffinement décrit des chirurgies sous anesthésie que le reste du résumé ne mentionne nulle part.
Objectifs
Ce projet cherche à mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire, comme l’anorexie ou la boulimie. À l’aide d’un modèle de souris, on souhaite étudier comment l’alimentation et le stress influencent le poids et le comportement durant la gestation et la lactation et ensuite à l'age adulte. L’objectif est de trouver de nouvelles pistes pour dépister plus tôt ces troubles et mieux accompagner les personnes à risque.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’acquérir de nouvelles connaissances sur les causes des troubles du comportement alimentaire (TCA) et leurs mécanismes sous-jacents. En offrant une meilleure compréhension de la manière dont ces troubles affectent les individus, ce projet ambitionne d'identifier de nouvelles cibles pour des diagnostics potentiels et éventuellement des interventions efficaces pour réduire les symptômes de la maladie et sa prévalence chez les personnes à risque.
Procédures
les régimes riches en graisses (« high fat diet ») pendant toute la durée de l'expérience. Manipulations quotidiennes (pesées, observations cliniques) 5min par animal tous les jours. Incisions de la queue pour collecter une goutte de sang et injection pour le test de tolérance au glucose et insuline: Mesurer la glycémie à 0, 15, 30, 60 et 120 minutes après injection grâce à un lecteur de glycémie, par prélèvement d’une goutte de sang à l’extrémité de la queue 1–5 µL de sang suffisent (une goutte à chaque mesure). Jeûne de 6 h (début tôt le matin pour limiter le stress).
Impact sur les animaux
les régimes riches en graisses (« high fat diet ») modifient le poids, le métabolisme et même certains comportements. lStress de la mise à jeun 6h, La douleur au point de piqure pour prelever une goutte de sang
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure expérimentale. Cette étape est indispensable afin de pouvoir prélever les tissus cérébraux nécessaires aux analyses scientifiques prévues dans ce projet. Ces analyses biologiques ne peuvent pas être réalisées autrement et sont essentielles pour répondre aux objectifs de recherche
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Afin de vérifier ce concept dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures concrètes ont été mises en place : Utilisation des deux sexes Tous les animaux produits, qu’ils soient mâles ou femelles, seront inclus dans les expériences. Cela permet d’éviter un gaspillage d’animaux et d’améliorer la représentativité biologique des résultats. Fondement expérimental solide Le projet s’appuie sur des données pilotes et sur l’expertise acquise au cours d’expériences précédentes. Ces éléments permettent de cibler précisément le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à l’hypothèse, en évitant les répétitions inutiles. Calcul statistique rigoureux Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une estimation de la variance observée dans ce type de données, afin de garantir une puissance statistique suffisante tout en évitant la sur-utilisation. Analyses statistiques optimisées L’utilisation de tests statistiques appariés permettra de réduire la variabilité interindividuelle et donc de diminuer le nombre total d’animaux nécessaires pour atteindre une conclusion robuste.
Raffinement
À chaque étape du projet, le bien-être des animaux sera une priorité. Conditions d’hébergement Les animaux naîtront et seront hébergés dans une animalerie à haut statut sanitaire. Ils seront maintenus en cages collectives ventilées, avec litière adaptée favorisant le fouissage. Des enrichissements seront systématiquement fournis : nids végétaux, tubes en carton, matériaux manipulables, afin de permettre l’expression de comportements naturels (construction de nids, exploration, jeu, rongement). Soins et suivi quotidien L’entretien et la surveillance seront assurés par un personnel qualifié et expérimenté. Un suivi quotidien standard est assuré, renforcé lors des périodes sensibles (ex. récupération après intervention). Procédures et gestion de la douleur Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale adaptée, avec administration systématique d’analgésiques validés par le vétérinaire référent. Les expérimentateurs impliqués disposent d’une solide expérience, garantissant des procédures maîtrisées et rapides, réduisant ainsi le stress et la douleur. Points limites et mesures correctives Des critères d’arrêt précoces sont définis pour détecter toute souffrance non compatible avec le projet. Des mesures de soutien seront appliquées dès les premiers signes d’altération de l’état général : réhydratation, maintien au chaud, nourriture enrichie ou pâte molle. Si nécessaire, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié de façon éthique, afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Pour atteintre l'ojectif du projet, il est nécessaire d’étudier l’évolution de l’animal de la naissance jusqu’à l’âge adulte : Période néonatale : le cerveau et le métabolisme sont en plein développement. Cette phase est critique pour comprendre l’influence précoce de l’environnement (nutrition, interactions maternelles) sur la vulnérabilité future aux TCA. Sevrage et adolescence : période de transition alimentaire et sociale, essentielle pour analyser comment les régimes (ex. high fat diet) et le stress social influencent la mise en place des circuits neuronaux de la récompense et de la régulation alimentaire. Âge adulte : permet d’évaluer la persistance des effets observés, la stabilisation des comportements alimentaires et l’installation éventuelle de phénotypes pathologiques durables.
Étude du phénotype glycémique en condition de thermoneutralité environnementale dans des modèles murins sain et obèse-diabétique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
309 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant par cinq séances de suivi glycémique. Une séance, c'est six heures de jeûne puis une incision au bout de la queue et un prélèvement de sang toutes les quinze minutes pendant deux heures. La moitié des souris reçoit dès dix semaines un régime riche en graisses qui les rend obèses et diabétiques jusqu'à la fin des expériences, avec une dégradation dentaire attendue, et le suivi métabolique impose l'isolement de chaque souris en cage individuelle. Le porteur fonde tout le projet sur le constat que l'hébergement réglementaire à 22 °C soumet les souris à un stress thermique chronique, et présente l'hébergement à 28-30 °C comme un raffinement pour des animaux qu'il rend par ailleurs malades.
Objectifs
Le changement climatique représente une menace croissante pour la santé humaine. Parmi ses conséquences les plus dangereuses figure la chaleur extrême, qui affecte particulièrement les patients atteints de maladies chroniques comme le diabète. Plusieurs études associent les vagues de chaleur à une augmentation des hospitalisations et de la mortalité chez les patients avec un diabète. Il reste néanmoins à déterminer si ces effets sont directement liés à la température et à mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués. Pour cela, nous souhaitons développer un modèle pertinent qui permettra d'étudier l’impact de la chaleur sur la régulation de la glycémie. Chez la souris, mammifère endotherme, la zone de thermoneutralité se situe autour de 28-30°C. Or, en laboratoire, les souris sont hébergées à 22 ± 2°C, ce qui induit un stress thermique chronique pouvant modifier leur métabolisme. Cette situation soulève des questions quant à la validité des modèles expérimentaux et leur transposabilité à l’homme. La régulation de l'équilibre glycémique étant sensible au stress, il est contre-intuitif de l’étudier chez des animaux en stress thermique. Or, peu d'études ont évalué l'effet de la température ambiante sur la glycémie, et leurs résultats sont souvent contradictoires. De plus, la notion de thermoneutralité est rarement prise en compte, et les études se concentrent généralement sur les régulations périphériques, négligeant les mécanismes cérébraux. Notre projet vise à étudier l’impact de la thermoneutralité sur la régulation de la glycémie et à identifier les mécanismes impliqués, en particulier ceux d’origine cérébrale. Dans ce contexte, une région du cerveau, l’hypothalamus, est un important organe régulateur des fonctions corporelles, notamment de la température corporelle, du sommeil et de l’appétit. Il semble donc représenter un acteur crucial reliant la température et l'équilibre glycémique, qui est important à étudier.
Bénéfices attendus
Les études réalisées sur la régulation cérébrale de l’équilibre glycémique, en contextes sain et pathologique, sont souvent menées à des températures d’hébergement qui induisent un stress thermique chez les souris, ce qui peut affecter leur physiologie et, par conséquent, la fiabilité des résultats et leur impact translationnel. Le nombre d’études conduites sur les souris à thermoneutralité est très limité. Ainsi, la caractérisation de l’homéostasie du glucose ainsi que des circuits neuroanatomiques dans un contexte de thermoneutralité est nécessaire. Cette étude va donc nous permettre de déterminer l’impact de la thermoneutralité et l’enjeu de la thermorégulation sur l’homéostasie glucidique. En outre, le présent projet propose d’étudier, à différentes échelles, l’impact d'un hébergement à thermoneutralité sur les mécanismes impliqués dans la physio-pathologie d’obésité/diabète, chez le modèle murin. Ces recherches apparaissent cruciales dans la lutte contre la pandémie croissante de diabète que nous connaissons à l’heure actuelle. Notre compréhension des enjeux sanitaires prenant en compte les facteurs environnementaux tels que la température, ouvrira la voie à des solutions innovantes dans l’adaptation à notre environnement et le traitement de ces maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis à divers types d'expérimentations et de prélèvements soit en condition vigile, soit sous anesthésie. - Afin d’évaluer la régulation de la glycémie chez des animaux soumis à une température environnementale correspondant à leur thermoneutralité, les souris seront placées en armoire ventilée et soumises à des cycles de température inclus dans la zone de thermoneutralité (27 à 31°C) et comparées aux animaux hébergés à la température règlementaire durant la période d’expérimentation. - Afin de comparer l'effet de la température environnementale chez des animaux sains et obèses diabétiques, les souris seront divisées en 2 lots, l’un soumis à un régime alimentaire standard et le second soumis à un régime riche en graisse (High Fat Diet) dès l’âge de 10 semaines jusqu’à la fin des expériences. -Afin de suivre la glycémie, les animaux seront mis à jeun pendant 6 heures de leur phase inactive, pour subir ensuite des prélèvements sanguins de 4μL à l'extrémité de la queue toutes les 15 minutes pendant 2 heures, soit un volume total de l'ordre de 40 μL par expérience ; Les expérimentations sont répétées 5 fois en respectant une semaine de repos minimum entre chacune d'entre elles. - Afin d'évaluer l'impact de la température d'hébergement sur le comportement anxieux chez la souris vigile, les animaux soumis aux différentes conditions d'hébergement, subiront un test permettant d'évaluer leur comportement exploratoire dans un environnement inconnu. Le test consiste à une heure d’habituation dans la pièce d’expérimentation et 5 minutes d’observation du comportement de la souris libre à explorer le nouvel environnement – chaque souris subira ce test une seule fois. - Afin de prélever des tissus à l'issue des tests physiologiques, les animaux seront profondément anesthésiés afin de réaliser une chirurgie sans réveil d'une durée de 15 minutes.
Impact sur les animaux
- Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chronique chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce régime riche en lipides, à température ambiante et à thermoneutralité peut entrainer une détérioration de la santé dentaire des souris, sévérité modérée. - La mise à jeun de 6 heures avant chaque test physiologique peut entrainer une perte de poids, sévérité légère. - Le prélèvement sanguin pour le suivi de la glycémie, par incision de l’extrémité de la queue peut entrainer une douleur légère et de courte durée à l’incision, ainsi qu'une légère perte de sang, sévérité légère. - Le suivi métabolique implique l’hébergement individuel des animaux à 1 animal/cage inhérent à ce suivi, sévérité modérée. - L’injection intra-péritonéale de diverses molécules pour la caractérisation du profil glycémique, durant les procédures peut entrainer une douleur légère et de courte durée à l’injection, sévérité légère. - Le test de comportement utilisé pour évaluer le comportement anxiogène chez la souris, peut entrainer un stress, et un risque de chute de la plateforme associé à une blessure, sévérité légère.
Devenir
A l'issue des procédures, les souris seront mises à mort dont la majorité sera utilisée pour des analyses post-mortems. Le prélèvement des organes post-mortem, notamment le cerveau, servira pour la caractérisation de l'anatomie cérébrale ou de pour des études moléculaires, ainsi que les mécanismes cellulaires d'intérêt.
Remplacement
Afin de mieux comprendre la relation complexe entre la température et le diabète, en particulier dans un contexte où les enjeux climatiques s’exacerbent, il est essentiel d’étudier cette interaction dans un cadre physiologique chez la souris. Cette approche permet d’explorer les mécanismes interconnectés de la thermorégulation et du maintien de l’homéostasie glucidique. Pour mieux élucider ces effets, un réseau de neurones de l’hypothalamus, connu pour réguler à la fois la température corporelle et la glycémie, est particulièrement interessant. La caractérisation des altérations neuroanatomiques et du fonctionnement des réseaux formés par ces neurones en réponse aux variations thermiques environnementales, nécessite l’utilisation d’un modèle in vivo intégré. Il est indispensable d’étudier la communication entre le système nerveux et les systèmes périphériques de l’organisme afin de comprendre l’influence du premier sur le second dans différents scenarii climatiques. La physiologie de la souris étant proche de celle de l’Homme, ce modèle animal constitue une étape clé pour la recherche translationnelle. Les innovations thérapeutiques pourront potentiellement être développées sur la base de ces nouvelles connaissances et applicables à l’Homme à l’avenir. À ce jour, il n’existe aucune alternative non-animale permettant d’étudier ces interactions de manière complète.
Réduction
Dans un objectif de réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous avons entrepris une planification expérimentale en amont et avons réalisé des estimations de puissance statistique, associées à une estimation pour chaque expérience du nombre d’animaux nécessaires par groupe. Ceci permet de réduire au plus le nombre d’animaux utilisés, tout en s’assurant d’avoir la puissance statistique nécessaire à nos tests. En outre, cela permet d’éviter le double emploi et la réplication d’expériences. Les tests statistiques envisagés seront adaptés en fonction du nombre de groupes et du design expérimental ainsi que des conditions de normalité et d’homoscédasticité des données. Le design de nos expérimentations prévoit, quand cela est possible (différents tests physiologiques par exemple), qu’une souris subisse successivement différents tests, réduisant de ce fait de façon significative le nombre de groupe d’animaux nécessaires.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse éventuelle des animaux. De fait, l’hébergement des souris à une température dans la zone de thermoneutralité est susceptible d’éliminer le stress thermique métabolique qu’elles subissent à température règlementaire. Les animaux seront maintenus à un minimum de trois par cage pour éviter tout isolement social et leur hébergement sera pourvu de matériel pour la nidification et d'un tube de plastique rouge leur fournissant un abri. Pour éviter la dégradation des croquettes riches en lipides par la chaleur à thermoneutralité, les croquettes seront remplacées toutes les 48 heures. Pour éviter d'induire un stress par choc thermique en sortant les animaux de l'armoire chauffante, les souris seront placées dans des cages d'expérimentation chauffées, qui assurent une température stable dans la zone de thermoneutralité pendant les procédures experimentales. De plus, l’état général des animaux sera quotidiennement évalué et les signes de mal-être seront surveillés attentivement, selon les points limites préalablement définis selon les recommandations pour le bien-être animal. Si un signe de mal-être ou une combinaison de signes apparaît, le suivi de l'animal sera renforcé et les soins adéquats seront apportés. Si l'état de l'animal s'aggrave dans les heures qui suivent ou ne s'améliore pas dans les 24-48 heures, il sera considéré qu'un niveau de souffrance intolérable est atteint et la mise à mort sera réalisée par élongation cervicale après anesthésie. L’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie/analgésie (locale ou générale). Il sera prévu, pour les animaux devant subir plusieurs tests au cours d'une même procédure, une période de rétablissement minimum d’une semaine entre chaque test, leur permettant une stabilisation de leur poids corporel et la reconstitution initiale de leur volume sanguin après prélèvement. Pour les souris sous régime riche en graisse, le suivi du poids est réalisé toutes les 2 semaines pour la surveillance de leur bien-être et l’intervention en cas d’atteinte d’un point limite.
Choix des espèces
Afin de caractériser les mécanismes de régulation centrale de la glycémie chez la souris à thermoneutralité, il est nécessaire d’adopter une approche intégrative permettant une compréhension globale d’un système physiologique complexe. Seule l’utilisation d’un modèle mammifère in vivo nous permettra d’étudier la physiopathologie de l’obésité et du diabète ainsi que leur interaction avec la thermorégulation et le maintien de la température corporelle. La souris constitue un modèle privilégié en raison de sa physiologie proche de celle de l’Homme, favorisant une recherche translationnelle dont les innovations thérapeutiques pourraient être appliquées en clinique humaine. La souris présente également de nombreux avantages pour l’élevage en animalerie : notamment taille et coût d’entretien réduits. Il s’agit d’un modèle animal largement utilisé pour les études physiopathologiques permettant une comparaison aisée de nos données avec celles d’autres équipes. De plus, la souris offre des possibilités uniques d’approches génétiques et phénotypiques complexes n’existant pas chez d’autres modèles mammifères. Au cours de cette étude, la physiologie chez l’adulte sera étudiée. Les souris seront donc âgées d’au moins 8 semaines lors des expérimentations.
Effets de l’acide valproïque sur la reproduction chez l’animal épileptique – Etude pilote MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souris d'une souche non consanguine, choisies pour leur variabilité génétique, vont être rendues épileptiques à vie par injections répétées d'un agent convulsivant. 448 souris vont être utilisées au total, 96 femelles et 352 descendants, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'état convulsif recherché dure au moins trente minutes, avec des contractions musculaires involontaires douloureuses, et le porteur attend une mortalité de 30 à 50 % par arrêt cardio-respiratoire à cette seule étape. Les survivantes boivent ensuite de l'acide valproïque dilué dans leur eau pendant deux à huit semaines, sont mises à la reproduction, et leurs filles reçoivent deux injections d'hormones pour la récupération d'ovocytes, avant que toutes soient tuées pour prélèvement d'organes.
Objectifs
Les médicaments antiépileptiques représentent un enjeu majeur dans la recherche pour la santé publique. L’épilepsie affecte plus de 60 millions de personnes dans le monde. De nombreuses études ont montré le risque de provoquer des malformations chez l’embryon au cours de son développement de certains traitements antiépileptiques. Cependant beaucoup de femmes atteintes d’épilepsie continuent d’être traitées au cours de leur grossesse et allaitement. En plus du risque de malformations au cours du développement, l’acide valproïque, un traitement antiépileptique largement prescrit ces cinquante dernières années, a montré des effets secondaires persistant sur plusieurs générations chez des rongeurs. Ces études ont utilisé des animaux non atteints d’épilepsie, de plus le traitement antiépileptique n’a été administré que sur de courtes périodes. Pour rendre compte de la réalité clinique, il est nécessaire de tester chez des animaux atteints d’épilepsie les effets secondaires sur plusieurs générations de l’acide valproïque et autres traitements sur une longue période, et ainsi montrer que l’exposition aux antiépileptiques peut être un facteur de risque chez l’Homme. Cette étude pilote a pour but, dans un premier temps, de tester la possibilité d’induire une épilepsie chez une souche de souris non consanguine (souris générées par des croisements d’animaux non apparentés) ainsi que de s’assurer de la capacité de ces animaux à se reproduire. Utiliser une souche de souris non consanguine permet de se rapprocher au mieux de la réalité chez l’homme (forte variabilité génétique contrairement aux souches de souris consanguines) afin d’évaluer de potentiels facteurs de risque. Dans un second temps, l’objectif de cette étude pilote est de déterminer une concentration optimale d’acide valproïque qui permette de se rapprocher au mieux de la concentration thérapeutique utilisée chez les patients et qui n’empêche ni la reproduction des animaux épileptiques traités, ni la viabilité des portées engendrées par ces animaux. Valider les étapes expérimentales de cette étude pilote supporterait la mise en œuvre d’un projet dont l’objectif est de déterminer dans quelle mesure les médicaments antiépileptiques affectent les descendances (au moins sur trois générations) de souris femelles épileptiques exposées à ces traitements. Ces objectifs de recherche dans le traitement de l’épilepsie se placent dans un cadre de santé publique.
Bénéfices attendus
En validant la possibilité d’induire un modèle d’épilepsie chez des souris femelles et de reproduire ces animaux traités à l’acide valproïque, cette étude pilote permettra à plus long terme de mieux comprendre les effets observés sur plusieurs générations des médicaments antiépileptiques. Démontrer le facteur de risque pour l’Homme que représentent les antiépileptiques aidera à améliorer les traitements de l’épilepsie ainsi que de limiter les effets secondaires sur les futures générations.
Procédures
Les animaux seront soumis à un traitement à un agent épileptogène qui permet le développement d'une épilepsie qui perdure à vie. Ce traitement est injecté à plusieurs reprises si nécessaire. Une première dose est injectée 30 minutes après l’administration d’un médicament protégeant des effets secondaires de ce traitement. Si au cours des 20 minutes suivant cette injection l’animal ne présente pas d’état convulsif, alors une seconde dose, plus faible, est injectée. Si aucun état convulsif n’est observé chez l’animal 10 minutes après cette seconde dose, alors une dose encore plus faible est administrée de façon répétée (toutes les 10 minutes) jusqu'à apparition d'un état convulsif. L’état convulsif doit durer au minimum 30 minutes pour qu’une souris soit considérée en épilepsie chronique. Passé ce délai, un anticonvulsivant est administré à l’animal. Ces animaux ingéreront un traitement antiépileptique directement dilué dans leur eau pour une durée minimum de deux semaines pouvant aller jusqu’à 8 semaines. MODIFICATION – Les femelles issues des portées recevront à 6-8 semaines 2 injections d’hormones espacées de 48heures.
Impact sur les animaux
Plusieurs effets indésirables sont attendus durant l’induction de l’épilepsie. Pour induire cette épilepsie il est nécessaire de déclencher un état convulsif chez les souris naïves. Pour obtenir cet état convulsif, les animaux subissent des injections répétées d’un agent épileptogène qui peuvent induire un stress au cours de la contention de l’animal. L’état convulsif dure au minimum 30 minutes au cours desquelles les animaux peuvent ressentir des douleurs dues aux contractions musculaires involontaires. Une perte de poids peut subvenir mais elle se rattrape dès le deuxième/troisième jour suivant l’induction de l’épilepsie. Au cours de cette procédure une mortalité de 30 à 50% est attendue due aux effets secondaires de l’agent épileptogène injecté (arrêts cardio-respiratoires). L'ajout du traitement antiépileptique dans l'eau des boissons des animaux pourrait avoir des effets indésirables sur les animaux tels qu'une diminution dans la prise d'eau et perte de poids. Ces effets seront surveillés afin de ne pas dépasser de points limites. Les effets de l’épilepsie et du traitement à l’acide valproïque étant inconnus sur le comportement de reproduction des femelles, des nuisances pourraient être occasionnées par celles-ci sur leurs portées telles qu’un manque de soin (peu ou pas d’allaitement) ou des blessures physiques. Également, durant les périodes de gestation, des complications pourraient survenir engendrant un état de stress et de douleur (contractions prolongées, terme de mise-bas dépassé). MODIFICATION – Les deux injections d’hormones pour stimuler l’ovulation et récupérer les ovocytes chez les femelles des portées peut engendrer un stress à la suite de la contention et une légère douleur à l’introduction de l’aiguille. A la fin de l’étude ou dans le cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront transférés dans une cuve d'induction afin de les anesthésier avant euthanasie. Cette manipulation peut engendrer un stress chez l'animal avant d'être complètement anesthésié.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Au cours de cette étude pilote, il sera développé et utilisé un modèle d’épilepsie chez la souris reproduisant de nombreuses caractéristiques de la pathologie observées chez l’Homme (affects cognitifs et comportementaux). L’épilepsie est une pathologie dont l’origine est localisée dans le cerveau, qui est un organe contrôlant l’ensemble des fonctions de l’organisme. De ce fait, les effets recherchés du traitement antiépileptique nécessitent l’accès à l’organisme entier (étude du comportement de reproduction, atteintes anatomiques sur les portées générées), ce qui n’est pas compatible avec des méthodes alternatives à l’expérimentation animale telles que la modélisation informatique ou bien les expériences in vitro. De plus, il est compliqué d’étudier les conséquences d’un traitement sur plusieurs générations chez un modèle humain. C’est pourquoi le modèle animal se retrouve nécessaire pour mener ce projet de recherche dont le but est de mieux comprendre les effets secondaires transgénérationnels, potentiellement dangereux pour la santé, des antiépileptiques.
Réduction
Le caractère méconnu des mécanismes cérébraux de l’épilepsie ne permet pas de calculer un nombre précis d’animaux pour les différentes procédures de cette étude pilote. L’induction de l’épilepsie peut engendrer une mortalité de 30 à 50% chez les animaux. Compte tenu de la variabilité biologique inter-individuelle, du comportement de reproduction inconnu chez les souris épileptique et de ce taux de mortalité, le nombre d’animaux a été optimisé à 448 souris CD-1 (96 femelles et une estimation de 352 souris générées par reproduction d’une partie de ces souris) pour permettre d’obtenir les observations nécessaires à cette étude, tout en réduisant au minimum le nombre d’animaux. L’organisation des animaux en différents lots permettra dans le cas d’un taux de mortalité plus faible que prévu de ne pas avoir recours au nombre total d’animaux estimé pour cette étude. Les souris femelles seront utilisées pour l’ensemble des procédures.
Raffinement
Au cours de cette étude pilote, des points limites suffisamment précoces et adaptés pour chaque procédure (induction épilepsie et traitement antiepileptique) seront mis en place pour réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse chez les animaux durant les manipulations ainsi qu’en dehors de ces périodes. Les animaux seront suivis quotidiennement jusqu’à leur mort. Leur poids ainsi que différentes variables, regroupées sur des fiches de suivi, seront surveillés afin de pallier quelconques signes de douleur ou de souffrance. Selon les observations, un protocole prévoit une action curative pouvant impliquer l’utilisation de médications pour soulager rapidement la douleur. L’induction de l’épilepsie chez les souris nécessite l’injection répétée de substance épileptogène. Le comportement de chaque souris sera surveillé entre chaque injection et permettra de prendre la décision de réinjecter ou non chaque animal individuellement. Ce protocole individualisé permet de réduire le temps de souffrance que les souris peuvent subir jusqu’à l’apparition d’une épilepsie chronique et accélère leur rétablissement. La semaine suivant l’induction de l’épilepsie, les animaux seront observés deux fois par jour pour s’assurer de leur bonne récupération, surtout dans la perte de poids qui peut survenir les 2 premiers jours. Des croquettes ramollies dans de l’eau avec du sucre seront placées dans les cages afin de réduire la perte de poids et faciliter la convalescence. Au cours du début du traitement antiépileptique, une attention particulière sera portée sur l’abreuvement des animaux. Si le traitement présente un caractère trop aversif et provoque des déshydrations trop importantes, celui-ci sera interrompu. Après accouplement, les femelles seront surveillées 2 fois par jour au cours de la dernière semaine de gestation afin de s’assurer que la mise-bas se déroule correctement. Les portées générées seront également surveillées et pesées quotidiennement afin de s’assurer de leur bonne croissance jusqu’au sevrage. Une attention particulière sera portée sur le comportement des mères envers leurs portées pour s’assurer que les souriceaux sont bien allaités et ne subissent pas de violences physiques. Le bien-être des animaux est également privilégié au niveau de leurs conditions d’hébergement. Ils seront regroupés par 2 jusqu’à 4 selon la taille des cages. Des études montrent que les animaux épileptiques présentent des crises moins sévères lorsqu’ils sont hébergés en groupe.
Choix des espèces
De nombreuses études ont montré la similarité des régions cérébrales impliquées dans l’épilepsie entre l’Homme et les rongeurs (rats et souris). Cette similarité permettra de mieux extrapoler les résultats de notre étude aux mécanismes pathologiques chez l’Homme. Des souris d’au minimum 6 semaines seront utilisées, cet âge correspondant à la maturité sexuelle nécessaire pour la reproduction. Les portées générées seront conservées jusqu’au sevrage (21jours après la parturition) pour étudier leur croissance.
Évaluation des effets anticonvulsivants des dérivés de l’ibogaïne chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une crise convulsive généralisée qui dépasse quatre minutes entraîne le retrait immédiat de l'animal et sa mise à mort sans délai. 220 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à la fin de l'expérience. Elles reçoivent jusqu'à trois injections successives à dix minutes d'intervalle, dont celle d'un agent chimique déclenchant les convulsions, puis sont observées trente minutes seules dans un cylindre de plexiglas de trente centimètres, un autre groupe recevant une injection quotidienne pendant quatorze jours. Le projet évalue le pouvoir anticonvulsivant de trois dérivés de l'ibogaïne à trois doses, le porteur écrivant que le recours aux modèles animaux "demeure incontournable" et qu'une partie complémentaire du travail est menée aux États-Unis sur cultures cellulaires.
Objectifs
L’épilepsie est une affection neurologique chronique, caractérisée par la survenue récurrente et spontanée de crises convulsives, susceptibles d’entraîner des altérations transitoires de la conscience, du comportement, ou du fonctionnement moteur et sensoriel. Cette pathologie, qui touche environ 1 % de la population générale, constitue un enjeu majeur de santé publique en raison de son impact fonctionnel, psychosocial et économique. En dépit des avancées thérapeutiques récentes, la prise en charge pharmacologique de l’épilepsie demeure partiellement insatisfaisante. Si les antiépileptiques de dernière génération ont permis d’améliorer la qualité de vie d’un grand nombre de patients, près d’un tiers d’entre eux restent réfractaires aux traitements actuellement disponibles. Cette pharmacorésistance met en évidence les limites de l’arsenal thérapeutique existant, en particulier pour certaines formes d’épilepsie focale résistante ou généralisée sévère. Elle souligne la nécessité impérieuse de développer de nouvelles approches pharmacologiques, fondées sur des mécanismes d’action innovants et sur une compréhension approfondie des circuits neuronaux impliqués dans la genèse et la propagation des crises. L’objectif général de ce projet est d’évaluer le potentiel anticonvulsivant de trois composés pharmacologiquement actifs, appartenant à la classe des dérivés de l’ibogaïne, dans un modèle murin d’épilepsie induite chimiquement. Chacun de ces agents sera testé à trois doses distinctes, en administration aiguë et chronique sur une période de 14 jours, afin d’examiner leur efficacité de manière dose-dépendante. Sur le plan mécanistique, ce projet vise également à déterminer l’implication des récepteurs sérotoninergiques dans les effets anticonvulsivants observés, à l’aide d’antagonistes sélectifs et d’analyses comportementales appropriées. Ces récepteurs, aujourd’hui reconnus comme des cibles émergentes dans la modulation des circuits cortico-limbiques impliqués dans les crises épileptiques, font l’objet d’un intérêt croissant, bien que leur rôle précis reste à clarifier.
Bénéfices attendus
L’épilepsie, troisième maladie neurologique la plus fréquente après la migraine et les démences, affecte environ 60 millions de personnes dans le monde et près de 600 000 en France, dont la moitié sont âgées de moins de 20 ans. Cette pathologie altère gravement la qualité de vie, impacte le développement scolaire et social des jeunes patients, et génère des coûts sociaux et économiques majeurs (soins, hospitalisations, absences professionnelles). Avancées scientifiques attendues: Clarification des mécanismes neuronaux impliqués dans les états convulsifs, notamment l’interaction des réseaux corticaux et limbiques. Validation préclinique de la classe émergente des ibogalogues, avec caractérisation de leur efficacité anticonvulsivante dose-dépendante en administration aiguë et chronique. Identification de la contribution des certains récepteurs sérotoninergiques comme cibles thérapeutiques potentielles, ouvrant la voie à de nouveaux concepts pharmacologiques pour l’épilepsie. Impact clinique et thérapeutique: Possibilité de développer de nouvelles options de traitement accessibles à court ou moyen terme, en particulier pour les patients pharmacorésistants (~30 %). La publication des résultats dans une revue à comité de lecture garantira une diffusion ouverte et immédiate des données, renforçant la transparence scientifique et accélérant la mise en œuvre de recherches complémentaires. Bénéfices à court et long terme: Court terme: données prépubliées valorisables dans d’autres programmes de recherche ou essais cliniques. Moyen/long terme: ces travaux peuvent servir de base à des études translationnelles, ouvrant potentiellement la voie à des essais cliniques et à l’optimisation de traitements personnalisés. Diffusion et accessibilité: Les données issues du projet, non liées à un dépôt de brevet, feront l’objet de publications en accès ouvert, bénéficiant à l’ensemble de la communauté scientifique. Partage des protocoles, scores comportementaux, et résultats à travers des plateformes scientifiques, renforçant la reproductibilité et l’échange de savoirs. Environnement et autres bénéficiaires: En comprenant mieux les mécanismes neuronaux épileptiques, ce projet pourra contribuer à l’avancée des neurosciences et des pharmacothérapies ciblées. Les connaissances acquises pourraient à terme bénéficier à d’autres pathologies neurologiques impliquant des déséquilibres sérotoninergiques ou des circuits neuronaux perturbés.
Procédures
Dans le cadre du traitement aigu, les animaux recevront soit une injection unique du solvant utilisé pour solubiliser les agents pharmacologiques, soit une injection unique de l’un des trois dérivés de l’ibogaïne. Dans un second ensemble expérimental, ces composés seront administrés en association avec l’agent chimique utilisé pour induire les convulsions expérimentale. Dans ce cas, deux injections successives seront réalisées: d’abord celle de l’agent pharmacologique testé, suivie dix minutes plus tard de l’injection de cet agent chimique. Dans un troisième groupe, les composés seront administrés en association avec l’agent chimique et un antagoniste des récepteurs sérotoninergiques. Trois injections seront alors effectuées dans l’ordre suivant: l’agent pharmacologique à tester, l’antagoniste sérotoninergique dix minutes plus tard, puis, dix minutes après l’antagoniste, l’injection de l’agent chimique. Dans le cadre du traitement chronique, les animaux recevront quotidiennement, pendant 14 jours, soit une injection unique du solvant, soit une injection d’un des trois dérivés de l’ibogaïne, à la dose la plus faible testée en aigu. Les animaux seront ensuite soumis à une observation comportementale standardisée visant à évaluer les réponses convulsivantes. Les injections seront réalisées, à l’aide de seringues munies d’aiguilles fines. Les injections dureront moins d’une minute. Un test de convulsion d’une durée de 30 minutes sera réalisé. Aucun prélèvement biologique (sanguin ou tissulaire) ne sera effectué au cours de cette procédure. Tous les animaux seront mis à mort conformément à la procédure réglementaire en vigueur dans l’établissement.
Impact sur les animaux
Parmi les effets indésirables possibles chez les animaux, on peut citer les réactions liées aux injections, en particulier lors du traitement répété. Pour limiter au maximum le stress et l’inconfort, nous utiliserons des aiguilles très fines et une zone d’injection située dans le bas de l’abdomen, reconnue pour être moins douloureuse. Dans le cadre de ce projet, un produit sera administré pour provoquer, de manière contrôlée, des crises chez la souris. Ces crises miment certains mécanismes de l’épilepsie humaine et permettent de tester si les dérivés de l’ibogaïne peuvent les prévenir ou les atténuer. Après les injections, chaque animal sera observé individuellement pendant 30 minutes dans un cylindre en plexiglas (diamètre 30 cm), ouvert sur le dessus pour assurer une bonne aération. Les principales nuisances attendues sont : un stress passager lié aux manipulations et aux injections ; la survenue de crises convulsives de courte durée après l’administration du produit déclenchant ; une période d’observation individuelle de 30 minutes dans le dispositif d’évaluation. Si une crise généralisée venait à se prolonger au-delà de quatre minutes, l’animal serait immédiatement retiré de l’expérience et mis à mort sans délai, conformément aux critères d’acceptabilité éthique, afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Devenir
Il sera procédé immédiatement à la fin de l'expérimentation à la mise à mort de ces animaux selon les méthodes autorisées par la législation.
Remplacement
Aucune alternative non animale ne permet à ce jour d’atteindre les objectifs de notre projet. Les investigations du système nerveux central, impliquant des interactions neuronales complexes et dynamiques, ne peuvent être reproduites ni par cultures cellulaires, ni par modèles informatiques, ni par organoïdes. Les études précliniques existantes, ainsi que les données cliniques disponibles, reposent majoritairement sur des modèles animaux intégrant la pharmacologie, la neurophysiologie et le comportement. Les protocoles prévus utilisent des composés chimiques potentiellement convulsivants induisant des crises épileptiques. Ces crises, réaction globale du cerveau, ne peuvent être modélisées que chez un animal entier. De même, les phénomènes émotionnels et comportementaux associés, comme l’anxiété ou la désorganisation motrice, nécessitent un organisme capable de comportements complexes, ce qu’aucune alternative in vitro ne permet actuellement. En l’absence de méthodes validées alternatives, l’utilisation de modèles animaux validés et scientifiquement pertinents demeure incontournable pour étudier l’épileptogénèse et évaluer les effets de nos molécules sur le comportement dans un environnement physiologique fidèle à la réalité clinique. Par ailleurs, une partie complémentaire du projet sera réalisée par nos collaborateurs aux États-Unis, à l’aide de modèles alternatifs tels que les cultures cellulaires, permettant d’explorer les mécanismes à l’échelle moléculaire. Enfin, bien que les études cliniques ou post-mortem fournissent des informations précieuses, elles ne permettent pas, à elles seules, de caractériser les dynamiques fonctionnelles du cerveau en condition physiologique. Le recours à un modèle animal demeure, dans ce cadre, scientifiquement justifié et nécessaire.
Réduction
Afin de minimiser l’utilisation d’animaux, une analyse de puissance statistique rigoureuse a été réalisée. Le nombre de souris utilisées a été calculé de façon à être le plus faible possible tout en permettant d’obtenir des résultats fiables. Cette approche respecte les bonnes pratiques en biostatistique pour les études animales, qui exigent l’utilisation du nombre minimal d’animaux compatible avec la validité, la fiabilité et la reproductibilité des résultats, conformément aux normes nationales et européennes (Directive 2010/63/UE, ARRIVE). Nous avons déterminé qu’un groupe de 10 animaux par condition sera suffisant. Cela permet de limiter le nombre d’animaux tout en conservant une bonne qualité scientifique
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages conformes aux normes réglementaires en vigueur, au sein d’un environnement contrôlé et enrichi. Celui-ci comprendra notamment des cylindres en carton, afin d’augmenter la complexité de l’habitat et de favoriser l’activité physique. Ce dispositif vise à améliorer le bien‑être animal et à limiter l’apparition de comportements stéréotypés. Une surveillance rigoureuse sera assurée : l’état général, la prise alimentaire, la consommation d’eau, le comportement et le poids corporel feront l’objet d’un suivi quotidien. Avant les expérimentations, une période d’acclimatation sera instaurée pour permettre aux animaux de s’adapter progressivement à leur nouvel environnement. De plus, une phase de manipulation douce (handling) sera réalisée durant 5 à 7 jours consécutifs avant les tests comportementaux. Afin de limiter le stress lié à la capture, les animaux seront manipulés à l’aide de tunnels transparents (plastique ou carton) disposés dans les cages. Cette méthode, moins intrusive que la capture par la queue, permet un transfert volontaire des animaux et contribue à une meilleure qualité des données comportementales. Les cages seront enrichies d’abris, d’objets et de matériaux de nidification pour favoriser l’expression de comportements naturels. Lors de l’expérimentation de convulsions induites chimiquement, les animaux présentant d’emblée des crises généralisées durant plus de 4 minutes seront retirés de l’étude. Si la douleur ou la souffrance dépasse les seuils prédéfinis (critères d’arrêt), la mise à mort de l’animal sera effectuée immédiatement pour interrompre au plus tôt la douleur, la souffrance et l’angoisse. Tous les animaux inclus dans l’expérimentation seront mis à mort à l’issue des 30 minutes d’observation, conformément aux critères d’acceptabilité éthique.
Choix des espèces
L’espèce de souris choisie est particulièrement adaptée: Elle est couramment utilisée dans des modèles où l’on provoque des crises de façon contrôlée par des agents chimiques, ce qui permet d’étudier de nouveaux traitements dans des conditions bien connues et reproductibles.. Elle a une sensibilité modérée et reproductible aux convulsions induites chimiquement, ce qui permet une bonne fenêtre d’observation des effets pharmacologiques. Le métabolisme, la neuroanatomie, ainsi que les réponses comportementales et électrophysiologiques de cette souche ont été largement décrits, facilitant l’interprétation des données expérimentales. C’est une une souche standardisée, robuste, bien tolérante à la manipulation, ce qui permet de limiter les variabilités interindividuelles et de réduire le nombre d’animaux nécessaires selon le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner). Les expériences viseront des souris de jeune âge adulte, âgées de 8 à 16 semaines. Ce stade correspond à une maturité neurophysiologique et comportementale suffisante, indispensable pour évaluer de manière fiables les effets anticonvulsivants des dérivés de l’ibogaïne. A Ce stade, les circuits neuronaux, notamment ceux impliqués dans l’excitabilité corticale et limbique, sont fonctionnellement matures. Cela garantit une réponse reproductible aux agents pro-convulsivants des agents chimiques et une meilleure transposabilité des résultats. La majorité des modèles murins validés pour l’étude des convulsions (modèle chimique aigu ou sensibilisation chronique) recommandent l’utilisation de souris adultes, notamment chez cette souche. Cela permet d’assurer la robustesse des observations comportementales et pharmacologiques, tout en respectant les principes de rigueur scientifique et d’éthique expérimentale.
Rôle du thalamus antérieur dans la consolidation de la mémoire
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Jusqu'à cinq chocs électriques d'une seconde en huit minutes, puis une chirurgie du cerveau d'une heure et demie pour injecter des composés et implanter à demeure une fibre de verre : 528 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour vérification histologique. Des séances de rappel de dix minutes suivent le conditionnement, sans nouveaux chocs. Le projet vise à comprendre comment le thalamus antérieur et le cortex transforment un souvenir récent en souvenir durable. Le porteur qualifie le conditionnement de peur d'aversif par définition tout en écrivant que "toute souffrance sera évitée", au motif que le bien-être des rats conditionne la qualité des données comportementales.
Objectifs
Nous cherchons à comprendre où et comment nos souvenirs sont stockés dans le cerveau. Au début, certaines structures comme l’hippocampe sont essentielles pour se souvenir d’événements ou de faits. Avec le temps, ces souvenirs deviennent autonomes et sont conservés dans le cortex. Le Thalamus antérieur aide à rendre les souvenirs durables en reliant l’hippocampe au cortex, qui stocke les souvenirs à long terme. Les connexions entre le thalamus antérieur et le cortex aident à transformer les souvenirs récents en souvenirs durables. Notre projet étudie comment cette interaction entre thalamus et cortex crée des traces mémorielles solides dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de connaitre l’architecture thalamocorticale et son implication dans la formation de souvenirs à long terme. Ce projet permettra ainsi de mieux comprendre comment le thalamus et le cortex travaillent ensemble pour former et stabiliser nos souvenirs. Ces connaissances seront précieuses pour affiner les modèles de la mémoire qui sont utilisés et dont les limites sont connues. Ce travail pourrait donner une nouvelle grille de lecture des pathologies de la mémoire comme la maladie d’Alzheimer. Ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une session de conditionnement aux chocs : maximum 5 chocs de 1s en 8 minutes. Et plusieurs séances de rappel (sans chocs) de 10 minutes chacune. Ils subiront une chirurgie d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation à demeure d’une fibre de verre très fine d’une durée maximale d’une heure et demie.
Impact sur les animaux
Le protocole de conditionnement de peur au contexte est par définition aversif pour les animaux puisqu’il repose sur la survenue d’un évènement déplaisant qui consiste en un choc électrique faible répété 5 fois maximum. Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Certains animaux recevront des injections d’un produit ne provoquant pas de douleur. L’animal subira ainsi une restriction de mouvements et l’introduction d’une aiguille, l’ensemble peut provoquer un léger stress ainsi qu’une légère douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux vérifications histologiques et à l'étude de marqueurs neuronaux
Remplacement
Etudier le fonctionnement du cerveau ne peut s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche expérimentale chez l’homme n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De même, les approches alternatives faisant appel à la modélisation sont utiles mais restent complémentaires des approches expérimentales sur les animaux qui permettent de valider ces modèles.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été calculé comme étant le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistique significative sur les paramètres étudiés grâce à l’utilisation de tests robustes. Cependant le nombre de groupes pourra être réduit en cours de projet : si une des voies étudiées ne montre pas de résultats significatifs sur les premiers lots elle ne sera pas étudiée sur les lots suivants.
Raffinement
Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, tunnel et barre à ronger) et seront hébergés en cage collective, même après les chirurgies. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés et des mesures conservatoires mises en place afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort.
Choix des espèces
D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille entre individus.
Etude spatio-temporelle au long terme de l’implication de l’environnement neurochimique sur la régulation de l’excitabilité neuronale chez un modèle de souris épileptique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une à deux chirurgies du crâne sous anesthésie, puis des crises d'épilepsie généralisées provoquées ou une épilepsie du lobe temporal installée durablement : 300 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie d'entre elles est en outre privée de sommeil ou exposée à un stress, sous surveillance vidéo continue, pour mesurer l'effet de ces facteurs sur les crises. Le porteur décrit les crises comme source d'un "stress de courte durée", tout en signalant l'atonie fréquente qui les suit et une perte de poids par malnutrition pendant les 24 à 48 heures suivant l'induction. Toutes les souris sont tuées puis perfusées pour prélever leur cerveau.
Objectifs
L’épilepsie touche environ 1% de la population mondiale et, dans 30% des cas, aucun médicament ne permet le contrôle des crises. Cette forme de la maladie dite pharmaco-résistante est souvent associée à de nombreuses comorbidités et complications (ex. troubles cognitifs). Son coût pour la société est estimé à 14 milliards d'euros par an en Europe et, malgré l’accès à plus d’une quinzaine de nouveaux médicaments anti-crises, le taux d’épilepsie réfractaire n’a pas changé en 30 ans. Ce constat difficile est en partie dû au fait que nous ne comprenons pas bien les mécanismes de déclenchement des crises épileptiques dans le cerveau. De plus, la plupart des patients souffrent de crises présentant une certaine rythmicité, suggérant l’existence de mécanismes biologiques sous-jacents liés au temps, comme des fluctuations cycliques dans l’activité cérébrale. Ces observations soulèvent l’hypothèse que l’excitabilité neuronale pourrait être modulée par des variations lentes de certains neurotransmetteurs et neuromodulateurs. Notre étude vise précisément à explorer cette hypothèse, en étudiant comment le cerveau contrôle l’excitabilité neuronale à long terme à travers les fluctuations de ces molécules.
Bénéfices attendus
L’observation des fluctuations de l’environnement neurochimique survenant dans une multitude de zones cérébrales, que nous permet notre approche expérimentale, apportera un regard nouveau non seulement sur les mécanismes de genèse des crises d’épilepsie, mais aussi, plus largement, sur la manière dont le cerveau régule l’excitabilité neuronale. Ce projet ambitieux permettra d’établir une carte spatio-temporelle de l’environnement neurochimique lié aux états cérébraux physiologiques et épileptiques, et aura donc un impact important pour les communautés neuroscientifique et médicale et à plus long-terme pour le developpemnet de nouvelles cibles therapeutiques.
Procédures
Les animaux subiront une à deux chirurgies sous anesthésie générale et avec analgésie.. De plus, la plupart des animaux vont subir soit une ou plusieurs crises aiguës généralisées (une crise dure quelques secondes à une minute) soit développer une épilepsie du lobe temporal. Tous les animaux seront suivis de près après chirurgie et induction d’une crise, et le cas échéant traités avec des soins adaptés (ex : analgésique pour la douleur, anti-convulsant pour la crise). Un certain nombre de souris sera également soumis soit à une privation de sommeil courte soit à un stress de courte durée de faible intensité, accompagnés d’un monitoring vidéo continu pour analyser les comportements et comprendre la place du manque de sommeil ou d’un événement stressant dans l’influence des crises épileptiques.
Impact sur les animaux
La procédure implique deux chirurgies sous anesthésie générale. Cette intervention entraîne une douleur modérée qui sera atténuée par un analgésique avant et pendant l’opération et des analgésiques pendant les 3 jours postopératoires. De plus, cela entraîne une déshydratation légère de courte durée qui sera prévenue par une dose de sérum physiologique durant la chirurgie. Crises épileptiques induites ou spontanées : les crises peuvent entraîner un stress de courte durée. Pendant la période post-crise, les animaux présentent très souvent une atonie et tout sera fait pour éviter de perturber les animaux pendant cette période critique. De plus, l’induction de l’épilepsie entraîne un stress métabolique/malnutrition chez beaucoup d’animaux avec une perte de poids durant les 24 à 48h post-induction que la plupart vont récupérer rapidement au cours de prochains jours. Nous avons mis en place un protocole de suivi spécifique post-induction pour suivre le bien-être de nos animaux durant cette période critique. Les animaux seront généralement hébergés avec leurs congénères mais séparés par des parois perforées, permettant un contact visuel, olfactif et auditif.
Devenir
À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés puis perfusés, afin de collecter leurs cerveaux pour des analyses histologiques.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative tangible pour ce projet. En effet, notre étude utilise des méthodologies impossibles à utiliser chez l’homme/patients. Des modèles de simulations informatiques compléteront notre étude mais nous devons d’abord avoir une compréhension plus claire du rôle du stress sur les crises épileptiques.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux requis pour ce projet, nous mettrons en place des contrôles internes (mesures répétées) chaque fois que cela sera possible. Cette approche présente un double avantage : elle permet de réduire le nombre de groupes expérimentaux nécessaires, tout en augmentant la puissance statistique (observations répétées sur le même animal) de l’étude grâce à une meilleure maîtrise de la variabilité interindividuelle.
Raffinement
Les animaux seront tous hébergés en groupe avec un suivi hebdomadaire renforcé sur l'état de chaque individu en termes de bien-être. Pour le modèle d’épilepsie utilisé, un protocole de suivi de la crise épileptique a été optimisé. En effet, comme pour les patients, si la crise dure moins de 5 minutes, l’animal n’est pas traité pour cette crise sauf être mis au calme. En revanche, si la crise dure plus de 5 minutes, l’animal se verra administrer un anti-convulsif. Pour toutes chirurgies, les animaux seront anesthésiés de manière générale avec l'administration d'analgésiques appropriés en amont, durant et après l'opération pendant plusieurs jours. De plus, tous les animaux seront suivis post-chirurgie induction d'épilepsie pendant plusieurs jours de manière renforcée pour limiter au maximum stress et douleur à l'aide de grille d'évaluation. Enfin, les points limites stricts propres au projet seront appliqués afin d'apporter des soins adaptés le cas échéant.
Choix des espèces
Ce projet utilise des modèles de souris adultes épileptiques pour étudier au mieux les épilepsies du lobe temporal chez les patients adultes. En effet, l’étude proposée ainsi que les méthodologies utilisées ne sont pas applicables aux patients. De tous les modèles expérimentaux, le cerveau de souris offre un grand nombre d'avantages : il est structurellement très proche du cerveau humain, et il est assez gros pour permettre l’utilisation de méthodes d’enregistrements précises. De plus, par rapport au rat ou au primate, la souris permet d’utiliser un éventail très large d’outils génétiques, développés dans cette espèce. Enfin, Il existe un très grand nombre de modèles d’épilepsie acquise et génétique qui reproduisent fidèlement différentes épilepsies qui pourraient être utilisés dans de futurs projets précliniques.
Conséquences de la maladie d’Alzheimer sur le système vasculaire cérébral dans un modèle souris et effet d’un agent neuroprotecteur sur les défauts mis en évidence
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
488 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacune recevant une injection par jour du quatorzième jour après la naissance jusqu'à l'âge de trois ou six mois, soit plus de cent cinquante piqûres pour les animaux menés au terme le plus long. Dès le dixième jour, les souriceaux sont retirés quelques minutes du nid pour habituer les portées à la manipulation, ce qui perturbe le nid et peut stresser les animaux. Le jour de la mise à mort, un traceur est injecté dans la circulation, puis le cerveau prélevé sous anesthésie terminale. Le porteur attend de ce projet de situer le stade auquel la barrière entre le sang et le cerveau perd son étanchéité dans la maladie d'Alzheimer, bénéfice qu'il formule au conditionnel, quand les injections quotidiennes commencent, elles, avant le sevrage.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une dégénérescence lente mais progressive des neurones, affectant les capacités de mémorisation des patients réduisant progressivement leur autonomie. Le cerveau est par ailleurs fortement irrigué par des vaisseaux sanguins hautement imperméables, formant une barrière étanche entre le sang circulant et les neurones. Dans la maladie d’Alzheimer, des atteintes à l’intégrité de la barrière ont été identifiées, et ces défauts pourraient participer à l’évolution de la dégénérescence neuronale. Nous souhaitons mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la désorganisation de la barrière dans la maladie d’Alzheimer, et en particulier définir précisément les modifications de la perméabilité des vaisseaux sanguins au cours de l’évolution de la maladie d’Alzheimer. De plus, nous avons récemment identifié un stade auquel on peut stopper la progression de la maladie avec une substance pharmacologique originale. Les molécules médicament, administrées quotidiennement, ont un effet bénéfique sur les marqueurs précoces de la maladie d'Alzheimer au niveau des neurones mais nous ne savons pas si cela permet également d'améliorer l'étanchéité des vaisseaux sanguins. Ce projet nous permettra donc de mieux caractériser les effets de ce potentiel nouveau médicament de la maladie d’Alzheimer sur les vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
La perte d’étanchéité de la barrière vasculaire dans le cerveau pourrait largement participer à la perte neuronale, et son rôle dans cette maladie est encore mal défini. Le projet pourra permettre d’identifier à quel stade de la maladie la barrière perd son étanchéité. De plus, il permettra d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’une molécule médicament, testée en phase pré-clinique sur la restauration de l’étanchéité de la barrière. Intervenir sur l'étanchéité des vaisseaux est une stratégie supplémentaire importante qui permettrait d'améliorer encore plus le bien-être des patients et leur qualité de vie.
Procédures
L’injection du produit médicament est rapide (quelques minutes) mais peut éventuellement induire une douleur légère au point d’injection et un inconfort pour l’animal. L'injection du médicament est quotidienne, du 14ème jour après la naissance jusqu'au prélèvement du cerveau à 3 mois et 6 mois. Le jour de la mise à mort, certains animaux seront injectés avec un traceur dans le système circulatoire. 30 minutes après cette injection, on procède à l'anesthésie générale avec mise à mort par prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
L’injection de la molécule médicament a montré l’absence d’effets indésirables associés à l’injection quotidienne de cette molécule par injection intra-péritonéale à des souris pendant 6 mois. La nuisance sera donc liée à la préhension quotidienne de l'animal et l’injection de la substance (équivalente à une piqure d’aiguille). La préhension des animaux commencent dès le 10ème jour après la naissance pour habituer les petits à être séparés quelques minutes de la mère ce qui perturbe le nid et peut stresser les animaux.
Devenir
Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient mis à mort, afin de récupérer le cerveau pour des examens post mortems
Remplacement
Nous nous intéressons à l’activité d’une structure complexe, impliquant de nombreux acteurs cellulaires et aux conséquences sur les vaisseaux sanguins au cours du développement de la maladie d’Alzheimer. Le développement de la maladie fait appel à de nombreuses interactions qui ne peuvent pas être reproduites in vitro. La souris permet d’avoir accès à des lignées transgéniques modèles de la pathologie humaine. La similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémoire chez la souris en fait un modèle de choix pour ce projet.
Réduction
Nous avons utilisé les données de la littérature pour déterminer la taille des groupes nécessaires à la validation des données par la communauté scientifique. Ce nombre a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en garantissant la validité statistique des résultats.
Raffinement
Chez les souris adultes transgéniques, aucun trouble de mémoire n’a été rapporté aux stades précoces de la maladie de notre étude et nous ne maintiendrons pas d’animal vieillissant en élevage. Lors des expériences de perfusion chirurgicale, la mise à mort se fera lors d'une anesthésie terminale avec une antalgie appropriée. Nous utilisons pour les injections des seringues microfines pour induire le moins de lésion et de douleur possible. Les seringues sont changées entre chaque animal pour prévenir l'émoussement des aiguilles. Les animaux sont habitués à la préhension quelques jours avant le début des injections, et pour éviter le rejet des petits par la mère, ils seront mis en contact avec un peu d'urine maternelle avant d'être replacés dans leur cage d’origine. Des points limites ont été mis en place concernant la souffrance liée aux manipulations et injections des animaux, ainsi que pour évaluer la progression de la maladie .
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles transgéniques mimant certaines pathologies humaines. Dans notre cas, l'existence de modèles transgéniques murins exprimant des mutations humaines de deux protéines impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie et responsables d’une surproduction d'une protéine toxique, permet de mimer la maladie d’Alzheimer et de l'étudier dès les stades précoces (sans symptômes). Cette lignée permet l’utilisation de contrôles issus de la même portée. De plus, la similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémorisation, notamment l’hippocampe, en fait un modèle de choix pour ce projet. Les animaux seront traités dès 14 jours après la naissance et jusqu’à l'âge de 3 ou 6 mois.
Étude de nouveaux traitements de l’alcoolodépendance dans un modèle pertinent de consommation excessive d’alcool et d’addiction à l’alcool.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tous tués à l'issue, pour prélever leurs tissus ou vérifier l'emplacement des canules implantées dans leur crâne, 5 830 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie de trente à soixante minutes pour l'implantation de canules, de lentilles ou l'injection d'un vecteur viral, puis s'auto-administre de l'alcool quinze à trente minutes par jour, cinq jours par semaine, pendant trois à quatre mois. S'y ajoutent jusqu'à douze injections dans l'abdomen et des sessions destinées à mesurer la consommation compulsive, que le porteur reconnaît aversives. Le même porteur présente la cage d'auto-administration d'alcool comme un "enrichissement moteur" et un "enrichissement cognitif", l'appui sur le levier valant apprentissage d'une tâche.
Objectifs
L’alcoolo-dépendance est une maladie chronique et hautement récidivante en dépit des thérapies existantes puisque 70% des patients rechutent après 12 mois de prise en charge (plus de 90% après 4 ans). Les mécanismes neurobiologiques impliqués dans la perte de contrôle sur la consommation d’alcool sont encore mal connus et trop peu de médicaments sont actuellement disponibles pour le traitement de l’alcoolodépendance et des troubles de la consommation d'alcool. Certaines structures cérébrales ont tout de même été identifiés comme étant des acteurs clefs des addictions en général et de l’alcoolo- dépendance en particulier. Dans ce contexte de recherche de nouveaux traitements, nous proposons de réaliser un projet qui permettra d’évaluer l’efficacité d’une dizaine de molécules dans différents aspects de la pathologie des troubles de la consommation d’alcool. Dans un second temps d'étude des bases neurobiologiques nous nous concentrerons sur 5 molécules au maximim. Ces aspects (consommation, motivation, rechute, compulsion, bases neurobiologiques…) seront donc étudiés grâce à la mise en œuvre des différentes procédures qui sont donc complémentaires. Nous allons de plus réaliser ce projet en utilisant des rats, aussi bien mâles que femelles car nous savons que les effets de l'alcool peuvent être différents entre les 2 sexes, mais aussi les effets des médicaments.
Bénéfices attendus
Au cours de ce projet nous nous attendons à identifer certaines molécules avec un réel potentiel dans le traitement des troubles de l'usage d'alcool. Nous pourrons grâce aux différentes procédures comportementales identifier précisemment les différentes dimensions du trouble de l'usage d'alcool (motivation, recherche, rechute...). Ensuite, nous allons clarifier la problématique de l'efficacité des traitement en fonction du sexe. Et enfin, nous identifierons des mécanimes neurobiologiques responsable du trouble de l'usage d'alcool et des mécanismes d'action des molécules efficaces à réduire ce trouble.
Procédures
1- Chirurgies (Implantation de canules, injection de vecteur viral, implantation de lentilles) : 1 seule chirurgie par rat - Durée de la chirurgie : 30 à 60 minutes. 2- Deux prélèvements de sang par rat au maximum sous anesthésie générale : durée de l'intervention : 3 minutes. 3- Auto-administration d'alcool : protocole de 15-30 minutes par jour, 5 jours par semaine pendant 3-4 mois. 4- Injection intra-péritonéales : chaque animal recevra plusieurs injections sur toute la durée des mois d'auto-administration - Maximum de 10-12 injections mais en moyenne 6 injections.
Impact sur les animaux
1- Douleurs au moment de l'injection intrapéritonéale; 2- douleurs post-opératoires prises en charge par un traitement analgésique; 3- perte de poids transitoire potentiel suite aux chirurgie; 4- Risque infectieux au niveau de la plaie situé sur le crâne; 5- Effet aversif lors des sessions d'évaluation de la compulsion.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chacune des procédures pour soit permettre le prélèvement de tissu en post-mortem en vue d'analyses complémentaires sur tissu, soit pour vérifier les sites d'implantation des canules guide ou des lentilles.
Remplacement
Les études de mécanismes complexes de maladies psychiatriques comme l'addiction ne sont pour le moment pas remplaçables par des méthodes in vitro ou in sillico. Les mécanismes impliqués sont trop complexes pour pouvoir être simplifiés à ce jour. Les modèles que nous avons choisis font partie des modèles les plus utilisés et les plus complets avec une validité de ressemblance, une validité de construction et une validité de prédiction très bien décrites dans la littérature. L'animal dans son entièreté est le seul modèle disponible actuellement pour remplir les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à une analyse statistique correcte pour chacune des expériences a été estimé sur la base de nos précédentes expériences utilisant les mêmes modèles de consommation d'alcool. Nous avons également pris en compte la variabilité inter-individuelle observée dans les différents paradigmes (comportementaux et chirurgicaux) utilisés. Aucun test statistique a priori n’a été utilisé pour déterminer la taille des groupes étant donné que nous ne pouvons pas anticiper la taille de l'effet des molécules que nous allons tester. Dans l’optique d’une réduction du nombre d’animaux utilisés, nous ne sélectionnerons que les molécules qui auront montrés un effet statistiquement significatif sur au moins un des comportements évalués. Nous en prévoyons 5 au maximum mais ce nombre pourra être plus faible et réduira donc d’autant le nombre d’animaux utilisés au total sur le projet. Nous évaluerons donc les effets de nos molécules testées sur les 2 sexes. Puis en fonction des résultats obtenus, effet sur un seul des 2 sexes ou un effet identique sur les deux sexes ou effets différent chez les deux sexes, nous ajusterons le design expérimental nous permettant de réduire potentiellement le nombre total de rats utilisés dans ce projet.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des cages enrichies grâce à un tube en carton et une buchette en bois. Les animaux seront manipulés 5 jours par semaine avec une intensification de l'habituation à la manipulation et un conditionnement positif à ces manipulations durant les jours suivant l'arrivée des animaux au sein de la plateforme, permettant ainsi une forte réduction du stress. Les rats seront placés 5 jours par semaine dans une cage d'auto-administration permettant un enrichissement moteur (appui sur les leviers) et un enrichissement cognitif (apprentissage d'une tâche d'auto-administration nécessitant une planification de l'action). Nous utiliserons la Rat Grimace Scale (RGS) tout au long de ce projet pour l'évaluation du niveau de souffrance/douleur ressentie par les animaux. De plus, nous ajouterons des points de surveillance spécifiques à cet acte, à savoir, aspect de la plaie, suintement, hémorragie, problème de suture jusqu'à la cicatrisation de la plaie avec une prise en charge analgésique adéquate.
Choix des espèces
L’espèce rat est choisie pour ce projet en raison de sa pertinence biologique et comportementale en particulier dans les protocoles d’auto-administration volontaire d’éthanol. De nombreuses données scientifiques validées démontrent que le rat est sensible aux effets renforçants de l’alcool, ce qui en fait une espèce pertinente pour modéliser l’initiation, l’escalade et la perte de contrôle de la consommation. Le rat accepte spontanément de consommer des solutions d’éthanol en accès libre ou en réponse à des contingences opérantes, ce qui permet de reproduire des comportements analogues à l’usage volontaire observé chez l’humain. L'utilisation du rat permet la mise en œuvre de protocoles plus complexes qui sont difficilement réalisables chez la souris en raison de différences comportementales et motivationnelles. L’utilisation du rat constitue le meilleur compromis entre pertinence scientifique, faisabilité technique et respect des principes des 3R. Tous les animaux seront utilisés à l'âge adulte pour nous permettre de mimer les troubles de la consommation d'alcool observés chez l'être humain adulte.