Système nerveux

Opérées trois fois sous anesthésie, une à deux heures par intervention, puis maintenues la tête contenue pendant environ deux heures pour une tâche perceptuelle, 946 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent douze injections sous-cutanées et une séance de trente minutes évaluant leurs capacités pré-attentionnelles. Les animaux utilisés appartiennent à une lignée à haut risque de schizophrénie, retenue pour observer comment les neurones des régions auditives échangent des informations. Toutes sont tuées pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Percevoir avec précision la réalité extérieure est essentiel à notre survie. En particulier, les modifications de la perception sont une des caractéristiques majeures de la plupart des troubles neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux, eux-mêmes source de souffrance et d’exclusion sociale. Bien qu'elles soient fondamentales, les bases biologiques d'une perception précise ou altérée sont très peu comprises. Dans cette étude, nous allons étudier d'une part chez des souris comment les neurones des régions cérébrales clés de la perception échangent des informations. Nous évaluerons les mécanismes qui conduisent au fonctionnement et au dysfonctionnement des neurones, grâce à l'utilisation d'un modèle de souris à haut risque de schizophrénie. Cette recherche fera progresser nos connaissances limitées sur la façon dont les troubles neurodéveloppementaux modifient les circuits neuronaux sensoriels et affectent ainsi la perception. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de comprendre les fonctions de régions cérébrales clés de la perception auditive chez la souris, modèle bien adapté pour mimer la physiologie et certains aspects de la pathologie humaine. L’utilisation de modèles souris transgéniques appropriés apportera des données au niveau cellulaire, anatomique et fonctionnel en identifiant les structures cérébrales fonctionnellement mises en jeu. Mieux comprendre ces structures permettra d’appréhender les processus de perception et de prédiction, mais aussi une meilleure compréhension des maladies psychiatriques dans lesquelles ces processus sont altérés. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.

Procédures

Chirurgie : 3 fois, 1h à 2h. Etude des capacités pré-attentionnelles : 1 fois, 30min. Contention pendant tâche perceptuelle : 1 fois, environ 2h. Injection sous-cutanée : 1 injection, durée 5 secondes, 12 fois. Injection intra-péritonéale : 1 injection, durée 5 secondes, 1 fois.

Impact sur les animaux

L’anesthésie peut entraîner du stress léger de courte durée. Les injections d’anesthésiques et d’analgésiques peuvent entraîner un stress et une douleur légère de courte durée. Une douleur modérée peut être associée à l’acte chirurgical. L’étude du comportement et la contention par la tête peuvent entraîner un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau en vue d'études physio-histologiques sur les souris expérimentales.

Remplacement

Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles complexes et comportementales sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Des analyses a priori de puissance statistique permettent de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. D'autres tests statistiques a posteriori choisis en fonction des distributions des populations nous permettre de comparer les moyennes et identifier des différences deux à deux entre groupes expérimentaux et génotypes. Les tests statistiques permettent également de trouver des corrélations entre les variables étudiées.

Raffinement

L’état de santé des animaux et leur accès à l’eau et nourriture sont surveillés quotidiennement. La chirurgie et le post-opératoire se déroulent dans des conditions qui protègent la santé de l'animal, en lui protégeant de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant et de la déshydratation avec une solution de sérum physiologique. La chirurgie se déroule sous anesthésie générale et des analgésiques sont utilisés avant et après la chirurgie, et sur les jours suivants. A la fin de la chirurgie, après le réveil complet, l'animal est replacé dans sa cage collective avec de la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux sont habitués à leur manipulation afin de réduire leur stress.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour l'exploration des mécanismes de la perception car les régulations cellulaires mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies cellulaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Pour les expériences, nous utiliserons des souris adolescentes et adultes entre 7 et 17 semaines car c'est au cours du jeune âge adulte que la plupart des altérations de la perception sensorielle apparaissent dans les troubles neurodéveloppementaux.

132 rats, jeunes d'un mois et âgés de dix-huit mois, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever le contenu de l'intestin, les muscles de la patte et le cerveau. Ils passent cinq semaines seuls en cage du lundi au vendredi, un hébergement dont le porteur reconnaît qu'il induit un stress modéré et empêche l'expression des comportements sociaux. S'y ajoutent des jeûnes de douze à quatorze heures avant les tests de satiété et de préférence alimentaire, deux prises de sang sur animal vigile emmailloté dans un tissu, deux injections et vingt-quatre heures en cage automatisée. L'enjeu déclaré est de positionner une protéine de maïs, la zéine, dans l'offre alimentaire humaine, le porteur affirmant qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne peut intégrer l'ensemble des paramètres étudiés.

Objectifs

Le vieillissement de la population s’accompagne d’une augmentation de la dépendance et des limitations fonctionnelles, dont la perte de masse et de force musculaire est l’une des causes principales. L’apport en protéines de qualité constitue un levier essentiel pour prévenir cela et les protéines du lactosérum sont aujourd’hui considérées comme optimales grâce à leur richesse en leucine, un acide aminé indispensable favorisant la synthèse protéique. Bien que les protéines végétales aient un équilibre en acides aminés de moindre qualité, l’utilisation de protéines végétales de diverses origines permet aujourd’hui de produire des mélanges présentant un profil d’acides aminés globalement satisfaisant. Cependant, il est difficile d’enrichir ces mélanges en leucine. Une protéine végétale se distingue pourtant par sa richesse en leucine : la zéine du maïs. Mais cette protéine est actuellement écartée de l’offre alimentaire car elle est peu soluble et très peu digestible. De nouveaux système de production de zéine ont été développés et permettent d’obtenir une meilleure solubilité et digestibilité (zéine optimisée). L’objectif du projet est ainsi d’étudier l’impact d’un mélange végétal protéique contenant la zéine optimisée sur la digestibilité, la synthèse protéique et le comportement alimentaire chez le rat jeune et âgé.

Bénéfices attendus

La zéine est une protéine peu étudiée mais avec un potentiel important en nutrition humaine du fait de sa richesse en leucine. Son utilisation en nutrition est bloquée par sa faible digestibilité. La production d’une zéine optimisée dont la digestibilité et la solubilité est augmentée permet de lever ce verrou. Le projet permettra d’obtenir les premiers résultats concernant l’effet de ce nouveau produit sur la synthèse protéique dans la population cible, l’individu âgé. D’autres paramètres évalués, comme le comportement alimentaire et la digestibilité, permettront de comparer les effets de la zéine par rapport à d’autres sources protéiques végétales et de la positionner dans l’offre de protéine végétale actuelle. Ce projet participe à promouvoir une transition vers une alimentation plus végétalisée et durable, tout en répondant aux besoins spécifiques des personnes âgées.

Procédures

Pesées. Les animaux sont pesés 5 fois par semaine. La pesée est réalisée en 2 minutes environ. Des régimes comportant des protéines végétales répondant aux besoins des rats sont donnés aux animaux pendant 4 semaines. Deux prélèvements sanguins sur animal vigile sont réalisés au cours du projet sur l’ensemble des rats, la durée ne dépassant pas 3 minutes par prise. L’ensemble des animaux reçoit également, une injection d’analgésique, réalisée sur rat vigile en moins de 30 s (une injection par rat). Tous les animaux reçoivent une injection réalisée sous anesthésie gazeuse en moins de 3 minutes. Mises à jeun : les tests de satiété et de préférence alimentaire sont réalisés après un jeun modéré (soit privation de nourriture pendant la période de repos (maximum 14h), n’entrainant pas de perte de poids, soit après suppression du premier repas en période d’activité. Caractérisation du comportement alimentaire : les animaux sont placés dans des cages automatisées permettant de suivre l’évolution de leur consommation alimentaire pendant 24h. Pour cela les animaux sont préalablement habitués à ces cages, pendant 1h quelques jours avant le test.

Impact sur les animaux

Afin d’évaluer la prise alimentaire (aliments et boisson en libre accès), il est nécessaire d’héberger les rats en cages individuelles du lundi au vendredi pendant 5 semaines. L’hébergement individuel peut induire un stress modéré et empêcher le rat d’exprimer ses comportements sociaux. Pour limiter ce stress, les rats sont placés à 2/cage lors des week-end, toujours avec le même partenaire et dans une cage ayant conservé leur odeur. Pour préciser les modalités de la prise alimentaire au cours du cycle de 24h, chaque rat est placé pendant 24h, une fois au cours de l’expérimentation, dans une cage de mesure automatisée du comportement alimentaire. Le changement d’environnement peut induire un stress léger pour les animaux. Pour le test de satiété (1 test par rat au cours de l’expérimentation) et pour le test de préférence alimentaire (1 test par rat pendant l’expérimentation), les rats sont mis à jeun au maximum pendant 12 à 14h, au cours de leur période de repos (période d’éclairage) pendant laquelle ils ne s’alimentent pas ou peu, ce qui peut être considéré comme un jeune physiologique (pas de perte de poids). Deux prises de sang (à jeun et après l’ingestion d’un repas calibré) sont réalisées pour évaluer les concentrations plasmatiques post-prandiales des hormones de la satiété. Ces prises de sang sont effectuées rapidement (< 3 min), le rat étant maintenu emmailloté dans un tissu. Cette opération peut provoquer un stress modéré. Une injection est réalisée sur rat anesthésié. Cette injection peut provoquer une douleur de piqure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car la détermination de la digestibilité des protéines, et de la synthèse protéique dans le muscle, et l’analyse de marqueurs cérébraux en lien avec la prise alimentaire nécessitent la collecte des contenus de l’intestin, des muscles de la patte et du cerveau.

Remplacement

L’objectif est d’évaluer l’effet d’une nouvelle source protéique pour l’alimentation humaine, la zéine optimisée, sur le comportement alimentaire, la digestibilité et la synthèse protéique chez des rats jeunes et âgés. Cette approche nécessite d’utiliser des modèles in vivo, permettant de prendre en compte les adaptations comportementales de l’individu et les effets physiologiques sur la digestion et le métabolisme protéique. Aucun modèle in vitro ou in silico ne peut intégrer l’ensemble de ces paramètres dans un système complexe permettant de modéliser l’ensemble des interactions entre l’alimentation, le cerveau, l’intestin et les organes associés.

Réduction

Le nombre minimum d’animaux par groupe a été calculé par un logiciel statistique à 10 rats/groupe à partir de données comparables obtenues lors d’études précédentes réalisées dans notre laboratoire afin de garantir qu’avec ce nombre d’animaux les résultats soient interprétables. Les résultats pour chaque groupe sont comparés entre eux à l’aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

A leur arrivée dans l’animalerie, les rats ont une période d’habituation de 7 jours à leur nouvel environnement. Tout au long du projet, le bien-être animal est pris en compte avec un hébergement enrichi et un suivi quotidien des rats par des agents qualifiés. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Pour limiter l'impact de l'hébergement individuel, les cages individuelles sont en plexiglas transparent permettant les interactions visuelles entre les animaux. Les rats demeurent dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils restent en contact olfactif et auditif (vocalises). Afin de limiter encore l’impact de l’isolement, les cages sont enrichies au moyen de tunnels (opaques ou transparents). Un enrichissement social est également prévu : les rats sont regroupés par 2 (rats de même sexe, âge et groupe) dans des cages collectives durant les week-ends. Ces périodes de regroupement permettent aux animaux d’exprimer leur comportement d’interaction sociale. Pour déterminer les modalités de la prise alimentaire sur 24h, les rats sont au préalable habitués aux cages de mesure automatisée de la prise alimentaire. Les prises de sang sont réalisées par un expérimentateur expérimenté pour cet acte technique. De plus, l’animal est habitué régulièrement à l’emmaillotage dans un tissu lors des pesées afin de limiter le stress induit par ce même emmaillotage lors des prises de sang. Lors de l’injection permettant l’évaluation de la synthèse protéique, les rats sont anesthésiés par anesthésie gazeuse et ont reçu une dose d’analgésique au préalable. Enfin, des points limites sont appliqués, au-delà desquels les animaux sont temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère dont la physiologie digestive (c’est un monogastrique) et le comportement alimentaire (c’est un omnivore), notamment la prise quotidienne en plusieurs repas séparés, sont comparables à ceux de l'Humain. Le rat est un modèle reconnu et utilisé par les laboratoires étudiant les mécanismes régulateurs du comportement alimentaire, mais aussi la digestibilité des protéines et le métabolisme protéique. L’objectif du projet est d’évaluer les effets du mélange zéine optimée et isolat de protéines de pois chez l’individu âgé. Ces effets sont comparés à ceux obtenus chez l’individu jeune. Pour cela, des rats jeunes (1 mois) et âgés (18 mois) sont inclus.

Anesthésiés, opérés pendant une heure au maximum, porteurs de deux dispositifs implantés de part et d'autre du dos, 39 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une prise de sang sur animal vigile suit chaque mois, six au maximum sur les six mois d'implantation. Le porteur indique que la non-biocompatibilité d'un dispositif peut provoquer irritation, inflammation, infection ou réaction immunitaire par cytotoxicité, ce que l'étude cherche précisément à mesurer pour un implant cérébral destiné aux patients parkinsoniens. Tous les rats sont tués à la fin, les tissus prélevés servant à juger la tenue de l'enrobage dans le temps.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est la seconde maladie neurodégénérative, touchant 10 millions de personnes dans le monde, surtout caractérisée par la mort de neurones induisant d’importants troubles moteurs. Les traitements médicamenteux actuels, comme les solutions chirurgicales permettent d’atténuer les symptômes de la MP, mais n’ont aucun effet curatif et ne ralentissent pas son développement. En conséquence, la neuroprotection dans la MP est une piste importante de recherche, afin d’enrayer ou de ralentir la perte des neurones. Plusieurs études ont souligné le fort potentiel neuroprotecteur de la lumière proche infra-rouge dans le cadre de la MP. L’objectif de notre projet est de valider un implant cérébral, destiné aux patients souffrant de la MP, comprenant à la fois une source électrique et une source optique à sa partie distale. La partie optique de cet implant permettra de stimuler optiquement une région du cerveau afin de réduire la mort des neurones dès les phases précoces de la MP et de suivre cette dernière. La partie électrique permettra de corriger les troubles moteurs dans les phases tardives de la MP. Nos 2 défis majeurs sont d’intégrer des composants optiques non biocompatibles à son extrémité et d’en réduire au maximum les dimensions. Pour cela, il convient d’encapsuler les composants optiques, afin de constituer une barrière hermétique et assurer une biocompatibilité. La solution classique utilisant le titane, le saphir et la céramique n’est pas optimale de par son caractère rigide et cassant et de par la nécessité de la miniaturisation de l’implant. C’est pour cela que nous voulons évaluer une solution alternative de dépôts en couches minces successives de 2 composants biocompatibles : un polymère et la céramique. Cette association devrait assurer une composante de flexibilité au dispositif grâce au polymère et assurer une barrière hermétique stable grâce à la céramique en offrant une épaisseur réduite au dispositif. Une autre solution serait d’ajouter à ce dépôt en couches minces successives un surmoulage à l’époxy biocompatible. Enfin, si ces 2 solutions ne répondent pas aux exigences nécessaires à l’implant, la solution plus classique d’encapsulation sera utilisée. Ces 3 solutions pourront être évaluées dans notre projet chez le rat, afin de garantir à la fois la biocompatibilité du dispositif, suite à cette encapsulation, et sa fonctionnalité tout comme son intégrité à long terme dans un organisme vivant.

Bénéfices attendus

Cette étude pilote permettra de valider une nouvelle approche d’encapsulation de matériaux non biocompatibles afin de pouvoir les intégrer dans le nouveau dispositif bimodal, miniaturisé, destiné aux patients parkinsoniens, mais qui pourra aussi être utilisés dans de futurs dispositifs implantables. Les bénéfices attendus du projet à court terme sont de mettre en place un nouveau dispositif pour la MP, le plus petit possible, pouvant traiter et suivre la maladie en validant l’intégrité et la biocompatibilité du dispositif.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie sur une durée maximale estimée de 1 heure. Une fois par mois une prise de sang sur animal vigile sera effectuée (durée maximale estimée de 5 minutes, 6 prélèvements au maximum pendant la procédure).

Impact sur les animaux

Tout acte chirurgical, visant à poser un implant qui doit être testé pour confirmer sa biocompatibilité, peut engendrer chez les animaux : douleur, faibles pertes de poids, hypothermie, déshydratation, risque d’infection au niveau du site d’incision ou d’implantation. Le réveil après une anesthésie générale peut induire une désorientation et un stress de courte durée. La non biocompatibilité d’un dispositif implantable peut induire une irritation, une réaction inflammatoire, une infection ou encore une réaction immunitaire suite à une cytotoxicité. Les prises de sang au niveau de la veine de la queue peuvent induire un inconfort pour l’animal, de courte durée (moins de 5 minutes).

Devenir

Tous les animaux de cette procédure sont concernés, soit 39 rats au maximum. Les animaux seront euthanasiés selon un protocole approprié, afin d’obtenir les prélèvements requis pour les analyses histologiques pour compléter scientifiquement l’étude. L’étude des tissus est indispensable pour valider la biocompatibilité de l’implant à long terme.

Remplacement

Même si les techniques d’aujourd’hui comme la construction d’organoïdes permettent de limiter l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, il n’existe à ce jour aucun modèle permettant de réaliser nos travaux sans perte d’informations scientifiques. Nous devons évaluer et valider à long terme l’intégrité et la biocompatibilité de composants du dispositif implantable qui ne peuvent être étudiées de façon complète que sur des organismes entiers, complets avec leur physiologie et leur complexité sur le plan biologique. En revanche, en amont, des premiers tests de cytotoxicité pour sécuriser au maximum l’implantation des dispositifs seront réalisés in vitro, à l’aide de lignées cellulaires, pour réduire le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

Les effectifs ont été ramenés au minimum, tout en permettant d’obtenir des conclusions scientifiques significatives. Nous avons utilisé un test statistique pour calculer le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. La pose de 2 implants chez un animal (un de chaque côté de l’animal, en dorsal) permet de diviser par 2 le nombre de groupes d’animaux, tout comme le choix de la zone d’implantation qui permet de ne pas constituer de groupe contrôle spécifique mais que chaque animal soit son propre contrôle. Les études préalables in vitro, permettent également de réduire le nombre d’animaux utilisés. Comme l’étude sera démarrée avec la moitié des effectifs du lot, le nombre d’animaux pourra être réduit jusqu’à 50% si l’effet attendu est suffisamment important pour obtenir des résultats fiables et homogènes (tolérance et intégrité de l’implant) avec la première moitié d’animaux, après validation avec un test statistique. Si la première solution d’encapsulation répond aux exigences requises pour l’élaboration de l’implant humain, les second et troisième lots ne seront pas réalisés et l’étude prendra fin. Dans le cas contraire, la solution 2 sera évaluée et si cette dernière répond aux besoins de l’implant la solution 3 ne sera pas testée. Si les 2 solutions alternatives d’encapsulation ne sont pas satisfaisantes, la solution 3 plus classique sera réalisée afin de vérifier si elle convient aux exigences de l’implant. Ceci pourrait conduire à une réduction notable du nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

Les rats seront hébergés à l’animalerie en groupes sociaux de 2, dans un environnement enrichi adapté à leur espèce. En cas de bagarre, induisant des blessures, les animaux seront séparés pour garantir leur bien-être et leur environnement enrichi sera augmenté. Les animaux seront habitués à la manipulation, par des personnes expérimentées, afin d’assurer leur bien-être pendant les changes, les pesées, les prises de sang ou tous soins nécessaires post chirurgie. Pour chaque chirurgie, l’animal sera sous anesthésie générale et analgésie, il sera placé sur un tapis chauffant pour maintenir sa température et un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter son inconfort. Des soins post opératoires adéquates seront adaptés pour chaque animal et des antalgiques et/ou antiinflammatoires non stéroïdiens seront utilisés le temps nécessaire. Lors des prélèvements de sang un anesthésique local sera appliqué pour limiter la douleur due à l’insertion d’une aiguille et le prélèvement se fera au niveau de la veine de la queue (la méthode avec le moins d’effets négatifs sur le bien-être du rat). Si, l’inconfort de l’animal est trop important, ce prélèvement sanguin sera effectué sous anesthésie gazeuse de courte durée. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience, avec une surveillance accrue en sortie de chirurgie et tout sera mis en œuvre pour que les animaux aient un niveau d’inconfort aussi limité que possible. L’utilisation de points limites adaptés à chaque étape de la procédure sera mise en place tout au long de l’étude. En cas d’effets inattendus, de perte importante de poids ou d’observation d’un phénomène douloureux, des traitements appropriés seront immédiatement mis en œuvre et/ou il pourra être décidé d’interrompre l’expérimentation. En parallèle, le vétérinaire en charge du bien-être des animaux sera alerté.

Choix des espèces

Compte tenu des objectifs de cette étude pilote, les expériences peuvent être réalisées chez le rongeur de par leur proximité phylogénétique avec l’Homme. Du fait de la durée du protocole et de la taille l’implant, nous utiliserons le rat. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes compte tenu de la durée d’implantation (6 mois). Des animaux juvéniles âgés de 6 semaines (permettant une meilleure habituation à la manipulation et une meilleure constitution des groupes socieaux du fait de leur jeune âge) seront réceptionnés par l’animalerie et utilisés seulement après une période d’acclimatation d’une semaine. Les chirurgies seront réalisées sur des animaux adultes d’environ 8 semaines. Les animaux seront utilisés en procédure à l’âge adulte (entre 2 et 8 mois).

Maintenus autour de 90 % de leur poids de forme pour rester motivés par la récompense alimentaire, 114 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour analyse de leur cerveau. Ils apprennent une tâche une heure par jour, au moins cinq jours sur sept pendant deux à trois mois, avant une opération d'une heure trente pour implanter des électrodes dans deux régions cérébrales, puis un à deux mois d'enregistrement. Le porteur qualifie cette restriction de temporaire et affirme qu'elle "impacte très peu" leur bien-être, tout en ajustant la ration dès que le poids passe deux jours de suite sous le seuil. L'objectif premier reste fondamental, comprendre quand le cerveau décide d'agir, les indications sur les troubles cognitifs humains venant en second et sans échéance.

Objectifs

Le comportement est adapté s'il est géré correctement et de façon flexible dans le temps, et décider quand agir est un processus fondamental dont la base neurobiologique reste largement inconnue. Le projet vise à analyser l'organisation fonctionnelle de deux zones du cerveau, et leur modulation, dans le contrôle flexible de l'action dans le temps. Sur la base de données récentes, nous faisons l'hypothèse que la coordination d'un comportement adapté dans le temps nécessite une interaction précise au sein des circuits neuronaux. L’objectif général de ce projet est d’évaluer l’implication de ces réseaux grâce à l’enregistrement de neurones de deux régions du cerveau afin de caractériser la signature neuronale et l’interaction entre les deux zones cérébrales lors de l’adaptation comportementale à différentes règles spatiotemporelles. Cette étude nous apportera des informations importantes et nouvelles sur le rôle de ces circuits dans la flexibilité temporelle.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera une information précieuse sur les réseaux neuronaux impliqués dans la flexibilité comportementale. Outre son intérêt en recherche fondamentale (objectif premier de l’étude), ce projet devrait fournir des indications précieuses en recherche translationnelle dans la mesure où des dysfonctionnements préfrontaux avec des altérations des fonctions exécutives (dont les flexibilités cognitives) ont été décrits dans plusieurs maladies du cerveau (ex : Schizophrénie, addictions).

Procédures

Dans ce projet, tous les rats seront entraînés à réaliser une tâche comportementale qui nécessite une légère restriction alimentaire initiale (~1 semaine) suivie d'un apport de nourriture contrôlé quotidien (2-3 mois). L'apprentissage est réalisé à raison d’une séance d’une heure par jour au moins 5 jours sur 7, puis subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale (durée environ 1h30) pour implanter des électrodes dans deux régions d’intérêt. Les animaux sont isolés d'un à trois jours maximum après la chirurgie pour permettre une bonne cicatrisation, puis remis en cages collectives. Après une semaine de récupération post-chirurgie, ils seront ré-entrainés à la même tâche comportementale (2 semaines) puis enregistrés pendant la réalisation de cette dernière (un à deux mois).

Impact sur les animaux

La tâche comportementale n’est pas stressante en soi, mais nécessite que l’animal ait une certaine motivation pour explorer l’environnement et chercher le renforcement positif (récompense alimentaire). Pour être au plus près du comportement naturel et favoriser la motivation, nous procéderons à une alimentation contrôlée, en donnant la nourriture immédiatement après la séance comportementale en quantité suffisante (90-95% de la ration normale), de façon à ce qu’il n’y ait pas de reste de nourriture le lendemain, mais que l’animal ait une légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire. Cependant, pour amorcer leur motivation à effectuer la tâche, les animaux seront restreints dans les premiers jours de la tâche comportementales de façon à les maintenir autour de 90% de leur poids. Le poids de l’animal est vérifié quotidiennement juste avant la tâche (donc au moment le plus éloigné de la dernière ration) et la quantité de nourriture est ajustée si le poids descend en dessous de 90% deux jours consécutifs, critère basé sur nos expériences précédentes. La nourriture sera ensuite progressivement augmentée de manière à ce que les rats réatteignent leur poids de forme théorique. Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale et impacte très peu leur bien-être. Un autre point de vigilance concerne la chirurgie. La chirurgie d’implantation des électrodes est faite sous antalgique et anesthésie générale, mais présente un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure (pour analyse des cerveaux).

Remplacement

Ce projet de recherche fondamentale s’inscrit dans le champ des Neurosciences comportementales. En effet, l’évaluation comportementale et neurobiologique en réponse à un changement de règle spatiotemporelle nécessite l’utilisation d’organismes entiers et vivants. L'utilisation d'animaux dans ce projet est nécessaire car nous ne pouvons pas déterminer les codes neuronaux sous-tendant le comportement sans faire appel à l’implantation d’électrodes qui ne peut se faire chez des sujets humains. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les oiseaux. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera minimisé autant que possible grâce à l’étude de plusieurs paramètres chez le même animal. Nous avons calculé le nombre de rats minimal par groupe pour obtenir des résultats significatifs et exploitables, en tenant compte de la perte de certains animaux (comportement temporel instable, perte à la chirurgie, mauvaise localisation des électrodes, mauvais signal d’enregistrement).

Raffinement

Après quelques jours d’acclimatation à leur arrivée dans l’animalerie, les rats sont manipulés et pesés quotidiennement au moins une semaine avant le début de l’entraînement à la tâche comportementale, afin de les habituer à l’expérimentateur et de laisser les rats s’habituer à la quantité contrôlée de nourriture. Pour la procédure chirurgicale, des protocoles appropriés d’analgésie et d’anesthésie seront appliqués. Le suivi postopératoire sera effectué quotidiennement par l’expérimentateur ou les zootechniciens pour s’assurer de la récupération complète des rats. Des points limites associés à des actions sont identifiés pour le cas où les mesures de prises en charge de la douleur et de l’inconfort pouvant résulter de l’étape chirurgicale ne seraient pas suffisantes. Nous avons aussi optimisé les équipements comportementaux pour permettre aux animaux porteurs d’implants cérébraux de se mouvoir avec le maximum de confort (mangeoire de haute taille, écran tactile à toucher avec le nez au lieu d’un trou où mettre son nez ce qui donne le risque de cogner l’implant). De plus, nous utilisons un cache des implants permettant de loger les animaux à deux par cage et nous avons dessiné et imprimé à l’imprimante 3D des supports d’implants cérébraux améliorant là aussi le confort des animaux en réduisant les possibilités d’accroches dans l’environnement de test. L’enrichissement des rats implantés est aussi modifié (maison en carton à la place des tunnels de plastique) pour empêcher les rats de se faire mal en se coinçant l’implant. Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec les conseils vétérinaires.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude des circuits neuronaux des processus cognitifs, largement conservés le long du phylum. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rongeur des aptitudes cognitives complexes. Les rats ont été sélectionnés pour ce projet car la littérature sur l’apprentissage temporel, dont nos propres publications, est majoritairement basée sur des études chez le rat, fournissant une base de connaissances solide. Les analyses anatomiques et fonctionnelles dans ces expériences s'appuient sur une richesse de connaissances sur la structure anatomique et la neurochimie du rat. Par ailleurs, le rat est généralement considéré comme ayant des capacités cognitives plus évoluées que la souris et la taille supérieure du rat nous permet de réaliser des interventions plus spécifiques au niveau central. Ce modèle animal est donc le plus approprié à la fois pour les études comportementales et neurobiologiques. Nous utilisons pour ce projet de jeunes adultes âgés de trois mois environ au début des expériences, pour s’assurer que le cortex préfrontal et sa connectivité soient matures dès le début de l’apprentissage de la tâche comportementale.

Jusqu'à trois heures par jour sur une roue d'activité, six fois par semaine pendant huit semaines : 2 976 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par une chirurgie terminale destinée à prélever des échantillons. Chacune subit d'abord une opération du crâne de moins de deux heures, puis, pour une partie d'entre elles, une injection de colorant sous anesthésie tous les six jours pendant trois à quatre semaines, avec un risque de lésion, de saignement et de dépression cardio-respiratoire. L'objet réel du projet reste la caractérisation de protéines fluorescentes servant à lire l'activité électrique des neurones, présélectionnées parmi plusieurs centaines de milliers de variants criblés en culture cellulaire. Le porteur affirme que la souris est le seul mammifère aisément modifiable génétiquement et retient l'espèce parce que la taille de son cortex correspond au champ du microscope et qu'elle est "assez résiliente" à ce type de chirurgie, avec "une appétence certaine pour courir sur une roue d'activité".

Objectifs

De nouvelles méthodes consistent a utiliser des protéines sensibles à la lumière pour « lire » ou « écrire » l’activité électrique grâce à des nouvelles méthodes dites optiques, c’est-à-dire basées sur la lumière. En utilisant l’imagerie de l’activité électrique des neurones, nous pouvons comprendre la communication entre différents types de neurones. Ceci est possible grâce à de nouvelles protéines fluorescentes Les stratégies utilisées pour obtenir une présence minimale de ces protéines sur le neurone se basent sur l’existence et la disponibilité de modèles transgéniques. Les souris constituent le seul mammifère aisément modifiable génétiquement et leur utilisation ne peut pas être remplacé par des systèmes in silico ou in vitro pour évaluer le potentiel de ces nouvelles protéines. L’objectif de ce projet est de caractériser in vivo ces nouvelles protéines dont la sensibilité est améliorée et peuvent être combinées grâce à la diversité de leur propriété, notamment la couleur qui les rende fluorescente. Afin de réduire l’utilisation d’animaux, le maximum de tests in vitro a été réalisé afin de présélectionner le plus petit nombre de protéines candidates à partir d’une base de plusieurs centaines de millier de protéines. Les expériences d’imagerie neuronale in-vivo permettent de tester plusieurs conditions et d’obtenir beaucoup d’information par animal afin de réduire le nombre d’animaux utilisés par protéine ou couple de protéines testé.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de donner accès à de nouveaux outils qui serviront pour mieux comprendre les mécanismes de fonctionnement des neurones. Les méthodes optiques comportent divers avantages y compris le fait qu'a partir d'un animal une grande quantité de données sont obtenues. Et en même temps, cette méthode est peu invasive par rapport à des approches d’insertions d’électrodes. Par ailleurs, ces animaux serviront à la fois à la recherche et à la formation des étudiant.e.s pour la recherche. Enfin, l’émergence et la validation de ces nouveaux outils permettront à terme, grâce à cette nouvelle façon précise et directe de mesurer l’activité cérébrale, de raffiner la compréhension du développement de maladies et des mécanismes d’actions de candidats médicaments.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie sous analgésie et anesthésie qui durera moins de 2 heures et sera réalisée une seule fois par animal. Certains animaux seront positionnés sur une roue d’activité au maximum 6 fois par semaine pendant au maximum 3 heures sur 8 semaines (au maximum) pour les expériences d’imagerie. Certains de ces animaux subiront une fois tout les six jours une injection de colorant (moins de quelques secondes) sous anesthésie sur 3 ou 4 semaines. Tous les animaux subiront une chirurgie terminale sous analgésie et anesthésie pour récupérer des échantillons.

Impact sur les animaux

Lors des injections d’analgésiques et anesthésiques, les animaux pourront subir un stress lors de la contention et de l’induction de l’anesthésie. Pour ces injections d’analgésiques et anesthésiques, l’animal pourrait ressentir une douleur lors du franchissement de la peau par l’aiguille. Lors du réveil post-chirurgical, les animaux pourront subir une hypothermie transitoire ainsi que des douleurs post opératoires. Un risque de lésion et de saignement est possible à la suite de l’injection du colorant ainsi qu'une dépression cardio-respiratoire de moins de 10 secondes. Lors de l’expérimentation d’imagerie intravitale, le maintien de l’animal sur la roue d’activité pourra durant les premières dizaines de secondes conduire à un stress.

Devenir

Tous les animaux seront donc euthanasiés par une méthode réglementaire pour prélèvement afin de répondre à une question scientifique.

Remplacement

Des études préalables in vitro ont été réalisées pour limiter grandement le nombre d’expérimentations in vivo. Ainsi des centaines de milliers de variants ont été évalués lors de screening réalisés sur des cellules, dites immortalisées, en culture. Nous essayons également de développer des méthodes in silico afin de raffiner la prédictibilité de la fonctionnalité de ces protéines candidates en fonction de leur séquence et des résultats obtenus in vitro. Cependant pour évaluer le potentiel de ces sondes dans différents types cellulaires, à différentes profondeurs et dans le cerveau d’un animal en comportement, l’utilisation de souris en expérimentation in vivo ne peut pas être remplacé par des systèmes in vitro.

Réduction

Les effectifs ont été réduits au maximum grâce à un calcul de puissance. De plus, un faible nombre d'animaux (2-3 souris par condition) est suffisant pour fournir un nombre élevé de neurones. Par conséquent, nous utiliserons au maximum 2976 souris. Des tests statistiques adéquats seront utilisés pour l’analyse des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. La température et l'hygrométrie sont contrôlées et monitorées, le cycle jour nuit est automatique. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à l’eau et la nourriture. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères. Le milieu est enrichi (nidification, rongement). Une période d'acclimatation de 7 jours sera systématiquement pour les animaux provenant du fournisseur agrée défini ou pour les animaux provenant de notre animalerie centrale et transférés dans la pièce de stabulation. Toute chirurgie sera précédée d’une analgésie et anesthésie adéquat. Le maintien de la température est assuré. Un suivi post opératoire est effectué quotidiennement et toutes les mesures sont prises pour veiller au bien-être animal. Des points limites ont été défini et seront appliqués afin de garantir la minimisation de risque de souffrance des souris les atteignant. La mise en place systématique d’une période de manipulation préalable à l’expérimentation ainsi qu’une habituation progressive du dispositif expérimentale permet de réduire le stress de l’animal.

Choix des espèces

La souris est choisie pour plusieurs raisons dont les plus importantes sont la disponibilité de modèles transgéniques et de manipulations génétiques multiples, la taille des circuits neuronaux et domaines fonctionnels du cortex, de l’hippocampe et du cervelet est en adéquation avec la taille de l'image accessible par le microscope et la validation d’outils optogénétiques sera comparative vis-à-vis des outils antérieurs précédemment validé chez la souris. Par ailleurs, la souris est assez résiliente à ce type de chirurgie et à une appétence certaine pour courir sur une roue d’activité. Des animaux adultes seront utilisés. Leur âge sera supérieur ou égale à 6 semaines car à cet age les conditions pour faire de la microscopie sont réunies et que nous souhaitons comprendre le fonctionnement des neurones dans le cerveau adulte.

Carencées en oméga-3 depuis le développement embryonnaire et jusqu'à leur mise à mort, soit jusqu'à 200 jours de régime, 840 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Quarante femelles gestantes subissent une chirurgie abdominale de trente minutes pour une injection dans le cerveau de leurs embryons, quarante nouveau-nés reçoivent une injection cérébrale sous anesthésie locale. Le porteur signale des avortements spontanés possibles après la chirurgie, une prise alimentaire augmentée toute la vie chez les animaux carencés, des défauts de mémorisation et une altération des tâches liées à l'effort, qu'il qualifie de légers alors que la procédure est classée modérée. Il annonce quatre interventions et n'en décrit que trois.

Objectifs

Dans ce projet nous cherchons donc à comprendre l’impact d’un régime carencé en oméga-3 sur le développement des astrocytes et des vaisseaux sanguins cérébraux.

Bénéfices attendus

Notre projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur le rôle des acides gras omega-3 dans le développement et la maturation d'un type de cellules du cerveau, les astrocytes, et des vaisseaux sanguins cérébraux. Cela pourrait permettre d’apporter de nouvelles pistes de compréhension de l’impact des changements alimentaires sur l’apparition de troubles comme les troubles du spectre autistique, la schizophrénie ou encore les troubles d’attention et d’hyperactivité chez les jeunes enfants.

Procédures

4 interventions sont utilisées dans ce projet. 1)Régime alimentaire : les animaux sont soumis depuis leur premier jours de développement jusqu’à leur mise à mort à un régime soit suffisant soit dépleté en omega-3. Nombre d’animaux concernés : l’ensemble des animaux de l’étude. Les animaux auront au maximum ce régime pendant 200 jours. 2)Injection dans le cerveau d’embryon (in utero) suite à une chirurgie abdominale des femelles gestantes. Nombre de femelles concernées : 40. Cette chirurgie n’est réalisée qu’une seule fois (durée: 30 min maximum pour la totalité de la chirurgie par femelle). 3)Injection cérébrale chez des nouveau-nés. Cette injection se fait une seule fois, sous anesthésie locale. Nombre d’animaux : 40 (durée 15min).

Impact sur les animaux

Certains animaux recevront une injection qui peut entrainer une gêne au site d’injection (nuisance légère et de courte durée, 2jours maximum). Un lot de femelles subira une chirurgie in utero abdominale qui peut entrainer des avortements spontanés avec un stress modéré et de courte durée (dans le 3 jours qui suivent la chirurgie) . Des animaux seront carencés en lipides oméga-3 depuis le développement embryonnaire. Il a été montré que cela pouvait induire une légère augmentation de la prise alimentaire tout au long de leur vie. Au niveau du comportement, une légère altération dans les taches liées à l’effort a été observée ainsi que des défauts de mémorisation donc de légères nuisances sur la durée de l’expérience.

Devenir

La mise à mort des animaux est nécessaire pour récupérer les cerveaux afin d’étudier les propriétés des astrocytes et des vaisseaux sanguins

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. D’après nos précédentes études sur le cerveau en développement et mature, il faut obtenir les observations sur au minimum 5 réplicas biologiques pour chaque condition afin de pouvoir obtenir des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Par ailleurs, pour les interventions pouvant induire une nuisance éventuelle, des mesures seront adoptées, selon une procédure avec des points limites gradés. En particulier, des points limites intermédiaires permettant la mise en place de soin aux animaux sera mise en place évitant la mise à mort des animaux. 1) Pour les nouveau-nés subissant une injection, ils feront l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure et les jours suivants. 2) Pour le lot de femelles subissant une chirurgie in utero : de l’analgésique est injectée avant et après la chirurgie. Un suivi très régulier dans les 48h qui suivent l’opération est mis en place, permettant d’initier des interventions éventuelles, allant de l’ajout d’analgésique à la mise à mort. 3) Pour l’ensemble des animaux soumis aux régimes, un suivi pondéral est assuré au cours du développement pour vérifier leur bon développement.

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Nous prévoyons 4 stades à étudier : 5, 15, 60 et 200 jours après la naissance. Ces stades ont été choisis sur la base d'études préalables qui montrent que l’Unité Gliovasculaire se met largement en place entre le 5ème et le 15ème jour après la naissance. Il est par ailleurs important de déterminer si ce sont des phénomènes uniquement développementaux (5 et 15 jours après la naissance) ou maintenus chez l’adulte (2 mois et environs 6 mois après la naissance).