Système nerveux

320 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à sept semaines de régime alimentaire spécifique puis à quatre semaines de traitement dans l'eau de boisson pour détruire la myéline de son cerveau. S'y ajoutent une biopsie de la queue, une anesthésie générale de 45 minutes à 1 h 30, des injections intracérébrales et une chirurgie d'une heure et demie ouvrant une fenêtre d'imagerie. Le porteur affirme que la souris est "le seul modèle" permettant de suivre en temps réel l'effet de la perte de myéline sur des types précis de neurones. Une partie des animaux est tuée sans avoir servi, faute de porter le génotype recherché, les autres le sont pour que leur cerveau soit prélevé.

Objectifs

La myéline est une gaine protectrice qui entoure certaines cellules du cerveau et permet une bonne transmission des messages nerveux. Lorsqu’elle est abîmée, comme dans la sclérose en plaques, cela perturbe non seulement la transmission de l'information, mais aussi la communication entre les cellules du cerveau. Notre projet cherche à mieux comprendre ce lien encore peu exploré entre la myéline et le bon fonctionnement du cerveau. Nous nous intéressons particulièrement à un type de cellule clé dans le traitement de l'information, souvent touché dans ce type de maladie. Ces cellules sont aussi entourées d’une matrice de soutien qui se dégrade quand la myéline est atteinte. Nous pensons que cette double atteinte, à la fois la perte de la gaine protectrice et la dégradation de cette matrice, pourrait fortement perturber le fonctionnement du cerveau. Nous allons donc observer comment les cellules réagissent à la perte, puis à la réparation de la myéline, et comment leur environnement évolue. Ces recherches pourraient ouvrir la voie à de nouveaux traitements, visant à protéger à la fois la myéline et les connexions essentielles entre les cellules du cerveau.

Bénéfices attendus

Ce projet démontrera comment la perte de la myéline altère la communication des neurones et comment la matrice qui les entourent peut les protéger. Ces découvertes éclaireront le fonctionnement des connexions entre neurones dans des individus sains et malades. Elles pourraient mener à de nouvelles thérapies combinant protection de la myéline et de la communication entre neurones, particulièrement pertinentes pour la sclérose en plaques. En révélant ces mécanismes clés, cette recherche ouvre la voie à des traitements innovants préservant les fonctions cérébrales.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Réalisation de biopsies à la queue (une fois, durant quelques secondes); 2) un traitement alimentaire spécifique de 7 semaines; 3) un traitement spécifique dans l’eau de boisson de 4 semaines; 4) injections sous-cutanées pour les analgésiques; 5) anesthésie générale (durée : 45 minutes à 1h30); 6) injections intracérébrales (durée : 45 minutes); 7) chirurgie pour l’imagerie cérébrale (durée : 1h30); 8) séance d'habituation et d'imagerie (durée : 45 min à 1h); 8) prélèvement des cerveaux pour des analyses.

Impact sur les animaux

La biopsie peut provoquer un stress léger et l’anesthésie générale peut provoquer également un stress léger. Concernant la chirurgie, les nuisances comprennent douleur modérée post opératoire. Concernant les injections sous-cutanées, une douleur légère peut survenir. En ce qui concerne l’imagerie du cerveau, les nuisances peuvent inclure un stress léger de la manipulation.

Devenir

Certains animaux sont mis à mort car ils sont sans génotype d’intérêt pour le projet. Tous les autres animaux seront utilisés pour des expériences et seront mis à mort afin de pouvoir collecter leur cerveau.

Remplacement

Notre compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies telles que la sclérose en plaques sera toujours insuffisante si ces mécanismes ne sont pas induits et analysés dans leur milieu naturel complexe. En étudiant les différentes composantes de façon isolée, de nombreux effets émergents de l'activité neuronale et des interactions cellulaires seront obligatoirement négligées. L’utilisation de l’animal est donc primordiale pour obtenir des résultats qui puissent avoir un véritable impact dans le développement de nouvelles thérapies chez l’homme. Les souris sont le seul modèle permettant d'étudier l'effet des altérations de la myéline sur des types spécifiques de neurones par imagerie cellulaire en temps réel.

Réduction

La stratégie que nous avons utilisée pour maintenir la lignée de souris est calculée de manière à minimiser au maximum le nombre de souris. Le nombre de cages pour les élevages a été réduit afin d'obtenir la production minimale nécessaire pour nos expériences. Afin de réduire au strict minimum nécessaire le nombre d’animaux, nous utiliserons une analyse de puissance statistique pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires afin d’obtenir un résultat scientifiquement fiable. De plus, les données seront analysées avec des tests statistiques adaptés et si la significativité est atteinte avec un nombre d’animaux plus faible que prévu, les expériences seront arrêtées.

Raffinement

Lors des actes chirurgicaux, les animaux sont anesthésiés et reçoivent des analgésiques en pré- et post-opératoires par voie locale et sous-cutanée. Après l’opération, un apport de fluide est effectué pour réhydrater l’animal, puis celui-ci est placé dans une enceinte chauffée jusqu’à son réveil complet. De la nourriture est placée dans la cage d’hébergement afin de faciliter la récupération; la surveillance des animaux est renforcée afin d’éviter toute souffrance; les animaux sont observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites est utilisée. Tout signe de douleur est soulagé avec des analgésiques.

Choix des espèces

Les expériences seront réalisées chez des souris génétiquement modifiées. La souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler de types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Pour le génotypage et les biopsies, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours. L'expérimentation est menée sur des animaux adultes entre 2 à 5 mois ce qui nous permet de faire nos protocoles et traitements.

Tapis roulant une semaine, test de préhension sur grille la suivante, et cela de la quatrième à la quarante-troisième semaine : 324 souris porteuses d'une forme lente de la maladie de Charcot vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent le lysat de plaquettes par ponction intrathécale, l'équivalent d'une ponction lombaire chez l'humain, et subissent six prélèvements sanguins étalés sur 300 jours. La mise à mort sert à prélever les tissus nerveux et à supprimer les animaux dont la pathologie a atteint son maximum. Le porteur décrit un modèle sans amyotrophie, sans perte de poids et sans signes de douleur, dont l'atteinte motrice ne se révèle que lorsqu'un effort est demandé.

Objectifs

La maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative incurable, mortelle, causée par la perte des neurones moteurs localisés dans le cerveau et la moelle épinière et qui sont responsables de la contraction des muscles striés. La maladie de Charcot touche environ 7000 patients en France. La maladie débute généralement entre 50 et 70 ans par une faiblesse musculaire, évoluant rapidement vers une paralysie généralisée des membres et une insuffisance respiratoire qui conduit au décès dans les 3 ans suivant l'apparition des symptômes. L’administration de lysats de plaquettes sanguines dans le cerveau de souris modèles de la maladie a déjà démontré ses effets thérapeutiques. Ce présent projet translationnel s’inscrit dans un projet global d’essai clinique ou une voie alternative efficace à l’administration directe dans le cerveau est explorée. La voie intrathécale est une approche peu invasive, simple et rapide qui permet aux médicaments administrés d'atteindre rapidement la moelle épinière. Notre objectif est donc d’évaluer l’effet thérapeutique de l’administration intrathécale de lysat de plaquettes dans des animaux qui présentent des signes de la maladie. Ce modèle est différent de celui qui a permis d’établir la preuve de concept, il permet de mimer l’hétérogénéité clinique de la maladie de Charcot. Le modèle que nous utilisons est un modèle léger de la maladie. La règle des 3R est appliquée à ce projet dans son ensemble. Le but est d’offrir une alternative thérapeutique peu invasive, plus accessible cliniquement, qui pourra s’intégrer ultérieurement dans une démarche clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet s’insère dans un programme de recherche hospitalo-universitaire qui doit aboutir à un essai clinique chez les patients atteints de la maladie de Charcot. Les expériences de notre partenaire ont démontré le pouvoir thérapeutique du lysat des plaquettes sanguines dans un modèle sévère de la maladie de Charcot. La preuve de concept s’est faite par une injection dans le cerveau qui est invasive. Notre objectif est d’évaluer une voie d’administration alternative peu invasive, simple et rapide dans un modèle moins sévère de la maladie de Charcot. Nos partenaires évaluent en parallèle cette même méthode alternative dans un modèle sévère de la maladie. Notre projet permettra de consolider cette approche thérapeutique avant de réaliser les premiers essais cliniques. L’utilisation d’un modèle différent de celui utilisé par nos collaborateurs permet de mimer l’hétérogénéité clinique de la maladie et représente donc un autre point fort de cette étude. Le bénéfice de notre approche est clairement identifiable de par la robustesse et la reproductibilité de nos résultats et l’application directe vers la clinique. La valorisation de ce projet se traduira par des publications dans des journaux internationaux à comité de lecture et un/des dépôts de brevet et la participation à la réalisation d’un essai clinique.

Procédures

Le projet implique de délivrer du lysat plaquettaire par voie intrathécale et de réaliser des prélèvements sanguins. Ces procédures réalisées sur animaux vigiles sont rapides (2 min maximum) et n’occasionnent que le stress de la contention et celui d’une piqûre. Afin de suivre l’évolution des capacités motrices des souris atteintes de la maladie de Charcot, les animaux seront suivis par des tests comportementaux simples, non invasifs, ne nécessitant pas de déprivation de nourriture et ne durent pas plus de 5 min. Trois tests comportementaux moteurs seront ici utilisés pour définir les capacités motrices. Le test du tapis roulant évalue l’endurance à l’effort. Ce test n’excède pas 20 min. Lorsque ce test est réalisé aucun autre test n’est réalisé dans la semaine afin de permettre une bonne récupération. Nous avons besoin de réaliser des études d’histologie du système nerveux. A cette fin, une préparation des tissus est nécessaire avant de procéder à la biopsie. Nous procédons donc à une perfusion ou ponction intra-cardiaque sur des animaux anesthésiés ayant reçu une dose léthale d’anesthésique/analgésique chimique. Cette procédure prend moins de 5 min par animal.

Impact sur les animaux

La maladie de Charcot est une maladie paralysante incurable dont l’issue est inexorablement fatale. Le modèle murin que nous utilisons a été déjà phénotypé dans de nombreuses publications, ce qui nous assure une optimisation de la règle des 3Rs. Le modèle de souris que nous utilisons perd très lentement ses capacités à effectuer des taches motrices et certains individus peuvent tardivement présenter une posture anormale (dandinement) qui est stable, et ne gêne pas l’accès à la nourriture et eau, pour suivre un déclin normal lié à l’âge et à la prise de poids. Ce modèle présente une atteinte motrice qui est principalement révélée lors d’une demande d’effort. Ce modèle ne présente pas une espérance de vie plus courte et la pathologie n’est pas associée à une amyotrophie et une perte de poids. Les souris, comme c’est le cas chez les patients, ne présentent pas de signes de douleurs. Notre objectif est d’améliorer les symptômes moteurs par une approche d’administration intra-thécale qui est une piqure de courte durée. Cette administration est standardisée, simple, rapide et sure pour l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour répondre à deux nécessités du projet : 1) prélever des tissus afin d’étudier les paramètres histologiques en liens avec des caractéristiques cliniques et un effet thérapeutique. 2) L’autre nécessité, qui est liée à la pathologie elle-même, est d’euthanasier des animaux à phénotype dommageable une fois la manifestation de la pathologie est maximale.

Remplacement

L’utilisation de souris mimant la pathologie humaine est le seul système qui permet de valider l’effet thérapeutique d’une biothérapie qui bloque différents processus cellulaires et moléculaires impliqués dans la maladie de Charcot. Les résultats précédents ont démontré le pouvoir thérapeutique du lysat des plaquettes sanguines dans un modèle souris de la maladie de Charcot quand celui-ci est administré directement dans le cerveau. Une étude à plus grande échelle prévoit une administration continue chez des patients atteints de la maladie de Charcot à un stade précoce. Notre mission est de proposer une voie d’administration alternative qui est peu invasive et rapide. L’administration intrathécale, qui correspond chez l’humain à réaliser un geste de ponction lombaire, de biomolécules répond à ces critères et offre un moyen de délivrer facilement les molécules thérapeutiques dans le système nerveux. Le modèle vivant demeure donc nécessaire pour évaluer une nouvelle voie d’administration et pour développer tout transfert thérapeutique vers la clinique.

Réduction

Le nombre de souris est déterminé en suivant scrupuleusement les recommandations internationales et les études qui définissent les tailles optimales des cohortes de souris modèles de la maladie. Nous suivons donc un traitement statistique qui permet de réduire le nombre d’animaux et de limiter les faux positifs. Nous nous référons aux études réalisées sur les effets de taille de groupe sur la puissance et la fiabilité des tests statistiques. Chaque cohorte est composée de 16 souris pour le comportement et 8 souris pour les études histologiques. Nous utilisons également des cohortes mixtes mâle et femelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux euthanasiés au sevrage.

Raffinement

Une connaissance extensive du modèle de la maladie de Charcot permet de connaître et donc d’anticiper les différents jalons de la maladie et donc d’optimiser l’expérimentation. La lignée de souris utilisée ne présente une forme légère de la maladie de Charcot qui se caractérise principalement par un défaut à effectuer un effort moteur. Ces souris ne présentent pas d’amyotrophie, pas de perte de poids et n’ont pas une durée de vie limitée. Une surveillance régulière est mise en place et assurée par les expérimentateurs et nous travaillons étroitement avec la structure du bien-être animal. Les conditions d’élevage qui incluent des copeaux dans les litières, un igloo et du coton vierge pour faire un nid végétal contribue à améliorer le bien-être des animaux en créant un microenvironnement propice au repos. Une surveillance visuelle quotidienne est effectuée par les zootechniciens. L’administration intrathécale est une approche rapide, peu invasive et peu douloureuse, et qui est conforme aux recommandations de la littérature. Afin de réduire le nombre de gestes le jour de l’injection, nous rasons la zone d’injection la veille. Avant l’injection intrathécale, nous injectons un anesthésique. Afin de s’assurer d’une injection efficace de la solution thérapeutique et d’ainsi optimiser le nombre d’animaux par cohorte, nous utilisons lors de l’injection deux marqueurs visuels de la bonne réalisation du geste : un mouvement reflexe de la queue et la présence temporaire de quelques minutes de membres postérieurs flaccides induit par la présence d’un anesthésique. De plus, les animaux sont suivis régulièrement après chaque administration. Toute anomalie indépendante de la pathologie comme des signes d’angoisse, de détresse, de douleur ou d’infection est signalée afin d’apporter une réponse rapide et adaptée.

Choix des espèces

Les lignées transgéniques modèles de la maladie de Charcot récapitulent l’hétérogénéité clinique de la pathologie et renforce la validité des résultats: début précoce/tardif, progression lente/rapide, traits cliniques, électrophysiologiques et histopathologiques spécifiques de la maladie. L’exploration des propriétés phénotypiques et génétiques des neutrophiles au cours de la maladie ainsi que le protocole d’immunothérapie que nous proposons requiert une expérimentation sur les modèles murins de la maladie. Notre étude a en effet pour objectif d’amener au plus proche de la clinique une stratégie d’immunothérapie. La complexité des interactions entre le système immunitaire et le système nerveux requiert un modèle à la physiologie complexe qui se rapproche de celle de l’homme. Le modèle de la maladie de Charcot que nous utilisons présente un phénotype léger de la maladie avec une progression lente. Pour l’étude comportementale, les animaux vont alterner d’une semaine à l’autre un test moteur. Les tests débuteront la 4ème semaine (30 j) avec le tapis roulant, la semaine suivante les animaux effectuerons le test de préhension d’une grille. Ce jusqu’à la 43ème semaine (300 jours). Les prélèvements sanguins sont effectués à 6 temps qui comprennent le stade avant l’administration (60 j), au début de l’administration (90j) et durant la progression des déficits moteurs (120, 190, 240 jours) et la fin de l’étude (300 jours). Cette fréquence assure le suivi longitudinal des paramètres sanguins étudiés. Pour l’étude des tissus, certains seront prélevés à des stades correspondant au début de l’administration (90 j), à la phase précoce et au pic de la progression (120 et 240 j) et au stade terminal de l’étude (300 j).

Valider un geste chirurgical, pas produire des connaissances : 10 rongeurs diurnes vont subir une opération d'une heure et demie sous anesthésie générale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des électrodes sont implantées après incision du scalp, puis chaque animal reste seul en cage pendant une semaine. Le porteur indique que la plaie peut s'enflammer au point que l'animal se gratte et arrache ses points de suture, et qu'une infection reste possible. Les dix animaux sont tués pour autopsie, afin de vérifier ce que la chirurgie a fait à leurs tissus, et le RNT ne nomme pas leur espèce.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans un projet de recherche plus large visant à étudier les effets de la lumière ambiante sur le cycle veille/sommeil au cours des 24 h. Les expériences seront menées en parallèle chez un modèle animal nocturne et chez un modèle animal diurne. Le projet de recherche scientifique se propose de tester l’hypothèse selon laquelle l'exposition à la lumière optimise le cycle veille/sommeil chez les espèces diurnes et nocturnes, par deux processus temporellement cohérents qui sont 1) les effets dépendants des horloges circadiennes et 2) les effets directs de la lumière sur les états de vigilances. Pour tester cette hypothèse il sera nécessaire d'enregistrer le cycle veille/sommeil sur les animaux au moyen d'électrodes d'enregistrement. L'objectif du présent projet est l'acquisition et la validation de la compétence nécessaire à la mise en oeuvre de ces enregistrements sur l'espèce diurne. Cette étape vient en amont de la mise en oeuvre de l'étude scientifique.

Bénéfices attendus

L’identification des effets directs de la lumière sur le cycle veille/sommeil pourrait permettre de participer à la prévention des troubles du sommeil et de leurs conséquences comme les troubles de l'humeur, les troubles métaboliques comme le diabète ou l’obésité, par des approches de photothérapie ciblée et par des recommandations sur des horaires d’exposition à la lumière qui seraient à éviter. Le transfert et la validation de l'approche sur l'espèce diurne permettra à la partie du projet scientifique relative à l'étude du sommeil de démarrer dans des conditions qui garantissent le bien-être des animaux, la qualité des données enregistrées et donc leur exploitation statistique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'une durée de 1h30 réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront placés en cage individuelle à l'issu de la chirurgie pendant une semaine.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut induit une douleur modérée, de l'inflammation au niveau de la plaie cutanée (incision du scalp) ce qui peut conduire l'animal à se gratter et à arracher les points de suture. Dans de très rares cas, une infection pourrait survenir. La contention nécessaire à la mise en place de l'anesthésie pourrait induire un stress léger transitoire. A l'issu de la chirurgie, les animaux seront placés en cage individuelle enrichie pendant une semaine pendant laquelle le suivi de l'état de santé des animaux sera réalisé. Cette situation pourrait induire un stress léger chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour autopsie afin de vérifier macroscopiquement les conséquences tissulaires de la procédure chirurgicale.

Remplacement

La régulation du cycle veille/sommeil et la mesure des effets de la lumière sur ce cycle implique plusieurs stuctures nerveuses et horloges cérébrales qui fonctionnent en réseau interconnectés et l'intégrité de la rétine qui leur relaie l'information lumineuse. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro ou de modéliser in silico la réponse de ce circuit multi-structures.

Réduction

Il n'y aura pas d'analyse statistique des résultats car il s'agit d'acquisition de compétences. Le nombre d'animaux a été défini sur la base de la complexité de la chirurgie, des connaissances du modèle animal et de sa physiologie et du risque anesthésique du fait que ces animaux qui sont diurnes seront opérés de jour moment où ils sont normalement actifs et au pic de leur métabolisme contrairement au rat et à la souris. Dèss que l'approche chirurgicale aura été validée comme reproductible la procédure sera stoppée.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée à l'espèce. Tout au long de la chirurgie, les animaux seront maintenus sur tapis chauffant thermostaté (température de 38°C) muni d'une sonde rectale pour éviter de placer l'animal en hypothermie. Les yeux seront recouvert de gel oculaire hydratant pour éviter le déssèchement de la cornée. La chirurgie sera réalisée en conditions aseptiques. Après la chirurgie, les animaux seront réhydratés par injection d'une solution saline isotonique et stérile puis placés sous lampe chauffante jusqu'à leur complet réveil et sous surveillance. La douleur sera prise en charge avant, pendant et après la chirurgie par la mise en place d'un traitement analgésique post-opératoire par prise de médicaments dans l'eau de boisson. La prise hydrique quotidienne sera alors mesurée. Dès le lendemain de la chirurgie, l'état de santé des animaux sera évalué quotidiennement à l'aide d'une grille de score pemettant d'objectiver des points limites pertinents suffisamment précoces pour interrompre dès que nécessaire la procédure et ainsi limiter la souffrance animale. A l'issu de la chirurgie, les animaux seront hébergés pendant une semaine dans seuls des cages enrichies avec plus du matériel de nidification pour aider à la thermorégulation et un bâton à ronger. Nous validerons que l'ajoût d'un tunnel en verre dans la cage est compatible avec la pose d'électrodes et d'un connecteur à la surface du crâne, afin de garantir l'intégrité du dispositif implanté qui permettra de collecter les données scientifiques et donc d'obtenir un résultat exploitable (principe de réduction).

Choix des espèces

Il s'agit d'un projet de formation visant à transférer une compétence chirurgicale à un modèle de rongeur diurne afin de permettre l'enregistrement du sommeil sur cette espéce. Le sommeil sera étudié sur de jeunes adultes lorsque les structures nerveuses impliquées sont mâtures.

Opérées de la cochlée entre leur sixième et leur neuvième jour de vie pour y recevoir un vecteur viral, 504 gerbilles de Mongolie attendent au moins huit semaines avant une seconde intervention dont elles ne se réveillent pas. Pendant celle-ci, leurs potentiels évoqués auditifs sont enregistrés de quatre à douze heures sous anesthésie entretenue par réinjections. Le niveau de souffrance déclaré est modéré pour la totalité de l'effectif, et le porteur ne mentionne comme nuisances que la douleur suivant l'injection intracochléaire et le stress lié aux piqûres. Toutes sont tuées pour que leur oreille interne et leur cerveau soient examinés au microscope, l'objet étant de préparer un implant cochléaire fonctionnant à la lumière plutôt qu'à l'électricité.

Objectifs

En 2050, près de 2,5 milliards de personnes dans le monde auront des problèmes d’audition. Pour 700 millions d’entre elles, ces problèmes seront très graves. Aujourd’hui, la meilleure solution pour les personnes qui n’entendent presque plus, c’est l’implant cochléaire électrique. C’est un petit appareil placé dans l’oreille interne. Il capte les sons et les transforme en courants électriques pour faire travailler directement les nerfs de l’oreille. Mais il y a un souci : l’électricité stimule trop large. Elle excite beaucoup de nerfs en même temps, ce qui fait perdre la précision des sons. Par exemple, dans un restaurant bruyant ou dans une classe, c’est difficile de comprendre une conversation. Pour améliorer ça, nous travaillons sur une nouvelle idée : utiliser la lumière au lieu de l’électricité. Comment ? On rend les nerfs sensibles à la lumière grâce à des petites protéines spéciales. Ensuite, on envoie de la lumière avec des mini-lampes dans l’oreille. Cette lumière active les nerfs, mais de manière beaucoup plus précise, un peu comme un rayon laser au lieu d’un éclair. Grâce à ça, on espère que les personnes entendront beaucoup mieux et comprendront les voix même dans le bruit. Notre projet a deux buts : Trouver la meilleure manière de rendre les nerfs sensibles à la lumière. Savoir exactement quels nerfs réagissent à cette lumière.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, un million de personnes qui ne pouvaient plus entendre utilisent déjà des implants cochléaires électriques. Grâce à ces appareils, la plupart arrivent à comprendre la parole quand il n’y a pas de bruit, par exemple dans une pièce calme. Mais dès qu’il y a du bruit autour – dans la rue, un restaurant, une salle de classe ou un bureau – ça devient très difficile. Parfois, ils n’arrivent presque plus à comprendre ce qu’on leur dit. Et il y a un autre problème : ils ne peuvent pas vraiment profiter de la musique, car les sons sont trop simplifiés. Pour améliorer ça, nous développons un implant cochléaire qui utilise la lumière. Cette nouvelle technologie devrait permettre d’entendre plus clairement, même quand il y a du bruit, et peut-être aussi de mieux profiter des sons comme la musique. Pour y arriver, il faut deux étapes importantes : Trouver la meilleure façon de rendre les nerfs de l’oreille sensibles à la lumière. Comprendre comment ces nerfs réagissent à la lumière pour pouvoir les contrôler de manière très précise. Ces recherches sont essentielles pour amener un jour cette nouvelle technologie aux patients et leur rendre une audition la plus naturelle possible.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales. La première procédure consiste à injecter un vecteur viral dans les cochlées des animaux entre le sixième et le neuvième jour de vie. Cette procédure permettra de photosensibiliser les neurones cochléaires. Cette procédure nécessitera environ 30 minutes par animal, en incluant l'induction de l'anesthésie et le réveil. La seconde procédure chirurgicale sera réalisée au moins 8 semaines après l’injection du vecteur viral, lors d’une procédure durant laquelle les animaux ne se réveilleront pas. Durant cette procédure, les potentiels évoqués auditifs seront enregistrés sur une durée de 4 à 12 heures. L'état de profonde anesthésie sera maintenu par reinjection régulière d'anesthésiant durant toute la procédure.

Impact sur les animaux

Les différentes nuisances ont été identifiées: - suite à l’injection intracochléaire à 6-9 jours de vie, douleur post-opératoire; - injection d’antalgiques et anesthétiques : stress

Devenir

À la fin de chaque étape, les animaux devront être euthanasiés (endormis définitivement sans douleur). C’est nécessaire car nous devons analyser leur oreille interne (cochlée) et leur cerveau pour vérifier si la thérapie génique a bien fonctionné. Pour cela, il faut prélever ces organes afin de les examiner au microscope.

Remplacement

Les travaux prévus nécessitent une organisation cellulaire extrêmement complexe, formant un réseau qui ne peut pas encore être reproduit en culture cellulaire ou dans les modèles in silico les plus sophistiqués. Une telle organisation cellulaire complexe ne peut être trouvée que chez d'autres mammifères, tels que les rongeurs. En outre, l'objectif du présent travail est de prédire les performances d'un implant cochléaire optique pour l'homme. Nous devons donc utiliser un modèle animal dont le système auditif est anatomiquement et physiologiquement aussi proche que possible de celui de l'homme. Nous avons donc choisi la gerbille de Mongolie. Les données générées seront partagées avec les scientifiques qui développent des modèles informatiques des voies auditives, ce qui permettra, nous l'espérons, d'utiliser des modèles in silico plutôt que des modèles animaux dans le cadre d'études futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été calculé avec soin grâce à un outil statistique. L’objectif est d’utiliser le moins d’animaux possible, tout en s’assurant que les résultats soient fiables. Pour cela, nous avons choisi des critères précis pour garantir que les expériences soient assez puissantes pour montrer un effet réel. Dans ce projet, les deux sexes (mâles et femelles) seront inclus sans faire de distinction.

Raffinement

Le bien-être des animaux est notre priorité pendant toute la durée du projet. Si un animal se retrouve seul, nous ferons en sorte qu’il ne reste pas isolé en le mettant avec d’autres animaux. Au début, un séparateur percé sera utilisé pour qu’ils puissent s’habituer les uns aux autres sans risque. Nous savons que manipuler les animaux peut être stressant pour eux. C’est pourquoi nous allons les habituer doucement à venir d’eux-mêmes sur la main des chercheurs, plutôt que d’être attrapés. Après l’injection (faite très tôt après la naissance), les animaux seront surveillés tous les jours et recevront des médicaments contre la douleur pendant deux jours. Ces médicaments seront donnés après une courte anesthésie (moins de 5 minutes) pour éviter tout stress. Si nous voyons qu’un petit n’est pas bien (par exemple, s’il n’est plus soigné par sa mère), il recevra des soins supplémentaires après avis d’un vétérinaire. Si malgré tout son état ne s’améliore pas, il sera endormi sans douleur. De même, si un animal montre des signes de souffrance plus tard, nous utiliserons une grille d’évaluation spéciale et, après avis du vétérinaire, il recevra des soins ou sera euthanasié.

Choix des espèces

Notre objectif est de savoir si l’implant cochléaire optique pourrait bien fonctionner chez l’être humain. Pour cela, nous devons faire des tests sur un animal qui a une oreille très semblable à celle de l’homme. Nous avons choisi la gerbille de Mongolie, un petit rongeur. Elle entend presque comme nous et sa grande oreille facilite l’accès à la cochlée pour y mettre un implant ou injecter le vecteur viral. Le vecteur viral (qui sert à rendre les nerfs sensibles à la lumière) sera injecté quand les petits ont entre 6 et 9 jours. Pourquoi ? Parce que le traitement marche beaucoup mieux à cet âge. Parce qu’à cet âge, l’os autour de l’oreille n’est pas encore formé, ce qui permet de faire l’injection sans opération lourde. Après 10 jours, cet os se durcit et il faudrait une chirurgie beaucoup plus invasive. Enfin, les mesures (tests) seront faites au moins 8 semaines plus tard, quand les animaux seront adultes et que leur système nerveux sera complètement développé.

Sédatés pour une IRM et un scanner, transportés entre deux établissements dans un sac opaque, puis anesthésiés pour l'implantation chirurgicale d'électrodes cérébrales, 6 serpents adultes nés en captivité sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avant d'être réutilisés dans un autre programme de recherche. Une semaine de récupération plus tard, l'équipe contrôle la position des électrodes par un second scanner, puis les enregistrements commencent, quatre jours par température testée. Vient ensuite la privation de sommeil : dès que l'animal adopte la posture enroulée typique du repos, un expérimentateur le stimule, et un micro-vibreur sert à mesurer son seuil de réveil pendant quatre jours. Le porteur écrit qu'"aucune douleur n'est induite" par cette privation, tout en décrivant une hausse du stress, de l'agitation, une baisse de vigilance et une altération temporaire des rythmes biologiques.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser le sommeil des serpents, dernière grande lignée de reptiles encore non étudiée dans l’évolution du sommeil. Le projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Leur physiologie atypique (absence de paupières, forte inactivité, faible métabolisme) en fait un modèle pertinent pour redéfinir les critères de sommeil chez les reptiles. Pour ce faire, nous allons enregistrer en télémétrie l’activité cérébrale et les paramètres physiologiques associés (tonus musculaire, fréquence cardiaque, respiration, activité des yeux) chez des serpents, et en les comparant aux états d’éveil calme et actif. Afin de déterminer si les animaux dorment, nous évaluerons leur seuil de réveil et leur réponse à la privation de sommeil. L’effet de la température sera aussi évalué du fait que le comportement de ces animaux est extrêmement lié à la température ambiante.

Bénéfices attendus

Ce projet aidera à mieux définir les critères comportementaux et physiologiques du sommeil chez des espèces qui ne présentent pas les signes typiques observés chez les mammifères. Il complétera aussi notre compréhension parcellaire sur l’évolution des états de sommeil et notamment du sommeil paradoxal. Les résultats de ce projet pourraient aussi avoir un impact sur le bien-être animal en identifiant les conditions favorables à un sommeil réparateur chez les serpents, ces données pourront ainsi améliorer les pratiques d’élevage, de détention et de conservation des reptiles, notamment pour les espèces menacées ou maintenues en captivité (zoos, centres de sauvegarde).

Procédures

Les animaux subiront une sédation pour passer une IRM et un scanner dans l’EU2 (1 journée). Ensuite, ils subiront une anesthésie générale permettant une intervention chirurgicale dans l’EU1 EU1 afin de mettre en place des électrodes d’enregistrement, suivie d’un traitement antalgique postopératoire. Après une phase de récupération (1 semaine), les animaux seront à nouveau sédatés pour passer un nouveau scanner (EU2) et vérifier la position des électrodes. Ils seront ensuite enregistrés dans l’EU1 en télémétrie dans leur propre terrarium à différentes températures, 4 jours par température. Après 1 jour d’acclimatation, ils seront privés de sommeil par une stimulation douce (dès que l'animal prendra une posture enroulée sur lui-même, typique d'une posture de sommeil) et sa récupération sera monitorée. Enfin, après 4 jours, une évaluation du seuil de réveil (à l’aide d’un micro-vibreur induisant des vibrations légères) sera réalisée pour estimer les latences de réveil et la profondeur du sommeil (4 jours). Pendant la durée des enregistrements, les animaux seront stabulés dans un terrarium adapté à leur taille et ne seront pas dérangés outre le remplacement des batteries du dispositif d’enregistrement entre chaque protocole.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues concernent l’intervention chirurgicale d’implantation d’électrodes et la phase expérimentale de privation de sommeil. L’implantation d’électrodes, bien que réalisée sous anesthésie générale, constitue une procédure invasive. Elle peut provoquer une douleur transitoire post-opératoire, une réduction temporaire de la mobilité, une perte d’appétit ou une altération du comportement. Un inconfort local (lié à la cicatrisation ou à la présence des électrodes) est également possible dans les jours suivant l’intervention. Chez les reptiles, ces effets sont souvent discrets mais seront systématiquement recherchés. La phase d’enregistrement, bien qu’exempte de contrainte physique, impose le port d’un dispositif fixé sur le crâne. Celui-ci peut gêner légèrement les mouvements ou induire un stress comportemental transitoire, notamment au moment de sa mise en place. Toutefois, les serpents étudiés étant peu mobiles et dociles, ces effets sont attendus comme modérés. La privation de sommeil, réalisée par stimulation douce manuelle en période de repos, peut entraîner une augmentation du stress, une agitation ponctuelle ou une altération du comportement exploratoire. Chez les reptiles, les effets secondaires restent généralement limités mais incluent une possible fatigue, une baisse de vigilance ou une altération temporaire des rythmes biologiques. Aucune douleur n’est induite par cette procédure. Des manipulations régulières sont nécessaires pour les soins post-opératoires, le changement de batterie et les tests de réactivité. Elles peuvent provoquer un stress ponctuel ou une réponse de défense, bien que les individus soient habitués au contact humain. Enfin, un risque faible de complications chirurgicales (infection locale, mauvaise cicatrisation, rejet du matériel) existe, bien qu’il soit réduit par l’expérience de l’équipe et le protocole appliqué. Ces effets sont rares mais potentiellement délétères pour l’individu concerné.

Devenir

Il est prévu que les animaux soient réutilisés après l’expérimentation dans un programme de recherche comparative.

Remplacement

Le sommeil est un phénomène à la fois comportemental, neurophysiologique et physiologique, impliquant de nombreuses fonctions intégrées telles que l’activité cérébrale, les rythmes circadiens, les régulations hormonales, métaboliques, cardiovasculaires et thermiques. Ces fonctions interconnectées ne peuvent pas être reproduites ni simulées de manière fiable à l’aide de modèles in vitro, in silico ou ex vivo. De plus, l’étude de l’évolution des états de sommeil nécessite une approche comparative entre espèces vivantes, dans leur intégrité biologique, afin de caractériser les similitudes et différences entre groupes phylogénétiques. Chez les reptiles, et en particulier les serpents, aucun modèle substitutif n’existe aujourd’hui pour étudier les états de sommeil de manière complète (comportement, physiologie, activité cérébrale). Ainsi, l’utilisation de l’animal est indispensable et constitue la seule méthode permettant de répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. Il n’existe donc actuellement aucune alternative éthique ou technique permettant de se passer de l’animal pour ce type d’étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en tenant compte à la fois des exigences méthodologiques et des principes de réduction. L’objectif principal est de caractériser un phénomène biologique présent dans une espèce : le sommeil. Pour cela, il est nécessaire d’observer ce phénomène chez plusieurs individus afin de démontrer sa constance et de contrôler les variations interindividuelles. Nos travaux antérieurs et ceux d’autres équipes ayant étudié les lézards ont montré que 6 individus étaient suffisants et nécessaires pour identifier et caractériser finement un état de sommeil, son homéostasie et son seuil de réveil associé. Le design expérimental a été rigoureusement conçu pour limiter le nombre d’animaux tout en assurant la robustesse des données. Une étude pilote sur un python tapis a permis de déterminer notre capacité à obtenir des signaux de qualité en ciblant des structures cérébrales précises. L’utilisation de techniques d’imagerie pré- et post-opératoire (IRM/Scanner) pour guider l’implantation, ainsi que la maîtrise technique des interventions, permet de garantir un taux de succès élevé, réduisant ainsi le nombre d’animaux. L'ensemble des procédures suit une logique intra-individuelle : chaque animal sert de témoin à lui-même avant et après privation, avant et après nourrissage, avant et après changement de température, ce qui permet de réduire considérablement le nombre total requis tout en augmentant la puissance des comparaisons.

Raffinement

Les études sur le sommeil nécessitent des observations sur des animaux non anesthésiés vivants dans de bonnes conditions psychophysiologiques. Le bien-être des animaux est donc une condition sine qua non de chaque étape de l’expérimentation. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. L'environnement sera notamment enrichi de branches et de substrats adaptés pendant les périodes d’acclimatation et de récupération. Durant les enregistrements, l’animal est libre de ses mouvements dans son propre terrarium. Les animaux seront transportés entre les établissements, sédatés, dans un sac opaque, adapté au transport de serpent afin de réduire leur stress. Les mesures de raffinement lors du transport incluent le maintien d’une température stable et adaptée à l’espèce, la réduction des vibrations et du bruit, ainsi qu’une manipulation minimale pour limiter le stress et tout risque de réveil ou de blessure. Par ailleurs, une grille de suivi du bien-être animal, et des points limités adaptés et précoces, spécifiques à l’espèce ont été mis en place en consultant des spécialistes (vétérinaires, éleveurs, herpétologues). Les décisions relatives aux points limites sont prises en concertation avec le vétérinaire référent et des spécialistes des serpents, si un comportement inhabituel est identifié.

Choix des espèces

L’objectif est d’étudier le sommeil des serpents, dernière grande lignée de squamates encore peu étudiée dans l’évolution du sommeil. Leur physiologie atypique (absence de paupières, forte inactivité, faible métabolisme) en fait un modèle pertinent pour redéfinir les critères de sommeil chez les reptiles. Toute espèce appartenant au sous-ordre des serpents pourrait donc être choisie. Cependant, beaucoup d’espèces de serpents ne sont pas adaptées à cette expérimentation, pour des raisons de statut de protection, de taille, de disponibilité en élevage et de dangerosité. Nous nous tournons ainsi vers des espèces de serpent de grande taille, calmes, non venimeuses et disponibles facilement en élevage. Les individus doivent avoir une tête de taille adaptée à l’implantation stable d’électrodes pour l’étude du sommeil. Leurs morphologies et leurs comportements moteurs doivent aussi faciliter les interventions, avec un risque minimal de blessure ou de stress durable. Phylogénétiquement, M. spilota, et B. constrictor sont tous les deux des représentants du groupe des serpents qui pourraient convenir. Les individus choisis, seront adultes (>5 ans) nés en captivité, et habitués aux manipulations . M. spilota, et B. constrictor par exemple, offrent un compromis optimal entre pertinence scientifique, faisabilité technique et respect du bien-être animal. Par ailleurs, les deux espèces présentent le même mode de vie semi-arboricole et le même régime alimentaire, et ce sont deux espèces assez courantes en élevage. Elles constituent donc des modèles cible.