Système nerveux
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Développement d’anticorps de type VHH dirigés contre la protéine prion chez le rongeur, à visée diagnostique et/ou thérapeutique
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Chaque souris reçoit six injections d'immunogènes espacées de trois semaines, six prélèvements sanguins, puis trois injections supplémentaires dans les cinq jours précédant sa mise à mort. 100 souris sont utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour produire des nanocorps dirigés contre la protéine prion. Le porteur décrit ces quinze interventions comme de "légères gênes temporaires" qui ne devraient entraîner "ni douleur importante ni effet durable", quand la gravité déclarée du projet est modérée. Toutes sont tuées dès que la réponse en anticorps est jugée correcte, pour prélever la rate.
Objectifs
Ce projet a pour but de produire un type particulier d’anticorps appelés VHH ou nanocorps. Ces anticorps sont beaucoup plus petits que les anticorps classiques. Leur petite taille est intéressante car elle leur permettrait, en théorie, de franchir plus facilement la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre la possibilité d’imaginer un jour des traitements pour des maladies qui touchent directement le système nerveux. Nous voulons produire ces anticorps contre la protéine prion (PrP). Cette protéine est responsable des maladies à prion, qui touchent l’animal et l’Homme, et qui sont toujours fatales car il n’existe actuellement aucun traitement. Les nanocorps obtenus pourraient servir à mieux comprendre comment ces maladies se développent, à améliorer leur diagnostic et à explorer de nouvelles pistes de traitement. Nous cherchons aussi à produire des nanocorps capables de reconnaître non seulement la forme « normale » de la protéine prion, mais aussi certaines formes anormales associées aux maladies. Cela permettrait d’obtenir des anticorps plus spécifiques et plus utiles que ceux dont nous disposons aujourd’hui. Enfin, la protéine prion est également impliquée dans d’autres maladies, comme certains cancers ou encore la maladie d’Alzheimer et de Parkinson. La production de nanocorps dirigés contre la protéine prion pourrait donc avoir un intérêt bien au-delà des seules maladies à prion, et bénéficier à un domaine plus large de la recherche biomédicale.
Bénéfices attendus
Les anticorps de type VHH, aussi appelés nanocorps, sont des outils innovants qui possèdent plusieurs avantages par rapport aux anticorps classiques. Leur petite taille leur permet de se fixer sur des cibles difficiles d’accès et, en théorie, de franchir la barrière protectrice qui sépare le sang du cerveau. Cela ouvre des perspectives uniques pour envisager un jour des traitements de maladies qui touchent directement le système nerveux. Ils sont aussi très stables, faciles à produire en laboratoire et peuvent être utilisés sous différentes formes pour la recherche, le diagnostic ou le traitement. Ces nanocorps sont déjà étudiés dans d’autres maladies humaines, par exemple certains cancers, des maladies infectieuses, ou encore des maladies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Leur potentiel d’application est donc très large. À ce jour, il n’existe aucun nanocorps dirigé contre les maladies à prion. Ce projet vise à combler ce manque en développant une nouvelle génération d’anticorps contre la protéine prion. L’intérêt dépasse les maladies à prion elles-mêmes, car la protéine prion est aussi impliquée dans d’autres pathologies. Les bénéfices de ce projet seront donc multiples : - fournir de nouveaux outils de recherche pour mieux comprendre le rôle de la protéine prion, - permettre un diagnostic plus précoce et plus précis des maladies à prions, - et à plus long terme, ouvrir des pistes thérapeutiques innovantes grâce à la petite taille des nanocorps, qui pourrait leur permettre d’atteindre le cerveau et de cibler spécifiquement les formes anormales de la protéine prion.
Procédures
100 souris sont prévues pour le projet. Pour chaque animal, les gestes techniques seront les suivants : - injection d’analgésique avant injection des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigile. Il faut compter 30 secondes par intervention. - Injections des immunogènes à hauteur de 6 injections toutes les 3 semaines sur animaux vigiles. Il faut compter 1 minute maximum par intervention (contention et injection) - Prélèvements sanguins sur animaux vigiles 1 prélèvement avant la première injection puis toutes les 2 semaines après chaque immunisation, soit 6 prélèvements. Il faut compter 2 minutes par intervention (contention, prélèvement puis massage de la joue) - Cinq jours avant la mise à mort, 3 injections toutes les 24h d’immunogènes sur animaux vigiles. Il faut compter environ 1 minute par intervention (contention et injection).
Impact sur les animaux
Les interventions prévues (injections et prises de sang) peuvent provoquer de légères gênes temporaires chez les souris, mais elles ne devraient pas entraîner de douleur importante ni d'effet durable. Les effets observés peuvent être une petite rougeur ou un léger gonflement à l'endroit de l'injection ou de la prise de sang ; une sensibilité locale passagère ; un léger inconfort dans les heures suivant la manipulation. Il peut arriver que certains animaux soient un peu moins actifs ou mangent un peu moins pendant un jour ou deux, ou qu'ils perdent légèrement du poids. Ces effets disparaissent généralement rapidement, sans conséquence sur leur état général.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la campagne d’immunisation quand les réponses en anticorps seront correctes afin de prélever la rate.
Remplacement
Il existe aujourd’hui des méthodes permettant de produire des anticorps sans utiliser d’animaux, par exemple des techniques de sélection réalisées uniquement en laboratoire., Cependant, ces approches n’aboutissent pas encore à des anticorps de même qualité que ceux produits par le système immunitaire d’un animal. En effet, l’organisme possède un mécanisme naturel qui « améliore » progressivement les anticorps pour qu’ils se fixent très efficacement à leur cible, un processus qui ne peut pas être reproduit artificiellement avec les techniques actuelles. Dans ce projet, les souris sont utilisées pour générer des cellules capables de produire durablement des anticorps. Ces cellules seront ensuite immortalisées en laboratoire et permettront de produire les anticorps sur le long terme, sans avoir à réutiliser de nouveaux animaux pour chaque antigène ou chaque série d’expériences.
Réduction
Le nombre de 5 souris par antigène a été déterminé à partir d’un calcul statistique. L’objectif est de garantir, avec une forte probabilité, que au moins deux souris par lot développent une bonne réponse immunitaire. Cela est nécessaire pour pouvoir utiliser leurs cellules et produire les anticorps sans avoir à recommencer tout le protocole depuis le début. En pratique, il est bien connu qu’une ou deux souris sur cinq peuvent ne pas répondre correctement aux immunisations. Le choix de 5 animaux tient donc compte de cette variabilité naturelle tout en évitant d’utiliser plus de souris que nécessaire. De plus, si la première tentative de production d’anticorps en laboratoire échoue (ce qui est rare), les trois souris restantes du lot servent de filet de sécurité. Cela permet de refaire un essai sans devoir réimmuniser un nouveau groupe d’animaux, ce qui contribue directement à réduire leur nombre sur l’ensemble du projet.
Raffinement
Trente minutes avant l’intervention les animaux recevront une injection d’analgésique. Après les interventions, les animaux seront surveillés et placés sur un tapis chauffant à 37°C pendant 2 heures pour favoriser leur récupération. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Les lignées de souris de laboratoires sont classiquement utilisées pour l’immunisation et la production d’anticorps. Les souris transgéniques exprimant des anticorps de camélidés évitent le recours à ces espèces, protocole beaucoup plus difficile à mettre en œuvre. De jeunes adultes (6 à 8 semaines) seront utilisés au démarrage des immunisations ; ils ont en effet la maturité immunologique nécessaire pour produire de bonnes réponses immunitaires lors des immunisations successives.
Determiner les modulations du phénotype microglial dans les pathologies neurodégénératives pour détecter des biomarqueurs précoces et développer de nouvelles approches thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Chercher des biomarqueurs précoces des maladies neurodégénératives dans la rétine et le cerveau conduit à utiliser 6 104 souris, toutes tuées à l'issue pour prélever système nerveux central, ganglions lymphatiques et rates. 5 240 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 64 un niveau léger, et 800 sont opérées sous anesthésie puis tuées avant tout réveil. 5 304 souris subissent des lavages oculaires vigiles, 6 040 des injections intrapéritonéales cinq jours de suite dont 2 000 des injections de toxine, et 3 240 des interventions chirurgicales de 30 minutes à 2 heures avant une mise à mort trois à neuf semaines plus tard. La toxine provoque une hypothermie marquée pouvant aller jusqu'à une mortalité aiguë, quand les retombées annoncées, prévenir ou ralentir des pathologies "toujours incurables", restent au conditionnel.
Objectifs
Avec près de 2 millions de cas en France, l’impact sociétal des maladies neurodégénératives est extrêmement élevé et devrait augmenter à l’avenir en raison de la proportion toujours croissante de la population âgée de plus de 65 ans. Ces maladies se caractérisent à la fois par la dégénérescence progressive de certains neurones et par l’apparition d’une inflammation marquée et chronique dans le cerveau. Cette neuroinflammation implique à la fois l’activation de cellules résidentes (astrocytes et microglies) et une infiltration de cellules immunitaires de la périphérie, notamment de lymphocytes et de macrophages. Plusieurs études dont les nôtres ont démontré que la neuroinflammation participe activement à la progression pathologique, a minima en exacerbant les lésions neuronales, voire précédant ces lésions. Dans de précédentes expériences, nous avons mis en évidence un rôle majeur d'une protéine dans la microglie, dans l’orchestration de ces phénomènes dans des modèles de la maladie de Parkinson. Le projet actuel vise d’une part à étudier le rôle de 3 partenaires de cette protéine sur le phénotype microglial, et d’autre part à élargir l’étude à d’autres modèles physiopathologiques impliquant la microglie, notamment au cours du vieillissement et de la maladie d’Alzheimer. Nos travaux permettront de mieux comprendre ces phénomènes biologiques complexes et de déterminer de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces pathologies toujours incurables. Nous mettrons également en évidence des biomarqueurs précoces de ces conditions physiologiques et pathologiques permettant diagnostique et un pronostique précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et physiopathologiques impliqués dans les pathologies neurodégénératives, liées ou non au vieillissement. Il permettra en particulier de mieux caractériser la participation des phénomènes inflammatoires dans le déroulement physiopathologique, et de révéler les évènements précoces au niveau de la rétine. Les résultats obtenus pourront ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les fonctions microgliales, permettant la prévention ou un ralentissement de la progression de cette pathologie chez les patients. Par ailleurs, les résultats de ce projet permettront d’identifier des biomarqueurs pronostiques précoces, utiles à la fois pour le diagnostic et le suivi clinique des patients. Ces avancées sont particulièrement cruciales pour des maladies pour lesquelles aucune option thérapeutique curative n’est à ce jour disponible.
Procédures
Au cours de ces procédures, les animaux seront soumis à des prélèvements issus de lavages oculaires sur animal vigile (5304 animaux). Des animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales (5 jours consécutifs) sur animal vigile (6040 animaux). Parmi ces derniers, certains seront soumis à 2 séries d'injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs dont des injections de toxine (2000 souris). Certains animaux seront soumis à des interventions chirurgicales sous anesthésie générale (3240 souris). Les interventions dureront 30 minutes à 2h et les animaux seront mis à morts 3 à 9 semaines après l'intervention.
Impact sur les animaux
Les injections par voie intrapéritonéale nécessitent une contention forte qui peut induire de l’anxiété, mais aucune des molécules injectées ne provoque de la douleur post-administration. LEs modèles de la maladie de Parkinson utilisés dans ce projet sont asymptomatiques. Néanmoins, l’administration de toxine entraîne une hypothermie transitoire marquée, susceptible de provoquer une instabilité cardiovasculaire pouvant aller jusqu’à une mortalité aiguë. Les injections stéréotaxiques et intravitréennes seront réalisées sous anesthésie générale, induisant une perte de la capacité de thermorégulation ainsi que des douleurs post-opératoires, minorées par les antalgiques.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. Le organes (systèmes nerveux central, ganglions lymphatiques, rates) seront récupérés pour réaliser des analyses cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Contrairement aux modèles in vitro, l’expérimentation animale permet de restituer la complexité spatio-temporelle des réponses cellulaires dans leur environnement physiologique, en tenant compte de la diversité des types cellulaires impliqués, de leur état métabolique spécifique, ainsi que de leurs interactions fonctionnelles. Les modèles cellulaires immortalisés ou les systèmes in vitro, bien qu’utiles pour des analyses mécanistiques ciblées, ne permettent pas de reproduire avec précision les régulations métaboliques fines ni les interactions neuro-immunitaires observées dans un organisme vivant. Le recours à l’expérimentation animale constitue ainsi une étape indispensable pour valider les hypothèses dans un contexte physiologique pertinent. Une fois ces mécanismes validés in vivo, nous approfondirons l’étude des processus moléculaires à l’aide de cultures primaires de neurones, de microglies et de lymphocytes, ainsi que par le biais de cultures organotypiques de rétine murine que nous avons développées au sein du laboratoire.
Réduction
Nous planifierons rigoureusement chaque expérience afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant la robustesse statistique des résultats obtenus. Les modèles d’induction de la maladie de Parkinson sélectionnés ont déjà été validés au sein de notre équipe et chez nos collaborateurs, ce qui nous permet d’optimiser la taille des groupes expérimentaux ; des cohortes de 10 souris sont nécessaires pour obtenir des données exploitables. Pour le modèle de synucléinopathie, l’approche retenue repose sur l’injection unilatérale du vecteur d'intérêt dans un œil, tandis que l’autre œil reçoit un vecteur contrôle, ce qui permet de réduire significativement le nombre d’animaux tout en limitant la variabilité interindividuelle. Par ailleurs, dans la mesure du possible, nous analyserons un ensemble étendu de paramètres cellulaires, moléculaires et transcriptionnels sur les mêmes individus, afin d’optimiser l’exploitation des tissus et de limiter le recours à des procédures expérimentales supplémentaires.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera une priorité tout au long de nos expérimentations et fera l’objet d’un suivi rigoureux, conformément aux recommandations du comité local de suivi du bien-être animal (SBEA) de notre établissement. Les souris seront hébergées en groupes dans des cages de surface adaptée, avec accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. L’environnement sera systématiquement enrichi (présence de coton pour la construction de nids, tunnels), et une période d’acclimatation à l’hébergement (1 semaine) puis à la manipulation et à la contention (2 semaines) sera mise en place afin de réduire le stress lié aux interventions. La douleur et l’angoisse seront systématiquement limitées par l’utilisation d’analgésiques et le recours à l’anesthésie générale lors des procédures invasives. Afin de prévenir cette baisse de température corporelle, les animaux seront placés sur un tapis chauffant pendant au moins une heure (ou jusqu’au réveil si anesthésie générale) après les interventions afin de leur permettre de maintenir une température compatible avec la récupération de leur capacité de thermorégulation. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé dès l’initiation des procédures expérimentales, permettant d’évaluer leur état général (prise alimentaire, comportement social, locomotion, toilettage), et d’intervenir rapidement si nécessaire, notamment via l’aide à l’alimentation ou des ajustements environnementaux. Des critères d’arrêt précis, validés par le SBEA, permettront d’interrompre immédiatement toute expérimentation en cas de dégradation de l’état de santé d’un animal. Tout animal présentant un ou plusieurs de ces signes sera euthanasié sans délai, dans le respect des protocoles en vigueur. Les responsables du projet sont titulaires des autorisations à l’expérimentation animale et à la chirurgie.
Choix des espèces
L’étude des processus de mort neuronale et de neuroinflammation nécessite le recours à des modèles capables d’intégrer l’ensemble des mécanismes physiopathologiques impliqués ces pathologies complexes, qui impliquent différents types cellulaires de différents systèmes physiologiques. À ce jour, aucune méthode alternative ne permet d’obtenir des résultats exploitables et pertinents au regard de la pathologie humaine. La souris a été choisie en raison de son faible coût, de sa facilité de manipulation, et de sa bonne tolérance aux procédures expérimentales. Le fond génétique C57BL/6J est celui qui présente la meilleure susceptibilité aux modèles utilisés. Ce choix est également justifié par la disponibilité d’outils génétiques adaptés : notre projet repose sur l’utilisation de lignées murines génétiquement modifiées exclusivement disponibles dans ce modèle. Par ailleurs, de nombreux outils moléculaires et immunologiques validés sont disponibles pour cette espèce, rendant possible une dissection fine des mécanismes pathologiques à l’échelle cellulaire. Nous utiliserons des souris âgées de 6 à 10 semaines au début de l'expérience. A ce stade, les souris ont terminé leur croissance et possèdent un système neuronal et immunitaire mature et fonctionnel.
Évaluation préclinique des effets potentiellement anxiolytiques et pro-cognitifs d’une nouvelle classe de modulateurs allostériques (‘nanobodies’) du récepteur nicotinique alpha7
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Habituation à l'expérimentateur pendant plusieurs jours, puis une à deux injections de composés répétées jusqu'à quatre fois, deux à trois tests comportementaux d'une heure par jour, un stress aigu induit pharmacologiquement jusqu'à quatre fois, et pour certaines un stress chronique de contention d'une heure par jour pendant deux semaines : 832 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 264 d'entre elles et modéré pour 568. Le porteur attend une anxiété chronique, une perte de poids légère et de possibles altérations de l'état général chez les animaux soumis à la contention répétée. Il précise que les souris ne pourront pas être réutilisées pour tester plusieurs doses d'un même composé, faute de connaître l'ampleur et la durée des effets. Tous les cerveaux sont prélevés après mise à mort, pour des expériences ex vivo sur des modulateurs d'un récepteur nicotinique.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de tester pour la première fois, chez des modèles murins en conditions basales ou après exposition à un stress, les effets potentiellement anxiolytiques et/ou pro-cognitifs d’une nouvelle classe de composés pharmacologiques très sélectifs et capables de stimuler des récepteurs ayant précédemment été impliqués dans les déficits cognitifs associés à plusieurs pathologies neuropsychiatriques et plus récemment à l’anxiété.
Bénéfices attendus
Les pathologies neurodégénératives, neurodéveloppementales et psychiatriques associées à des troubles anxieux et/ou cognitifs représentent l’un des enjeux majeurs de santé publique, et leur prévalence s’accroit. Il n’existe à ce jour pratiquement aucun traitement efficace pour soigner ces pathologies, notamment les troubles cognitifs et l’anxiété qui leur sont associés. A court terme, ce projet devrait permettre une première identification des effets thérapeutiques potentiels d’une nouvelle classe de composés pharmacologiques ciblant certains récepteurs aux neurotransmetteurs, sur ces aspects. Ce projet générera des bases solides pour des études précliniques plus approfondies en vue de futures études cliniques avec nos collaborateurs proches qui ont accès à des cohortes de patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux à trois tests comportementaux d’1h maximum par jour, ce jusqu’à quatre fois, susceptibles d’entraîner un stress passager. Ils recevront une à deux injections de composés pharmacologiques, ce répété un maximum 4 fois par animal. Certains animaux seront exposés à un stress aigu induit pharmacologiquement de durée d’une heure maximum, jusqu’à quatre fois. Certains animaux seront exposés à un stress chronique de contention pendant 1 heure par jour pendant deux semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent éprouver un inconfort et une douleur légers de courte durée liés à l’introduction de l’aiguille. Les animaux sont susceptibles d’éprouver une anxiété transitoire lors de la soumission à un stress aigu, celle-ci devrait disparaitre au bout de quelques heures maximum, on n’attend pas d’altération de l’état général. Les animaux sont susceptibles d’éprouver une anxiété chronique lors de la soumission à un stress chronique (contention quotidienne durant 1h pendant deux semaines). On peut s’attendre à une perte de poids légère et à de possibles altérations de l’état général et du comportement qui devraient rester légères pendant cette période (une étude montre une perte de poids de 5% après 4 semaines de contention quotidienne de 6h.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure car les cerveaux seront prélevés pour des expériences ex vivo
Remplacement
Pour identifier les effets potentiels thérapeutiques de nouveaux composés sur les processus cognitifs et anxieux, il est essentiel de faire des mesures sur des modèles animaux ayant un système nerveux entier et fonctionnel, et d’étudier les comportements et les états émotionnels associés au plus près de la façon dont ils se manifestent chez l’homme. Ceci ne peut, par essence, être réalisé autrement que sur des animaux vivants, ayant une connectivité physiologique intègre entre les différentes régions du cerveau et un degré de développement de leurs fonctions émotionnelles et cognitives suffisant pour en faire des modèles d’étude pertinents
Réduction
La méthodologie statistique a été réfléchie et discutée en amont de la soumission de ce projet sur la base de notre expertise de longue date et de la littérature. Dans nos études, la variabilité inter-individuelle est élevée. Il est donc nécessaire de tester au moins 12 animaux, respectivement, par groupe expérimental, sexe et conditions pour obtenir des résultats statistiquement robustes. Un groupe contrôle adapté d’animaux sera systématiquement prévu pour chaque jeu d’expériences et sera spécifique de chaque condition expérimentale testée. Le nombre d’animaux par groupe se base d’une part sur notre expérience solide des procédures et des modèles et souche d’animaux qui seront utilisés dans ce projet, et d’autre part sur la littérature, très abondante sur le sujet et dans laquelle la même souche de souris est couramment utilisée. Notre expérience en études comportementales et marquages cellulaires nous a déjà permis de réduire cette variabilité et de mieux la prendre en compte pour l’expliquer. Les paramètres mesurés seront ensuite comparés entre groupes, sexes et conditions pour comparer les groupes. Les animaux ne pourront pas être réutilisés pour tester plusieurs doses d’un même composé car nous ne connaissons pas encore ni l’ampleur ni la durée des effets susceptibles d’être observés. Sur cette base, nous nous efforcerons de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés en ajustant au mieux les protocoles expérimentaux et les analyses statistiques pour obtenir des résultats statistiques robustes tout en tenant compte de la variabilité inter-individuelle des animaux testés.
Raffinement
Avant chaque expérience nous passerons plusieurs jours à manipuler les animaux afin de les habituer à l’expérimentateur et à la manipulation. Il y aura, sauf circonstance imprévue, seulement un expérimentateur par groupe expérimental. Entre les expériences, les animaux seront laissés tranquilles dans leurs cages au maximum et surveillés plusieurs fois par semaine. et nous nous rapprocherons de la structure responsable du bien-être animal (SBEA) pour redéfinir les conditions optimales d’enrichissement si besoin. Par exemple, du gel hydrique pourra être proposé aux animaux en cas de dénutrition et /ou perte de poids. L’exposition au stress étant utilisé pour la première fois par notre équipe, une évaluation sera faite en continue avec le vétérinaire et la SBEA pour améliorer le bien-être sans interférer l’objectif scientifique. Des points limites sont établis pour chaque procédure avec des actions correspondantes pour limiter la douleur à son minimum sans compromettre les résultats scientifiques.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire. La souris est, en outre, un modèle particulièrement intéressant lorsqu'on souhaite mettre en œuvre des tests relativement rapides mais largement validés et riches en information pour mesurer les fonctions cognitives et les niveaux d’anxiété. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 10 semaines), afin que le cerveau soit suffisamment développé notamment pour l’étude de leur comportement.
Analyse de l’effet preventif et curatif du vieillissement par des extraits de plantes sur la mémoire et la cognition
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Six tests comportementaux, dont des tests destinés à évaluer des états de type anxieux ou dépressif, qualifiés de "simples, sans douleur" : 400 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. L'extrait végétal est administré dans l'eau de boisson, sans geste invasif, et la seule nuisance retenue est la contention nécessaire à l'injection de la surdose anesthésique qui les tue. Les cerveaux sont prélevés pour analyses histologiques, biochimiques et moléculaires, afin de tester si cet extrait prévient le vieillissement cérébral non pathologique. Le porteur retient des souris de douze mois, assez âgées pour présenter des signes de vieillissement et assez jeunes pour supporter un traitement long, et précise que le produit est déjà vendu dans le commerce et sa sécurité démontrée chez l'humain.
Objectifs
Ce projet vise à évaluer les effets du traitement par un extrait végétal connu pour ses propriétés neuroprotectrices, sur la mémoire, la cognition et le bien-être général chez des souris âgées. Cet extrait végétal a aussi un effet bénéfique sur les sujets avec maladie d’Alzheimer. L’hypothèse centrale est que cet extrait végétal, administré par voie orale, pourrait prévenir ou atténuer les effets du vieillissement cérébral non pathologique. Ceci pourrait à long terme contribuer à la validation scientifique de substances d’origine naturelle comme options thérapeutiques ou complémentaires dans la prévention ou la prise en charge des troubles cognitifs.
Bénéfices attendus
Le vieillissement cérébral entraîne souvent un déclin progressif des fonctions cognitives (mémoire, attention, apprentissage) ainsi que des troubles de l’humeur et de la motivation. Les options pour prévenir ce déclin lié à l’âge restent limitées. Ce projet vise à tester les effets d’un extrait végétal, utilisé dans certaines maladies neurologiques, sur la cognition et le bien-être de souris âgées. Les tests comportementaux évalueront la mémoire, la reconnaissance d’objets, la motivation, l’exploration et la qualité des nids, offrant une vue d’ensemble de l’impact du traitement. Si les résultats sont positifs, cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles stratégies préventives chez l’humain, d’autant que cet extrait végétal présente un bon profil de tolérance. Le projet aidera aussi à identifier des biomarqueurs du vieillissement cérébral, utiles pour suivre de futures interventions.
Procédures
Les animaux seront soumis à six tests comportementaux simples, sans douleur, afin de mesurer leur mémoire, activité locomotrice, anxiété, dépression. Chaque test sera effectué une seule fois. La durée de ces tests varie entre 6 minutes et 20 minutes pour chaque souris. Une légère nuisance est engendrée lors de la contention pour l’injection de la surdose anesthésique qui dûre 3-5 secondes.
Impact sur les animaux
Les études précédentes n’ont mis en évidence aucun effet secondaire majeur ni indésirable sur les animaux. Toutefois, une légère nuisance peut être engendrée lors de la contention nécessaire pour l’injection de la surdose anesthésique. De plus, certains tests comportementaux, tels que ceux visant à évaluer des états de type anxieux ou dépressif, peuvent induire un niveau de contrainte ou de stress léger et transitoire pour les animaux. L’ensemble de ces nuisances est considéré comme léger et de courte durée, sans conséquence durable sur le bien-être animal.
Devenir
Mise à mort: La mise à mort des animaux est justifiée par la nécessité de poursuivre les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires permettant de comprendre les effets des extraits végétaux sur le vieillissement cérébral et les fonctions cognitives. Ces investigations exigent le prélèvement de tissus cérébraux intacts, fixés ou frais, non compatibles avec la survie des animaux. L’analyse fine des structures neuronales, vasculaires et gliales, ainsi que l’évaluation des marqueurs de vieillissement cellulaire, requièrent donc la mise à mort des souris en fin d’expérimentation afin d’obtenir des échantillons de qualité et de répondre aux objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Le remplacement des souris par d'autres modèles (in silico, in vitro, organoïdes, etc.) n'est pas envisageable dans le cadre de cette étude, car celle-ci vise à évaluer les effets d’un traitement oral par l'extrait végétal sur des fonctions complexes telles que la cognition, la mémoire, la motivation ou encore le bien-être général dans un contexte de vieillissement. Ces dimensions reposent sur des interactions dynamiques entre plusieurs systèmes (nerveux, immunitaire, endocrinien, digestif…) qu’aucun modèle alternatif ne peut actuellement reproduire de manière intégrée.
Réduction
Pour utiliser le plus petit nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs nous faisons les actions suivantes : 1. Calcul rigoureux de la taille d’échantillon : nous utilisons de logiciels de puissance statistique pour déterminer le nombre minimal de souris requis. 2. Mesures comportementales multiples : nous utilisons plusieurs tests cognitifs chez les mêmes individus pour maximiser les données par animal. 3. Utilisation de groupes contrôles minimum: nous utilisons seulement un groupe contrôle (boisson saline seulement) sans utiliser un groupe sans traitement car ceci est scientifiquement valable. 4. Analyse longitudinale : nous suivons les mêmes animaux à différents temps pour limiter le nombre total requis.
Raffinement
Pour améliorer les conditions de vie et réduire la souffrance des animaux, nous mettons en oeuvre les actions suivantes : 1. Surveillance rigoureuse : suivi clinique durant les deux premières semaines de traitement, puis bi-hebdomadaire, avec pesée hebdomadaire. Surveillance quotidienne assurée par l’équipe zootechnie suivant la grille d’observation (pelage, réactivité, etc) tout au long du traitement. 2. Traitement non invasif : Administration de l'extrait végétal via l’eau de boisson pour limiter le stress lié aux manipulations. Aucun geste invasif n’aura lieu durant ce projet. 3. Tests comportementaux non invasifs : Tous les tests choisis sont conçus pour être faiblement stressants, réalisés à luminosité faible et après acclimatation. Si besoin nous pourrons ajouter du matériel de nidification, d’abris (tunnels, igloos, cabanes), et d’objets à manipuler ou explorer (rouleaux en carton, plateformes, etc.). Ces enrichissements permettent de stimuler les comportements naturels (construction de nids, exploration, interaction sociale), de réduire le stress et d’améliorer les conditions de vie en captivité.
Choix des espèces
L’utilisation de souris dans cette étude est scientifiquement justifiée par les données existantes sur l'extrait végétal , déjà testé chez les rongeurs (souris et rats), avec des effets neuroprotecteurs documentés. Le choix des souris, bien caractérisées pour les études de vieillissement cognitif, permet une évaluation précise des effets du traitement sur la mémoire et le comportement. Les souris présentent également l’avantage d’une variabilité génétique réduite, d’une compatibilité optimale avec les tests comportementaux utilisés, et d’un accès à des outils analytiques validés. L’administration de l'extrait végétal par l’eau de boisson est non invasive, respectant ainsi les principes éthiques de réduction de la souffrance animale. De plus, ce produit est disponible commercialement et sa sécurité a été démontrée chez l’humain, renforçant la pertinence translationnelle du modèle murin dans un contexte de prévention ou d’atténuation du déclin cognitif lié à l’âge. Ce modèle constitue donc une étape essentielle avant une application clinique. Nous utilisons des souris âgées de 12 mois, qui présentent déjà certains signes de vieillissement cérébral tout en étant encore suffisamment jeunes pour permettre un traitement de longue durée.
Évaluation de nouvelles molécules à visée thérapeutique ou thérapies dans un modèle de sclérose en plaques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Les souris dont l'état dépasse les points limites définis par la grille de score sont tuées avant la fin du protocole. 870 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever le sang et les tissus nerveux. Une encéphalomyélite auto-immune leur est induite par injection d'un peptide de myéline et d'un adjuvant, ce qui provoque une hypotonie de la queue puis une faiblesse voire une paralysie des membres postérieurs, un repli social et une réduction du toilettage, sur environ 30 jours dans les modèles aigus et jusqu'à 45 jours dans les modèles rémittents. Le suivi passe par des tests de sensibilité à la douleur d'environ cinq minutes, répétés selon la progression de la maladie, et le porteur justifie le recours à la souris par des raisons scientifiques et par un "intérêt pratique", faibles coûts, cycles de reproduction courts et facilité de manipulation.
Objectifs
La sclérose en plaques est une maladie auto-immune chronique qui affecte le système nerveux central en détruisant la gaine de myéline entourant les axones. Cette démyélinisation entraîne l’apparition de lésions dispersées dans le cerveau et la moelle épinière, conduisant à une dégénérescence des neurones. Les symptômes varient selon les patients et les zones du système nerveux atteintes, et comprennent des troubles moteurs, sensitifs, visuels, urinaires ou encore des douleurs neurogènes pouvant être associées à des symptômes dépressifs. La maladie évolue souvent par poussées inflammatoires suivies de périodes de rémission plus ou moins marquées. Bien que des traitements existent, leur efficacité est parfois limitée et ils sont associés à des effets secondaires importants, ce qui souligne la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Ce projet vise à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques en utilisant un modèle murin bien établi d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, qui reproduit plusieurs caractéristiques de la sclérose en plaques humaine. Les animaux reçoivent une injection d’un peptide dérivé de la myéline associé à un adjuvant, ce qui déclenche une réponse inflammatoire du système nerveux central entraînant des symptômes moteurs et sensoriels. L’évolution de la maladie est ensuite suivie par des tests comportementaux pour mesurer la sensibilité à la douleur et les troubles moteurs. Des analyses complémentaires, notamment histologiques et biochimiques, permettent de mieux comprendre les mécanismes en jeu. Le projet inclut également une approche d’imagerie in vivo, non invasive, permettant d’observer l’inflammation et la progression de la pathologie chez l’animal vivant. Cette stratégie globale permettra d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules et d’identifier des biomarqueurs associés à la maladie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer le potentiel thérapeutique de nouvelles molécules ou associations de molécules dans un modèle murin de sclérose en plaques, en se concentrant sur la réduction des déficits moteurs et des douleurs neuropathiques associés à cette pathologie. En combinant des approches comportementales, biochimiques et d’imagerie non invasive sur l’animal vivant, il permettra de caractériser l’impact de ces traitements sur l’inflammation et la neurodégénérescence. Il s’inscrit dans une perspective de recherche translationnelle avec pour finalité l’identification de traitements plus efficaces et mieux tolérés pour les patients atteints de sclérose en plaques. À court terme, c’est-à-dire pendant la durée du projet, les bénéfices attendus concernent l’identification de molécules ou formulations prometteuses ainsi que l’évaluation comparative de leur efficacité dans des protocoles d’administration variés. Cela permettra de déterminer les doses optimales et les fenêtres thérapeutiques pertinentes, qu’il s’agisse d’une administration préventive ou curative. Le projet favorisera également la détection de synergies d’action entre composés, qui pourraient aboutir à des stratégies thérapeutiques combinées plus performantes. Par ailleurs, l’utilisation d’outils d’imagerie innovants sur l’animal entier contribuera à mettre en évidence de nouveaux biomarqueurs de la maladie, exploitables pour le suivi non invasif de la réponse au traitement. À long terme, les connaissances générées dans le cadre de ce projet pourraient contribuer au développement de nouveaux traitements destinés à améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de sclérose en plaques. Ces avancées pourraient également être transposables à d’autres maladies neuroinflammatoires chroniques, pour lesquelles les approches thérapeutiques actuelles restent limitées. En affinant notre compréhension des mécanismes d’action des molécules testées et en enrichissant les modèles de suivi préclinique, ce travail vise à renforcer le lien entre la recherche fondamentale et les applications cliniques, dans le respect des principes éthiques de l’expérimentation animale et au service d’un enjeu de santé publique majeur.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis à un ensemble d’interventions techniques brèves, non chirurgicales, nécessaires à l’induction et au suivi du modèle EAE. Les interventions réalisées lors de l’induction du modèle EAE sont les suivantes : 2 injections sous-cutanées (1 minute au total) sous anesthésie gazeuse et 2 injections intrapéritonéales (15 secondes par injection). Les interventions réalisées lors du suivi du modèle EAE sont les suivantes : manipulation quotidienne des animaux (1 minute), test de la sensibilité à la douleur (animal vigile, sur une durée d’environ 5 minutes et répétée à différents temps selon la progression de la maladie), contention pour administrations de molécules à visée thérapeutique (durée d’intervention de 30 à 60 secondes en fonction de la voie d’administration et à une fréquence établie en fonction du protocole et du schéma thérapeutique choisi), examens d’imagerie non invasive par fluorescence sous anesthésie gazeuse (une à deux fois par animal ; injection du traceur par voie intraveineuse d’une durée de 30 secondes maximum ; durée de la session d’imagerie par fluorescence : 60 secondes maximum), un prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum à partir du 18ème jour, durée d’environ 3 minutes). Chaque intervention est conduite par un personnel qualifié, en conditions contrôlées, afin de garantir à la fois le bien-être animal et la qualité des données produites.
Impact sur les animaux
Le modèle EAE utilisé dans ce projet entraîne inévitablement des effets indésirables, dont la nature, l’intensité et la durée varient selon la phase de la maladie induite et la sensibilité individuelle des animaux. Les premiers signes cliniques apparaissent généralement entre 8 et 14 jours après immunisation. Ils se traduisent initialement par une hypotonie de la queue, évoluant vers une faiblesse progressive voire paralysie des membres postérieurs, et dans les formes les plus sévères, des atteintes des membres antérieurs, voire un état prostré. Ces troubles neurologiques sont associés à une réduction significative de la mobilité, pouvant générer une inactivité prolongée. Des pertes de poids significatives sont régulièrement observées durant la phase aiguë de la maladie, liées à une réduction de la prise alimentaire et à l’état général affaibli de l’animal. Des troubles du comportement peuvent également apparaître, comme un repli social, une réduction de la toilette ou un stress accru lié à la manipulation ou à la douleur chronique. La durée des effets varie selon les procédures : dans les modèles aigus, les effets s’étendent sur environ 30 jours, tandis que dans les modèles rémittents, les effets peuvent s’étendre sur 45 jours avec une phase de rémission suivie d’une rechute. Tout au long de l’expérimentation, une surveillance clinique quotidienne est assurée selon une grille de score précise. En cas de dépassement des points limites prédéfinis, les animaux sont euthanasiés immédiatement. L’administration de molécules thérapeutiques peuvent engendrer des effets indésirables qui sont difficiles à anticiper. En effet, la plupart des molécules testées sont des molécules en cours de développement dont nous n’avons pas la connaissance. Les injections par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale peuvent entraîner une douleur légère et transitoire. Une surveillance clinique étroite permettra d’en adapter les modalités en fonction des réponses observées. La manipulation, l’administration de la sonde fluorescente et l’anesthésie pour l’imagerie non invasive par fluorescence peuvent provoquer du stress chez l’animal.
Devenir
A l’issue du protocole, les animaux seront mis à mort pour prélever le sang total et/ou pour prélever les tissus nerveux d’intérêt.
Remplacement
L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’efficacité pharmacologique de nouvelles molécules ou formulations thérapeutiques dans un modèle murin de sclérose en plaques, en se concentrant sur les troubles moteurs et les douleurs neuropathiques associés à la pathologie. L’utilisation de modèles animaux de sclérose en plaques est incontournable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. De plus, si nous voulons préciser les mécanismes sous-jacents à son développement et l’efficacité de nouveaux développements ou molécules thérapeutiques, l’utilisation d’animaux vivants est, à ce jour, indispensable. Il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro, ex vivo ou mathématique capable de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de la maladie chronique. Des approches alternatives sont toutefois intégrées dans la stratégie globale du projet : - Criblages préalables ex vivo (tests cellulaires sur lignées ou cultures primaires) sont réalisés pour évaluer la cytotoxicité, l’activité anti-inflammatoire ou neuroprotectrice des composés avant toute expérimentation in vivo. Ces tests permettent de réduire le nombre de candidats à tester chez l’animal. - Les données issues de modèles informatiques (in silico) et de banques de données moléculaires sont utilisées pour orienter la sélection des molécules candidates, en amont des procédures expérimentales. Cependant, ces approches ne permettent ni de reproduire l’interaction complexe entre système nerveux et système immunitaire, ni d’évaluer de façon fiable les manifestations cliniques fonctionnelles de la maladie (déficit moteur, sensibilité douloureuse, réponse à un traitement sur l’organisme entier). Ainsi, bien que la réflexion sur le remplacement des modèles animaux soit constante, les connaissances disponibles et les limitations techniques actuelles rendent l’utilisation de modèles murins vivants incontournable pour ce projet. Ces modèles sont, en outre, reconnus pour leur validité scientifique dans le domaine de la sclérose en plaques, et sont largement utilisés dans les recherches précliniques ayant conduit aux traitements aujourd’hui disponibles pour les patients.
Réduction
La stratégie d’expérimentation proposée est basée sur des expériences en mesures répétées (études longitudinales). Cette approche permet à chaque animal d’être son propre contrôle et d’être évalué à plusieurs reprises au cours du temps. Une approche statistique est envisagée par une comparaison des groupes d’animaux. Le nombre d’animaux sera de 10 par groupe de traitement (groupe d’animaux recevant une molécule à tester ou un traitement thérapeutique) et permet dans ces conditions d’obtenir une significativité suffisante pour conclure. L’utilisation d’imagerie sur animal vivant en suivi longitudinal permettra de préciser la nature des modifications physiologiques qui se mettent en place lors du développement de la pathologie et de limiter de manière significative le nombre d’animaux utilisés sur la durée. Les analyses post mortem des tissus prélevés en fin d’étude permettront d’optimiser les résultats obtenus in vivo et d’éviter les répétitions d’expériences. Cette stratégie globale vise à garantir une recherche de haute qualité scientifique tout en respectant les principes éthiques d’utilisation raisonnée des animaux.
Raffinement
Le principe de raffinement est intégré à chaque étape du protocole expérimental et repose sur une combinaison de mesures préventives, d’adaptations techniques et de suivi quotidien individualisé. Avant le début de la procédure les animaux bénéficient de séances d’habituation à l’environnement expérimental, au matériel et aux expérimentateurs. Ces périodes d’adaptation permettent de réduire le stress induit par les manipulations et de faciliter les évaluations comportementales. L’environnement d’hébergement est enrichi avec des matériaux adaptés (igloo, coton, accès facilité à la nourriture) afin de favoriser le confort, le repos et les comportements naturels, en particulier pour les animaux présentant un score clinique élevé. Les animaux sont suivis quotidiennement selon une grille d’évaluation fondée sur des critères comportementaux et physiologiques précis incluant l’état d’hydratation, la posture, la mobilité, la réactivité, l’aspect du pelage et la perte de poids. Cette grille permet une détection précoce des signes de souffrance et une prise de décision rapide quant à la poursuite de la procédure ou à l’application des points limites conduisant à l’euthanasie. La nourriture est adaptée à la condition de l’animal et fournie sous forme de gel pour faciliter la prise alimentaire même en cas de mobilité réduite. L’induction de la maladie et les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress. La manipulation est effectuée par un personnel expérimenté et formé spécifiquement aux procédures utilisées dans le cadre du modèle EAE. L’évaluation de la douleur neuropathique est restreinte aux animaux présentant des scores cliniques faibles afin de ne pas surcharger ceux qui présentent déjà un état avancé de la maladie. L’utilisation de techniques non invasives d’imagerie permet de limiter le nombre d’interventions et d’examens post mortem en suivant les mêmes individus tout au long de l’étude. Cette stratégie contribue à réduire l’inconfort global tout en préservant la qualité des résultats. Un comité de pilotage interne est chargé du suivi scientifique et éthique du projet. Il permettra d’intégrer de nouvelles méthodes de raffinement en fonction des avancées techniques ou des recommandations éthiques récentes. Une veille méthodologique active sera assurée afin d’adapter les procédures en continu et d’améliorer le bien-être animal sans compromettre les objectifs scientifiques.
Choix des espèces
La souris s’est rapidement imposée au cours du temps comme des modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Dans le domaine particulier de la recherche fondamentale et appliquée sur la sclérose en plaques et les pathologies associées (déficit moteurs, douleurs neurogènes...), l’essentiel de la littérature est obtenue chez ces deux espèces, (majoritairement chez la souris) pour diverses raisons (i) scientifiques, les mécanismes moléculaires et cellulaires décrits dans ces espèces sont retrouvés chez l’homme et (ii) pour un intérêt pratique: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de manipulation et très bonne adaptation aux conditions expérimentales, l’intérêt majeur étant en premier lieu, l’historique de la connaissance de ces animaux, chez lesquels l’essentiel des traitements utilisés en clinique humaine de la douleur aujourd’hui ont été évalués et validés. Des animaux adultes (8-12 semaines) seront utilisés dans ce projet. Il s’agit d’animaux adultes qui sont généralement choisis dans les études de pharmacologie et qui répondent bien à l’expérimentation. Tous les animaux auront le même âge au début de chacune des études. L’induction de la pathologie chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible, fournissant ainsi des résultats satisfaisants. Ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouveaux outils thérapeutiques.
Evaluation in vivo de nouveaux vecteurs viraux permettant une étude ciblée de différentes populations neuronales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 48 d'entre elles et modéré pour 96. Un tiers reçoit une injection dans la veine de la queue, un tiers une injection dans le sinus situé derrière l'œil, et le dernier tiers une chirurgie intracérébrale de 35 à 45 minutes sous anesthésie, avec les risques de mort pendant l'anesthésie ou au réveil et d'infection postopératoire que le porteur rappelle. L'enjeu déclaré reste préparatoire, vérifier in vivo que des vecteurs viraux ciblent bien une sous-population de neurones, avant de servir dans d'autres projets sur les protéines étudiées au laboratoire depuis plus de vingt ans. Sur le remplacement, le porteur indique seulement que la validation in vitro a déjà eu lieu et qu'il est maintenant "nécessaire" de tester ces outils in vivo, les cerveaux étant prélevés après mise à mort pour analyse histologique.
Objectifs
Pour mieux comprendre comment fonctionne le cerveau il est nécessaire de pouvoir étudier les principales cellules qui le composent et en particulier les neurones. Il existe différents types de neurones dont les rôles sont bien définis. On distingue ainsi par exemple les neurones excitateurs des neurones inhibiteurs. Dans chacune de ces classes, il existe des sous classes de neurones caractérisées par des morphologies et des fonctionnements différents. Pour mieux comprendre le rôle de chaque type de neurones dans l'organisation cérébrale générale, il est important de pouvoir modifier spécifiquement le fonctionnement de tous les neurones d'une seule sous-classe. Pour cela nous souhaitons développer de nouveaux outils moléculaires qui ciblent spécifiquement tous les neurones d'une seule sous classe. Dans ce projet, nous souhaitons confirmer nos résultats produits à partir de cellules en culture et valider in vivo les nouveaux vecteurs que nous avons conçus. Une fois validés, ces nouveaux outils pourront être utilisés dans le cadre d'autres projets pour étudier le rôle des protéines d'intérêt du laboratoire dans la mise en place, la structure et le fonctionnement de chaque sous population neuronale. Ce projet nous permettra également de tester différentes voies d'administration de nos outils.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de valider in vivo des outils moléculaires destinés à mieux cibler les différentes sous-populations neuronales présentes dans le cerveau. Dans ce projet, maintenant que la validation in vitro a été réalisée, nous allons quantifier l'efficacité et la spécificité de chacun de nos outils in vivo. Une fois ces outils validés in vivo ils pourront servir dans un prochain projet à étudier les protéines d'intérêt que nous caractérisons dans notre laboratoire depuis maintenant plus de 20 ans en ciblant des sous populations neuronales. Ce projet s'inscrit donc dans le processus de connaissance et de découverte suivi par le laboratoire nous permettant de mieux décrire les processus normaux de neurodéveloppement pour mieux en comprendre les dysfonctionnements.
Procédures
Injections intraveineuses sous anesthésie via la veine de la queue : 48 animaux. L'intervention durera moins de 10 minutes. Injections intraveineuses sous anesthésie par voie retro-orbitaire : 48 animaux. L'intervention durera moins de 10 minutes. Injections intracérébrales sous anesthésie : 48 animaux. Temps estimé de l’acte chirurgical de 35 à 45 min/souris. Chaque animal ne sera soumis qu'à une seule intervention.
Impact sur les animaux
Les injections dans la veine caudale peuvent entrainer l'apparition d'hématome et d'inflammation si le produit est injecté en dehors de la veine (injections péri veineuses). Les injections intraveineuses dans le sinus rétro orbitaire peuvent entrainer exceptionnellement des lésions oculaires. Les injections intracérébrales sont des chirurgies. Les risques liés à ces injections sont les mêmes que ceux pouvant survenir au cours de toute chirurgie (décès lors de l'anesthésie ou au moment du réveil, infection post-opératoire,...)
Devenir
Les résultats attendus de ce projet nécessitent de réaliser des analyses histologiques ou immunohistologiques sur des coupes de cerveaux. Les animaux seront donc mis à mort à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Comme précisé préalablement les validations de ces outils ont déjà été réalisées in vitro. Il est maintenant nécessaire que nous puissions tester ces outils in vivo et que nous puissions vérifier que l'expression de nos protéines fluorescentes est suffisante et spécifique dans les sous-populations de neurones que nous souhaitons étudier.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est réduit car nous ne pensons pas avoir une grande variabilité entre les animaux. Il est basé sur ce que nous avons pu lire dans la littérature. Une certaine variabilité peut survenir lors de la réalisation du geste technique. Le personnel de notre laboratoire possède une grande expérience des injections intracérébrales chez la souris et des injections intraveineuses.
Raffinement
Tous les gestes techniques seront réalisés sous anesthésie générale. Un soin particulier sera apporté dans les soins post-opératoires chez les animaux avec une chirurgie stéréotaxique. Une couverture analgésique péri et post-opératoire est prévue pour les animaux avec une chirurgie
Choix des espèces
La souris reste le meilleur modèle pour ce projet. Si nos vecteurs viraux répondent à nos critères, d'autres vecteurs, basés sur la même technologie et permettant d'inhiber ou d'activer certains gènes d'intérêt, seront construits avant d'être injectés chez des souris. Pour ce projet préliminaire nous prévoyons des injections sur des animaux adultes âgés au minimum de 10 semaines et au maximum de 8 mois. Nous souhaitons utiliser des animaux adultes pour lesquels la phase active de neurodeveloppement est terminée. Ce prérequis validé, l'âge exact des animaux a peu d'importance pour ce projet.
Évaluation de l’effet de composés sur la régénération de la myéline chez la souris modèle de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris paralysées par le modèle de sclérose en plaques peuvent être gardées jusqu'à trois semaines après l'apparition des premiers signes. 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Une partie subit une chirurgie de la moelle épinière de trente minutes pour qu'on y injecte un agent qui détruit la myéline, puis un traitement quotidien pendant quatre à dix-sept jours. Une autre est immunisée par quatre injections, ce qui installe une paralysie progressive des membres, une perte de poids et des difficultés à boire et à manger, pour évaluer des molécules censées régénérer la myéline, effet encore hypothétique quand la paralysie, elle, fait partie du protocole.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire du système nerveux central (cerveau, moelle épinière et nerfs optiques) du jeune adulte au cours de laquelle la gaine de myéline protégeant les axones est détruite (démyélinisation). Cette perte de myéline se traduit, à long terme, par des troubles sensitifs et moteurs (fourmillements, troubles de l’équilibre, troubles visuels, paralysies…). La SEP a une plus forte prévalence chez la femme (3/4 de femme) et touche plus de 100 000 personnes en France. Deux mille cinq cents nouveaux cas de SEP sont diagnostiqués chaque année. Cette maladie représente la première cause de handicap sévère non traumatique du jeune adulte. Elle est caractérisée par des épisodes inflammatoires et de démyélinisation pouvant affecter toutes les structures du système nerveux central. A ce jour, les traitements de la SEP ciblent uniquement la composante inflammatoire de la maladie mais ces traitements ont peu d’effets sur la remyélinisation (régénération de la gaine de myéline). Le développement de stratégies pharmacologiques visant à promouvoir la remyélinisation est donc un enjeu thérapeutique majeur pour le traitement de la SEP. L’objectif de ce projet vise à évaluer l’effet de molécules au potentiel myélinisant prometteur, dans des modèles murins de la sclérose en plaques.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but d’évaluer l’effet de composés potentiellement capable de favoriser la régénération de la gaine de myéline endommagée. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre d’identifier une ou plusieurs molécules candidates permettant d’augmenter significativement la remyélinisation et donc de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de la sclérose en plaques. En effet ces traitements induisant une régénération de la gaine de myéline pourraient venir compléter les traitements actuels qui agissent principalement sur la composante inflammatoire de la maladie, et ainsi aboutir à une prise en charge plus globale de la sclérose en plaques.
Procédures
Nous utiliserons deux modèles expérimentaux de la sclérose en plaques chez la souris, afin d’évaluer le potentiel thérapeutique de plusieurs molécules candidates. Le premier modèle consiste pour chaque animal en une injection d’un agent induisant une lésion de la myéline, au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale et analgésie adaptée. Cette intervention dure environ 30 minutes et n’est réalisée qu’une fois par animal. Les animaux seront ensuite traités quotidiennement de 4 à 17jours avec les molécules d’intérêt (durée inférieure à 1 minute pour chaque administration). Le deuxième modèle est un modèle complémentaire où la perte de myéline est induite par immunisation. Pour cela les animaux recevront, sous anesthésie générale, 2 injections (durée inférieure à 1 minute par injection) et 2 injections espacées de 2 jours (durée inférieure à 5 minutes par injection). Pour cette partie de l’étude, les animaux vigiles seront traités quotidiennement durant 2 semaines avec les molécules d’intérêt (durée inférieure à 1 minute pour chaque administration). L’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire afin de réaliser des prélèvements d’intérêt.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux lors des procédures sont liées à la chirurgie et à l’immunisation. Lors de la chirurgie nécessaire à la réalisation de lésions de la moelle épinière, les risques sont l’hypothermie, des lésions musculaires, des saignements et des douleurs post-opératoires légères durant 48 heures. Pour l’immunisation: plaie au site d’injection, paralysie progressive et temporaire des animaux, suite à l’installation du modèle entrainant des difficultés à se déplacer et à s’abreuver. Les injections et le traitement peuvent entrainer respectivement un hématome au site d’injection et une irritation des voies supérieurs si le traitement est répété. La mise en place de notre modèle de lésion de la moelle épinière impliquera une chirurgie et une anesthésie générale. L’anesthésie sera associée à une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardiorespiratoire. La chirurgie pourra entrainer une douleur et un inconfort post-opératoire durant 48 heures environ. Le modèle d’immunisation peut entrainer une paralysie progressive et temporaire des animaux, une perte de poids et des difficultés pour se nourrir et s’abreuver à partir de 10 jours environ après l’immunisation. Les animaux seront gardés maximum 3 semaines après l’apparition des premiers signes cliniques liés à ce modèle. Des lésions cutanées peuvent également survenir suite aux injections (en lien avec le produit injecté pour l’immunisation). Les administrations de composés d’intérêt pourront générer un stress et une brève et légère douleur. Les injections des composés pourront entrainer l’apparition d’hématome ou d’induration au site d’injection. Les gavages répétés pourront être associés à une irritation des voies supérieures.
Devenir
Une analyse post mortem de tissus d’intérêt est nécessaire pour évaluer le potentiel des molécules testées dans les deux modèles ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Après des essais préalables sur différents modèles cellulaires, seuls les meilleurs candidats seront retenus. Il sera ensuite nécessaire de recourir à un modèle animal pour évaluer l’effet des composés sur un organisme entier. Seul le modèle animal est pertinent pour cette étude car nous pouvons ainsi analyser l’effet de ces molécules dans un contexte in vivo reproduisant le mieux les caractéristiques des lésions observées dans la pathologie humaine.
Réduction
Des études seront menées en amont afin de raffiner et réduire au maximum le nombre de souris utilisées (détermination des doses à administrer par exemple). Les modèles de la pathologie qui seront utilisés ont déjà démontré leur pertinence pour l’analyse des mécanismes de réparation des lésions de la myéline et de la composante inflammatoire observée dans la maladie. Ils sont bien connus et reproductibles permettant donc l’évaluation de l’efficacité de composé. Le nombre d’animaux (600 au total) est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement exploitables.
Raffinement
Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous anesthésie générale et analgésie pendant toutes les interventions qui le nécessitent. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par le vétérinaire. Ils seront hébergés dans une animalerie agréée dans des conditions de température et d’hydrométrie conformes à la réglementation. De plus, ils seront hébergés en groupe et bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement (un nid et un bâton de bois à ronger). Durant nos procédures expérimentales nous assurerons une surveillance adaptée en fonction des étapes, telle qu’une surveillance rapprochée en période post-chirurgicale et lors de l’expression des signes cliniques de notre modèle d’immunisation. Nous apporterons un soutien nutritionnel aux animaux lorsque nécessaire pour faciliter leur accès à la nourriture et à l’eau. Nous nous assurerons que l’état général des animaux soit compatible avec l’administration des composés à évaluer avant de commencer les traitements. Pour ces composés, nous vérifierons les données de d’études précédentes pour nous assurer de choisir les bonnes conditions d’administration et l’absence de toxicité attendue avant de les utiliser chez nos animaux. Pour toutes nos procédures, des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
La souris, grâce à sa forte homologie génétique avec l’homme, est un modèle de choix pour l’étude de nombreuses pathologies humaines. Dans le cadre de l’étude de la sclérose en plaques il existe 2 modèles bien connus et caractérisés qui permettent de reproduire les caractéristiques de la pathologie. Ainsi, pour ce projet le seul moyen à notre disposition pour analyser le processus de réparation de lésions de la myéline est d’utiliser des modèles murins bien établis du processus de démyélinisation (destruction de la myéline) et remyélinisation (régénération de la myéline). Il nous est donc impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas les animaux, et plus précisément la souris. Les animaux utilisés seront âgés d’au moins 12 semaines, afin d’avoir atteint une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes). De plus à ce stade du développement, la chirurgie est facilitée par la relative faible masse musculaire et de tissus graisseux des animaux, permettant ainsi une meilleure accessibilité à la moelle épinière lors de la chirurgie.
Maintien et création de lignées de poisson zèbre pour l’étude de gènes de maladies rares du cervelet
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Un fragment de nageoire coupé sous anesthésie, puis quelques jours d'isolement : c'est ce que subit une partie des 3 550 poissons zèbres de ce projet, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Les individus porteurs des mutations recherchées sont gardés vivants pour entretenir les lignées, alors que le champ officiel sur le devenir des animaux reste vide. Ces lignées reproduisent des maladies rares du cervelet, et le porteur annonce que les poissons mutants pourraient avoir du mal à nager, donc à s'alimenter. Il justifie l'effectif de 3 550 poissons par un nombre "rigoureusement calculé" d'après des expériences antérieures, sans donner aucun élément de ce calcul.
Objectifs
Ce projet a pour but de créer et maintenir des lignées de poisson zèbre, utilisés comme modèles de maladies rares du cervelet, une partie du cerveau essentielle pour coordonner les mouvements. Ces pathologies congénitales sont liées à des mutations dans des gènes spécifiques, dont les effets restent à préciser. Pour cela, ce projet vise à l’utilisation du modèle poisson-zèbre, un poisson souvent utilisé en recherche car il partage des similarités avec les humains au niveau des gènes et du développement. Ces recherches pourraient aider à mieux diagnostiquer ces maladies et à trouver de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre la fonction de gènes dont les mutations sont à l’origine de maladies rares du développement du cervelet. En avançant dans l’identification des gènes impliqués et des mécanismes pathologiques en aval, il permettra d’améliorer le diagnostique génétique, et d’identifier de potentielles approches thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Un prélèvement d'un petit bout de nageoire sera réalisé sur certains poissons, sous anesthésie courte (1 minute) et sous analgésie, une seule fois au cours de la vie de l’animal.
Impact sur les animaux
Les poissons subiront un stress lié à l’anesthésie de courte durée pour le prélèvement de nageoire caudale pour le génotypage, et à l’isolement nécessaire de quelques jours qui s’en suit. Les poissons exprimant les mutations pourraient présenter des difficultés dans la nage qui pourraient perturber la capacité des poissons à s’alimenter.
Devenir
Les poissons porteurs des modifications génétiques seront gardés en vie pour le maintien des lignées.
Remplacement
Le projet vise à mieux comprendre comment le cervelet se forme pendant le développement embryonnaire, aussi bien dans des conditions normales que lorsqu’il est touché par des maladies génétiques rares. Ce processus est très complexe et dépend de nombreux facteurs, comme les interactions avec d’autres parties du cerveau et les influences de l’environnement. À ce jour, il n’est pas encore possible de reproduire complètement ce développement in vitro en laboratoire, car il s’agit d’un phénomène délicat et interconnecté. Étudier des organismes vivants reste essentiel pour avancer dans la compréhension de ces maladies et imaginer de nouveaux traitements.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire pour ce projet a été rigoureusement calculé selon les expériences antérieures, afin de limiter leur utilisation tout en garantissant la réalisation du projet.
Raffinement
Les poissons sont élevés dans des conditions optimales où la qualité de l’eau, la température et l’éclairage sont vérifiés régulièrement. Les poissons bénéficient d’un apport en nourriture vivante (Paramécies et Artémias), et d’un enrichissement social par le maintien d’un nombre de poissons suffisant par aquarium et des accouplements réguliers. Dans le cadre de ce projet, un suivi génétique des poissons est nécessaire. Cela implique un prélèvement d’un petit fragment de nageoire. Celui-ci est réalisé sous anesthésie d’une durée très courte et avec une analgésie pour éviter toute douleur. Les poissons bénéficient d’une surveillance quotidienne pour détecter rapidement tout signe de stress ou de difficulté, comme des problèmes d’alimentation ou des comportements inhabituels. L'application de points limites stricts et spécifiques au projet permet d’éviter toute souffrance chez les animaux.
Choix des espèces
Le développement du cervelet chez le poisson-zèbre est très similaire à celui de l’Homme, notamment en ce qui concerne les gènes impliqués, la formation des neurones et leur organisation. Cette espèce présente plusieurs avantages pour la recherche : elle est très prolifique, se développe rapidement et permet d’étudier le développement du cerveau sur les embryons en utilisant peu d’animaux adultes reproducteurs. Les prélèvements pour suivi génétique des animaux seront réalisés chez les adultes.
Impact d’une infection à Listeria monocytogenes du cerveau sur l’immunité cérébrale et la neurodégénérescence. MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Les souris dont le score d'encéphalite atteint 4, ou qui perdent plus de 20 % de leur poids, sont mises à mort. 1 474 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une partie reçoit des Listeria directement dans le cerveau sous anesthésie, une autre subit l'induction d'une encéphalite auto-immune qui peut la paralyser sept à quinze jours, et un troisième groupe passe tous les quinze jours pendant sept mois un test de mémoire dans un labyrinthe et un test d'équilibre sur cylindre rotatif. L'identification de cibles thérapeutiques contre les troubles cognitifs qui suivent une infection cérébrale reste annoncée au conditionnel, quand la paralysie des membres et la perte de poids figurent, elles, au protocole.
Objectifs
Nous cherchons à définir l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur la santé cérébrale après l’infection. En effet, les altérations du système immunitaire cérébral sont susceptibles de favoriser ou au contraire protéger le cerveau contre des dommages ultérieurs, notamment les maladies neuronales et neurodégénératives telles que la sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Parkinson. Ce projet permettra à la fois d’étudier comment s’effectue la réparation du système immunitaire cérébral après la résolution d’une infection ainsi que les mécanismes menant à une sensibilité accrue ou diminuée aux futurs dommages neuronaux.
Bénéfices attendus
Sur un plan des connaissances scientifiques, nous chercherons à déterminer les rôles respectifs du système immunitaire cérébral (microglie) et périphérique (monocytes provenant du sang) dans la réponse aux infections du système nerveux central, ainsi que leur rôle dans l’apparition de troubles cognitifs après l’infection. La comparaison des séquelles neurologiques induites en présence ou absence de la microglie et/ou des monocytes permettra de mettre en évidence le rôle de chacune de ces populations immunitaires dans les séquelles neurologiques apparaissant après la guérison de l’infection. Nous chercherons à mettre en évidence les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’apparition de ces troubles cognitifs, pour comprendre comment les cellules immunitaires ayant joué un rôle dans la résolution de l’infection cérébrale (microglie ou monocytes recrutés) peuvent ensuite adopter un phénotype dommageable pour le bon fonctionnement cérébral. L’identification de ces mécanismes permettrait de mettre en évidence des cibles thérapeutiques utiles dans le traitement des séquelles neurologiques post-infectieuses.
Procédures
Procédure 1 : les animaux seront soumis soit à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), soit à une injection intracérébrale (Y COMPRIS UNE INJECTION DANS LE CERVEAU) sous anesthésie générale (durée d’environ 10 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Procédure 2 : les animaux seront soumis à un gavage sur animal vigile (durée d’environ 1 minute), puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils subiront 1 injection cutanée et intrapéritonéale sous anesthésie gazeuse (générale, durée des 2 injections : environ 5 minutes) pour induire la réponse auto-immune, et une dernière injection intrapéritonéale (durée d’environ 30 secondes) pour achever l’induction de la réponse autoimmune, sur animal vigile. Procédure 3 : les animaux seront soumis à une injection intraveineuse sur animal vigile (durée d’environ 2 minutes). Puis ils seront soumis à 3 injections d’antibiotiques par voie intrapéritonéale sur animal vigile (durée d’environ 30 secondes). Un groupe expérimental se verra également administrer des anticorps en même temps que les injections d’antibiotiques (portant la durée d’injection à environ 1 minute). Ils seront soumis à des tests cognitifs tous les 15 jours pendant 7 mois, consistant en un test de mémoire (trouver la bonne sortie parmi plusieurs qui se ressemblent, un test durant environ 30 minutes) et un test moteur (rester le plus longtemps possible sur un cylindre rotatif, durée d’environ 15 minutes).
Impact sur les animaux
Dans l’ensemble des procédures l’infection induit un degré de souffrance : perte de poids, « sickness behaviour » et atteinte cérébrale qui peut parfois induire des paralysies des pattes des souris. Dans la procédure n°1, un niveau de douleur modéré sera à prendre en compte suite à l’inoculation intracraniale de bactéries, qui sera pris en charge par antalgiques. L'INJECTION DE LISTERIA MONOCYTOGENES DANS DES REGIONS CEREBRALES SPECIFIQUES PEUT INDUIRE DES TROUBLES NEUROLOGIQUES LIE AU SITE D'INJECTION. LES SOURIS SERONT SURVEILLEES QUOTIDIENNEMENT AFIN DE DETECTER TOUT SYMPTOME NEUROLOGIQUE GRAVE. Dans la procédure n°2, l’induction d’encéphalite autoimmune est susceptible d’engendrer une perte de mobilité par paralysie des membres, d’une durée variable entre 7 et 15 jours selon la littérature. Dans la procédure n°3, au cours du vieillissement des souris de souche 5xFAD on notera l’apparition de signes associés à la maladie d’Alzheimer tels qu’une perte de mémoire et des capacités d’interaction sociale diminuée. Ces troubles apparaissent progressivement, à partir de 6 mois d’âge environ.
Devenir
Les procédures nécessitent toutes une mise à mort des animaux à la fin de la procédure afin d’étudier leurs organes par diverses techniques. Il n’y aura donc pas d’animaux laissés en vie à la fin du projet.
Remplacement
L’étude de l’interaction entre le système immunitaire et le fonctionnement du système nerveux central nécessite un hôte animal car les mécanismes d’interaction entre ces 2 systèmes cellulaires complexes ne peuvent pour l’instant pas être modélisés in vitro. En particulier pour comprendre les séquelles induites par une infection et les conséquences à long terme, il est absolument nécessaire de mener les études dans un hôte animal qui est capable de régénérer les tissus altérés.
Réduction
Pour l’observation du comportement des animaux, nous suivrons dans le temps les mêmes individus, ce qui permet 1) d’augmenter la puissance statistique de l’étude et 2) éviter de mettre à mort un animal après un unique test comportemental (sauf pour le test du labyrinthe de Barnes car les animaux s’habituent à ce test au fil du temps) . Pour les études de la réponse immunitaire au sein du cerveau, le cerveau des souris disséquées sera séparé en 2 hémisphères, un hémisphère étant utilisé pour l’analyse histologique par immunofluorescence et l’autre pour la cytométrie en flux. Cela permettra de diminuer par 2 le nombre de souris nécessaire pour ces expériences. Afin de vérifier que les 2 hémisphères cérébraux ne réagissent pas de manière différente à l’infection nous vérifierons l’absence de différence entre les analyses effectuées sur les hémisphères droits et gauches. Nous utiliserons également des souches de Listeria monocytogenes dites « fortement neuroinvasive » qui induisent de manière très reproductible une infection du système nerveux central après gavage. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux inoculés par rapport à l’inoculation des classiques souches de laboratoire de Listeria qui n’induisent une infection du système nerveux central que dans une petite proportion des animaux inoculés. Les effectifs des populations de souris auxquelles nous aurons recours sont établis en tenant compte des tests statistiques permettant d’obtenir une significativité du résultat obtenu (test de Mann-Whitney (deux groupes non appariés), Wilcoxon (deux groupes appariés) ou ANOVA (plus de deux groupes) pour les comparaisons de valeur avec faible effectif, se basant sur une distribution non gaussienne des résultats).
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. L’état général des animaux sera suivi. Les paramètres observés seront : poil ébouriffé, apparence corporelle/body condition, expression faciale/mouvement. Une aide à la thermorégulation sera mise en place dans toutes les cages pour éviter l’hypothermie : abri en carton, matériel de nidification (coton/papier) et chaufferettes. Une réhydratation par voie sous-cutanée (Ringer Lactate) et mise à disposition d’eau gélifiée sera entreprise pour les animaux présentant des signes de déshydratation (perte de poids >10%, pli cutané). Les animaux présentant un état pathologique trop avancé (score de 2 pour un paramètre de la grille proposée par le comité d’éthique, ou perte de poids supérieure à 20% du poids initial, ou un score d’encéphalite ≥ 4) seront mis à mort. LES ANIMAUX SERONT EGALEMENT MIS A MORT EN CAS D'APPARITION DE SYMPTOMES NEUROLOGIQUES GRAVES SUITE A UNE INJECTION CEREBRALE STEREOTAXIQUE ET CEUX POUVANT AUSSI EMPECHER UNE ALIMENTATION ET UN ABREUVEMENT EFFICACES. La douleur induite par l’injection intracrâniale sera limitée en injectant les souris avec un antidouleur (buprénorphine) avant et après l’injection, qui se fera sous anesthésie gazeuse et en appliquant un anesthésique local sur la zone à injecter. Le stress induit par l’encéphalite autoimmune (paralysie → difficulté d’accès à la nourriture, de thermorégulation, de nettoyage) sera limité en multipliant les source d’accès à la nourriture et à de la gélose hydratante au niveau du sol de la cage, ainsi qu’en chauffant les cages avec des chaufferettes pour aider la thermorégulation des souris. Les animaux seront pesés le jour précédant l’infection puis, au minimum, à partir du jour 3 quand les animaux commencent à perdre du poids du fait de l’infection. La pesée aux deux premiers jours ne sera pas systématique et dépendra de l’état apparent de l’animal. Cela permettra de limiter les manipulations à un moment où les animaux ne perdent pas de poids d’après notre expérience.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire, un grand nombre d’outils et de lignées transgéniques ayant été développés pour étudier la réponse immunitaire des souris. Il s’agit également d’un bon modèle en neurosciences, les souris ayant certaines capacités cognitives suffisamment développées pour étudier l’impact que peuvent avoir les infections du système nerveux central sur des fonctions neuronales ciblées pour ce mammifère. Nous utiliserons des souris adultes, pour ne pas interférer avec les phénomènes de neurodéveloppement dans notre étude. Les souris adultes seront âgées de 2 à 9 mois, les plus âgées (6 à 9 mois) seront utilisées pour 1) le suivi à long-terme des conséquences de l’infection, et 2) pour étudier le phénomène de neurodégénerescence dans les souris 5xFAD qui commencent à développer des troubles à partir de l’âge de 6 mois.
Étude des mécanismes de développement des tumeurs cérébrales primitives à l’aide de modèles murins
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
À cinq à dix jours de vie, on leur coupe l'extrémité de la queue pour lire leur génotype. Celles qui portent les mutations recherchées reçoivent ensuite une injection quotidienne pendant cinq jours au plus, qui peut leur faire perdre du poids et de la mobilité pendant autant de temps, et une partie des femelles gestantes passe jusqu'à trois jours isolée. 4 078 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, pour décrire les étapes précoces d'un type de tumeur cérébrale qui représente moins de 10 % des gliomes. Les non-porteuses sont tuées faute de pouvoir être placées ailleurs, les reproductrices dès que leur fertilité baisse, les porteuses pour qu'on prélève leurs organes.
Objectifs
Les gliomes sont des tumeurs cérébrales primitives malignes de l’adulte. Les mutations génétiques impliquées dans l’apparition de ces tumeurs ont été caractérisées et ont permis de mettre en évidence différents sous-groupes de gliomes, dont la prise en charge peut différer en fonction des altérations identifiées. Cependant, les traitements actuels ne sont pas suffisants pour éradiquer ces tumeurs, qui récidivent fréquemment. Les études ont mis en évidence une forte complexité de la biologie de ces tumeurs. En effet, elles sont composées de nombreuses populations cellulaires dont les fonctions évoluent en fonction du stade de développement de la tumeur. Il apparait donc impératif de mieux caractériser la dynamique de ces populations cellulaires et de leurs interactions et d’identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents. De plus, peu d’études scientifiques ont caractérisé les dynamiques cellulaires dans les étapes précédant la formation de tumeurs, lorsque seulement une ou deux mutations génétiques sont présentes. Ce projet aura pour objectif de renforcer les connaissances sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement d’un type de gliome spécifique, les oligodendrogliomes, grâce à différentes lignées de souris génétiquement modifiées.
Bénéfices attendus
Les oligodendrogliomes représentent moins de 10 pourcents des gliomes qui touchent environ 4000 nouvelles personnes par an en France. Les oligodendrogliomes sont rares, ont un pronostique plus favorable que d’autres tumeurs cérébrales. Pourtant, il n’existe pas de traitement curatif pour ces tumeurs, qui récidivent fréquemment. Les différentes étapes du développement tumoral, notamment les étapes précoces, ne sont pas vraiment caractérisées pour le type de tumeurs cérébrales que nous souhaitons étudier au cours de ce projet (les oligodendrogliomes). Ainsi, ce projet pourrait permettre de décrire pour la première fois les conséquences des modifications génétiques spécifiques dans l’apparition et le développement des oligodendrogliomes. De plus, il pourrait permettre de comprendre comment un type de cellules spécifiques modifiées impactent le fonctionnement des autres cellules cérébrales. Les données obtenues pourront être évaluées sur de nouveaux modèles tumoraux in vitro, afin de réduire le recours aux animaux pour ce type de tumeurs. A terme ce projet renforcera les connaissances sur les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement des oligodendrogliomes et pourrait permettre l’identification de biomarqueurs pronostiques ou diagnostiques qui pourraient améliorer la prise en charge des patients atteints de ces tumeurs.
Procédures
Un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animal vigile pour l’ensemble des jeunes animaux produits pour identifier leur patrimoine génétique (une fois, durée inférieure à 1 minute par animal). Une partie des animaux recevra une injection quotidienne d’une molécule permettant de mettre en place le modèle (animal vigile, moins d’une minute par injection, maximum 5 jours consécutifs). Il pourra être nécessaire d’héberger individuellement une partie des femelles gestantes pendant 3 jours maximum. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Lors du prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux ils ressentiront une légère et brève douleur. Les injections seront associées à une légère douleur et un inconfort. Les injections de la molécule permettant de mettre en place le modèle chez les souriceaux de deux lignées génétiquement modifiées peuvent s’accompagner d’une perte de poids et de mobilité, qui peut durer jusqu’à 5 jours. Il pourra être nécessaire d’héberger individuellement une partie des femelles gestantes, maximum 3 jours, cela pourra générer un stress social.
Devenir
Tous les animaux reproducteurs seront euthanasiés lorsque l’on observe une baisse de la fertilité. Les animaux générés non porteurs des modifications génétiques d’intérêts seront euthanasiés car il ne sera pas possible de les replacer du fait de leur modification génétique. Les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêts seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organes d’intérêt pour répondre à notre question scientifique.
Remplacement
Les tumeurs cérébrales, depuis la première mutation jusqu’à la tumeur formée, sont des pseudo-organes complexes qui ne peuvent se résumer exclusivement à des cellules tumorales. En effet, dans une tumeur cérébrale, il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement composé de molécules et cellules cérébrales saines (cellules immunitaires, vaisseaux sanguins, neurones). Ce microenvironnement joue un rôle clé dans le développement et la résistance au traitement des tumeurs. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Nous utilisons des modèles in vitro qui nous permettent de mettre en évidence les effets directs des mutations sur la biologie de la cellule mais uniquement sur du court terme car ces modèles ne se maintiennent pas au-delà de 8 jours. Cependant ces modèles cellulaires ne nous permettent pas d’explorer les interactions avec d’autres populations cellulaires. Nous mettons actuellement en place des modèles de co-culture de plusieurs populations cellulaires afin de répondre à certaines de nos questions scientifiques tout en réduisant notre recours à l’animal. Malgré tout, ces modèles restent imparfaits car ne reconstituent pas complètement le contexte biologique (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales. L’utilisation d’organismes entiers est donc importante pour décrire et comprendre, au cours du temps, les effets des mutations sur certaines cellules spécifiques dans le cerveau, et les conséquences sur les autres populations cérébrales. C’est la raison pour laquelle dans ce projet nous utiliserons des lignées de souris génétiquement modifiées présentant des mutations dans les gènes d’intérêt pour notre objectif scientifique.
Réduction
Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences. Le nombre d’animaux choisi est basé sur des données que nous avons précédemment obtenues ainsi que sur des calculs utilisant des outils statistiques. Ces calculs nous permettent de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour obtenir des données scientifiques valides. Nos lignées de souris génétiquement modifiées ont une génétique complexe, ce qui nécessite de nombreux croisements avant d’obtenir les animaux portant le patrimoine génétique d’intérêt. Nous optimiserons nos stratégies de croisement afin que le maximum de souris soient utilisés et nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaires. Au total nous prévoyons 4078 souris dans ce projet afin de maintenir nos lignées et produire les lots expérimentaux nécessaires pour nos analyses.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et les conditions d’enrichissement de l’environnement, de sociabilité et soins respectent la règlementation de la directive européenne et sont contrôlés quotidiennement. Les animaux bénéficient d’eau et de nourriture (adaptée au stade physiologique) à volonté. Ils sont observés quotidiennement par l’équipe de zootechnie et 2 fois par semaine par l’équipe de recherche. En cas d'anomalie un suivi est mis en place en collaboration entre l’équipe de recherche, la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et le vétérinaire. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Le prélèvement pour génotypage est rapide et parfaitement maitrisé. Il est réalisé sur de jeunes animaux (cicatrisation rapide) et est de la taille la plus petite possible. On utilise du matériel propre et désinfecté entre chaque animal, et on s’assure après le geste que le souriceau soit bien repris en charge par sa mère. Concernant les animaux dont l’état général peut être dégradé suite à l’injection de la molécule permettant d’induire la modification génétique, ils seront suivis quotidiennement, par examen de leur aspect physique. Un apport alimentaire et hydrique complémentaire sous forme de gel pourra être apporté, en consultation avec la SBEA. Les animaux recevant une injection d’un agent euthanasiant seront sédatés au préalable pour réduire leur stress et éviter toute douleur liée à l’euthanasiant.
Choix des espèces
La souris est le modèle animal classiquement utilisé dans les expériences et les études thérapeutiques menées en cancérologie. De très nombreuses connaissances sur les mécanismes de formation des tumeurs ont été découverts et caractérisés chez la souris. De plus nous avons dans cette étude besoin de mammifères modifiés génétiquement, et les souris sont les animaux pour lesquels cette technique est la plus développée. Nous utiliserons des souriceaux, jeunes adultes et adultes. L’utilisation des souriceaux (stades postnataux) permettra de cibler un nombre important de cellules d’intérêt afin d’étudier l’impact des gènes d’intérêt sur différents processus cellulaires. Les stades adultes permettront de déterminer si les cellules d’intérêt adultes sont également sensibles aux différentes mutations. Enfin, l’utilisation des animaux à différents temps post-induction des mutations génétiques permettra de comprendre les effets courts et long terme des mutations. Ceci est particulièrement important car chez les patients les mutations semblent apparaitre tôt au cours de la vie (enfance-adolescence) alors que les tumeurs sont diagnostiquées à l’âge adulte (40 ans). Nous prélèverons les animaux pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 5 à 10 jours afin de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et de connaitre leur modification génétique très tôt pour leur inclusion dans nos lots expérimentaux.
Etude du rôle des cellules satellites gliales dans les comorbidités associées à la migraine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
672 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir dix injections, subir quatre heures de piqûres de filaments sur la face ou la patte les jours d'injection, boire pendant une semaine une eau qui irrite son intestin, et passer six séries de trente minutes de bruit au cours d'une même nuit. Les procédures sont classées en niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour le prélèvement d'organes. Le projet cherche un mécanisme commun entre migraine, fibromyalgie et douleurs viscérales, du côté des cellules satellites gliales qui entourent les neurones. Le porteur situe le bénéfice possible au-delà de ce projet, tester un jour de nouvelles molécules, quand les stimulations douloureuses, elles, sont datées et comptées.
Objectifs
Parmi les douleurs chroniques, la migraine qui affecte environ 15% de la population générale, est sur-représentée dans certaines autres maladies douloureuses chroniques. Ainsi, environ 20% des patients souffrant de douleurs du viscérales au niveau des intestins sont également migraineux. Cette proportion atteint jusqu’à 45 à 80% des patients fibromyalgiques (douleurs musculaires diffuses), selon les études. Malgré ces observations cliniques, le(s) mécanisme(s) pouvant expliquer la présence de la migraine dans d’autres maladies douloureuses est(sont) encore peu connu(s). Ainsi, le but de notre projet est de mieux comprendre si un mécanisme commun entre les douleurs viscérales, la fibromyalgie et la migraine pourrait exister. Parmi les mécanismes sous-tendant ce type de douleur chronique, une activation trop importante des neurones pourrait être à l’origine de la sensibilité exacerbée de ces patients. Des cellules particulières appelées les cellules satellites gliales, entourant les neurones dans les ganglions, semblent jouer un rôle clef dans la régulation de l’activité des neurones. Le but de notre projet est donc de caractériser le rôle des cellules satellites gliales entre différents modèles de douleur chronique, de fibromyalgie, douleur viscérale et migraine à la fois chez les mâles et les femelles. Pour cela, nous évaluerons l'expression de plusieurs marqueurs spécifiques d’activation des cellules satellites gliales dans (i) un modèle de douleur, mimant la fibromyalgie, induite par le stress sonore, (ii) un modèle de migraine induite par des injections répétées d’une molécule qui provoque des migraines chez les patients migraineux et (iii) un modèle de douleur viscérale induite par l'administration orale d’une molécule induisant une inflammation du côlon.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes qui expliqueraient pourquoi la migraine est plus fréquente chez des patients souffrant déjà d’autres douleurs (douleurs viscérales inflammatoires et fibromyalgie), notamment le rôle de cellules particulières, appelées les cellules satellites gliales qui entourent les neurones. A plus long terme, comprendre ces mécanismes permettrait de tester de nouvelles molécules pharmacologiques pour cibler plus spécifiquement les patients présentant la présence de la migraine et d’une autre maladie douloureuse viscérale ou de fibromyalgie.
Procédures
Les interventions seront : Injections d’une molécule : chaque injection dure moins d’une minute (au total 10 injections sur plusieurs semaines). Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h toutes les 30 minutes ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Les animaux peuvent être sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : elle a lieu une fois et elle sera sans réveil. La chirurgie dure environ 45 min. Stress induit par un son : série de sons pendant 30min, répétés toutes les 3 heures, soit 6 fois au cours de la nuit, ce qui représente un total de 3 heures de stress sonore.
Impact sur les animaux
Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée chez l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Une douleur légère est provoquée par les injections de molécules. Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte qui entraine une douleur modérée Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Cette molécule induit une irritation de l’intestin et la douleur provoquée est modérée. Les animaux seront sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : le début de cette anesthésie peut induire un stress transitoire de l’animal qui dure moins de 2 minutes. La répétition d’un son entraine un stress chez l’animal.
Devenir
Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par des techniques qui nécessitent le prélèvement d’organes : les animaux seront donc mis à mort à la fin des procédures.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi pour toutes les procédures, nous aurons 12 animaux (6 males et 6 femelles) par groupe. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela limitera le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur et le stress engendrés dans le cadre des différents modèles. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique), nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les points limites fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher ainsi que de papier de nidification, chose importante pour la souris. Une des procédures nécessite une chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse par une personne expérimentée.
Choix des espèces
La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui est difficilement réalisable chez le rat. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature. Ce stade de développement a été choisi car c’est chez le jeune adulte que le plus souvent la maladie migraineuse débute chez l’être humain.
Circuits cérébraux du codage prédictif chez le macaca fascicularis EU 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse de leur cerveau. Huit reçoivent des traceurs injectés dans le cerveau au cours d'opérations de quatre à six heures, suivies de trois jours de traitement antidouleur, quatre portent un implant crânien et une barre de tête, et quatre vivent sous restriction d'eau pendant sept à seize mois. Le but est fondamental, comprendre comment les voies descendantes du cortex fabriquent des prédictions, question posée en parallèle chez des humains par IRM fonctionnelle. Sur le remplacement, le porteur écarte l'informatique en affirmant qu'il n'existera pas de modèle assez précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible.
Objectifs
Les études neurophysiologiques classiques sur le traitement de l’information au sein du cortex montrent que les voies ascendantes de la hiérarchie corticale génèrent des représentations du monde de plus en plus complexes au sein des aires dites de haut niveau hiérarchique, chaque niveau traitant les données sensorielles dans des fenêtres spatiotemporelles de plus en plus étendues. Par contraste, la fonction des voies descendantes reste largement inconnue, constituant ainsi un obstacle majeur à la compréhension du fonctionnement du cerveau dans sa globalité. On attribue pourtant aux voies descendantes, non pas un seule mais plusieurs fonctions complexes telles que l’imagination de représentations sensorielles à partir de concepts issus de l’expérience d’objets visuels (e.g. imagerie mentale d’une orange). La théorie du codage prédictif propose que notre représentation interne du monde se base sur l’interaction entre connexions descendantes (qui transmettent les informations de prédiction sur l’origine des messages ascendants) et les connexions ascendantes (qui 1. encodent la différence entre prédictions des niveaux hiérarchiques supérieurs et signal reçu des niveaux inférieurs et 2. transmettent cette erreur de prédiction aux niveaux supérieurs afin d’adapter en continu leurs prédictions). Les théories sur le traitement hiérarchique prédictif ont un impact significatif sur la compréhension des mécanismes neuronaux liés aux processus de perception, cognition, langage ou encore conscience dans le cerveau humain, en condition saine et pathologique. Malgré cette importance, il existe peu d’évidences empiriques chez les primates dont fait partie l’homme concernant les réseaux de voies descendantes et la nature fonctionnelle des signaux transmis, et les processus d’intégration entre signaux ascendants et descendants restent largement indéterminés. Le but du projet est d’identifier les circuits neuronaux anatomiques et fonctionnels du traitement prédictif dans le système visuel. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez l’animal sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux qui sont impliqués dans la représentation neuronale des sens (en particulier la perception visuelle), ce qui permet une compréhension mécanistique du codage prédictif, mais aussi de son rôle dans des processus tels que l'imagerie mentale et l'imagination. Nos recherches sont menées en parallèle chez l’homme avec des paradigmes comportementaux similaires ; où, dans le modèle animal, les techniques invasives permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et, chez l’homme, de confirmer et d’extrapoler ces résultats au cerveau entier grâce à l’IRMf. Notre objectif global est de comprendre le traitement hiérarchique dans le cerveau humain, ce qui, dans le domaine émergent de la psychiatrie computationnelle, permettra de mieux comprendre les mécanismes neuronaux en cause dans de nombreux troubles cérébraux.
Procédures
Étapes d’imagerie sous anesthésie générale : scan CT - EU2 (n=12, 1 fois/animal, 10min); IRM - EU1 (n=12, 2 fois/animal, 3-5h). Étape d’injection de traceurs sous anesthésie générale - EU1 (n=8, 1 fois/animal, 4-6h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=8, 1 fois/animal, 3j). Étape d’enregistrements électrophysiologiques aigus sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 1-3j). Étape d'implantation de l'implant pour enregistrements semi-chroniques sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h). Étape de fixation de la barre de tête sur l'implant sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 4-5h). Étape d'injection de traceurs et insertion des électrodes - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=4, 1 fois/animal, 3-5j) - EU1, avec adaptation ou prolongation des traitements post-opératoires selon l’avis du vétérinaire référent. Étape de mis à jeun avant anesthésie générale (max 16h). Étape de contrôle hydrique (n=4, 1 fois/animal, 28-64sem).
Impact sur les animaux
Injection intramusculaire = légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille et de l’injection du liquide médicamenteux. Contrôle hydrique = possible perte de poids et baisse du niveau d’hydratation. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place. Injection intracérébrale de traceurs et Implantation intracrâniale = douleurs post-opératoires liées à l’acte chirurgical, 3 à 5 jours. Un suivi de la douleur en période post-opératoire est réalisé pour adapter le traitement contre la douleur.
Devenir
À l’issue de chacune des trois procédures, les animaux seront euthanasiés (12 animaux, 3 Lots). Le passage d’une étape à l’autre se fait systematiquement sous condition de récupération complète de l’animal après chaque étape. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 12 animaux est nécessaire à la validation scientifique du projet (identification de la signature cellulaire et moléculaire des connexions ascendantes et descendantes ; quantification anatomique et fonctionnelle des connexions ascendantes et descendantes ; validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).
Remplacement
La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Il a été demontré par ailleurs que la tractographie par IRM de diffusion (IRMd) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.
Réduction
Le principal facteur nous contraignant au choix de 2 animaux au minimum par procédure réside dans le minimum internationalement reconnu pour la publication et la validation des résultats dans des journaux internationaux avec relecture par des pairs. Les statistiques étant réalisés sur le nombre total de cellules séquencées afin de pouvoir les classer en groupes ou clusters qui différent de par leur expression génomique. D'autres animaux sont prévus uniquement en remplacement (par exemple en cas d’atteinte de point limite avant la fin de la procédure et l’impossibilité d’exploiter les résultats pour cet animal), ou dans le cas où nous devrions augmenter la quantité totale de cellules nécessaire pour le séquençage (environ 10000 cellules par type de projection). Notre expérience montre qu’une injection dans 2 aires différentes permet le marquage de 12000-60000 cellules par type de projection de l’aire source vers deux aires cibles injectées. Le nombre de traceurs pouvant être utilisés simultanément a été récemment augmenté de 4 à 5, ce que devrait suffire pour obtenir un nombre suffisant de cellules par type de projection ; réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. L’analyse statistiques portant sur les mesures répétées (nombre d’essais par neurone et par condition) pour les différents types de neurones unitaires enregistrés. L’utilisation des mesures répétées augmente considérablement la puissance statistique permettant d’étudier l’effet sur un échantillon de petite taille (
Raffinement
Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie avec la mise en place de points limites pour le passage d'une étape à une autre. Une grille de score post-op nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, sous anesthésie génerale, en supprimant l’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce à un nouveau système qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par un laser connecté au système de navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal. Pour les actes de scan CT (ou tomodensitométrie) effectués dans l'EU2, le transport de l'EU1 à l'EU2 d'une durée de 10 minutes est effectué sous anesthésie en cage de transport avec couverture de survie et couverture rembourée.
Choix des espèces
1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous devons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre le carnivore et l’homme est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications de l’équipe de recherche démontrent une forte homologie entre le connectome cortical humain et non-humain mais également de leurs différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.