Système nerveux

Des tâches de locomotion de dix secondes, répétées pendant une heure au cours d'une unique séance : 412 souris vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue par une chirurgie terminale sous anesthésie profonde. Elles subissent avant cela une ou deux chirurgies d'une à deux heures pour injection virale et implantation d'un dispositif d'enregistrement, certaines étant isolées vingt-quatre à quarante-huit heures. Le porteur reconnaît que ces chirurgies entraînent inévitablement un stress et des douleurs, avec une perte de poids et un risque que l'animal endommage sa cicatrice à force de se gratter. Il s'agit d'enregistrer l'activité de neurones inhibiteurs pendant la marche libre, et l'effectif de 412 animaux est présenté comme "défini mathématiquement au plus juste", sans que le calcul soit donné.

Objectifs

Pour marcher, courir ou simplement bouger, notre système nerveux doit constamment ajuster la communication entre les neurones sensoriels (qui perçoivent les mouvements) et les motoneurones (qui les déclenchent). Dans la moelle épinière, des neurones appelés GABApré jouent un rôle clé dans ce réglage fin, en modulant les signaux entre les muscles et les motoneurones. Mais on connaît encore mal comment ces neurones agissent pendant le mouvement, car la plupart des recherches ont été faites ex vivo, dans des conditions peu naturelles. Ce projet a pour but de mieux comprendre le rôle des neurones GABApré pendant la marche libre chez la souris, en enregistrant leur activité en temps réel. Nous verrons aussi comment le blocage de ces neurones affecte la capacité de l’animal à s’adapter à des mouvements plus complexes. Enfin, une étude anatomique nous aidera à savoir si certains GABApré ont des rôles différents selon leur position dans la moelle, ce qui pourrait révéler une spécialisation fine dans le contrôle moteur.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera plusieurs bénéfices, à court et à long terme. À court terme, il permettra de mieux comprendre comment la moelle épinière ajuste les signaux sensoriels pour produire des mouvements fluides et adaptés. Grâce à des techniques innovantes, nous pourrons observer pour la première fois l’activité de certains neurones en temps réel, chez des animaux en mouvement libre. Ce travail contribuera aussi au développement de nouvelles méthodes de recherche combinant enregistrements neuronaux, manipulations ciblées et mesures précises du comportement. À long terme, ces avancées pourraient avoir des retombées pour la recherche médicale. En comprenant mieux les mécanismes naturels de filtrage sensoriel, ce projet pourrait ouvrir la voie à des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour traiter certaines affections neurologiques, comme la spasticité, les douleurs neuropathiques ou les troubles moteurs liés à des lésions de la moelle épinière.

Procédures

Les animaux subiront, sous anesthésie, une chirurgie d’environ 1 à deux heures pour injection virale et/ou implantation de dispositif d’enregistrement (2h quand il s’agit des deux objectifs combinés) ou bien 2 chirurgies d'une heure avec un délai de récupération de 2 à 4 semaines. Deux semaines après la ou les chirurgies, ou 1h après dans le cas d’expériences terminales, les animaux effectueront des tâches comportementales de locomotion fine. Ces tâches durent une dizaine de secondes et sont répétées pendant un maximum 1h. Une seule session comportementale est prévue. Tous les animaux subiront une chirurgie terminale sous anesthésie profonde pour prélèvement de tissus.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entraînent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entraîner une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparaît également en quelques jours. Les tests comportementaux envisagés peuvent également être source de stress pour les animaux, ainsi que les contentions et les injections effectuées pendant les tests. Certains animaux devront être isolés pendant 24 à 48h, ce qui est également un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Le projet porte sur le rôle de l’inhibition présynaptique dans le contrôle de la locomotion, c’est-à-dire un circuit comprenant une sortie physiologique complexe. Un tel circuit est impossible à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doit être intact pour pouvoir être étudié. Il est impossible à modéliser numériquement car les propriétés des différents éléments sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini mathématiquement au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement fiables et robustes. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et obtenir des résultats spécifiques de genre. Les expériences seront effectuées de façon séquentielle, afin de finaliser les expériences de mise au point des différents outils avant d’effectuer les expériences de comportement, ce qui permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les chirurgies sont espacées d’au moins 2 semaines. Un temps d’habituation à la pièce et au dispositif d’enregistrement est prévu, sur 20-30 minutes pendant deux jours consécutifs. Pendant les tests comportementaux, une couverture de 5cm de mousse souple est placée sous le dispositif expérimental, afin d’amortir une éventuelle chute de l’animal. Les animaux sont manipulés grâce à une petite coupelle en plastique, afin d’éviter la préhension répétitive par la queue. Des animaux qui ne subissent par les chirurgies sont herbergés avec les animaux tests. Ils sont présents sur la plateforme d’arrivée des tests de comportements, réduisant ainsi le stress des animaux tests.

Choix des espèces

Pour étudier comment certains neurones contrôlent les mouvements, nous utilisons la souris. Ce choix est justifié car la souris permet de cibler très précisément des neurones grâce à des outils scientifiques avancés. Cela aide à comprendre comment les signaux qui freinent ou modulent les mouvements fonctionnent. La souris permet aussi d’enregistrer l’activité des neurones tout en observant les animaux bouger librement, ce qui est difficile à faire avec d’autres animaux. De plus, beaucoup d’études existent déjà sur les circuits nerveux de la moelle épinière de la souris, ce qui facilite l’analyse des résultats. Nous travaillons avec des souris d’au moins 21 jours, car à cet âge les circuits de contrôle des mouvements sont complètement développés et stables. Cela garantit que les résultats ne sont pas influencés par la croissance.

Soumises à une laparotomie de quarante-cinq minutes pour une électroporation in utero du placenta, 72 souris gestantes sont utilisées dans ce projet, qui compte 1 008 souris au total, toutes tuées à l'issue dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur descendance passe des tests sensorimoteurs quotidiens, avec un test moteur de trente minutes à quinze puis quarante-cinq jours. L'objet est de réprimer deux facteurs placentaires pour reproduire les effets d'une exposition prénatale à l'alcool sur la migration des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. Le porteur écrit que l'électroporation in utero n'entraîne "aucune nuisances ou effets indésirables sur l'embryon", alors que le projet consiste à provoquer chez ces embryons des troubles du neurodéveloppement.

Objectifs

Le projet présenté répond à un problème de santé public majeur, à savoir l’exposition prénatale à l’alcool. En effet, l’alcool présente de nombreuses cibles et notamment les vaisseaux sanguins. Il a été mis en évidence que l’exposition prénatale à l'alcool désorganise les vaisseaux sanguins et perturbe l’expression de certains acteurs importants dans la mise en place des vaisseaux, comme le Placental Growth Factor et la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome. Cette dérégulation des vaisseaux retentie sur la mise en place des cellules neurales qui utilisent les vaisseaux comme support de migration. En effet, les oligodendrocytes et les neurones inhibiteurs, qui migrent de manière vasculo-associée, présentent un défaut de positionnement à la suite d’une exposition prénatale à l'alcool. Enfin, l’exposition prénatale à l'alcool entraine des troubles du neurodéveloppement à la fois au niveau cognitif et moteur qui pourrait s’expliquer par le défaut de positionnement des cellules neurales. Le placenta est un organe transitoire présent au cours de la grossesse qui assure des fonctions endocrines, immunitaires et métaboliques. Il synthétise le Placental Growth Factor et la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome indispensables au bon développement du fœtus. En effet, la diminution au niveau du placenta de ces acteurs entraine une désorganisation des vaisseaux dans le cerveau, à l’image de celle observée à la suite d’une exposition prénatale à l'alcool et apporte une nouvelle preuve d’un axe placenta-cerveau fonctionnel. Cependant aucune étude ne fait le lien entre les acteurs placentaires et l’apparition de troubles du neurodéveloppement. Ce qui fait l’objet de cette étude. Le premier objectif ayant pour but d’étudier les effets de la diminution au sein du placenta du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome sur la mise en place des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. Le second objectif est d’étudier les conséquences sur le comportement sensorimoteur de la jeune descendance et le comportement moteur du jeune adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’une part de comprendre l’impact de l’environnement fœtal (notamment l'exposition prénatale à l'alcool) sur le devenir des individus et d’autre part d’identifier dès la naissance de potentiels cibles permettant de prédire l'apparition de troubles du neurodéveloppement. Nous nous attendons a observé qu’une diminution au niveau placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome ait un impact sur le développement du cerveau et le comportement des souriceaux en réponse à l'exposition prénatale à l'alcool, notamment dans la mise en place et la maturation des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs : soulignant le rôle important de l’axe placenta-cerveau. De plus, ce projet permettra le suivi à long terme des individus dont l’environnement fœtal aura été modifié par l'exposition prénatale à l'alcool.

Procédures

Les femelles gestantes (72 femelles) subiront une chirurgie d’électroporation in utero d’une durée de 45 minutes par femelle. La descendance suivra des tests sensorimoteurs, d’une durée maximale d’une minute par test, par animal et par jour. Le test moteur à P15 et P45 sera réalisé une fois par animal pour une durée de 30 minutes.

Impact sur les animaux

L’électroporation in utero n’entraine aucune nuisances ou effets indésirables sur l’embryon, l’injection dans le placenta peut provoquer une petite gène de quelques secondes lors de l’insertion de l’aiguille. La laparotomie réalisée sur la femelle gestante pourrait entraîner une douleur d'une durée estimée à 24 heures qui sera contrôlée par une analgésie pré- et post-opératoire.

Devenir

A chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. En effet, il est nécessaire d’étudier la mise en place des structures cérébrales des individus dont l’environnement maternel aura été modifié afin de mieux comprendre le rôle du placenta dans le neurodéveloppement et de pouvoir corréler ces observations avec les troubles du neurodéveloppement.

Remplacement

Dans ce projet visant à étudier l’impact de l’environnement fœtal sur le devenir des individus, les expériences in vivo ne peuvent à l’heure actuelle pas être remplacées par des études in vitro. Les études de l’interaction inter-organe placenta-cerveau ne peuvent se faire que sur des individus vivants et l’évaluation du devenir cognitif de ces individus dont l’environnement fœtal aura été modifié ne peut s’effectuer que par des études sur les animaux. Aucune approche de remplacement n’est aujourd’hui disponible dans les études pré-cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au minimum nécessaire pour atteindre l’objectif scientifique de cette étude. Les procédures comportementales de ce projet sont non invasives et un même animal sera soumis aux différents tests dès que possible. Le nombre d’individu est de 14 (7 dans chaque groupe). Avec une perte estimée à 30%, le nombre de femelles gestantes nécessaire est de 10 par groupe. Des animaux des deux sexes issus de la descendance seront utilisés pour cette étude puisqu’il a été démontré un effet sexe au cours du neurodéveloppement et lors de la mise en place des comportements. Lors des analyses, si aucun effet sexe n’est détecté, alors les animaux seront regroupés afin de réduire au maximum. Selon les expérimentations et les comparaisons à effectuer les tests statistiques appropriés seront choisis.

Raffinement

Pour raffiner, les femelles gestantes dont les souriceaux seront prélevés après la naissance seront hébergées dans des cages individuelles avec enrichissement (nid en carton, lanières de papier kraft, tunnel). Cet hébergement individuel est nécessaire afin d'éviter le cannibalisme des femelles entre les portées à la naissance. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C, hydrométrie à 55 %, luminosité à 100 lux avec une durée de cycle jour/nuit 12h/12h). Après l’intervention, les femelles gestantes seront remises dans leur cage avec accès dans la cage à l’eau et à la nourriture. Elles seront par la suite surveillées par les porteurs du projet (suivi de la douleur, suivi des points de suture, prise de poids, évaluation du comportement). Si des points limites sont atteints, les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde. A la naissance des souriceaux, ceux-ci seront manipulés lors des différents tests comportementaux et remis immédiatement, après chaque test, au contact de leur mère. Au jour 21, les souriceaux seront sevrés, séparés selon leur sexe et hébergés par 5 individus au maximum par cage contenant un environnement enrichi (nid, tunnel, lanières de papier kraft).

Choix des espèces

Ce projet s’inscrit sur une volonté de mieux comprendre la communication placenta-cerveau et d’identifier des marqueurs diagnostics d’atteintes cérébrales liés au changement de l’environnement placentaire capables d’avoir des répercussions sur le devenir des individus. La souris est un modèle de choix pour l’étude de nombreux systèmes complexes comme ceux retrouvés au cours du neurodéveloppement. De plus, la maturation corticale des souriceaux est le reflet de la maturation corticale du cortex humain. Ainsi, l’étude chez le souriceau permet de répondre à la problématique de la neuroplacentologie. Ce choix se justifie également par l’abondante littérature et par l’expérience du laboratoire qui contribuent à réduire le nombre d’animaux à utiliser. Les femelles gestantes seront utilisées au 13ème jour de vie embryonnaire afin de réalisée l’électroporation in utero placentaire. Ce stade développemental a été choisi sur la base des études précédentes et d’un point de vu neurodéveloppemental correspond au début des vagues de migration cellulaire des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. La descendance sera prélevée au 20ème jour de vie embryonnaire et au 2ème jour après la naissance afin d’évaluer les conséquences de la répression placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome, d’une part, sur le développement cortical du fœtus et sur son placenta apparié et d’autre part sur l’angiogenèse corticale et la migration vasculo-associée des oligodendrocytes et des neurones inhibiteurs. La descendance sera étudiée en comportement et sera prélevée au 15ème jour après la naissance ou au 45ème jour après la naissance afin d’évaluer les conséquences de la répression placentaire du Placental Growth Factor et de la molécule d'adhésion cellulaire du mélanome sur le comportement à court et moyen terme et sur le neurodéveloppement.

Les souris sont rendues anxieuses par un isolement social chronique et par un régime hyperlipidique, que le porteur présente comme un modèle de pathologie psychiatrique. 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique d'une heure et demie pour implanter des fibres optiques dans le cerveau, parfois doublée de la pose d'une pompe sous-cutanée, puis une privation alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids pour les tâches de conditionnement opérant. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses histologiques, une perte de poids supérieure à 20 % déclenchant une mise à mort immédiate.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, qui controle l'inflammation dans le cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques. Parmi les facteurs de risques des maladies psychiatriques l'isolation sociale chronique AINSI QUE L’OBESITE ONT été démontréS comme délétère pour la santé mentale que soit dans des études chez l'animal ou l'humain. L'objectif est donc de tester si les métabolites bactériens sélectionnés pourraient diminuer les effets délétères de l'isolation sociale ET DE L’OBESITE sur la neurotransmission dopaminergique et le comportement chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment les métabolites bactériens qui sont diminués chez les sujets atteints de maladies psychiatriques pourraient protéger des altérations comportementales et de neurotransmission dans un modèle validé de pathologies psychiatriques chez la souris.

Procédures

Les animaux subiront des interventions chirurgicales visant à implanter des fibres optiques dans le cerveau et potentiellement des pompes sous cutanées. La chirurgie stéréotaxique dure 1h30 avec une phase de réveil de 2 heures. L'implantation de pompes sous cutanée quant à elle dure au maximum 15 minutes. Cette dernière sera réalisée en même temps que l'implantation pour les souris concernées.

Impact sur les animaux

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum). Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Le modèle de pathologie psychiatrique reposant sur l'isolation sociale qui induira, d'après la littérature scientifique un phénotype anxieux chez les souris. LA CONSOMMATION DU REGIME HYPERLIPIDIQUE INDUIRA UN GAIN DE POIDS QUI PEUT ETRE ASSOCIE A DES TROUBLES METABOLIQUES (DIABETE) ET UN PHENOTYPE ANXIEUX CHEZ LES SOURIS. Pour les injections ou les tests comportementaux, les animaux subiront des préhensions et contentions. Les souris réaliserons des tests comportementaux dont certains induisent un stress de courte durée. Enfin dans le cas ou les métabolites ne pourraient être administrés par l'eau de boisson ou la nourriture (pour des raisons organoleptiques conduisant à la non consommation par la souris), une chirurgie visant à implanter des pompes osmotiques sous-cutanées sera réalisée.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (800).

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons des mâles et des femelles. Le nombre d'animaux (800) nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes ayant subis un stress chronique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement ultra-enrichi (carré de coton, maison en carton, pièce en plastique pour se cacher et jouer) même en cas d'isolation sociale. Ce stress chronique a été sélectioné par rapport au stress chronique de défaite sociale, modèle de référence en psychiatrie, car il induit des altérations comportementales similaires sans induire de potentielles blessures à l'animal. Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage (en annexe): - Perte de poids anormale (10-20% score 1, score 3 si supérieur à 20%) - état du pelage - site de chirurgie - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...). Si le score est supérieur ou égal à 3 une mise à mort immédiate aura lieu. Un suivi du bien être animal sera effectué sur tous les animaux de manière quotidienne pendant le protocole de stress et l'étude comportementale en utilisant une fiche de suivi du bien être (en annexe). Le poids, le comportement général, l'apparence et les signes neurologiques seront scorés. Si un animal présente un score supérieur à 3 dans une des 4 rubriques il sera mis a mort. Sinon si un mal être est détecté il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson, la nourriture ou l'implantation d'une mini pompe sous cutanée par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Ce modèle d'étude chez la souris âgée de 8 semaines (jeune adulte) est la référence dans les pathologies psychiatriques et les métabolites d'intérêt dans ce projet sont naturellement présent chez la souris.

4 768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des métabolites bactériens par gavage jusqu'à une fois par jour pendant six semaines, ou par injection sous-cutanée jusqu'à huit semaines, avec un risque d'irritation locale, de perte de poils et de fausse route. Suivent des tests de sociabilité, de comportements répétitifs et d'anxiété, dont le test du champ ouvert, et des évaluations de la physiologie intestinale allant jusqu'à six heures, pour reproduire chez la souris des traits associés à l'autisme. Le porteur écarte le rat au motif qu'il est plus grand, a besoin de plus d'espace et "ne convient pas à la taille de notre animalerie, surtout avec le nombre important d'animaux prévus".

Objectifs

Les troubles du neurodéveloppement, comme les troubles du spectre de l’autisme (TSA), concernent environ 1 % de la population mondiale. Ces troubles se manifestent par des difficultés d’interaction sociale, des comportements répétitifs, mais aussi par des troubles associés comme l’anxiété ou l’hyperactivité. Les patients atteint de la maladie présentent également des problèmes digestifs (constipation, diarrhée, douleurs abdominales), souvent associés à un déséquilibre de leur flore intestinale. Les causes exactes des TSA restent mal comprises, mais de plus en plus de travaux suggèrent un lien entre le cerveau, l’intestin et les milliards de microbes qui le peuplent : le microbiote intestinal. Le microbiote intestinal aide à réguler nos défenses immunitaires, notre digestion, et même à communiquer avec le cerveau, notamment grâce à certaines petites molécules produites par les bactéries intestinales- appelées métabolites. Chez les patients autistes, plusieurs études ont observé des anomalies dans certains métabolites présents dans leur corps. Par exemple, des métabolites issus de la dégradation par le microbiote intestinal d’un acide aminé appelé phénylalanine, sont retrouvés en quantité plus élevée dans les urines et le sang des patients. Le but de ce projet est d’identifier des métabolites capables de déclencher chez la souris des altérations du comportement (sociabilité, comportements répétitifs, anxiété) et/ou des troubles gastro-intestinaux (transit, perméabilité, inflammation), et d’explorer leur mode d’action, notamment par des approches pharmacologiques ciblant le système nerveux. Nous testerons également l’effet de traitements ciblant le microbiote, susceptibles de contrebalancer ces effets. Nous utiliserons un modèle murin, permettant la manipulation de nombreux outils génétiques, une bonne reproductibilité et une forte sensibilité aux variations du microbiote. Néanmoins, ce modèle ne reflète pas toute la complexité des TSA humains (cognition, langage) et les différences interespèces limitent l’extrapolation. Ce projet générera donc des données utiles pour guider de futures recherches cliniques.

Bénéfices attendus

Cette étude est conçue pour générer des connaissances fondamentales qui pourront être utiles pour la recherche chez l’humain. Elle permettra de mieux comprendre les mécanismes biologiques impliqués dans les TSA, en particulier le rôle du microbiote intestinal. Ce projet contribuera à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques ciblant le microbiote, et à tester leur efficacité dans des modèles animaux avant de les envisager pour une application chez l’humain, en vue d’améliorer la santé et la qualité de vie des personnes autistes. Ces résultats seront accessibles à court terme, à l’issue des différentes étapes expérimentales, c’est-à-dire dans les 2 à 3 ans suivant le début du projet. En revanche, leur application en santé humaine nécessitera des étapes supplémentaires, notamment des validations dans d’autres modèles expérimentaux, puis des essais cliniques. Ainsi, même si ce projet contribue à poser les bases de futures approches thérapeutiques, une application concrète chez l’humain ne pourra être envisagée qu’à moyen ou long terme.

Procédures

Identification par injection de puce : durée 10s ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Test de comportements évaluant le phénotype social : durée 4min30s, 10min, 12min, 25min et 72h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant les comportements répétitifs : durée 5 à 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant l’anxiété : durée 5min, 6min et 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Evaluation de la physiologie intestinale : durée 60min, 90min et 6h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Prélèvement sanguin après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois à une fois par jour pendant 6 semaines en fonction de la procédure. • Injections : durée 5s ; fréquence une seule fois à une fois par jour pendant 4 à 8 semaines en fonction de la procédure. • Anesthésie gazeuse : durée 10 min ; fréquence 1 fois sur la procédure.

Impact sur les animaux

Certains des métabolites administrés pourraient impacter le métabolisme ou provoquer des troubles digestifs chez les souris, comme de la constipation, de la diarrhée, ou un inconfort intestinal (ballonnements, douleurs abdominales). Ces effets seront surveillés par l’observation du comportement des animaux, leur poids et leur consommation d’eau et de nourriture. Les substances seront parfois administrées par gavage, une méthode qui peut engendrer un stress temporaire et/ou une légère irritation de l’œsophage, mais la réalisation du geste par du personnel formé limite l’inconfort. Il est à noter que lorsque pratiqué quotidiennement, ce geste est susceptible entraîner un stress modéré lié à la contention répétée des animaux pour chaque gavage, bien que celui-ci tende à diminuer avec l’habituation. L’administration quotidienne de substances sous la peau, au niveau de la nuque, peut entraîner de la même manière, un stress modéré lié à la contention répétée des animaux. Une irritation locale, une perte de poil et une modification de la peau sont susceptible d’apparaitre au site d’injection. Certains des tests comportementaux prévus dans les procédures sont générateurs d’un inconfort faible à moyen mais de courte durée (comme le test du champ ouvert qui évalue les comportements anxieux) et n’induisent pas de douleur ni de signes caractéristiques de mal-être chez la souris (perte de poids, prostration, poil hirsute, absence de toilettage ...). Enfin, un petit prélèvement de sang sera effectué en coupant l’extrémité de la queue. Cette méthode entraîne un léger saignement, rapidement stoppé par une pression douce (hémostase), et ne laisse pas de séquelle à long terme.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront sacrifiés afin de permettre le prélèvement d’organes nécessaires à la réalisation d’analyses biologiques. Ces analyses sont indispensables pour approfondir la compréhension des mécanismes impliqués dans notre contexte d’étude.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, des alternatives non animales pourraient apporter des informations précieuses mais aucune ne permet actuellement de reproduire la complexité du microbiote ni ses interactions avec le système digestif et le système nerveux et l’impact sur la cognition. Par exemple, l’utilisation de cultures cellulaires intestinales permet d'étudier la perméabilité intestinale et l’inflammation mais s’affranchit de la complexité du microbiote et de ses interactions avec le système immunitaire ou nerveux. Les cultures de cellules neuronales ne permettent pas d'étudier les circuits neuronaux fonctionnels ni les comportements associés. L’utilisation de modèles informatiques (in silico) permettrait de simuler des voies de signalisation, des paramètres d'absorption intestinale, ou la distribution des métabolites dans l’organisme. Néanmoins, ces modèles dépendent fortement de données expérimentales préexistantes et sont incapables de prédire des effets émergents à l’échelle comportementale.

Réduction

Pour garantir l’obtention de résultats fiables et statistiquement exploitables, nous avons défini des tailles d’échantillons optimales à l’aide de calculs de puissance réalisés avec un logiciel dédié. Ces calculs ont permis de déterminer qu’un effectif de 12 animaux par groupe est suffisant pour détecter des effets de taille moyenne avec les tests statistiques les plus adaptés à nos données, tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés. Par ailleurs, nous intégrerons à la fois des mâles et des femelles dans notre étude, ce qui permet de couvrir les deux sexes dans une même expérimentation, réduisant ainsi le nombre global d’animaux nécessaires. L’ensemble des résultats sera analysé à l’aide de logiciels statistiques spécialisés. Au total, 4768 animaux sont requis pour l’ensemble du projet, ce chiffre ayant été réduit au strict nécessaire en respectant les principes de la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupes d’au moins quatre, dans des conditions contrôlées (température, humidité) et surveillés quotidiennement par les expérimentateurs. La plupart des procédures n’induiront qu’un inconfort léger et bref. Celles pouvant affecter le bien-être feront l’objet d’un suivi renforcé basé sur une grille de score permettant d’identifier toute souffrance et d’appliquer des points limites précoces. Pour limiter stress et douleur, les gavages répétés seront effectués avec des canules souples à bout rond de sorte à limiter au maximum une irritation de l'oesophage, et les animaux seront habitués avant au geste de contention et à l'introduction d'un cône dans la cavité bucale. En cas de fausse route,l'animal recevra un analgésique injectable toutes les 8–12 h. Si les signes de détresse (difficultés respiratoires, prostation) apparaissent ou persistent 24h après, l'animal sera euthanasié. Les injections seront réalisées en alternant les sites et avec des aiguilles fines. En cas d’inflammation locale, le site sera surveillé et traité si besoin. Les prélèvements sanguins seront effectués par incision de l’extrémité de la queue, méthode permettant de collecter rapidement du sang sans anesthésie et avec un stress minimal. En cas de saignement prolongé, une compresse stérile sera appliquée, et un stylet hémostatique utilisé si nécessaire. Les animaux seront systématiquement surveillés après le prélèvement. Les tests comportementaux seront précédés d’habituation aux dispositifs expérimentaux ; les sessions seront espacées pour favoriser la récupération et réalisées dans un environnement calme par les mêmes expérimentateurs autant que possible. Les procédures nécessitant une anesthésie seront conduites avec soin : le puçage se fera sous anésthésie gazeuse, assurant une intervention rapide et indolore ; avant les prélèvements d’organes, une analgésie préventive injectable sera administrée 30 min avant l’anesthésie générale injectable. Une surveillance clinique renforcée sera assurée tout au long de l’étude. Les points limites incluent : perte de poids > 20 %, altération de l’état général, troubles locomoteurs, blessures persistantes, refus de s’alimenter ou stress prolongé. Tout animal présentant ces signes sera examiné et, sans amélioration rapide, retiré de l’étude et euthanasié conformément aux recommandations.

Choix des espèces

L’autisme entraîne des troubles du comportement importants, et ces troubles peuvent être reproduits chez le rongeur grâce à des séries de tests comportementaux adaptés aussi bien aux jeunes souris qu’aux adultes. La souris est un modèle particulièrement pertinent car son système nerveux et son développement cérébral partagent de nombreuses similitudes avec ceux des humains, ce qui n’est pas aussi bien le cas chez d’autres espèces comme le poisson. En outre, la physiologie intestinale, notamment la perméabilité et la motilité de l’intestin et du côlon, ne peut être étudiée que chez un animal vivant, et la souris offre un bon compromis entre complexité biologique et faisabilité expérimentale. Notre institut a une animalerie avec des rats et des souris, mais les rats sont plus grands et ont besoin de plus d’espace, ce qui ne convient pas à la taille de notre animalerie, surtout avec le nombre important d’animaux prévus. Puisque notre projet porte sur les effets des métabolites produits par les microbes sur le développement du cerveau, nous avons choisi d’étudier les souris à des stades où leur système nerveux garde une certaine capacité d’adaptation, notamment à l’adolescence (vers 4 semaines), ainsi que pendant la gestation, afin de mieux comprendre comment l’exposition précoce influence le développement ultérieur. Ces choix permettent d’étudier les mécanismes liés aux troubles du neurodéveloppement dans un modèle fiable, pertinent et bien caractérisé, indispensable pour développer des traitements adaptés.

192 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Chacune subit une chirurgie de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, une injection dans le cerveau et l'implantation d'un dispositif d'enregistrement qu'elle gardera dans sa cage, avec un risque d'infection et une gêne liée à l'encombrement. Les enregistrements durent jusqu'à deux heures et demie par jour, y compris chez des femelles en lactation, ce que le porteur reconnaît susceptible de provoquer un rejet de la portée. Il écrit qu'il n'existe "malheureusement pas d'alternatives", tout en indiquant que son projet global comporte un modèle numérique du circuit neuronal étudié.

Objectifs

Notre projet vise à explorer comment l’activité des neurones producteurs d’ocytocine (ou neurones ocytocinergiques) est modulée par certains récepteurs spécifiques dans deux régions d’intérêt du cerveau. Ces neurones jouent un rôle central dans la régulation de nombreuses fonctions physiologiques et comportementales, notamment le stress, la reproduction et les interactions sociales. La modulation de leur activité par des récepteurs spécifiques pourrait constituer un mécanisme essentiel pour ajuster finement la libération d’ocytocine. Nous étudierons, chez des souris génétiquement modifiées ou non, comment les récepteurs modulent l’activité des neurones ocytocinergiques dans le cerveau adulte, et l’impact de cette modulation sur l’activité du cerveau. En clarifiant ces mécanismes, notre objectif est de mieux comprendre le rôle des récepteurs étudiés dans la régulation de l’ocytocine, ainsi que leur impact potentiel sur les comportements sociaux et émotionnels dépendants de cette neurohormone.

Bénéfices attendus

Les troubles neuropsychiatriques et neuroendocriniens affectent profondément la qualité de vie des patients, avec des conséquences sur leur bien-être émotionnel, leurs interactions sociales, leur autonomie et leur santé physique. Ces affections représentent un enjeu majeur de santé publique, tant sur le plan humain qu’économique. Malgré les progrès récents, les bases neurobiologiques de ces pathologies restent encore mal comprises, ce qui limite le développement de traitements efficaces. Il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes fondamentaux qui régulent l’activité neuronale dans les circuits impliqués dans la régulation des émotions, du stress, de la reproduction et des comportements sociaux. Parmi ces circuits, les neurones ocytocinergiques occupent une position centrale. Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre le lien entre une dysrégulation de circuits spécifiques au niveau du cerveau et des altérations du comportement social et émotionnel. À long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques, avec l’ambition d’améliorer la prise en charge des patients atteints de certains troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques.

Procédures

Tous les animaux auront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptée pour réaliser une injection dans le cerveau et implanter un dispositif d’enregistrement de l’activité cérébrale (45 minutes maximum par animal). Pour une partie des animaux des enregistrements (animal vigile) de l’activité cérébrale seront ensuite réalisés au cours de sessions d’habituation (4 séances d’une heure chacune, réparties sur 4 jours) puis lors de sessions d’enregistrements de l’activité cérébrale chez des femelles pendant la lactation et après la lactation (2.5h maximum par enregistrement, une fois par jour répété sur 4 jours répartis sur une période de 8 jours pendant la lactation puis 4 jours consécutifs après la lactation). Pour l’autre partie des animaux ils auront des enregistrements (animal vigile) de l’activité cérébrale réalisés au cours de sessions d’habituation 4 séances de 0,5h, 4 jours consécutifs) suivis d’enregistrements réalisés au cours de tests comportementaux visant à représenter divers types de stimuli connus pour activer les neurones ocytocinergiques : 4 tests comportementaux seront réalisés avec 5 jours de repos entre chaque test. Le premier test consistera en une session quotidienne de 15 minutes pendant 3 jours consécutifs, le deuxième en deux sessions quotidiennes de 15 minutes pendant 2 jours consécutifs, le troisième test en deux sessions quotidiennes de 15 minutes pendant 3 jours consécutifs, et enfin le quatrième test en une session quotidienne de 6 minutes maximum pendant 3 jours consécutifs. Tous les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La chirurgie sera associée à un risque de douleur et un inconfort pendant quelques jours. Une telle procédure implique une anesthésie générale qui entrainera un risque d’hypothermie, de sécheresse oculaire et un risque de difficultés cardiaques et respiratoire. De plus, après l'implantation du dispositif sur sa tête, l'animal devra vivre dans la cage avec, ce qui peut provoquer une gêne due à l’encombrement et limiter son comportement habituel, et présenter un risque d’endommagement de l’implant. Cet implant sera également associé à un risque d’infection. Les enregistrements réalisés chez les femelles pendant la lactation pourront entraîner un stress chez la mère et provoquer un rejet de la portée. Les tests comportementaux pourront générer un stress lié au changement d’environnement et au test en lui-même.

Devenir

À la fin des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses post-mortem pour répondre à notre objectif scientifique.

Remplacement

Il n’y a malheureusement pas d’alternatives à l’utilisation d’animaux pour ces expériences, car l'objectif est de découvrir le fonctionnement de zones spécifiques dans le cerveau intact. Il s'agit d'une question empirique qui nécessite l'examen de circuits intacts pour y répondre. Il n'existe aucune lignée cellulaire qui récapitule avec précision la physiologie neuronale des animaux, et comme nos expériences étudient les interconnexions entre les neurones qui se produisent dans le cerveau intact, ces expériences ne seraient pas possibles en culture cellulaire. Il est important de noter que notre projet scientifique global comporte une composante alternative à l’expérimentation animale : l’analyse de modèles in silico (création d’un modèle numérique du circuit neuronal étudié incluant les résultats de notre caractérisation expérimentale). Ce modèle sera diffusé publiquement et constituera une alternative à l’expérimentation animale pour l’étude du rôle fonctionnel de certaines cellules cérébrales spécifiques.

Réduction

Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (192) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Le nombre d'animaux utilisés dans les procédures sera réduit en effectuant différentes procédures sur un seul animal. Nos compétences chirurgicales permettront également de réduire le nombre de complications chez les animaux et de minimiser les dommages durables. Enfin, notre choix de la taille de l'échantillon est basé sur des études précédentes et est cohérent avec ceux généralement employés dans le domaine. La taille réelle de l'échantillon dépendra de la variabilité de la lecture biologique. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Il est également important de noter que le projet comporte un plan de partage de données. Les données expérimentales seront disponibles en libre accès sur la plateforme ebrains.eu (la plateforme de partage de données neuroscientifiques financées par l’Union Européenne) ce qui permettra à d’autres équipes de profiter de ces données, leur évitant ainsi de reproduire ces expériences, et réduira donc le nombre d’animaux utilisés à terme.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton, bâtonnet de bois à ronger et maison) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement. En cas d’anomalie celle-ci sera gérée en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire qui apportent conseils et recommandations pour assurer une prise en charge adaptée de l’animal. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale et des analgésiques seront administrés avant et après l’intervention pour limiter la douleur. Nous maintiendrons la température des animaux au cours de toute la durée de l’anesthésie pour éviter toute hypothermie et appliquerons un gel oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. Un soutien nutritionnel et hydrique ainsi qu’une surveillance étroite seront mis en place à la suite des chirurgies pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Pour les séances d’imagerie, afin de réduire le stress, nous prévoyons une d'habituation des animaux au dispositif. Nous prévoyons également des périodes de repos entre les sessions d’imagerie. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale.

Choix des espèces

Les propriétés de base des microcircuits de cellules du cerveau chez la souris sont similaires à celles des autres mammifères, y compris l'homme, ce qui rend les résultats obtenus avec un tel modèle éventuellement transposables à la médecine humaine. Actuellement, seuls les modèles murins nous permettent de visualiser les types de cellules spécifiques que nous étudions. Les souris peuvent être génétiquement modifiées révélant ainsi la fonction de gènes spécifiques. Le développement du cerveau chez la souris est très bien caractérisé, ce qui facilite les études anatomiques et fonctionnelles. Dans ce projet, des animaux adultes seront utilisés pour toutes les procédures, car les interventions chirurgicales requises ne peuvent être réalisées que sur des sujets adultes (8 semaines minimum). Une partie du projet nécessitera également d’utiliser des femelles après une chirurgie et après une période de gestation dès la naissance des petits car nous nous intéresserons spécifiquement à l’activité des neurones ocytocinergiques pendant la lactation.