Système nerveux

Tués à l'issue pour que leur cerveau soit découpé et analysé, 12 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des IRM de trois à cinq heures, des injections de traceurs directement dans le cerveau lors d'opérations de quatre à six heures, la pose d'un implant crânien et d'une barre de tête, puis l'insertion d'électrodes. Quatre d'entre eux vivent sous contrôle hydrique pendant vingt-huit à soixante-quatre semaines, avec un risque de déshydratation dont le porteur détaille les signes, muqueuses sèches, peau qui perd son élasticité, urine concentrée. Le choix du macaque tient à ce que le rongeur ne convient pas pour l'IRM des fibres cérébrales et que l'homologie du carnivore avec l'humain est jugée trop pauvre.

Objectifs

Les études neurophysiologiques classiques sur le traitement de l’information au sein du cortex montrent que les voies ascendantes de la hiérarchie corticale génèrent des représentations du monde de plus en plus complexes au sein des aires dites de haut niveau hiérarchique, chaque niveau traitant les données sensorielles dans des fenêtres spatiotemporelles de plus en plus étendues. Par contraste, la fonction des voies descendantes reste largement inconnue, constituant ainsi un obstacle majeur à la compréhension du fonctionnement du cerveau dans sa globalité. On attribue pourtant aux voies descendantes, non pas un seule mais plusieurs fonctions complexes telles que l’imagination de représentations sensorielles à partir de concepts issus de l’expérience d’objets visuels (e.g. imagerie mentale d’une orange). La théorie du codage prédictif propose que notre représentation interne du monde se base sur l’interaction entre connexions descendantes (qui transmettent les informations de prédiction sur l’origine des messages ascendants) et les connexions ascendantes (qui 1. encodent la différence entre prédictions des niveaux hiérarchiques supérieurs et signal reçu des niveaux inférieurs et 2. transmettent cette erreur de prédiction aux niveaux supérieurs afin d’adapter en continu leurs prédictions). Les théories sur le traitement hiérarchique prédictif ont un impact significatif sur la compréhension des mécanismes neuronaux liés aux processus de perception, cognition, langage ou encore conscience dans le cerveau humain, en condition saine et pathologique. Malgré cette importance, il existe peu d’évidences empiriques chez les primates dont fait partie l’homme concernant les réseaux de voies descendantes et la nature fonctionnelle des signaux transmis, et les processus d’intégration entre signaux ascendants et descendants restent largement indéterminés. Le but du projet est d’identifier les circuits neuronaux anatomiques et fonctionnels du traitement prédictif dans le système visuel. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Les questions scientifiques abordées dans le projet sont de nature fondamentale et, comme toute recherche fondamentale en neurosciences, ont une incidence sur les questions de santé et de maladie humaines. Ainsi, les bénéfices immédiats de nos travaux chez l’animal sont pour l'interprétation de la structure et de la fonction du cortex humain, où il est évident que les expériences invasives sur les circuits cérébraux ne peuvent être réalisées. Le projet étudie les mécanismes cérébraux qui sont impliqués dans la représentation neuronale des sens (en particulier la perception visuelle), ce qui permet une compréhension mécanistique du codage prédictif, mais aussi de son rôle dans des processus tels que l'imagerie mentale et l'imagination. Nos recherches sont menées en parallèle chez l’homme avec des paradigmes comportementaux similaires ; où, dans le modèle animal, les techniques invasives permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et, chez l’homme, de confirmer et d’extrapoler ces résultats au cerveau entier grâce à l’IRMf. Notre objectif global est de comprendre le traitement hiérarchique dans le cerveau humain, ce qui, dans le domaine émergent de la psychiatrie computationnelle, permettra de mieux comprendre les mécanismes neuronaux en cause dans de nombreux troubles cérébraux.

Procédures

Étapes d’imagerie sous anesthésie générale : scan CT - EU2 (n=12, 1 fois/animal, 10min); IRM - EU1 (n=12, 2 fois/animal, 3-5h). Étape d’injection de traceurs sous anesthésie générale - EU1 (n=8, 1 fois/animal, 4-6h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=8, 1 fois/animal, 3j). Étape d’enregistrements électrophysiologiques aigus sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 1-3j). Étape d'implantation de l'implant pour enregistrements semi-chroniques sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h). Étape de fixation de la barre de tête sur l'implant sous anesthésie générale - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 4-5h). Étape d'injection de traceurs et insertion des électrodes - EU1 (n=4, 1 fois/animal, 5-7h) suivi de traitement anti-inflammatoire et antalgique sur animal vigile en post-opératoire (n=4, 1 fois/animal, 3-5j) - EU1, avec adaptation ou prolongation des traitements post-opératoires selon l’avis du vétérinaire référent. Étape de mis à jeun avant anesthésie générale (max 16h). Étape de contrôle hydrique (n=4, 1 fois/animal, 28-64sem).

Impact sur les animaux

Injection intramusculaire = légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille et de l’injection du liquide médicamenteux. Contrôle hydrique = possible perte de poids et baisse du niveau d’hydratation. En cas de signes cliniques de déshydratation (muqueuses sèches, perte d'élasticité de la peau (plie de peau), concentration de l'urine, réduction en humidité des fèces fraîches, perte de poids corporel), le supplément en eau est augmenté après le travail et discuté avec le vétérinaire. En cas de perduration des signes de déshydratation, nourriture et liquides en biberons sont mis à disposition jusqu'à ce que l'animal ait retrouvé son poids normal. Les causes seront recherchées et discutées avec le vétérinaire, et une adaptation de la procédure de contrôle hydrique sera alors mise en place. Injection intracérébrale de traceurs et Implantation intracrâniale = douleurs post-opératoires liées à l’acte chirurgical, 3 à 5 jours. Un suivi de la douleur en période post-opératoire est réalisé pour adapter le traitement contre la douleur.

Devenir

À l’issue de chacune des trois procédures, les animaux seront euthanasiés (12 animaux, 3 Lots). Le passage d’une étape à l’autre se fait systematiquement sous condition de récupération complète de l’animal après chaque étape. L’analyse post-mortem du cerveau et donc l’euthanasie des 12 animaux est nécessaire à la validation scientifique du projet (identification de la signature cellulaire et moléculaire des connexions ascendantes et descendantes ; quantification anatomique et fonctionnelle des connexions ascendantes et descendantes ; validation de la position anatomique de façon précise des sites d’enregistrements).

Remplacement

La mesure de l'électrophysiologie dans le cortex n'est possible qu'avec des méthodes invasives (enregistrements de cellules individuelles), car elles seules fournissent la résolution spatiale et temporelle nécessaire pour répondre à la question. Les méthodes non invasives telles que l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), l'électroencéphalographie sont donc exclues. L'étude des activités unitaires neuronales in-vivo étant essentielle pour la question de recherche, il est impossible de réaliser les expériences sur des cultures in-vitro. Enfin, les simulations informatiques ne peuvent pas répondre à nos questions de recherche car il n'y aura pas de modèle informatique suffisamment précis du cerveau d'un primate dans un avenir prévisible. En ce qui concerne la connectivité anatomique, seul le traçage peut fournir la connectivité inter-aires dirigée et pondérée dont nous avons besoin. Il a été demontré par ailleurs que la tractographie par IRM de diffusion (IRMd) présente pour l’instant un grand nombre de faux positifs, et l'absence de directionnalité la rendent inadéquate pour le présent projet. Néanmoins, nous utiliserons plusieurs approches statistiques et paramétriques afin d'optimiser la correspondance entre le traçage des voies neuronales et la tractographie. Nous développons également de nouveau protocoles d’IRMd afin d’augmenter la résolution spatiale et donc la précision des mesures. Cela permettra, tant ici que pour de futures expérimentations, d'utiliser l’IRMd, méthode absolument non invasive. Nous utilisons des modèles statistiques pour modéliser les comptages et ainsi comparer la variabilité intra- et inter-individuelle, e.g. en utilisant des modèles linéaires généralisés. Ces modélisations devraient permettre à terme de valider ou du moins d’estimer le degré de validité des mesures réalisées avec de nouveaux protocoles d’IRMd en comparaison avec les mesures issues du traçage neuronal via des traceurs fluorescents rétrogrades.

Réduction

Le principal facteur nous contraignant au choix de 2 animaux au minimum par procédure réside dans le minimum internationalement reconnu pour la publication et la validation des résultats dans des journaux internationaux avec relecture par des pairs. Les statistiques étant réalisés sur le nombre total de cellules séquencées afin de pouvoir les classer en groupes ou clusters qui différent de par leur expression génomique. D'autres animaux sont prévus uniquement en remplacement (par exemple en cas d’atteinte de point limite avant la fin de la procédure et l’impossibilité d’exploiter les résultats pour cet animal), ou dans le cas où nous devrions augmenter la quantité totale de cellules nécessaire pour le séquençage (environ 10000 cellules par type de projection). Notre expérience montre qu’une injection dans 2 aires différentes permet le marquage de 12000-60000 cellules par type de projection de l’aire source vers deux aires cibles injectées. Le nombre de traceurs pouvant être utilisés simultanément a été récemment augmenté de 4 à 5, ce que devrait suffire pour obtenir un nombre suffisant de cellules par type de projection ; réduisant ainsi le nombre d'animaux utilisés. L’analyse statistiques portant sur les mesures répétées (nombre d’essais par neurone et par condition) pour les différents types de neurones unitaires enregistrés. L’utilisation des mesures répétées augmente considérablement la puissance statistique permettant d’étudier l’effet sur un échantillon de petite taille (

Raffinement

Une attention particulière est portée à l'animal après la chirurgie avec la mise en place de points limites pour le passage d'une étape à une autre. Une grille de score post-op nous permet d’évaluer, en fonction de critères spécifiques à l'espèce, les signes indicateurs de gêne ou de souffrance plusieurs fois par jour et d'adapter le traitement antalgique si nécessaire. Par ailleurs, nous avons mis en place des techniques d’enrichissement de l’environnement. Concernant le conditionnement comportemental des animaux, nous faisons appel à une méthode d’entrainement progressive qui se base sur l’habituation et le volontariat de l’animal. Nous avons raffiné les étapes d’imagerie, sous anesthésie génerale, en supprimant l’implantation d’un marqueur de navigation cérébrale, grâce à un nouveau système qui utilise le scanner CT (ou tomodensitométrie) pour aligner les images d’IRM avec un scan du crâne réalisé en per-opératoire par un laser connecté au système de navigation cérébrale. Le fait d’utiliser un système d’enregistrement semi-chronique constitue également un raffinement de la procédure, les électrodes ne sont pas rétractées en dehors du cerveau après chaque session, évitant ainsi la pénétration répétée de la dure mère inévitable pour les enregistrements aigus et qui peut être douloureuse pour l’animal. Pour les actes de scan CT (ou tomodensitométrie) effectués dans l'EU2, le transport de l'EU1 à l'EU2 d'une durée de 10 minutes est effectué sous anesthésie en cage de transport avec couverture de survie et couverture rembourée.

Choix des espèces

1) le cortex cérébral n’existe que chez les mammifères et 2) les fibres inter-aires sont limitées à la matière grise chez le rongeur et donc invisibles à l’IRM. Pour ces raisons, pour étudier simultanément les connexions en IRM et en microscopie, nous devons utiliser le carnivore ou le primate non humain. D’autre part, l’homologie entre le carnivore et l’homme est relativement pauvre mais beaucoup plus importante avec le primate non humain (PNH). Le primate non humain est donc un modèle de choix en neurosciences cognitives pour comprendre le cerveau humain. De nombreuses publications de l’équipe de recherche démontrent une forte homologie entre le connectome cortical humain et non-humain mais également de leurs différences avec celui du rongeur. Nous utilisons des animaux adultes (post puberté) avec une connectivité complètement mature au moment de l’expérimentation.

Injection dans l'utérus de femelles gestantes après ouverture de l'abdomen, injection déclenchant une naissance prématurée, transfert des nouveau-nés prématurés à une mère adoptive, anesthésie de souriceaux sur la glace, chirurgie stéréotaxique de deux heures sur adultes : 4 185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur prévoit des saignements vaginaux, des mises bas prématurées difficiles et le rejet possible des petits par la mère adoptive. Le projet cherche comment une inflammation pendant la gestation ou une naissance prématurée perturbent la construction du cerveau, croisées avec des risques génétiques de troubles neuropsychiatriques. Il annonce des procédures "établies afin de limiter la douleur, l'angoisse ou le stress", après avoir décrit un protocole qui provoque délibérément des naissances prématurées et sépare des nouveau-nés de leur mère.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de mieux comprendre la mise en place d’un organe complexe tel que le cerveau des mammifères. En effet, il a été montré que des défauts de son développement, contribuent à l’étiologie de plusieurs maladies neurologiques et psychiatriques (troubles du spectres autistique, schizophrénie ou troubles bipolaires). Il apparaît donc essentiel mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent le développement du cerveau. En particulier nous voulons comprendre comment des changements environnementaux au cours du développement (inflammation pendant la gestation et chez le juvénil, naissance prématurée ou absence de cellules immunitaires embryonnaire) perturbent l’élaboration du cerveau. De plus, nous analyserons l'impact additif, convergent ou synergique des perturbations environnementales avec des risques génétiques associés aux troubles neuropsychiatriques. Notre projet vise à déterminer le lien entre environnement et prédisposition génétique sur la mise en place du cerveau chez la souris. En combinant la génétique de la souris avec un ensemble d’outil d’analyses biologiques disponible nous souhaitons comprendre comment la naissance prématurée ou les fonctions immunitaires au cours de la gestation provoquent des perturbations pouvant causer de défauts de développement du cerveau associés à des pathologies.

Bénéfices attendus

Les maladies neuropsychiatriques trouvent souvent leur origine dans des perturbations du développement du cerveau, notamment au cours de périodes critiques allant de la vie prénatale à l'adolescence. Cette complexité provient d'une combinaison de facteurs génétiques et d'influences environnementales incluant des perturbations immunitaires (inflammations) lors des étapes cruciales du développement ou une naissance prématurée. Des études ont montré qu’une grande prématurité et des perturbations immunitaires modifient non seulement directement le développement, mais ont également un impact sur les cellules immunitaires du cerveau. De plus, nous analyserons l'impact additif, convergent ou synergique des perturbations environnementales avec des risques génétiques qui ont été identifiés dans divers troubles neuropsychiatriques chez l’homme. Ainsi, comprendre comment des perturbations gène/environnement impact sur les processus développementaux entourant la naissance et sur la formation du cerveau représente un intérêt majeur de santé publique.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à différents gestes techniques selon les questions scientifiques : 1) Chirurgie sur femelle gestante analgésiées et anesthésiées pour procéder à une injection in utero de molécules dans des embyrons (20 minutes). 2) Injection unique sur femelle gestante ou animal juvenil vigiles d’une solution induisant une inflammation (quelques secondes). 3) Injection unique sur femelle gestante vigile d’une solution permettant d’induire une naissance prématurée par voie basse (quelques secondes). 4) Adoption de nouveaux nés prématurés par une mère adoptive issué d’un autre croisement. 5) Injection répétée quotidiennement d’une substance permettant de moduler les niveaux de sérotonine dans des nouveaux nés (quelques secondes). 6) Anesthésie sur glace et injections de marqueurs neuronaux sur souriceaux (environ 10 min). 7) Chirurgie sur animaux adultes analégésiés et anesthésiés pour injections stéréotaxiques de traceurs axonaux (max 2h).

Impact sur les animaux

Les contentions nécessaires à la réalisation d'une injection peuvent induire un stress chez les animaux, principalement en raison de la manipulation et de la restriction physique temporaire imposées. Ce stress, bien que transitoire, peut perturber le comportement normal des animaux et provoquer des réactions physiologiques liées à l’anxiété. De plus, elles peuvent engendrer une douleur légère de courte durée consécutive à l’introduction de l’aiguille ainsi que la possibilité de saignement. L’anesthésie peut quant à elle provoquer des effets secondaires comme : un stress thermique, une hypotension ou une détresse respiratoire. Plus spécifiquement : 1) La chirurgie requise sur femelle gestante analgésiée et anaesthésiée pour l’injection in utero de molécules peut avoir un impact sur i) le déroulement de la gestation des femelles en provoquant des saignements vaginaux ou au site d’incision abdominale ; ii) sur le développement des embryons conduisants à des mises bas prématurées et des difficultés de mise bas. 2) Les injections sur femelle gestantes pour déclencher une naissance prématurée ou sur nouveaux-nés pour moduler la sérotonine peuvent engendrer un stress lié à la contention, provoquer un léger saigenement au site d’injection. 3) Le transfert de nouveaux nés prématurés à une mère adoptive peut engendrer un stress chez les petits ou chez la mère pouvant conduire à une reget de celle-ci. 4) Les injections de molécules inflammatoires sur femelles gestantes ou animal juvenile peuvent engendrer un stress lié à la contention, un léger saigenement ainsi qu’une réaction inflammatoire transitoire au site d’injection. 5) Les chirurgies requisent pour es injections de traceurs axonaux i) chez les nouveaux-nés, peuvent provoquer des saignements au point d’incision et d’injection ; ii) chez l’adulte, nécessite une chirurgie de l’animal analgésié sous anesthesie gazeuse qui peut conduire à des effets secondaires lié à l’anesthesie (stress thermique ou respiratoire) ainsi qu’à des saignements au site d’incision.

Devenir

L'ensemble des animaux impliqués dans ce projet (4185) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites. Pour l'ensemble du projet, les cerveaux des souris seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques, immunohistochimiques ou transcriptomique.

Remplacement

L’étude des interactions des gènes et de l’environnements dans l’élaboration cerveau en cours de développement nécessite impérativement l’utilisation d’un organisme complet. Ce processus dépend en effet d’une multitude de signaux corporels qui influencent directement le comportement des cellules et leurs interactions avec le tissu. Des signaux hormonaux, immunitaires, de tensions des tissus, de la circulation sanguine, de l’environnement de la mère ou des neurones en développement. Ces processus, hautement coordonnés, ne peuvent être reproduits ni par des systèmes de culture (in vitro), qui présentent des limitations spatiales et temporelles, ni par des organoïdes, qui manquent de la diversité et des interactions cellulaire nécessaires. Les simulations informatiques, quant à elles, se limitent aux molécules bien caractérisées et ne permettent pas d’étudier les mécanismes encore largement inconnus qui régissent les phases précoces de développement du cerveau. De plus, nos travaux s’inscrivent dans la continuité de nos recherches antérieures. L’utilisation d’un modèle mammifère in vivo est indispensable pour observer ces mécanismes dans leur environnement physiologique

Réduction

Un total de 4185 animaux sera nécessaire à la réalisation de ce projet. Notre projet est conçu pour minimiser le nombre de souris utilisées tout en garantissant des résultats scientifiquement robustes. La taille de chaque stade d’analyse a été optimisée pour pouvoir utiliser le test statistique approprié et obtenir des résultats statistiquement fiables. En effet, à cause des variabilités inter-animal et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ainsi, grâce à notre expérience préalable dans des projets similaires, nous avons déterminé que 8 animaux (4 de chaque sexe) constituent la taille optimale par groupe expérimental. Cela équilibre le besoin de robustesse statistique et la réduction du nombre d'animaux. Les procédures expérimentales ont été établies pour éviter l’utilisation inutile de souris. De plus, après le sevrage des souriceaux, les mères non traitées pourront être réutilisées dans de nouveaux accouplements. Enfin, dans nos différentes conditions expérimentales, si un résultat n’est pas concluant lors de la première analyse (immunohistochimie), alors les autres expériences prévues ne seront pas réalisées. Cette stratégie contribue significativement à la réduction du nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les mesures de raffinement qui seront mises en œuvre sont liés aux aspects des procédures et concernent l’établissement de points limites, l’hébergement et l’enrichissement de l’environnement des souris. Nous réduirons au maximum l’inconfort ces souris car les procédures que nous mettons en œuvre sont établies afin de limiter la douleur, l’angoisse ou le stress. Nous appliquerons des soins et ou actes nécessaires. Durant les procédures, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux et des séances d’habituation à la manipulation des animaux pourront être anticipées afin de limiter le stress de contention lors des injections. Nous examinerons le comportement et l’apparence des souris ayant subi une procédure ou dont la mère aura subi un traitement pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté. La présence de points limites définis et adaptés pour chacune des procédures nous permettra de détecter toute souffrance chez la souris. En cas d’atteinte de points limites et de souffrance grave ne pouvant être traitée, l’animal sera immédiatement retiré du projet et euthanasié sur décision de l’expérimentateur ou du personnel de l’animalerie, si l’expérimentateur n’est pas joignable. Les animaux sont hébergés dans des conditions respectant la réglementation en vigueur : hébergement en surpression, portoirs avec des cages ventilées individuellement, stabulation en nombre limité par cage, eau et nourriture à volonté, change litière et biberons hebdomadaires, vérification quotidienne, température et hygrométrie contrôlées, intensité et durée d’éclairage définies, enrichissement du milieu : papier kraft, coton et maison en carton. L’ensemble des procédures seront toujours réalisées par des personnes formées et compétentes.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de laboratoire largement utilisées pour étudier le fonctionnement du corps et les effets de ses dysfonctionnements à différents niveaux, que ce soit au niveau du comportement, du fonctionnement physiologique ou des organes. Elles sont également essentielles pour créer des modèles qui nous aident à mieux comprendre certaines maladies humaines. Leur grande similarité génétique avec l'homme, combinée à la possibilité d'utiliser un grand nombre de souris modifiées génétiquement, en fait un excellent choix pour répondre à nos questions de recherche. En outre, leur cycle de reproduction rapide et leur petite taille facilitent leur gestion tout en permettant d’étudier une espèce ayant un développement proche de celui des humains. La courte période de gestation des souris, ainsi que le nombre élevé d’embryons, nous permettent de générer suffisamment d'animaux pour mener plusieurs expériences à partir de quelques parents seulement. Dans le cadre de nos recherches en cours et pour tirer parti des outils génétiques disponibles dans notre laboratoire, nous continuerons à utiliser ce modèle de souris. Dans le cadre de notre projet, les animaux seront utilisés à différents stades de développement, adaptés aux objectifs expérimentaux spécifiques allant de l’embryon jusqu’à l’adulte. Ainsi, les cerveaux seront analysés à 2 stades embryonnaires, en fin de gestation, stades critiques pour l‘élaboration du cerveau. Les cerveaux des souriceaux seront étudiés à diiférents stades après la naissance, des périodes critiques pour la maturation du cerveau. Enfin, les souris juvéniles et adultes seront utilisées pour explorer la persistance et les conséquences à long terme Ce choix stratégique garantit une compréhension globale des processus allant de la formation fœtale à la maturation et au maintien des circuits dans des contextes normaux et pathologiques.

Une heure par jour pendant quinze jours, une partie des 200 souris de ce projet est enfermée seule dans une cage sans litière, sans eau ni nourriture, face à un dispositif de stimulation lumineuse. Ces 200 souris vont toutes être tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie crânienne de deux heures leur pose des électrodes à trois mois, puis elles enchaînent des tâches de reconnaissance d'objet et d'association place-objet, avec des enregistrements de sommeil de 24 heures qui les isolent trois fois de suite. Le projet cherche à savoir si l'enrichissement de l'environnement et la stimulation lumineuse à 40 Hz renforcent la réserve cognitive du cerveau, une autre partie des souris passant deux mois en cages enrichies. Le porteur retient la souris parce que la plupart des modèles d'Alzheimer existants y ont été développés et parce que son laboratoire en a l'expertise de longue date.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA), première cause de démence dans le monde, se caractérise par un déclin cognitif progressif classiquement associé à des marqueurs histo-pathologiques spécifiques comme les dépots amyloides. Pourtant, certains individus présentant une importante accumulation de ces marqueurs neuropathologiques conservent des fonctions cognitives intactes, remettant en question le rôle déterminant de ces marqueurs dans l’expression clinique de la pathologie. Ces observations ont conduit au concept de « réserve cognitive » : la capacité du cerveau à compenser les atteintes liées à la maladie en mobilisant d’autres circuits neuronaux. Alors que de nombreuses approches thérapeutiques visant la réduction les dépôts amyloïdes pour soigner la MA ont échoué, renforcer cette réserve cognitive apparaît comme une stratégie thérapeutique prometteuse. À ce titre, l’enrichissement environnemental (consistant en des conditions d’hébergement plus stimulantes cognitivement avec un hébergement en groupe, des labyrinthes et autre…) et une méthode de stimulation sensorielle non invasive, principalement visuelle à une fréquence de 40Hz, appelée GENUS (Gamma Entrainment Using Sensory stimulation), ont récemment montré un fort potentiel pour le renforcement de cette réserve. Nous pensons que les troubles liés à la MA proviennent avant tout d’un dysfonctionnement des dynamiques cérébrales, plutôt que de la seule accumulation de protéines anormales. En étudiant un nouveau modèle de souris atteintes de la maladie, nous avons observé que les premiers troubles de la mémoire sont liés à une baisse de la fluidité de l’activité cérébrale. Fait marquant, de brèves stimulations visuelles rythmiques (vGENUS) ont permis de rétablir cette fluidité, ainsi que les capacités cognitives. Notre projet a deux objectifs : (1) suivre l’évolution de l’activité cérébrale dans ce modèle animal pour identifier des signes précoces de troubles cognitifs, et (2) tester l’effet de l’enrichissement environnemental et du GENUS sur cette activité et sur les performances mentales. Nous pensons que ces interventions pourraient restaurer une activité cérébrale plus efficace, et ainsi renforcer la résistance du cerveau face à la maladie. Ces résultats pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant directement le fonctionnement des réseaux neuronaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la dynamique cérébrale au cours de l’évolution de la maladie d’Alzheimer et des déficits cognitifs associés, afin d’identifier des biomarqueurs précoces, donc des marqueurs de dynamique cérébrale pathologique pouvant être détecté à des stades très précoces de la maladie. Dans un second temps, ce projet visera à comparer les effets bénéfiques de l’Enrichissement environnemental avec un protocole de stimulation sensorielle non-invasive (vGENUS). Dans son ensemble, ce projet apportera donc une meilleure compréhension et une meilleure caractérisation des stades précoces et de l’évolution de la maladie d’Alzheimer, dans l’optique de pouvoir développer des outils diagnostique précoces de la pathologie. De plus, mieux comprendre l’impact de différents protocoles thérapeutiques ayant déjà montré leurs effets bénéfiques optimisera leur mise en place, dans l’optique d’une démocratisation de ces stratégies thérapeutiques non-invasive pour la prise en charge de patient atteint de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Pour les 3 procédures les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale (environ 2h) à 3 mois pour la mise en place d’électrodes. Ils seront isolés le temps du réveil de la chirurgie (maximum 12h), entre les phases d’acquisition et de rétention des taches de reconnaissance d’objet (24h de délai, pendant lesquels le sommeil des souris est enregistré) et la tâche d’association place-objet (5 min de délais), et également pendant des enregistrements de sommeil de 24 ± 1h répétés 3 fois entre les sessions de comportement. Les sessions de comportement durent 6 jours pour la première puis 4 jours pour les suivantes où les essais des tâches durent 10 minutes et les animaux feront un maximum de 2 essais par jours ce pendant la tâche d’association place-objet. Pour la procédure 2, les animaux seront exposés à un protocole de stimulation lumineuse, ils seront placés 1h par jour pendant 15 jours isolé dans une cage sans litière, nourriture et boisson avec un seul côté de la cage transparent, faisant face au dispositif de stimulation. Les tâches comportementales seront réalisées avant et après ces protocoles. Pour la procédure 3, les animaux seront placés dans des cages d’enrichissement comportemental (Dans les cages ‘Marlaux’) pendant 2 mois avant de réaliser les tâches comportementales. A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort après une anesthesie générale.

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique peut potentiellement induire de la douleur et une altération de l'état de santé général des animaux pendant 48h au maximum. Également, la plaie pourrait présenter des problèmes de cicatrisation, notamment des infections. Enfin, les périodes d’isolement de maximum 25h entre deux expériences où lors des enregistrements de sommeil peuvent induire du stress chez les animaux.L’injection d’anesthésique avant la mise à mort peut induire une douleur aigüe de courte durée.

Devenir

Tous les animaux (200) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem

Remplacement

Ce projet vise à étudier la dynamique cérébrale globale dans les stades de la MA précoces, ainsi, cette étude nécessite l’usage d’un modèle qui permet d’étudier les stades précoces présymptomatiques de la maladie, ce qui n’est pas possible chez l’humain. De plus les mesures de dynamique globale nécessitent le système cérébral dans son ensemble, couplé aux performances mnésiques pour évaluer la progression de la MA, cette étude ne peut donc pas être réalisée in-vitro et doit être réalisée chez l’animal.

Réduction

Le nombre d'animaux dans chaque groupe représente le minimum nécessaire, déterminé grâce à une analyse statistique rigoureuse. Cette analyse prend en compte plusieurs facteurs importants incluant la variation naturelle du comportement chez la souris ou la mortalité naturelle due au vieillissement. Le nombre d'animaux choisi nous permet donc d'obtenir des résultats scientifiquement valables malgré ces contraintes.

Raffinement

La chirurgie sera opérée sous anesthésie gazeuse supplémentée par une couverture analgésique locale au niveau de la zone d’incision chirurgicale. Une pommade d’anesthésique local limitera les douleurs aux oreilles dues aux barres d’oreilles, l’ajout de pommade à base de vitamine A limitera le dessèchement oculaire. Pendant la chirurgie un anti-inflammatoire non stéroïdien assurera l’analgésie et il sera ajouté au biberon pendant 1 à 3 jours pour assurer l’analgésie post-opératoire. Enfin, la température corporelle sera maintenue grâce à un tapis chauffant thermostaté. La lutte contre l’hypothermie se poursuit jusqu’au réveil complet de l’animal en plaçant sa cage sous une lampe chauffante. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience par du personnel formé, plus particulièrement avec une observation détaillée la semaine suivant la chirurgie. Des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute souffrance inutile. En amont des expériences, les animaux seront familiarisés à la manipulation par l’expérimentateur afin de diminuer le stress. Ils seront également habitués à l’utilisation d’une boite pour le transport de l’animal depuis sa cage d’hébergement au dispositif expérimental et vice versa.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est la souris, dont le système nerveux central présente une organisation anatomique et fonctionnelle proche de celui de l’humain, en particulier en ce qui concerne les bases neurobiologiques de la mémoire. L’étude de la mémoire spatiale chez le rongeur constitue un modèle pertinent de la mémoire épisodique humaine. Par ailleurs, la majorité des modèles animaux de la maladie d’Alzheimer (MA) actuellement disponibles ont été développés chez la souris. Le modèle que nous utilisons présente une avancée significative par rapport aux précédents : il ne repose pas sur la surexpression artificielle des protéines clés de la MA, ce qui limite les effets secondaires associés à cette approche. Ce modèle reproduit une apparition progressive des troubles mnésiques, comparable à celle observée au stade préclinique de la MA chez l’humain. De plus, nous disposons d’une expertise de longue date dans l’étude des bases neurobiologiques de la mémoire chez la souris, ainsi que dans l’analyse de modèles murins de la MA. Toutes les souris utilisées seront issues d’un fond génétique homogène. L'étude suivra les souris de l'âge adulte (3-4 mois) jusqu'à un âge avancé (18 mois). Cette période nous permet d'observer l'évolution complète des capacités cognitives au cours du vieillissement normal et pathologique et d’observer l’effet de l’enrichissement environnemental ou du vGENUS sur ces performances.

Chaque souris est opérée du cerveau pendant une trentaine de minutes, puis soumise à un test de mémorisation où l'on mesure son temps d'immobilité, et à deux injections sous contention. 768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin pour analyse de leur cerveau. Il s'agit de créer une mémoire traumatique puis de manipuler les zones cérébrales qui la maintiennent, pour voir s'il est possible de rétablir un souvenir normal de l'événement. Ni la nature de la chirurgie, ni le contenu des deux injections, ni le protocole du conditionnement ne sont précisés, alors que l'effectif de 768 souris repose sur des groupes d'au moins douze animaux.

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier la participation de différentes structures cérébrales qui sont impliquées dans la formation de la mémoire traumatique et dans son maintien. Dans le cas des troubles de stress post-traumatiques, on assiste très souvent à une altération de la mémoire. Cette altération se caractérise par une amnésie des éléments du contexte où a eu lieu l'expérience traumatisante et par une hypermnésie d'élements plus anodins qui sont à la source de "Flashback" incontrolés. Chez l'homme comme chez animal, le maintien de la mémoire traumatique est associé à une sur-activation de certaines zones cérébrales ou au contraire à une sous-activation d'autres zones. Le but de ce projet est de manipuler l'activation de ces structures chez la souris afin d'évaluer si il est possibke de restaurer une mémoire normale de l'événement traumatique.

Bénéfices attendus

En identifiant les bases neurobiologiques spécifiques de la mémoire traumatique, ce projet doit ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le traitement de ce trouble lié au stress.

Procédures

768 souris seront soumises à une procédure de chirurgie d'une durée de 30 minutes environ sous anesthésie. Toutes ces souris seront soumises à un test comportemental de mémorisation. Le test comportemental dure 5 minutes pour la séance d'apprentissage et 6 minutes pour le test de rappel de la mémoire au cours duquel nous mesurons le temps d'immobilité des animaux. Deux injections seront faites chez les 768 souris qui seront immobilisées par contention et dureront moins de 20 secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie est un acte expérimental de classe modérée. Les douleurs post-opératoires sont minorées par l'administration d'antalgiques. 768 souris seront soumises à un test comportemental de mémorisation, qui peuvent induire un stress: un acte de classe modéré. Les injections nécessite d'immobiliser les souris (768) une minute et peut provoquer un faible stress: un acte de classe modérée

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour l'analyse des cerveaux.

Remplacement

L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine.

Réduction

Concernant la réduction, l’effectif de 768 souris se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Notre expérience des approches comportementales indiquent que des effectifs d’au moins 12 animaux par groupe s’avèrent nécessaires pour atteindre le seuil de significativité des résultats. Un nombre inférieur de souris par groupe à la fin de l'étude comportementale pourrait impliquer une réplication de l'expérience.

Raffinement

Tout au long du projet, les animaux seront surveillés par du personnel qualifié, des points limites spécifiques seront établis et des critères d'arrêt seront prévus pour éviter toute souffrance inutile. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous couverture anesthésique et antalgique et des méthodes de raffinement (réchauffement, asepsie) adaptées. En cas de problème constaté, les animaux seront traités selon l'arbre décisionnel prévu.

Choix des espèces

La souris adulte (8 à 16 semaines): -est un mammifère proche de l'espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. La souris représente l'animal classiquement décrit dans littérature, pour ce type d‘expérimentation et l’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris adulte: Nous utiliserons des souris àgées de 8 à 16 semaines, âge qui correspond à l’état adulte de la souris. Pour une comparaison des résultats, l’étude des réseaux impliqués dans la formation de le maintien d'une mémoire implique l’utilisation de cette espèce. -permet d'accéder au niveau cellulaire grâce à des procédures de biologie réalisables en laboratoire.

Maintenues éveillées une heure vingt dans un dispositif d'imagerie cérébrale, à deux reprises, 32 souris subissent aussi une chirurgie de trente minutes, six injections intrapéritonéales, deux injections sous-cutanées, quatre prélèvements de sang à la queue et un jeûne pouvant aller jusqu'à vingt heures. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélever leur cerveau. Le projet cherche à savoir si des changements métaboliques, jeûne ou régime pauvre en sucre, stabilisent l'activité cérébrale altérée dans les troubles liés au stress. Le RNT range l'habituation et les séances d'imagerie en "stress léger", sans dire quelle intervention chirurgicale les souris subissent ni comment elles sont immobilisées pendant une heure vingt d'examen sur animal vigile.

Objectifs

Les troubles liés au stress, comme la dépression, sont souvent accompagnés par des déséquilibres métaboliques. De plus ces troubles sont caractérisés par de l'instabilité dans l’activité du cerveau. Ces troubles peuvent être améliorés par des changement métaboliques, par exemple lors d’un régime spécial ou d’un jeûne. Le but de ce projet est de comprendre comment le métabolisme peut aider à stabiliser l’activité cérébrale

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de comprendre comment les changements métaboliques, en stabilisant l’activité neuronales, peuvent améliorer les troubles liés au stress.

Procédures

6 Injections intrapéritonéales (IP) et 2 sous-cutanées (SC). 1 Chirurgie sous analgésie et anesthésie (30 minutes). Habituation progressive (de 5 minutes à 45 minutes) au dispositif d’imagerie sur 10 jours. 2 séances d’imagerie d’une durée de 1h20 sur animal vigile. 4 prélèvements de sang caudal sur animal vigile. 1 jeune d’une durée maximale de 20 heures.

Impact sur les animaux

Injections : douleur légère de courte durée. Période de récupération post-chirurgie : douleur modérée. Habitation et séance d’imagerie : stress léger. Prélèvement de sang : douleur légère de courte durée. Jeune : stress léger.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour préserver leur cerveau et analyse post-mortem

Remplacement

Dans des modèles de culture de cellules nerveuses, on a observé que certaines substances produites par l’organisme lors du jeûne ou d’un régime très pauvre en sucre peuvent soutenir l’activité du cerveau. Cependant, pour comprendre comment ces substances contribuent à stabiliser l’activité cérébrale, il est nécessaire d’avoir recours à des organismes plus complexes. Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative capable de reproduire toute la complexité du cerveau, ce qui rend les études chez l’animal indispensables.

Réduction

Nous menons des études dans lesquelles nous suivons chaque animal au fil du temps. Cela nous permet de comparer son état initial avec les différents stades métaboliques. Cette approche a l’avantage de réduire le nombre d’animaux tout en gardant des résultats fiables. D’après notre expérience, un groupe de 12 animaux est suffisant pour obtenir des résultats statistiquement solides. Des tests statistiques spécifiques au projet seront utilisés pour l'analyse des résultats.

Raffinement

Les souris seront élevées en groupes sociaux dans des cages comprenant du matériel de nidification (enrichissement). Un personnel formé au bien-être animal surveille les animaux tous les jours. L’apparition de signes de stress ou de douleur sera attentivement suivie en fonction d’une évaluation régulière de points limites appropriés. Des anesthésiques et analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur des animaux. Des goutes pour les yeux sont appliqués pour prévenir l’assèchement des yeux pendant la chirurgie. Des séances progressives d’habitation au dispositif d’imagerie serons effectué pour réduire le stress.

Choix des espèces

L’imagerie fonctionnelle à ultrason chez l’animal vigile est établie chez la souris. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Chez l’Homme, les troubles liés au stress sont fréquents chez les jeunes adultes des deux sexes. Les animaux seront utilisés entre 6 semaines et 4 mois de vie, ce qui corresponds à ce stade. Les deux sexes sont considérés.