Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Identification guidée par imagerie des cibles thérapeutiques pour le trouble du spectre de l’autisme
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Placées dans un dispositif qui déclenche des comportements dits excessifs pendant dix minutes, puis injectées dans le péritoine sur animal vigile, les souris de ce projet enchaînent jusqu'à quatre tests et quatre injections. 456 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le but déclaré est d'identifier les circuits cérébraux actifs pendant ces comportements, puis de les inhiber chimiquement pour voir si les traits mesurés comme autistiques s'atténuent. Les tests de sociabilité, de comportements répétitifs et d'intérêts restreints sont nommés et chronométrés, mais le test central, celui qui révèle les comportements excessifs, n'est jamais décrit.
Objectifs
Il s’agit 1) d’identifier les structures nerveuses dont l’activité est liée à des comportements excessifs chez des souris modèles du trouble du spectre de l’autisme et 2) d’inhiber ces structures afin d’atténuer ces comportements excessifs ainsi que ceux caractérisant le trouble du spectre de l’autisme (sociabilité altérée, comportement répétitifs, intérêts restreints). Pour cela les souris modèles seront croisées successivement avec 2 autres lignées de souris. La première lignée permet d’induire l’expression d’une protéine rapportrice uniquement dans les neurones spécifiquement activés lors d’un comportement particulier. La deuxième lignée permet d’induire l’expression d’un récepteur inhibiteur exogène également dans les neurones activés lors un comportement particulier et, après injection du ligand spécifique au récepteur, de vérifier que l’inhibition de ces neurones modifie les comportements. En raison de l'émergence récente de techniques de stimulation cérébrale non invasives comme options thérapeutiques potentielles pour modifier l'excitabilité pathologique, il est crucial de déterminer si le dysfonctionnement d’une ou plusieurs structure(s) particulière(s) pourrait conduire à un trouble du spectre de l’autisme sévère. Il n’existe pas actuellement de modèles non-animaux permettant de lier activité neuronale et comportement. L’identification de telles structures par des techniques de neuroimagerie chez l'homme est limitée par les tâches pouvant être réalisées dans un scanner d’imagerie par résonnance magnétique. Elle est aussi limitée par la difficulté d'imager des patients avec un trouble sévère. Par conséquent, les données sur le trouble du spectre de l’autisme proviennent d'individus au repos avec un autisme de haut niveau. Malgré ces limitations, les résultats de neuroimagerie sont souvent contradictoires. Seule l’utilisation d’un modèle murin du trouble du spectre de l’autisme, exprimant une protéine rapportrice dans les neurones activés lors d’un comportement excessif, pourrait permettre d'identifier les structures/circuits dont le dysfonctionnement serait responsable de la sévérité du phénotype autistique. Ce modèle exprimant ensuite un récepteur inhibiteur dans les neurones précédemment identifiés devrait permettre de déterminer si l’inhibition de ces neurones permet d’atténuer les traits autistiques les plus sévères.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un modèle murin du trouble du spectre de l’autisme, permettant l’expression d’une protéine rapportrice de l’activité neuronale dans les neurones activés lors de la réalisation de comportements excessifs, devrait permettre d'identifier les structures/circuits dont le dysfonctionnement pourrait être responsable de la sévérité du phénotype autistique. L’inhibition de ces structures/circuits chez les souris modèles, si elle atténue/normalise les comportements excessifs et ceux caractérisant le trouble du spectre de l’autisme, apporterait une preuve de concept que les formes humaines les plus sévères de ce trouble peuvent potentiellement être améliorées via des techniques de stimulation cérébrale non invasives inhibitrices.
Procédures
Le premier lot d’animaux réalisera le test permettant de révéler les comportements excessifs sur 10min suivi d’une injection. Le deuxième lot d’animaux réalisera deux fois ce test comportemental de 10min et recevra 2 injections, avec un intervalle de 4 jours entre le premier et le second test et leur injection. Le troisième lot d’animaux réalisera le test de 10min, permettant de révéler les comportements excessifs, suivi d’une injection. Après 3-4 jours, il sera soumis à 3 tests comportementaux différents, permettant de suivre les traits autistiques. Ces tests (intérêts restreints, 30min ; comportements répétitifs, 10min ; sociabilité, 30min) seront réalisés à 48h d’intervalle précédés chacun d’une injection.
Impact sur les animaux
La répétition de tests comportementaux pourrait engendrer du stress. Les injections en intrapéritonéal pourraient engendrer irritation et douleur au point d’injection et du stress car réalisées sur animaux vigiles.
Devenir
Afin d’analyser au niveau histologique les liens entre comportement et activité neuronale, les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale.
Remplacement
Il n’existe pas actuellement de modèles non-animaux permettant de lier activité neuronale et comportement. Seule l’utilisation d’un modèle murin du trouble du spectre de l’autisme, exprimant une protéine rapportrice dans les neurones activés lors d’un comportement excessif, devrait permettre d'identifier les structures/circuits dont le dysfonctionnement pourrait être responsable de la sévérité du phénotype autistique. Chez les souris modèles exprimant un récepteur inhibiteur dans les neurones activés lors de ces comportements excessifs, l’inhibition de ces structures/circuits, si elle corrige les comportements, apporterait une preuve de concept que les formes humaines les plus sévères du trouble du spectre de l’autisme peuvent être potentiellement améliorées via des techniques de stimulation cérébrale non invasives inhibitrices.
Réduction
Afin de révéler des différences pathologiques, 12 animaux par groupe sont requis. Des tests statistiques appropriés permettront de révéler la significativité de ces différences. Les expériences seront réalisées en aveugle et l’ordre de passage des individus pour les tests comportementaux se fera au hasard. Les groupes utilisés en premier permettront de déterminer s’il y a d’abord des différences 1) entre contrôles et modèles exprimant la protéine rapportrice, au repos ou après réalisation du test pour révéler les comportements excessifs (4 groupes) et 2) entre modèles exprimant le récepteur inhibiteur avant et après traitement avec le ligand ou son solvant (2 goupes). Les groupes suivants permettront de prouver la spécificité des différences observées. 19 groupes seront nécessaires à la réalisation de l’ensemble du projet. Le trouble du spectre de l’autisme affecte préférentiellement les garçons, les filles pouvant camoufler leur phénotype. Les mâles et les femelles seront testés en parallèle. Les analyses se feront en fonction du sexe afin de déterminer si les traits autistiques des femelles sont moins marqués que ceux des mâles et si cela peut être lié à l’activation d’un circuit différent permettant aux femelles de camoufler leurs traits autistiques. 228 souris par sexe seront nécessaires. Les différences d’activité entre contrôles et modèles seront modélisées afin d’identifier les structures dont l’activité devrait être modifiée pour normaliser les comportements excessifs. Cette modélisation devra être toutefois validée par les résultats expérimentaux de l’inhibition des neurones activés lors des comportements excessifs.
Raffinement
Les souris seront suivies régulièrement et des points limites spécifiques au projet seront appliqués. La semaine suivant l’habituation à la zone d’hébergement dédiée aux souris utilisées en comportement, les souris seront quotidiennement placées en pièce de comportement pendant au moins 1h puis entrainées à être manipulées par l’expérimentateur pendant une minute (maintien dans les mains de l’expérimentateur formant une coupe, prise de poids, marquage sur la queue). Le marquage sur la queue permet de repérer rapidement les animaux et de les manipuler toujours dans le même ordre, installant une routine et facilitant les interactions avec l’expérimentateur (i.e vers le 5ème jour, à chaque ouverture du couvercle, les souris peuvent se présenter dans l’ordre où elles vont interagir, les autres restant dans le nid). 48h après cet entrainement, les souris réaliseront selon les groupes de 1 à 4 tests comportementaux (test pour révéler les comportements excessifs ; répétition de ce test avant et après traitement à 3-4 jours d’intervalle pour les effets de l’inhibition des neurones responsables de ces comportements excessifs ; test pour révéler les comportements excessifs puis 3-4 jours après et à 48h d’intervalle les tests de sociabilité, de comportements répétitifs et d’intérêts restreints). Ces tests ne devraient pas engendrer de stress chronique. Le poids des animaux sera régulièrement suivi lors de l’entrainement à la manipulation et avant chaque test comportemental. Les tests seront interrompus en cas de perte de poids pour laisser aux souris le temps de récupérer. Selon les groupes, les souris recevront de 1 à 4 injections. En cas d’injections répétées, elles seront suffisamment espacées pour ne pas provoquer d’irritation. Pour prévenir la douleur qui pourrait survenir suite aux injections répétées, un traitement antalgique de fond sera ajouté à l’eau de boisson durant toute la période de répétition des injections
Choix des espèces
La souris est la seule espèce où il est possible de modéliser le trouble du spectre de l’autisme, de suivre les neurones activés lors de comportements particuliers et d’inhiber ces neurones pour voir si les comportements peuvent être améliorés. Le trouble du spectre de l’autisme est un trouble neurodéveloppemental dont les symptômes comportementaux apparaissent dans la petite enfance, généralement avant 3 ans, et se maintiennent toute la vie. Il y a peu de tests comportementaux pouvant être réalisé avant sevrage chez la souris. Les expériences seront donc réalisées sur des jeunes adultes de 1.5 à 2,5 mois.
Etude des mécanismes corticaux d’intégration somatosensori-motrice chez la souris, en contexte normal et pathologique.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Jusqu'à 105 sessions d'enregistrement par animal, une restriction d'accès à l'eau pouvant durer quatre mois, et pour 90 souris l'amputation d'un membre antérieur à l'articulation de l'épaule. 1 993 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 112 d'entre elles étant enregistrées sous anesthésie générale et tuées avant tout réveil. 1 881 subissent une chirurgie de 45 à 120 minutes pour fixer une pièce sur le crâne, y poser une fenêtre optique ou une électrode. Le porteur reconnaît que l'amputation entraîne une perte de fonction et un abaissement durable des seuils de douleur, pour un objectif, des prothèses reliées au cerveau dans les deux sens, qu'il place lui-même au rang de promesse.
Objectifs
Le but de ce projet est de comprendre comment, au niveau du système nerveux central, les informations somatosensorielles (toucher, proprioception) sont traitées, mais aussi prises en compte dans la production du mouvement d'un membre, et pour l'appropriation corporelle. Au-delà d'une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral, ce projet participe à l'effort pour concevoir des prothèses reliées de façon bidirectionnelle (incluant un retour sensoriel tactile) à des interfaces cerveau-machine. En effet, le développement d'interfaces bidirectionnelles promet de rendre le contrôle des prothèses plus précis et rapide, et d'améliorer leur sensation d'intégration au corps des patients.
Bénéfices attendus
Au-delà d'une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral, ce projet participe à l'effort pour concevoir des prothèses reliées de façon bidirectionnelle (incluant un retour sensoriel tactile et ou proprioceptif) à des interfaces cerveau-machine. En effet, le développement d'interfaces bidirectionnelles promet de rendre le contrôle des prothèses plus précis et rapide, et d'améliorer leur sensation d'intégration au corps des patients.
Procédures
Les expériences prévues nécessitent l'enregistrement de l’activité cérébrale de souris. - Enregistrements sous anesthésie générale : une seule intervention, sans réveil, durant quelques heures, sur un maximum de 112 souris. - Chirurgies sous anesthésie pour mettre en place le dispositif d'enregistrement (pièce de fixation, fenêtre optique ou électrode) : durée de 45 à 120 minutes, sur un maximum de 1881 souris (une fois par animal). - Injections systémiques (intraveineuses) sous anesthésie, pour introduire des gènes permettant d’observer ou de modifier l’activité cérébrale : environ 20 minutes, sur 510 souris maximum (une fois par animal). - Injections intracérébrales sous anesthésie, pour cibler l'expression de ces gènes sur des régions précises du cerveau : environ 60 minutes, sur 150 souris maximum (une fois par animal). - Imagerie fonctionnelle sous anesthésie générale pour localiser les régions cérébrales d'intérêt : environ 20 minutes, sur 1881 souris maximum (une fois par animal). - Enregistrements chroniques chez l’animal éveillé et habitué : sessions de 20 à 60 minutes, répétées 5 à 15 fois par souris, sur un maximum de 206 souris. - Enregistrements chroniques chez l’animal éveillé, tête fixée ou en liberté (fibroscopie) : sessions de 20 à 60 minutes, répétées 10 à 105 fois par souris, sur un maximum de 1675 souris. Ces expériences nécessitent un contrôle de l’apport en eau, pouvant durer jusqu’à 4 mois. - Chirurgie d’amputation d’un membre antérieur sous anesthésie : environ 1h30, sur 90 souris (une fois par animal). Les expériences qui suivent pourront durer jusqu’à 3 mois.
Impact sur les animaux
Les souris impliquées dans le projet seront soumises à des procédures susceptibles de s’accompagner d'effets indésirables : Dépression respiratoire ou cardiaque, hypothermie, impact sur le tractus digestif liés à l’anesthésie, réactions inflammatoires ou infectieuses liées à l’implant d’électrodes ou de fenêtres optiques. Certains groupes de souris feront l’objet d’injections de constructions virales non pathogènes dans le sinus rétro-orbitaire réalisées sous anesthésie générale, qui lorsque le geste est maitrisé ne s'accompagne pas de complications. Certaines souris seront impliquées dans des tâches de conditionnement opérant, souvent associées à des enregistrements d’activité neuronale réalisées soit « tête-fixée », soit en comportement libre, mais connectées à un système d’enregistrement par le biais d’un faisceau de fibres optiques flexibles. Les effets indésirables liés à ces expériences sont principalement : Stress lié à la privation hydrique, perte de poids, stress et inconfort lié au maintien par la tête. Certaines souris, dans le cadre du développement de neuroprothèses seront soumises à l'amputation d'un membre antérieur au niveau de l'articulation gléno-humérale (épaule). Cette amputation, bien que réalisée dans des conditions réduisant au maximum le stress et la douleur, constituera une nuisance pour l'animal avec une perte de fonction, et une diminution des seuils de douleur sur le long terme.
Devenir
A la suite de nos expériences nous devons, pour interpréter de manière pertinente les résultats obtenus, prélever le cerveau des animaux et réaliser des analyses histologiques.
Remplacement
Dans le domaine des neurosciences, les alternatives à l’usage de modèles animaux sont les approches in silico, ex vivo, et in vitro. Dans le cadre de notre projet, notre objectif est de comprendre les mécanismes neuronaux impliqués dans le traitement des informations somatosensorielles et leur perception, la motricité et l’apprentissage moteur. Les approches in silico évoluent, diverses initiatives sont menées à l’échelle mondiale pour collecter massivement des données de manière à raffiner les modèles mimant le fonctionnement du système nerveux, en y intégrant notamment la grande diversité des propriétés intrinsèques des neurones qui constituent les réseaux corticaux, mais aussi les spécificités régionales du cortex cérébral en termes de connectivité. Mais les modèles actuels sont encore bien trop simplifiés pour se substituer aux études sur des animaux vivants. Le but de notre étude est justement d’approfondir la compréhension des mécanismes qui régissent l’intégration somatosensori- motrice corticale, pour pouvoir ensuite conduire à une modélisation des processus étudiés.
Réduction
Pour réduire au minimum le nombre d'animaux impliqués dans nos expériences, nous avons adopté une stratégie de multiplication des mesures sur les mêmes animaux. Nous travaillons avec des implantations chroniques d’électrodes et de fenêtres optiques qui permettent de réaliser des mesures chroniques répétées durant de multiples sessions consécutives chez le même animal. Nous associons méthodes d’imagerie, d’analyse du comportement, d’électrophysiologie et d’optogénétique sur le même animal. Cette stratégie nous permet de collecter un grand nombre de données à partir d’un nombre réduit d’animaux.
Raffinement
Nous mettrons en œuvre de nombreuses mesures visant à assurer le bien-être des animaux impliqués dans notre projet. Cela commence par l’utilisation d’une anesthésie et analgésie adaptés à chaque type d’intervention. A l’issue des procédures chirurgicales, les animaux seront placés dans une enceinte chauffée dédiée au réveil et la surveillance post-opératoire afin de minimiser leur stress. Une fois complètement réveillés, ils seront réintroduits dans leur cage habituelle pour éviter qu’ils ne se sentent isolés. Un suivi quotidien consciencieux sera mis en place pour observer leur poids, leur état de santé général, leurs expressions faciales et leur comportement, pendant plusieurs jours après l’intervention. En dehors de la phase post-opératoire, nous habituerons les animaux à l’environnement des sessions d’enregistrement pour limiter leur stress. Lorsque les animaux seront soumis à une restriction d’accès à l’eau dans le cadre d’un apprentissage comportemental, leur poids et leur apparence seront contrôlés quotidiennement pour garantir leur bien-être. Par exemple, en cas de perte de poids trop importante, un complément en eau leur sera accordé. Une grille d’évaluation du bien-être animal sera utilisée pour définir les seuils d'intervention spécifiques à chaque individu. En cas de signes de douleur, un traitement approprié sera administré. Enfin, dans ce projet, nous veillons à ce que les animaux soient logés en groupe dans des cages spacieuses, enrichies, et adaptées à leurs besoins comportementaux et physiologiques. Ces mesures sont essentielles pour assurer le bien-être des animaux dans nos expériences et diminuer la variabilité de nos résultats.
Choix des espèces
Le cortex cérébral de la souris est doté d’une structure laminaire, comparable à celle des primates tout en étant dépourvu de circonvolutions. Il offre un accès direct privilégié aux aires sensorimotrices, y compris un accès optique. C’est un atout très précieux à l’heure où les méthodes optiques sont devenues des outils incontournables pour enregistrer et contrôler l’activité d’assemblées de neurones. En outre, la souris est un modèle privilégié pour l'étude du système somatosensoriel, grâce à la masse de connaissances acquises concernant le système des vibrisses, auxquelles correspondent des structures bien définies au niveau du cortex somatosensoriel primaire. Le laboratoire maîtrise très bien ce modèle, un facteur important pour la réussite des expériences envisagées et pour la minimisation du nombre d'animaux impliqués dans les expériences. Également, le modèle souris bénéficie d'outils optogénétiques particulièrement performants, qui sont facilement mis en œuvre grâce à la commercialisation de nombreuses lignées transgéniques dédiées. La grande majorité de nos expériences seront réalisées sur des souris adultes (> 8 semaines), car nous souhaitons étudier les principes de fonctionnement des circuits somatosensori-moteurs corticaux, au sein d’un système nerveux bien développé et établi. Les animaux adultes sont plus faciles à entraîner à des tâches comportementales où les courbes de poids sont utilisées pour gérer la restriction hydrique des animaux. Cela facilite la mise en œuvre de nos expériences, et l’adoption de protocoles longitudinaux impliquant la collecte répétée de données chez un même animal.
Modulations pharmacologiques des mécanismes communs dans les différents types d’accidents vasculaires cérébraux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 980
Soixante minutes d'interruption de la circulation dans une artère cérébrale, sans qu'aucun analgésique ne soit administré ensuite. 1 260 souris et 980 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, une partie étant opérée sous anesthésie et tuée avant tout réveil. D'autres subissent une hémorragie intracérébrale provoquée chirurgicalement, une injection intra-artérielle destinée à créer des microhémorragies, ou un drainage d'hématome, auxquels s'ajoutent des traitements quotidiens, des séances d'imagerie de quarante-cinq minutes, des prélèvements sanguins mensuels et des tests de mémoire, d'anxiété et de motricité étalés sur plusieurs semaines. Le recours à deux espèces de rongeurs, le porteur l'appuie sur les recommandations STAIR, un ensemble de critères établis par des experts du domaine.
Objectifs
L’objectif global du projet est de moduler pharmacologiquement les mécanismes communs entre les différents types d’AVC (Accident Vasculaire Cérébral) afin d'en contrer les effets néfastes ou les complications, à court terme ou à long terme.
Bénéfices attendus
Concernant les hémorragies cérébrales, à la phase aiguë (c’est-à-dire jusqu’à 7 jours), ce projet permettra de proposer plusieurs pistes thérapeutiques pour l’évacuation de l’hématome. Au-delà de 7 jours, ce projet permettra de proposer une piste anti-inflammatoire pour contrer les effets délétères de l’œdème présent autour de l’hématome résiduel. En ce qui concerne les ischémies cérébrales, des modulations pharmacologiques à court et et à long terme par des médicaments aux multiples effets permettra d'évaluer les bénéfices de ces traitements sur les troubles de la mémoire et la récupération fonctionnelle post AVC.
Procédures
Les animaux vont être soumis respectivement et de manière unique à - une intervention chirurgicale afin d'induire un accident vasculaire ischémique (interruption de la circulation sanguine dans une artère cérébrale d'une durée de 60 min) - une intervention chirurgicale afin d'induire d'une hémorragie intracérébrale (d'une durée de 30 minutes) - une injection intra-artérielle de molécules permettant la constitution de microhémorragies cérébrales (d'une durée de 10 minutes) - une intervention chrirugicale post hémorragique et drainage de l'hématome (d'une durée de 60 min). Pour l'ensemble de ces procédures, les animaux recevront des traitements pharmacologiques innovants quotidiennement (par voie orale ou par injection d'une durée de 5 minutes par administration), en parrallèle d'évaluations comportementales visant à tester la mémoire, l'anxiété et la motricité (tests s'étalant de quelques heures à plusieurs semaines), de séances d'imagerie (d'une durée de 45 minutes/séance) et de prélèvements sanguins mensuels (5 minutes/prélèvement).
Impact sur les animaux
L'induction des AVC ischémiques et des HIC chez les animaux se fait par une chirurgie réalisée sous anesthésie. Malgré nos précautions, il se peut que cela entraine une gêne chez l'animal à plus ou moins long terme (perte d'appétit, de motivation, augmentation de l'anxiété). De plus, la principale nuisance attendue dans le modèle d'AVC ischémique repose sur le fait qu'aucun analgésique ne sera administré et que cela peut entrainer une douleur. Une perte de mobilité transitoire peut également être observée dans les 72h qui suivent l'intervention. De même, les animaux subiront une IRM nécessitant une anesthésie non invasive sous isoflurane pouvant entrainer un stress et un mal-être chez l'animal mais qui reste proche de l'induction et dont les effets sont minimes et à court terme. De potentiels effets indésirables peuvent apparaitre en fonction des traitements administrés, même si les doses sont non toxiques (troubles digestifs, nuisance liée à la piqure). Une douleur peut être générée lors du prélèvement rétro-orbital. Aucune nuisance n'est attendue lors des tests comportementaux, hormis la légère restriction alimentaire lors d'un test comportemental. La mise en place d'une surveillance rapprochée et de points limites permettra de limiter au maximum ces gênes potentielles (voir document associé).
Devenir
A la fin des protocoles, les animaux seront mis à mort après différents temps d'intérêt, entre 24h et 6 mois post chirurgie, pour des études du tissu cérébral qui nécessitent d'avoir accès à l'organe.
Remplacement
L’expérimentation proposée vise à comprendre les mécanismes impliqués dans la survenue d'un accident vaculaire cérébral. Il s’agit de l’étude d’un trouble physiopathologique intégré faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux mécanismes dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro.
Réduction
L’ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l’accomplissement de ces études requiert un nombre total de 2240 animaux. Le nombre minimal nécessaire d'animaux a été défini pour assurer la validité scientifique et statistique des résultats. Les données et les analyses statistiques sont conformes aux recommandations sur la conception expérimentale et l'analyse en pharmacologie.
Raffinement
Dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales sera réalisé en limitant au mieux (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une vigilance particulière sera réalisée sur les points limites afin de respecter au mieux le bien-être animal. Les mesures spécifiques seront la mise à disposition de gel nutritif enrichi lors d'une perte importante de poids, de la désinfection en cas de plaies et d'un ajout d'enrichissement en cas de comportement aggresif anormal. Selon les critères observés et la cause identifiée, les animaux seront soit isolés et soignés, et/ou recevront un traitement analgésique, ou seront mis à mort dans une salle dédiée. La structure du bien-être animal ou le vétérinaire référent seront sollicités pour avis si besoin. Les conditions d'hébergement sont optimisées avec un environnement contrôlé (température, pression, humidité de l'air) et de l'enrichissement dans les cages.
Choix des espèces
En accord avec les données de la littérature et surtout afin de stabiliser la reproductibilité et la fiabilité des résultats obtenus, nous avons choisi de travailler sur des animaux (rats et souris) jeunes adultes nous permettant d'envisager des études à long terme. Le choix de 2 espèces de rongeurs repose sur les recommandations STAIR (Stroke Therapy Academic Industry Roundtable) qui rassemblent des critères expérimentaux définis par des experts internationaux et adaptés à l’évaluation expérimentale.
Création et maintien de lignées de poissons zèbre génétiquement modifiés pour l’étude des protéines contrôlant l’architecture des neurones
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Tués dès la fin de la procédure pour les uns, gardés jusqu'à douze mois puis mis à mort pour les géniteurs et génitrices, 16 950 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le projet consiste à créer et maintenir des lignées génétiquement modifiées pour étudier les protéines qui structurent les neurones. Chaque poisson subit à quatre mois, sous anesthésie, le prélèvement d'un morceau de nageoire caudale destiné au génotypage, geste que le porteur décrit comme sans dommage tout en reconnaissant qu'il peut induire du stress et de la douleur. L'effectif reste sans justification statistique, le porteur indiquant qu'aucune méthode n'a pu servir à le déterminer puisque aucune expérience n'est menée sur les poissons adultes.
Objectifs
Notre programme de recherche porte sur l’étude de neuropathies héréditaires humaines caractérisées par des atteintes neurologiques sensitives et motrices. La prise en charge clinique des patients est actuellement symptomatique et aucun traitement curatif n’existe à ce jour, ce qui pose l’urgence de développer des modèles animaux précliniques pour la mise au point des thérapies. Nous nous intéressons aux protéines qui forment l’architecture du neurone et qui sont mutées dans nombre de maladies neurologiques. Notre programme de recherche vise à comprendre le rôle physiologique de ces protéines structurelles et leur régulation. Afin de mener ce projet à bien, nous avons choisi le modèle du poisson zèbre, qui constitue un modèle/outil de choix pour l’étude du système neuromusculaire, similaire à celui de l'Homme et déjà fonctionnel dès le stade larvaire précoce. En outre, la transparence de l'animal durant le développement nous permet de capturer les processus dynamiques qui nous intéressent par imagerie dans un modèle in vivo. Pour réaliser ce projet, nous créerons et maintiendrons des lignées poisson zèbre transgéniques. Ces lignées nous permettront de générer des embryons dans le but d’étudier les protéines structurelles des neurones par des techniques de microscopie ou de biochimie à des stades larvaires (
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale permettant de mieux comprendre les fonctions des protéines contrôlant l'architecture des neuroneset leur implication dans des mécanismes pathologiques. L’objectif à long terme (>5ans) est de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.
Procédures
La création et le maintien de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux transgéniques. Cette procédure d'identification nécessite le prélèvement d’un morceau de tissu de la nageoire caudale du poisson afin d’en extraire l’ADN. Ce prélèvement, d’une durée inférieure à 5 minutes, sera réalisé sous anesthésie une seule fois au cours de la vie de l’animal, à 4 mois. Classiquement, cette technique ne génère pas de dommages ni de mortalité. Il s’agit la du seul geste invasif qu’auront à subir les poissons zebres une fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Nous ne nous attendons pas à ce que les protéines étudiées induisent des nuisances dans les lignées transgéniques créées. Seule les formes mutées, avec des mutations retrouvées chez les patients, ont le potentiel de générer un phénotype dommageable (défauts sensorimoteurs). Ces défauts pourraient induire un défaut de nage chez ces poissons n’entrainant pas, au vu de la littérature sur les patients, de mortalité ou de conditions d’hébergement particulières. Nous porterons une attention particulière aux déficits moteurs en évaluant la qualité de la nage des poissons générés (notamment observable lors du nourrissage) et à l’apparition de signes de souffrance. Pour les autres lignées transgéniques, un suivi des poissons zebres sera réalisé afin de s’assurer qu’aucun d’entre eux ne développe de phénotype dommageable dans le temps. Lors de la création de ces lignées, un certain nombre de poissons zebres seront amenés à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification qui peut induire du stress et de la douleur.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les animaux d’intérêt (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 12 mois puis mis à mort. Les autres seront mis à mort dès la fin de chaque procédure afin de ne pas garder d’animaux génétiquement modifiés , non nécessaires à la conduite de ce projet et ne pouvant pas être replacés (adoption ou autre projet).
Remplacement
Le projet vise à acquérir une meilleure compréhension fondamentale des protéines controlant l'architecture des neurones. Bien qu'il existe des systèmes d'étude de cellules in vitro, ces modèles sont fortement limités car les neurones ne sont pas matures et ne permettent pas d'étudier complètement les fonction de ces protéines. Par conséquent, il n'existe actuellement aucun système in vitro qui réponde aux deux critères de complexité et de transparence des tissus, nécessaires pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cela nous rend dépendants de l'utilisation de systèmes in vivo. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents, qui est déjà fonctionnel au stade larvaire et qui a une transparence tissulaire ce qui en fait un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques. Nous souhaitons établir des lignées poisson-zèbre transgéniques afin de disposer d’outils pour étudier la biologie des neurones.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre de poissons à élever jusque l’âge de 4 mois, une estimation préalable de l’efficacité des techniques utilisées sera réalisée sur des oeufs de poisson zèbre sauvages à 24-48h heures post fécondation. Nous limiterons également au maximum le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de nageoire caudale pour identification en réalisant les prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres. Ainsi, dès lors que le nombre d’animaux nécessaires à la génération des lignées sera obtenu, les prélèvements seront stoppés. Pour le maintien des lignées créées, seul le nombre de poissons zèbres nécessaire au maintien de chaque lignée sera conservé, ce qui correspond à une vingtaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Étant donné qu'aucune expérience ne sera réalisée sur les poissons adultes, aucune méthode statistique n'a pu être utilisée pour déterminer le nombre d'animaux. Le nombre d'animaux a donc été déterminé sur la base du nombre de couples reproducteurs requis.
Raffinement
Tous les poissons adultes seront élevés en aquarium en conditions d’hébergement standard, avec une surveillance hebdomadaire. Les individus devant subir la procédure d'identification par prélèvement de nageoire caudale seront placés sous analgésie avant la procédure. Pendant cette procédure, l'exposition à l'anesthésique sera minimisée en effectuant rapidement les manipulations tout en s'assurant que le poisson est suffisamment sédaté pour ne pas sentir les manipulations. Une sédation adéquate sera confirmée en vérifiant l'absence de réaction de fuite provoquée par le toucher. Le plus petit morceau de nageoire possible sera prélevé afin de faciliter la cicatrisation et minimiser l’impact de cette procédure sur les animaux. La récupération de l'anesthésie sera étroitement surveillée : si le réveil n'est pas observé dans les 10 minutes, l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance. Nous réduirons au minimum le temps d'isolement des animaux (24h à 48h maximum). Les animaux seront traités par lots de 16 ce qui permet de former des bancs réduisant ainsi le stress des poissons. Les poissons ayant subi la procédure seront surveillés pendant 15 jours soit le temps minimum de cicatrisation afin que tout comportement ou aspect anormal puisse être évalué lors des contrôles de routine effectués par les soigneurs. Des points limites précoces et adaptés aux modèles d'étude ont été définis (points limites d'altération de la morphologie ou de comportement). En cas d'atteinte d'un seuil limite, les poissons seront euthanasiés.
Choix des espèces
Grâce à la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme, le poisson zèbre est un modèle idéal pour étudier les fonctions des gènes et des protéines qui sont pertinentes pour la physiologie et la pathologie humaines. Les embryons de poisson zèbre ont un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, avec tous les types de cellules pertinents pour nos questions biologiques. En outre, la transparence des embryons de poisson zèbre permet de suivre des processus dynamiques dans un contexte d'organisme entier à l'aide de techniques non invasives.
Étude des altérations du protéome de manière pathologie-spécifique dans des modèles murins de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Établir quelles protéines des neurones et des astrocytes se modifient dans la maladie d'Alzheimer conduit à utiliser 978 souris, dont des modèles transgéniques et des porteuses du facteur de risque ApoE. Toutes relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Elles reçoivent une injection sous anesthésie vers quatre ou cinq mois, puis une injection quotidienne pendant deux semaines, et la moitié passe un mois sous régime modifié destiné à supprimer les cellules immunitaires du cerveau. Paralysie des membres postérieurs, épilepsie, hydrocéphalie et malocclusion sont annoncées comme phénotypes possibles. Le porteur n'utilise que des mâles, en indiquant que le recours aux deux sexes exigerait un nombre d'animaux "bien trop important d'un point de vue éthique", tout en reconnaissant que ce serait un atout scientifique.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle aucun remède n’existe à ce jour. Les pathologies Alzheimer dans le cerveau, ainsi que la neuroinflammation, sont des caractéristiques de la MA qui entraînent une perte synaptique et neuronale, constituant la base du déclin cognitif. Certains gènes sont connus pour contribuer à la neurodégénérescence, à la neuroinflammation, aux pathologies Alzheimer, mais les mécanismes restent encore mal compris. Nos études suggèrent que les microglies (cellules immunitaires du cerveau) et les astrocytes (cellules nourricières des neurones) pourraient être des médiateurs de cette toxicité génétique, mais des études sont nécessaires pour confirmer ou infirmer cette hypothèse. L'investigation des changements protéomiques des neurones et des astrocytes causés par les pathologies Alzheimer, ainsi que le rôle de certains gènes pro-Alzheimer et des microglies dans ces processus, est donc essentielle pour comprendre la MA et développer des traitements efficaces. Le projet vise à dévoiler comment 1) les pathologies Alzheimer, 2) les facteurs de risques génétiques, et 3) les microglies modifient les protéines des neurones et des astrocytes, conduisant à la neurodégénérescence. Nous utiliserons des souris : 1) contrôles (saines), 2) modèles Alzheimer, en présence ou en absence de microglies. Nous utiliserons également des souris exprimant le principal facteur de risque génétique (ApoE) de la MA. Cette étude nous permettra d'identifier avec précision les changements protéomiques émergents induits par la MA dans les neurones et les astrocytes.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence neuronale dans la MA. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des effets néfastes des pathologies Alzheimer et des microglies pour préserver les neurones et qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.
Procédures
Tous les animaux subiront une anesthésie gazeuse afin de recevoir une injection unique à 4/5 mois. Tous les animaux vigiles subiront une injection quotidienne (environ 30 secondes) pendant 2 semaines avant la fin du protocol. Un mois avant l'euthanasie et la collecte des tissus pour les 2 cohortes, la moitié des souris seront traité avec une diète modifiée afin de supprimer les cellules immunitaires dans le cerveau pendant un mois (soit à 6 ou à 9 mois).
Impact sur les animaux
L'injection unique à 4/5 mois peut générer une douleur, un saignement ou une inflammation. Les injections quotidienne pendant 2 semaines peuvent entraîner un stress et une douleur de courte durée et un risque d'infection. Un de nos modèles de la maladie d'Alzheimer peut développer une paralysie des membres postérieurs qui pourra à la longue les empêcher d'accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Ces souris peuvent aussi faire de l'épilepsie, de l’hydrocéphalie et de la malocclusion (mauvais alignement des dents) qui pourront générer de la souffrance, du stress et une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analysé.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence neuronale ainsi que les pathologies alzheimer sont très/assez difficiles à obtenir in vitro. Les souris modèles de la maladie d'Alzheimer du projet représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence neuronale et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte neuronale ainsi que les pathologies tau et amyloïde, nous nous tournons donc vers ce modèle murin.
Réduction
Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Pour analyser comment les différentes pathologies alzheimer et les cellules immunitaires du cerveau modifient les protéines des neurones et des astrocytes (cellules nouricières du cerveau), nous utiliserons des mâles et des femelles. Concernant le rôle de certaines prédisposition génétiques, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Les mâles et les femelles ne peuvent pas être analyser ensemble car les souris alzheimer ont une variabilité pathologique importante entre mâles et femelles. Nous utiliserons les mâles car ils développent une pathologie plus tôt par rapport aux femelles. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les mécanismes découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages enrichies. Une observation quotidienne sera effectuée afin de s’assurer de leur bien-être. Lors des injections, chaque souris sera anesthésiée et recevra un anesthésiant. Une attention particulière sera portée aux souris lors des observations pour détecter d’éventuels effets indésirables. Comme un des modèles peut développer des phénotypes dommageables, des points limites stricts ont été définis et seront appliqués afin de réduire les nuisances causées aux animaux.
Choix des espèces
Les souris modèles Alzheimer constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, les pathologies cérébrales, ainsi que la neurodégénérescence progressive responsable des troubles cognitifs dans la maladie Alzheimer sont très difficilement modélisables in vitro et nécessites des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. - Une cohorte sera utilisée à 7 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades précoces de la maladie sans neurodégénérescence mais avec pathologies Alzheimer. - Une cohorte sera utilisée à 10 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la maladie avec neurodégénérescence résultant des pathologies Alzheimer.
Potentiel thérapeutique d’agonistes dans les déficits en ocytocine
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Opérées deux heures pour l'implantation d'un détecteur d'activité neuronale, ou tuées par ponction cardiaque sous anesthésie terminale, 4 828 souris vont être utilisées dans ce projet. 2 556 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 272 un niveau léger, toutes tuées pour des analyses ex vivo. L'objectif est de vérifier si l'activation d'une protéine restaure la sécrétion d'ocytocine chez des modèles murins d'autisme et de myopathie de Duchenne, jusqu'à sept tests de comportement et de force étant pratiqués par animal. Le porteur décrit ces tests comme des situations "soit non anxiogènes ou très peu", et fonde l'effectif de 4 828 animaux sur sa seule expérience du domaine.
Objectifs
De multiples maladies cérébrales sont associées à un déficit d’ocytocine (OT) et de vasopressine (VP), une neurohormone importante dans nos capacités d’interactions sociales et dans les comportements anxieux. Ceci concerne notamment des maladies neurodéveloppementales très différentes telles que le trouble du spectre de l’autisme (TSA) et les déficiences intellectuelles. Une possibilité intéressante émerge de nos données : améliorer la sécrétion endogène d'OT et/ou de VP cérébrale pour favoriser une libération physiologiquement appropriée. En effet , il a été démontré qu'une protéine joue un rôle majeur dans la libération d'OT et de VP par les neurones. Ainsi, le but de ce projet est de fournir la preuve de concept que cette protéine peut être pharmacologiquement ciblé pour restaurer les niveaux de ces neuropeptides dans des conditions pathologiques pour lesquelles elle sontt déficientes : le TSA, la myopathie de Duchenne (DMD) et la corticothérapie.
Bénéfices attendus
Les essais cliniques portant sur l’efficacité de l’administration exogène d’OT ne montrent pas de bénéfice à long-terme. Ce revers incite à une réévaluation de l'approche de supplémentation pour proposer des stratégies alternatives : augmenter la sécrétion endogène d'OT du cerveau pour obtenir une libération physiologiquement appropriée de ce neuropeptide. Cependant, cette quête est confrontée au défi important d'une compréhension insuffisante des mécanismes contrôlant la sécrétion d'OT. Notre étude permettra ainsi d’évaluer l'efficacité de l’activation de cette protéine comme stratégie thérapeutique de correction des sécrétions endogène d'OT mais également de VP dans des modèles murins de pathologies distinctes : TSA et DMD. Nous proposons en outre de tester si cette stratégie thérapeutique peut être efficace pour atténuer les effets secondaires associés à la corticothérapie dans la DMD. La corticothérapie étant utilisée dans de multiples maladies cérébrales associées à une neuroinflammation (par exemple, la sclérose en plaques, les lésions cérébrales périnatales, la neuroinflammation induite par le stress et la dégénérescence), nos résultats ont le potentiel d'avoir un impact thérapeutique élevé sur un certain nombre de conditions pathologiques.
Procédures
Une perfusion intracardiaque sous anesthésie sera réalisée sur les animaux pour un prélèvement du cerveau afin de réaliser une étude d'immunomarquage sur le cerveau ainsi fixé. La durée de cette procédure est de 30 minutes. Des souris seront sujettes à une intervention chirurgicale sous anesthésie pour analyser les variations cérébrales d'ocytocine et de vasopressine. La durée de cette procédure est d'une heure. Des souris seront également sujettes à une intervention chirurgicale d'une durée de deux heures visant à l'implantation d'un détecteur d'activité neuronale. Finalement, des animaux subiront une ponction cardiaque sous anesthésie afin de pouvoir mesurer l'ocytocine et la vasopressine plasmatique. Certain animaux subiront une série de tests comportementaux qui sera réalisée une seule fois après 5 semaines de traitement. Les tests d'une durée de 5 à 15 minutes seront réalisés une seule fois (un seul essai) avec des délais entre tests de 24h. Il y aura au maximun pour une souris 5 tests pour l'analyse comportementale et 2 tests pour l'évaluation de la force soit 7 tests maximun.
Impact sur les animaux
La contention ainsi que l’injection d’analgésique et d’anesthésique peuvent engendrer un stress chez l’animal. Certains animaux seront soumis à une chirurgie sous-anesthésie. Les animaux impliqués dans les tests d'évaluations comportementales sont dans des situations soit non anxiogènes ou très peu, n’impliquant pas de stress ou inconfort majeur. Finalement, des animaux subiront une ponction cardiaque sous anesthésie profonde et terminale sans réveil.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux sont euthanasiés pour l'analyses de parametres physiologiques ex vivo.
Remplacement
Le but du projet est d'étudier le potentiel thérapeutique de molécules dans la sécrétion de neurohormones qui regissent de nombreuses fonctions physiologiques et comportementales et dont la dérégulation est impliqué en dans de nombreuses maladies neurodéveloppementales. Dans ce contexte il est necessaire d'utiliser des animaux et un tissu nerveux intact afin de comprendre les mécanismes qui régulent les fonctions patho-physiologiques et comportementales liés à ces neurohormones hypothalamique. Effectuer cette étude sur un système in vitro aboutirait à une étude de processus non-physiologiques et ne serait donc pas pertinent.
Réduction
Pour réduire autant que possible le nombre d'animaux nécessaires, le nombre de souris total nécessaire utilisé pour chacune des stratégies correspond à notre expérience dans le domaine pour assurer la validité statistique des résultats.
Raffinement
Pour toute chirurgie, les animaux recevront les doses nécessaires d’anesthésiques, analgésiques et antalgiques en pré- et postopératoire. Les jours suivant l'opération chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés tous les jours par l'expérimentateur et/ou les animaliers (avec une fiche post-opératoire pour chaque animal), et recevront si besoin un analgésique. Une grille de score avec des points limites précoces pour évaluer le bien être des souris sera utilisée. Pendant la période de repos, aucune manipulation expérimentale n’est entreprise.
Choix des espèces
La souris est un petit mammifère dont le système nerveux central présente de nombreuses analogies avec les mammifères supérieur (dont l'humain). La grande maitrise des méthodes d'élevages, des conditions de bien-être animal et la haute standardisation des lignées en fait un organisme de choix pour une étude physiologique des interactions neurogliales. De plus, la modification génétique indispensable à la réalisation de ce projet est seulement disponible chez la souris. Les souris seront utilisées à partir de l'âge de 6 semaines, âge auquel les souris peuvent être traitées 5 semaines et être étudier à l’âge adulte (3 mois). Les souris seront utilisées à l'âge adulte à partir de 2 à 3 mois, âge auquel, la plupart des expériences décrites dans la littérature ont été réalisées. A ce stade de 2 mois, les animaux ont un cerveau qui a fini son développement et les animaux présentent un comportement d’adulte.
Influence du sexe et du cycle hormonal sur l’efficacité thérapeutique de la neurostimulation transcrânienne dans la migraine
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
928 rats vont être utilisés dans des procédures relevant toutes d'un niveau de souffrance sévère, chacun subissant au minimum une chirurgie d'implantation de vis crânienne. Certains subissent en plus une ablation des ovaires, une pose de canules pour l'injection d'une soupe inflammatoire, puis une intervention finale de huit heures sous anesthésie profonde sans réveil, comprenant trachéotomie, canulation de la carotide et de la jugulaire et craniotomie. Une hypersensibilité douloureuse est attendue après l'induction du modèle de migraine, et les mesures de seuil de réaction cutanée se répètent toutes les trente minutes pendant trois heures, puis une fois par jour pendant cinq jours. Tous les animaux sont tués pour prélever sang et tissus nerveux, et le porteur, qui décrit ces tests comme peu douloureux, annonce à long terme des traitements de la migraine mieux adaptés au sexe et au cycle hormonal.
Objectifs
La migraine, qui se manifeste par des maux de tête récurrents, touche environ 15 % de la population, en majorité des femmes. Une méthode prometteuse pour soulager cette douleur est la neurostimulation, en particulier la stimulation transcrânienne à courant continu, qui consiste à appliquer un faible courant électrique sur certaines zones du cerveau. Cependant, on connaît encore peu son efficacité réelle contre la migraine et les mécanismes par lesquels elle agit. Dans nos recherches précédentes, nous avons utilisé un modèle animal de la migraine et observé que : 1) La douleur n’est pas ressentie de la même manière chez les mâles et les femelles ; 2) Les neurones impliqués dans la transmission de la douleur réagissent différemment selon le sexe et le cycle hormonal des femelles. L’objectif de notre projet est donc de mieux comprendre comment la stimulation transcrânienne à courant continu agit sur la migraine, en tenant compte des différences entre les sexes et des variations hormonales chez les femelles. Ce projet se divise en trois grandes étapes : 1. Identifier les meilleurs protocoles de stimulation (préventive vs curatif) 2. Tester l’efficacité de la stimulation selon le sexe et le cycle hormonal chez les femelles et comparer les résultats avec des femelles opérées pour ne plus produire d’hormones sexuelles. 3. Explorer les mécanismes cellulaires à l’origine de ces effets, afin de mieux comprendre comment la stimulation modifie l’activité des neurones liés à la douleur.
Bénéfices attendus
Bien que la migraine touche plus souvent les femmes que les hommes et soit liée aux variations hormonales, la plupart des recherches ont été faites uniquement chez les mâles. Ce projet va donc nous aider, à moyen terme, à mieux comprendre comment le cerveau perçoit la douleur liée à la migraine et comment la neurostimulation agit, aussi bien chez les hommes que chez les femmes, en prenant en compte les changements hormonaux. À plus long terme, ces connaissances pourraient permettre de créer des traitements mieux adaptés à chacun, en tenant compte du sexe et du cycle hormonal. L’objectif est d’apporter des solutions plus personnalisées et efficaces pour soulager les personnes souffrant de migraine.
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 6 : • ovariectomie. L'opération durera 10 minutes sous anesthésie générale. • chirurgie d'implantation de vis pour réaliser des neurostimulations (1 par animal,
Impact sur les animaux
Certains animaux subiront une ablation des ovaires sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux auront au minimum une chirurgie pour implanter une vis. Ces interventions peuvent entraîner une douleur passagère après l’opération. Nous prévoyons également une hypersensibilité à la douleur après l’induction des modèles de migraine. Les tests de sensibilité cutanée sont peu douloureux : ils consistent à mesurer le seuil de réaction à un stimulus, et l’animal peut s’en soustraire à tout moment.
Devenir
A la fin des procédures , les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever le sang et les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser des analyses immunohistochimiques, protéiques ou électrophysiologiques.
Remplacement
Il n’existe aujourd’hui aucune méthode alternative permettant de remplacer ce protocole. Pour bien comprendre comment la douleur est traitée par le corps, il est essentiel de faire des études chez l’animal vivant, car cela fait intervenir plusieurs zones du cerveau et du système nerveux en même temps. Travailler avec des animaux permet aussi de prendre en compte leurs variations hormonales naturelles, ce qui est très important, notamment pour mieux comprendre la migraine chez les femelles. À ce jour, aucune autre méthode ne permet d’évaluer l’efficacité d’un traitement anti-douleur potentiel de façon aussi complète. Même sous anesthésie, un animal avec un système nerveux intact est indispensable pour mener des recherches fiables dans ce domaine. Les études comportementales sur l’animal vivant restent donc nécessaires pour progresser dans la recherche sur la mise au point de nouveaux traitements liés aux effets thérapeutiques de la neurostimulation contre la migraine.
Réduction
Le nombre de rats utilisés par groupe a été déterminé à partir de nos expériences précédentes, en tenant compte des éventuelles difficultés pouvant survenir au cours des différentes étapes de l’étude. Nos données montrent que 8 rats par groupe sont généralement suffisants pour obtenir des résultats statistiquement fiables. Toutefois, certaines étapes (comme l’habituation, les injections, les tests comportementaux ou les prélèvements de tissus) peuvent poser problème. C’est pourquoi nous prévoyons, à titre préventif, jusqu’à 10 rats par groupe dans certaines procédures. De plus, nous allons combiner deux phases du cycle hormonal : un niveau élevé et un niveau bas d’œstrogènes. Pour chaque phase de l’étude, nous adapterons nos analyses en fonction des données recueillies, afin d’obtenir des résultats solides, avec une puissance statistique d’au moins 70 %. Si nous constatons que 8 animaux suffisent, nous n’en utiliserons pas davantage. Dans un souci de réduction du nombre d’animaux utilisés, les études seront réalisées par étapes. Si ces premières expériences ne montrent pas de résultats significatifs, les étapes suivantes ne seront pas réalisées.
Raffinement
Pour garantir le bien-être des rats, un enrichissement de leur environnement sera mis en place : des rouleaux seront placés dans les cages pour stimuler leur comportement naturel et améliorer leur confort. Les différentes interventions prévues seront réalisées sous anesthésie générale, afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Selon le type de procédure, différents produits anesthésiques seront utilisés. De plus, avant et après les interventions, une prise en charge de la douleur sera assurée. Les animaux seront étroitement surveillés, quotidiennement, par du personnel formé, en respectant les règles légales en vigueur. Nous serons particulièrement attentifs à tout signe de souffrance ou de mal-être, comme : un mauvais état général (poils hérissés, absence de toilette, amaigrissement), des difficultés à bouger, à se nourrir ou à se relever, une température corporelle anormale, des signes de douleur ou d’agressivité inhabituelle, ou encore des lésions visibles (sur la peau, les yeux ou la queue). Si un animal montre des signes de souffrance trop importants (par exemple, s’il perd plus de 20 % de son poids après une chirurgie ou présente des tumeurs), il sera retiré immédiatement de l’étude et mis à mort afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le rat de la souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux adultes entre 8-12 semaines. Des animaux adultes sexuellement matures sont requis pour étudier l'influence du cycle hormonal.
Étude du rôle du gène H13 au cours du développement chez la souris pour évaluer son implication dans une maladie rare, le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Colin.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Des souris construites pour porter l'anomalie d'empreinte parentale en cause dans le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin peuvent présenter un retard de croissance, un museau déformé, des troubles de l'alimentation et un tonus musculaire faible. 740 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont une lignée jamais étudiée pour laquelle 40 animaux font l'objet d'une surveillance renforcée. 240 sont pesées chaque semaine de 2 à 12 semaines, 120 embryons sont prélevés 14 jours et demi après la fécondation, 144 passent jusqu'à six tests moteurs et de mémoire, et 60 subissent deux prélèvements sanguins sans anesthésie. Toutes sont tuées à la fin du protocole, la majorité de leurs organes étant disséquée pour des analyses moléculaires et anatomopathologiques.
Objectifs
A la fécondation, nous héritons de deux copies de chaque gène, une de notre mère et une de notre père. Contrairement à la plupart des gènes qui sont activés de façon identique sur les deux copies, certains gènes sont activés différemment selon qu'ils proviennent du père ou de la mère. Ce phénomène, appelé "empreinte parentale", joue un rôle essentiel dans le bon déroulement de la croissance et du développement. Ainsi, lorsqu'une erreur survient dans ce mécanisme, cela peut entraîner des maladies rares. C’est le cas du syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin, qui se traduit par un retard de croissance, des difficultés pour s’alimenter et d’autres troubles du développement. Cette maladie est liée à une anomalie où un enfant reçoit deux copies d'un même chromosome uniquement de sa mère, au lieu d'une copie de chaque parent, ce qui perturbe l'équilibre nécessaire à une croissance normale. Afin de mieux comprendre les conséquences de ces erreurs d’empreinte, ce projet utilisera des lignées de cellules et de souris génétiquement modifiées. Plus précisément, les souris permettront d’étudier comment la transmission d’une modification génétique par la mère ou par le père influence la croissance, l’alimentation, le métabolisme et le développement général de l’animal. En comparant les effets selon l’origine maternelle ou paternelle, nous pourrons mieux cerner les mécanismes qui conduisent à l’apparition de troubles du développement. Ces recherches visent à améliorer la compréhension de ces maladies rares et pourraient, à long terme, aider à mettre en place de nouvelles stratégies de diagnostic et de traitement pour les patients.
Bénéfices attendus
Les maladies rares touchent environ 6 % de la population mondiale, ce qui constitue un enjeu important pour la santé humaine. La majorité d’entre elles sont dues à des anomalies génétiques et comprendre les causes de ces maladies est essentiel pour pouvoir mieux les diagnostiquer et, à terme, proposer des traitements plus adaptés. Ce projet s’intéresse à une maladie rare identifiée récemment, qui s’appelle le syndrome de Mulchandani-Bhoj-Conlin. Cette maladie provoque notamment des troubles de la croissance et du développement. Pour mieux comprendre ses origines, nous allons étudier une région de l’ADN, qui pourrait être impliquée dans son apparition. Grâce à des expériences menées chez la souris, nous allons analyser si des anomalies dans cette zone peuvent provoquer des symptômes similaires à ceux observés chez les patients. Si c’est le cas, cela permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de cette maladie. Cela pourrait aussi aider à identifier d'autres personnes atteintes de symptômes proches, mais dont la cause génétique n’a pas encore été trouvée. À terme, ce travail pourra contribuer à améliorer le diagnostic des maladies rares liées à la croissance et au développement, et ouvrir de nouvelles pistes pour aider les patients.
Procédures
Dans ce projet, plusieurs interventions seront réalisées afin d'étudier la croissance et le développement de différent modèle de souris. Pour l’une des lignées qui n’a jamais encore été étudiée, 40 animaux seront suivis de manière renforcée pour détecter tout signe de mal-être. Pour le suivi de la croissance après la naissance, 240 souris seront pesées une fois par semaine, de l’âge de 2 semaines à 12 semaines. Pour l’étude de la croissance embryonnaire, 120 embryons seront prélevés 14,5 jours après la fécondation (et 120 embryons à un autre stade si nécessaire) pour mesurer leur taille et leur poids. Parmi les souris dont la croissance aura été suivie, 144 seront soumises à des tests moteurs et neurodéveloppementaux, de difficulté légère à modérée, pour évaluer leurs capacités motrices, leur mémoire et leur niveau d'anxiété. Les nouveau-nés seront testés pour leur tonus musculaire entre 5 et 10 jours après la naissance. Ces manipulations seront brèves et limitées à 3 fois par animal. Chez les souris plus âgées, entre l’âge de 2 et 6 mois environ 144 souris seront observées pour évaluer leur activité motrice, leur équilibre, leur comportement face à des situations nouvelles ou légèrement stressantes, ainsi que leur capacité à mémoriser de simples trajets. Chaque animal réalisera jusqu’à 3 sessions d’observations espacées dans le temps (une toutes les 6 à 8 semaines environ), pour un total de 6 tests maximum par animal. Chaque session durera entre 5 et 30 minutes. Deux prélèvements sanguins (4 et 8 semaines) seront effectués sur 60 souris pour mesurer les hormones de croissance. Les prélèvements seront effectués sans anesthésie mais avec contention adaptée, par des personnes expérimentées.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés pourraient présenter certains signes observés dans une étude précédente, et proches de ceux décrits chez les personnes atteintes de la maladie étudiée. Cela peut inclure un retard de croissance, une augmentation du contenu minéral des os, une forme anormale du museau, des difficultés à bien réguler le taux de sucre après les repas, ainsi que des troubles de l’alimentation ou un tonus musculaire plus faible. Les interventions réalisées sur les animaux seront toutes effectués pour limiter l’inconfort des animaux. L’identification et le prélèvement pour analyse génétique seront réalisés une seule fois pour chaque animal. Cela pourra entraîner une gêne passagère et un stress très léger. Le suivi du poids, qui sera effectué chaque semaine, est une manipulation simple et rapide. Elle pourra générer un stress léger lié à la manipulation répétée. Les prélèvements sanguins, qui seront effectués au maximum deux fois dans la vie des animaux, pourra provoquer une gêne temporaire lors du prélèvement et un léger stress lié à la contention. Le test pour vérifier le tonus musculaire des nouveau-nés pourra entraîner un inconfort très bref dû à la manipulation. Les tests comportementaux réalisés sur les animaux plus âgés consisteront à observer leur activité, leur réaction à des environnements nouveaux ou leur capacité de mémoire. Ces observations, espacées dans le temps et limitées en nombre, pourront provoquer un stress passager lié à la nouveauté ou à une situation inhabituelle mais ne causeront pas de douleur.
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés au cours des différentes procédures du projet décrit ici sera mis à mort à la fin du protocole. La majorité des organes sera disséquée et prélevée afin de poursuivre les études moléculaires et anatomo-pathologiques après avoir caractérisé le phénotype global des animaux.
Remplacement
Ce projet a pour but de mieux comprendre la fonction d’une région particulière de l’ADN, afin de savoir si elle joue un rôle dans une maladie rare qui affecte la croissance et le développement. Cette maladie entraîne notamment un retard de croissance, des difficultés de développement, et des problèmes touchant les muscles et les os. Pour répondre à cette question, nous utiliserons comme modèle la souris. Ce choix est nécessaire, car certains signes de la maladie – comme les retards de croissance ou les effets sur le développement de l’embryon – ne peuvent être étudiés que dans un organisme complet, en développement. Par exemple, pour savoir si un retard de croissance est lié à un problème de placenta (organe qui nourrit le bébé pendant la grossesse), il faut observer l’embryon au cours de son développement dans l’utérus, ce qui n’est pas possible sans utiliser un animal entier. En parallèle, certaines analyses plus fines, qui concernent l’activité de cette région de l’ADN seront faites en laboratoire sur des cellules. Ces cellules sont soit déjà disponibles, soit seront prélevées sur les animaux pour être étudiées sans avoir besoin d’utiliser à nouveau un animal entier.
Réduction
Le projet a été conçu pour utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, tout en obtenant des résultats fiables et exploitables. Pour cela, les animaux sont élevés de manière optimisée : certaines portées contiendront à la fois les animaux à étudier ainsi que des contrôles, ce qui réduit le nombre total nécessaire. Les animaux participeront à plusieurs étapes de l’étude afin d’éviter les doublons : par exemple, les mêmes souris seront suivies pour leur croissance, soumises à des tests neuro développementaux simples, et recevront des prises de sang espacées. À la fin de l’étude, leurs organes seront conservés pour de futures analyses en laboratoire, ce qui permettra de continuer les recherches sans utiliser d'autres animaux.
Raffinement
Les animaux seront surveillés tous les jours par l’expérimentateur ou le personnel de l’animalerie afin de détecter rapidement tout signe de souffrance, et d’intervenir si nécessaire. Pour identifier les animaux, un prélèvement sera réalisé sur l’oreille. Cette procédure, effectuée par du personnel expérimenté, sera aussi rapide que possible pour limiter l’inconfort. La zone sera ensuite surveillée pendant deux jours afin de s’assurer qu’il n’y ait pas de complication. Certains animaux pourraient présenter des difficultés de croissance ou d’alimentation. Dans ce cas, un suivi renforcé sera mis en place, notamment par une surveillance régulière du poids. Si une perte de poids importante est constatée ou si l’animal montre des signes de difficulté à se nourrir, une alimentation spéciale et enrichie sera proposée. Pour l’un des modèles, pour lequel aucune donnée n’est disponible, une attention particulière sera portée sur deux générations. Des grilles d’observation standardisées permettront de décider si une surveillance renforcée est nécessaire ou, en cas de signes trop sévères, si l’animal doit être euthanasié. Enfin, tous les animaux vivront dans des cages spacieuses, en petits groupes, avec des éléments pour les stimuler et leur offrir du confort (abris en carton, papier pour faire des nids), conformément aux règles en vigueur.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle pour cette étude car elle partage avec l’être humain certains mécanismes importants (tel que celui étudié ici, l’empreinte parentale), ce qui permet d’étudier leur rôle dans des maladies humaines rares. Un modèle de souris spécialement conçu pour cette recherche existe déjà, ce qui permet de gagner du temps et d’utiliser des données déjà disponibles. La souris est aussi une espèce bien connue des chercheurs, pour laquelle de nombreux outils facilitent les analyses. Les souris utilisées seront âgées de quelques semaines à un an. Les études sur les jeunes souris commenceront à partir de 2 semaines après la naissance, pour suivre leur croissance et leurs comportements jusqu’à l’âge adulte. Pour comprendre les effets pendant la grossesse, certaines observations seront aussi faites sur les fœtus à différents moments de leur développement, en commençant par un stade précis et en adaptant ensuite si besoin.
Prélèvements de tissu pour la caractérisation phénotypique de souris génétiquement altérées élevés pour l’étude de structures cérébrales
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 000 souris vont être utilisées dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, toutes tuées. Les nouveau-nés sont maintenus une minute pour une biopsie de la queue. Celles qui n'ont pas le génotype recherché sont tuées, par décapitation avant dix jours et par dislocation cervicale ensuite, les autres par ponction intracardiaque sous anesthésie profonde pour prélèvement du cerveau. Le but déclaré est de cartographier en trois dimensions deux populations de neurones de l'hypothalamus rendues fluorescentes, l'une liée à l'appétence, l'autre à la satiété. Sur le raffinement, le porteur ne mentionne que les 2 mm de queue prélevés, et fixe l'effectif de 2 000 animaux d'après des stratégies d'accouplement calculées "selon nos expériences antérieures".
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'identifier de façon précise certains neurones présents dans l'hypothalamus, structure majeure dans la régulation du métabolisme. Comme cette structure ne représente que 1% à 1.5% du cerveau total, les neurones qui le composent sont peu nombreux et présentent des localisations très précises. Parmi ceux-ci des neurones contrôlent respectivement l'appétence et la satiété. L'utilisation de souris exprimant des molécules fluorescentes marquant spécifiquement ces 2 populations neuronales permettront de les détecter in situ et d'en connaître l'architecture en 3 dimensions. Ces données complétées à celles de physiologie offriront une apporoche complémentaire du rôle de ces neurones dans la prise alimentaire.
Bénéfices attendus
Les principaux bénéfices attendus du projet sont l'identification des 2 populations neuronales d'intérêt grâce à la présence de fluorescence endogène au sein de ces neurones, d’en comprendre leur architecture et leurs connexions au sein de l'hypothalamus ainsi que la possibilité d’identifier des protéines s’exprimant spécifiquement dans ces 2 populations neuronales.
Procédures
Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute et une biopsie de queue sera prélevée. Les adultes du génotype d’intérêt subiront une injection d'analgésique puis une anesthésie profonde suivie d'une perfusion intracardiaque terminale..
Impact sur les animaux
La contention et la biopsie peuvent provoquer un stress chez l’animal ainsi qu’une légère souffrance de courte durée.
Devenir
Les animaux ne possédant le génotype d’intérêt seront mis à mort. Les nouveaux nés jusqu’à 10 jours sont mis à mort par décapitation et les souris âgées de plus de 10 jours seront mis à mort soit par dislocation cervicale. Les animaux présentant le génotype d’intérêt seront mis à mort par ponction intracardiaque après analgésie et anesthésie profonde pour prélèvement du cerveau.
Remplacement
Les questions scientifiques posées ne peuvent être étudiées qu’in vivo sur des cerveaux prélevés sur des animaux adultes. Il s’agit de comprendre in situ les interactions qu'entretiennent 2 populations neuronales spécifiques avec les autres neurones, ainsi que leur organisation en 3 dimension, et cela ne peut pas être reproduit in vitro
Réduction
Les stratégies d’accouplements ont été calculés selon nos expériences antérieurs pour générer un nombre suffisant d’animaux pour réaliser au mieux nos expériences. En outre, les croisements ont été optimisés pour produire les animaux d’intérêt. D’autre part, les 2 sexes seront utilisés pour les expériences de qui réduit le nombre d’animaux. Enfin, la perfusion intracardiaque permet d’augmenter la viabilité des tranches individuelles, ce qui réduira le nombre d’animaux et en limitera leur nombre.
Raffinement
Le prélèvement lors de la biopsie est réalisé sur une extrémité réduite la queue (environ 2 mm) permettant néanmoins d'obtenir suffisamment d'ADN pour réaliser pour le génotypage.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur l'importance des neurones régissant la prise alimentaire. Cette régulation trouve son siège dans l'hypothalamus, petite structure qui représente 1% à 1.5% du cerveau. Des outils adaptés à la souris et à la taille de cette petite structure sont disponibles pour la réalisation de ce projet tels que la détection de molécules biologiques, la disponibilité de modèles génétiques murins permettant de répondre aux questions scientifiques posés. Des animaux adultes (3 mois) seront utilisés car la maturité et l’organisation neuronale de l'hypothalamus est alors à son climax.
Cibler les signaux synaptiques « Mangez-moi » pour prévenir l’engloutissement synaptique excessif par la microglie et réduire la perte synaptique dans la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
505 souris porteuses de mutations Alzheimer vont être utilisées, chacune recevant une injection dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, passant trois demi-journées de tests comportementaux, puis subissant une chirurgie terminale. 300 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 205 un niveau modéré, et toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Environ 15 % développent une paralysie des membres postérieurs, d'autres de l'épilepsie, une hydrocéphalie ou une malocclusion. Le porteur annonce trois tests destinés à explorer mémoire et anxiété sans préciser lesquels, et avance qu'un traitement retardant la maladie de cinq ans diviserait par deux le nombre de cas, projection qui reste à démontrer.
Objectifs
La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle aucun remède n’existe à ce jour. Dans la MA, la perte des synapses (connexion entre les neurones) est le principal moteur du déclin cognitif. Des données récentes mettent en évidence le rôle central des microglies (cellules immunitaires du cerveau) dans cette perte synaptique, via un excès de phagocytose (destruction) des synapses par les microglies. Cela pourrait ouvrir la voie à des applications thérapeutiques ciblant le signal aberrant de type « mange-moi » émis par les synapses à destination des microglies, ce qui constitue l’objectif principal de ce projet. L’objectif global est de réduire la perte synaptique dans la maladie d'Alzheimer et de ralentir le déclin cognitif. Ce projet a pour but de tester deux molécules développées par l’équipe, conçues pour convertir le signal aberrant « mange-moi » des synapses en un signal « ne me mange pas », empêchant ainsi une phagocytose synaptique excessive par les microglies. Sur la base de résultats préliminaires prometteurs obtenus in vitro, nous souhaitons désormais évaluer l’impact de ces molécules sur la perte synaptique et neuronale dans un modèle murin de MA, ainsi que leurs effets sur la fonction cognitive, l’activité et la structure synaptique et les modifications protéiques, notament dans les synapses affectées par la MA.
Bénéfices attendus
Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la perte des synapses (connexions entre les neurones) dans la MA. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la transformation du signal aberrant « mange-moi » des synapses en un signal « ne me mange pas », empêchant ainsi la destruction excessive des synapses par les microglies qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.
Procédures
Tous les animaux subiront une anesthésie gazeuse (5 minutes maximum) afin de recevoir une injection intraveineuse unique dans le sinus rétroorbitaire. Tous les animaux subiront 3 tests comportementaux pendant 3 demi-journées et une chirurgie terminale sous anesthésie.
Impact sur les animaux
L'injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbital peut générer une douleur, un saignement ou une inflammation. Tous les animaux subiront 3 tests comportementaux pouvant entrainer un stress, destinés à explorer leurs capacités de mémorisation et leur niveau d'anxiété.Notre modèle de la maladie d'Alzheimer peut développer une paralysie des membres postérieurs qui pourra à la longue les empêcher d'accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Ces souris peuvent aussi faire de l'épilepsie, de l’hydrocéphalie et de la malocclusion (mauvais alignement des dents) qui pourront générer de la souffrance, du stress et une perte de poids. En ce qui concerne le comportement, il s'agit de manipulations répétées qui sont indolores et non invasives mais peuvent être stressantes pour les animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analysé.
Remplacement
Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique ainsi que les pathologies alzheimer sont très/assez difficiles à obtenir in vitro. Les souris modèles de la maladie d'Alzheimer du projet représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin. De plus, les modèles de test comportementaux n'étant pas possible in vitro, l’utilisation d’un animal qui développe des altérations mnésiques similaires à celles observées dans la MA est donc nécessaire, avec des capacités mnésiques mesurables.
Réduction
Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Nous utiliserons mâles et les femelles témoins et les souris modèles de MA.
Raffinement
Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Au cours de l'injection rétro-orbitaire, chaque souris sera préalablement anesthésiée au sévoflurane et recevra une goutte d'anesthésique local en collyre dans l’oeil. Suite aux injections rétro-orbitaires, une attention particulière sera accordée aux yeux lors de l'observation quotidienne afin d'identifier de possibles effets indésirables (oeil fermé, saignement, inflammation…). Les souris MA développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Environ 15% des souris MA développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois. Les premiers signes sont la rétraction des membres postérieurs quand la souris est soulevée par la queue. Au début, les souris sont entièrement ambulatoires et peuvent accéder normalement à la nourriture et à l'eau. Cela peut évoluer vers une faiblesse des membres postérieurs et éventuellement une paralysie. A ce stade de la nourriture humidifiée et/ou du gel hydratant seront disposés à l’intérieur de la cage. Les souris sont observées quotidiennement pour leur capacité à atteindre la nourriture et l'eau. Ce processus, lorsqu'il se produit, progresse au cours des semaines à plus d'un mois. Critères d’euthanasie : signes de douleur persistante (animal prostré, dos courbé, etc.) ou incapacité à se déplacer pour boire ou manger. Notre objectif est de les amener à 10 mois maximum. Les souris MA sont sensibles au bruit et à la manipulation. Si une crise épileptique se produit, nous laisserons la souris récupérer et observerons 5 minutes. Si elle est incapable de se remettre d'une crise, elle sera euthanasiée. Habituellement, les souris récupèrent et se comportent normalement. Si la souris développe une hydrocéphalie, elle sera euthanasiée. Si une malocclusion est identifiée, la souris sera évaluée. Une malocclusion dentaire empêche l’usure normale des dents qui poussent en continu, entraînant des douleurs, des blessures et une incapacité à s’alimenter. Les dents seront taillées chaque semaine par le personnel animalier et le poids sera surveillé.
Choix des espèces
Les souris modèles Alzheimer constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, les pathologies cérébrales, ainsi que la neurodégénérescence progressive responsable des troubles cognitifs dans la maladie Alzheimer sont très difficilement modélisables in vitro et nécessites des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. - Une cohorte sera utilisée de 4/5 mois à 7 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades précoces de la maladie sans neurodégénérescence mais avec pathologies Alzheimer. - Une cohorte sera utilisée de 4/5 mois à 10 mois (avec tests comportementaux de un mois à une semaine avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la maladie avec neurodégénérescence résultant des pathologies Alzheimer. Les cohortes seront composées de mâles et de femelles.
Développement d’une nouvelle thérapie génique ciblant la production de leptine adipeuse pour traiter le syndrome de Rett
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tester une thérapie génique visant la leptine dans le syndrome de Rett conduit à utiliser 510 souris modifiées pour développer les symptômes de la maladie. 375 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 135 un niveau sévère, et toutes sont tuées à l'issue. Biopsie de la queue vers le dixième jour de vie, injection sous-cutanée au vingtième, un ou deux prélèvements sanguins, puis tests moteurs, cognitifs et sociaux, mesure de l'activité respiratoire et suivi de l'épileptogenèse entre le 45e et le 50e jour. Les souris mâles ont une espérance de vie réduite à deux mois et le porteur annonce qu'il évaluera l'effet du traitement sur cette durée de vie, les animaux étant tués quand une grille de score signale une dégradation de leur apparence ou une perte de poids.
Objectifs
Le syndrome de Rett est une maladie d'origine génétique définie par un trouble grave et global du développement du système nerveux central. Ce syndrome entraîne un polyhandicap qui se manifeste par une déficience intellectuelle sévère, infirmité motrice, des troubles respiratoires et présence d’activité épileptique. Il n’existe actuellement aucun traitement curatif de la maladie. Diverses thérapies géniques ou pharmacologiques sont envisagées pour traiter ce syndrome. Notre objectif est de développer une nouvelle thérapie génique ciblant la leptine. La leptine est une hormone sécrétée par le tissu adipeux, capable d’agir au niveau du cerveau et de contrôler de nombreuses fonctions physiologiques telles que la prise alimentaire, le métabolisme, les activités respiratoires et cardio-vasculaires, l’anxiété, les fonctions cognitives et la susceptibilité à l’épilepsie. Ces fonctions sont affectées chez les patients atteints du syndrome de Rett et chez les modèles murins de la pathologie, ce qui soulève la possibilité que des niveaux excessifs de leptine puissent contribuer à la progression du syndrome de Rett. En accord avec cette hypothèse, des taux élevés de leptine circulante ont été observés chez des patients atteints du syndrome de Rett et dans des modèles murins. Notre objectif est de tester le rôle de l’hormone adipocytaire, leptine, dans les troubles associés au syndrome de Rett sur un modèle murin, au niveau comportemental et neuronal.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet pre-clinique est de démontrer un rôle de la leptine dans l’etiologie du syndrome de Rett et d'ouvrir vers le développement d'une nouvelle approche thérapeutique pour traiter cette maladie qui devra être tester dans d'autres étdues cliniques.
Procédures
Dans ce projet, nous utiliserons des souris modifiées génétiquement qui récapitulent les symptômes et troubles décrits chez les patients atteints du syndrome de Rett. Ces souris seront générées et élevées au laboratoire. Un prélèvement de poils pour le génotypage et une injection sous-cutanée seront réalisées chez les animaux mâles et femelles au sevrage (20-21ieme jour de vie postnatale). Certains animaux seront soumis à un (au 40ieme jour de vie) ou deux (au 30ieme et 40ieme jour de vie) prélèvement(s) sanguin(s). Des analyses comportementales (moteur, cognitif et social), physiologique (activité respiratoire) et pathologique (épileptogenèse) seront réalisées entre le 45ieme et 50ieme jour de vie postnatale. Nous évaluerons également les effets du traitement sur l’espérance de vie des animaux, d’une durée moyenne de 2 mois chez les animaux non-traités. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les symptômes seront rapportés sur une grille de score nous permettant de définir le point limite d'euthanasie afin de limiter leur souffrance.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour présenter les symptômes observés chez les patients souffrant du syndrome de Rett. Ces symptômes, qui apparaissent vers le 30ieme jour de vie, sont des difficultés respiratoires, des troubles locomoteurs et cognitifs, des activités épileptiques (chez les souris femelles), et une perte de poids (uniquement chez les souris mâles). Les souris mâles présentent une espérance de vie réduite de 2 à 3 mois. Une biopsie de la queue sera effectuée vers le 10iéme jour de vie pour définir le génotype des animaux ce qui entrainera une douleur légère de courte durée. Les animaux recevront une injection sous-cutanée au 20ieme jour de vie. Certains animaux seront soumis à un (au 40ieme jour de vie) ou deux (au 30ieme et 40ieme jour de vie) prélèvement(s) sanguin(s). Ces injectons et prélèvements devraient provoquer une douleur légère et de courte durée.
Devenir
Dans toutes les procédures, les animaux seront surveillés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être. En fonction de l’évolution de différents critères comme par exemple l’apparence de l’animal ou une perte de poids, les animaux seront euthanasiés pour réduire toute forme de souffrance. Tous les animaux utilisés pour l'analyse comportementale seront euthanasiés à la fin de l'étude.
Remplacement
Seule l'expérimentation chez l'animal permettra de remplir les objectifs de ce projet. Il n'est actuellement pas possible par des méthodes in vitro (non animales) de reproduire les processus pathologiques complexes du syndrome de Rett. L’organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux ne peuvent être reproduits dans des modèles de lignées cellulaires ou de cultures neuronales.
Réduction
Des calculs statistiques utilisant les données d'études antérieures ont été utilisés pour calculer le nombre minimum d'animaux requis tout en garantissant l'obtention de résultats statistiquement significatifs. Les tâches proposées permettent d’évaluer les animaux sur plusieurs paramètres au niveau comportemental et neuronal, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Pour les enregistrements de l’activité nerveuse, 2 chercheurs seront mobilisés. La présence de 2 chercheurs pour ces enregistrements permettra d’augmenter le nombre de neurones enregistrés par animal, et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés pour atteindre une taille de l’échantillon permettant une analyse statistique.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué quotidiennement via l’observation de leur aspect général (poil hirsute, position voûtée, yeux) et de leur comportement (apathie, agressivité, absence de nidation). Le suivi de leur poids sera également un critère. Lorsque les points limites sont atteints (signes visibles de la maladie, perte ou prise de poids excessive) les animaux seront euthanasiés. L'équipe continuera à examiner les dernières découvertes afin d'identifier toute nouvelle possibilité d'affiner l'expérience de ces animaux, tout en atteignant les objectifs de l'étude. Nous respecterons un délai de 15 jours entre les deux prélèvements pour éviter toutes complications (choc hypovolémique, et anémie). Dans le cas peu probable où une anémie serait observée, nous cesserons immédiatement les prélèvements. Dans le cas peu probable où un choc hypovolémique serait observé, l’animal sera euthanasié. Les animaux destinés à l’analyse comportementale seront habitués à la manipulation par l’expérimentateur. Les animaux seront anesthésiés avant d’être euthanasiés.
Choix des espèces
La souris est actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé en recherche biomédicale. Elle présente de nombreux intérêts : sa taille, son rythme rapide de reproduction et une gestation courte par rapport à d’autres organismes-modèles. De nombreux animaux existent permettant par exemple de déterminer les mécanismes moléculaires impliqués dans différentes pathologies. Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement qui récapitulent les symptômes décrits chez les patients atteints du syndrome de Rett. Il s’agit donc d’un modèle pertinent concernant les objectifs du présent projet. Pour ce projet, les analyses comportementales et neuronales seront réalisées à partir du 40ieme jour de vie, qui correspond à la période d'apparition et d'aggravation des symptômes.
Régulation de la communication vocale et de l’affiliation du marmoset par l’ocytocine EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérés une journée pour l'implantation d'électrodes chroniques, puis une seconde journée pour que leurs neurones à ocytocine soient transfectés par un virus, 12 ouistitis subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut rester cinq ans dans le projet, avec des sessions d'enregistrement de une à trois heures, jusqu'à cinq fois par semaine, et des examens d'IRM et de TEP sous anesthésie générale. L'objet déclaré est de comprendre comment le cerveau des primates encode les échanges vocaux entre congénères et ce que l'ocytocine y modifie. Le porteur justifie le choix du marmoset par sa petite taille et ses "capacités cognitives inférieures" à celles du macaque, présente l'imagerie comme un raffinement qui permet d'envisager un placement en sanctuaire, et prévoit six individus réutilisés dans un autre protocole pour six désimplantés et mis en retraite.
Objectifs
Pour les primates, humains compris, les signaux acoustiques sont essentiels pour communiquer. Grâce à leurs capacités cognitives, ils sont capables d’ajuster leur production vocale selon le contexte social, mais on ne sait pas encore comment les neurones encodent les vocalisations des congénères et produisent une réponse appropriée. Ce projet permettra d’enregistrer les neurones et d’étudier les vocalisations de singes marmoset dans différents contextes sociaux, dans des conditions semi-naturelles, les animaux se déplaçant librement dans la colonie. En parallèle, les neurones à ocytocine, neurohormone impliquée dans les comportement sociaux et espoir thérapeutique, seront stimulés pour comprendre son influence sur la communication acoustique des primates. Cette approche multidisciplinaire et multisite (un établissement pour l'hébergement, le comportement et l'electrophysiologie, un autre établissement pour la neuroimagerie) permettra de mieux cerner le rôle de l'ocytocine et d’en savoir plus sur le fonctionnement du cerveau des primates lors de conversations naturelles dans différents contextes sociaux.
Bénéfices attendus
Le projet produira plusieurs résultats significatifs. Sur le plan scientifique, il révélera comment le cerveau encode la communication accoustique, c'est à dire les échanges vocaux entre individus, ainsi que les liens affiliatifs entre eux. Cela apportera une nouvelle perspective au domaine, où les bases neurales de la perception et de la production vocales sont étudiées ensemble dans le cadre d'une interaction sociale naturelle : les conversations. De plus, il montrera le rôle du neuropeptide ocytocine (OT) dans ce processus. Cela est crucial car ce sera la première preuve causale que l'OT endogène module le comportement social des primates, et, indépendamment, la communication acoustique. Ainsi ce projet avancera nos connaissances sur les bases neurales et chimiques de l'affiliation entre individus.
Procédures
Les animaux seront d'abord habitués à l'environnement et aux expérimentateurs du laboratoire (1 à 3 mois). Ils seront notamment entrainés à coopérer afin que les expériences se déroulent sans stress. Ensuite, des examens de neuroimagerie nous permettrons d'identifier les structures cérébrales d'intérêts (une demi journée par examen). Les animaux seront implantés avec des électrodes chroniques (chirurgie d'une journée), et leurs neurones à ocytocine seront transfectés pour pouvoir les activer ou les inhiber sur commande (chirurgie d'une journée). Enfin, nous enregistreront conjointement l'activité cérébrale et les vocalisations des sujets lors de leur comportements naturels avec leurs partenaires, directement dans la pièce d'hébergement (sessions de 1 à 3h, entre 1 et 5 fois par semaine, pendant la durée du projet). Il s'agit d'une seule procédure modérée, chaque animal participera à ce projet pendant une durée maximale de 5 ans. L'hébergement, l'entrainement, les chirurgies, les expériences comportementales et neurophysiologiques auront toutes lieu dans l'EU 1/2. Seuls les examens de neuroimagerie, IRM et TEP, seront réalisés dans l'EU 2/2.
Impact sur les animaux
1. Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale, destinée à l'implantation d'électrodes et l'injection de virus AAV. La chirurgie suscitera un inconfort post-opératoire passager (quelques jours), maitrisé par l'administration d'analgésique. Par ailleurs, une légère perte de poids et une réduction de la mobilité sont possibles selon le temps pris par l'individu pour s'adapter à son implant (quelques jours). 2. Pour les tests comportementaux, ceux-ci auront lieu directement dans la cage d'habitat ou la cage d'expérimentation (enregistrement passif de l'animal libre). Cette cage d'expérimentation sera placée soit devant la cage d'habitat ou une autre cage, face à un autre individu. L'impossibilité d'interaction tactile et la nature prosociale des marmosets préviendront l'apparition de stress fort, mais une anxiété légère est possible. De plus, la pose de l'équipement d'enregistrement (neurologger + veste avec micro et ecg) nécessite une manipulation à la main par les expérimentateurs, ce qui peut également être stressant. Ce stress et cette anxiété seront graduellement réduits avec l'habituation des individus à ces situation (quelques semaines). 3. Les animaux seront aussi soumis à des examens d'IRM, de TEP (Tomographie à émission de positon), pour lesquels ils seront mis sous anesthésie générale, ce qui provoquera un léger stress lors de l'induction ainsi qu'un inconfort (quelques heures) au réveil. 4. La désimplantation ne laisse pas de séquelle (hormis une cicatrice), la peau et l’os se cicatrisent. Comme toutes les procédures chirurgicales, elle peut comporter des risques d’infection, ou plus rarement encore, entraîner des crises d’épilepsie. Dans l’éventualité où une infection ou des crises d’épilepsie se produiraient, une médication appropriée d’antibiotiques ou d’antiépileptiques serait administrée à l’animal, sous l’avis de notre vétérinaire. De même que pour l'implantation, toute douleur post opératoire sera traitée par analgésique (quelques jours).
Devenir
A la fin de la procédure, les singes seront réutilisés dans un autre protocole ou bien désimplanteés et replacés pour une mise en retraite. Cette décision sera prise par la Structure du Bien être Animal au cas par cas et avec l'accord des responsables et du vétérinaire référant.
Remplacement
Les modèles in silico du cerveau ne sont pas encore assez évolués pour simuler le comportement spontané de primates. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal. Le choix d'un modèle primate est justifié par les questions spécifiques du projet qui s'intéressent justement à la différence des effets de l'ocytocine chez le rongeur et chez le primate, ainsi qu'aux bases neurales de la communication acoustique du primate. L'OT module-t-elle le comportement social et l'activité cérébrale chez les primates comme elle le fait chez les rongeurs ? Comment les circuits cérébraux spécifiques aux primates (ACC) encodent-ils la communication acoustique ? Comment le contexte social riche et spécifique des primates influence-t-il la production vocale ? Pouvons-nous infecter et manipuler les neurones de primates en utilisant des AAV périphériques ? Nous avons sélectionné le marmoset, pour remplacer le modèle classique qu'est le macaque, en raison de sa plus petite taille, de ses capacités cognitives inférieures ainsi que par sa proximité phylogénétique plus lointaine et surtout du fait de son riche comportement acoustique et pro social.
Réduction
La principale réduction du nombre d'animaux vient des technologies utilisées, les électrodes choisies pour ce projet ont de nombreux contacts et sont implantées de manière chronique et ont une longue durée de vie, ce qui permet d'enregistrer beaucoup de neurones en peu de temps, et d'utiliser un même singe pour toutes les étapes du projet. Ainsi une grande quantité de données sera extraite de chaque session et de chaque singe impliqué, ce qui au final réduit le nombre de session et d'animaux nécessaires. Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations (n =12 selon le calcul de puissance).
Raffinement
Plusieurs éléments de raffinement sont mis en oeuvre : Recours à l’imagerie (IRM et TEP), qui se substitue pour la plupart des animaux à l’histologie post-mortem et permet d’envisager leur replacement en sanctuaire à l'issue des expériences. Durant chaque transport, les animaux seront sédatés à la kétamine. Entrainement des singes via du renforcement positif, ce qui permet de les manipuler sans contention. De plus, l'intégralité des expériences seront conduites en conditions semi-éthologiques, c’est-à-dire en conditions expérimentales où les animaux sont libres de leurs mouvements et peuvent se déplacer et interagir avec des objets ou des congénères. La différence entre conditions purement éthologiques et semi-éthologiques est que ces dernières n’adviennent pas en milieu naturel. Ces conditions sont rendues possibles grâce à notre laboratoire d’enregistrement sans fil où les animaux pourront se déplacer librement et se comporter d’une manière naturelle. Surtout, ces enregistrements se déroulent directement dans ou à côté de la cage d'hébergement, à l'intérieur de la salle de stabulation, ce qui enlève le stress d'une sortie de cage prolongée. Ces conditions expérimentales dans lesquelles les animaux sont testés constituent un élément de raffinement important. De plus l'hébergement des marmosets se fera dans de grandes cages (1.7 voir 3.4m^3 pour deux animaux) ce qui est supérieur, relativement à leur taille, à ce qu'on les macaques en laboratoire. Tous les actes chirugicaux seront fait sous anésthésie et avec un traitement analgésique. Enfin, un traitement humain des animaux sera assuré par des points limites liés à la douleur éventuelle suite à la chirurgie ou un inconfort lié à un stress chronique.
Choix des espèces
Les aires de la communication acoustique et de l'affiliation ne sont pas équivalentes entre les rongeurs et les primates. Ces derniers ont en effet développé un cortex cingulaire antérieur qui leur est unique, en terme de connectivité et de type de neurones. Par ailleurs, les primates ont une cognition sociale bien plus élaborée et complexe que celle des autres modèles. Dans l'optique de transférer les connaissances acquises par le présent projet à l'humain, et notament à des patients, il est donc crucial de réaliser ces expériences sur un primate non humain. Enfin, un des objectifs du projet est de tester si l'on peut manipuler le comportement social des primates via le système ocytocinergique, comme on a pu le faire chez le rongeur. Il est donc obligatoire d'utiliser un primate non humain pour répondre à cette question. Les animaux utilisés seront adultes. Ce stade permet de documenter les bases neuronales d’un sujet normal adulte et sain, présentant un système de communication et d'affiliation dévelopés.