Système nerveux

Le rat des sables, rongeur diurne dont la rétine compte 40 % de cônes contre 3 % chez la souris, est retenu pour reproduire une maladie de l'œil humaine. 208 individus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une injection sous la rétine pratiquée sur des nouveau-nés de dix à vingt jours, puis trois électrorétinogrammes, trois tomographies et trois fonds d'œil sous anesthésie. Le porteur indique que l'injection n'engendre "en général" aucune lésion, sans écarter une infection, une inflammation ou une douleur transitoire, et signale un stress aigu lié aux transports entre les deux établissements. Tous sont mis à mort pour analyse moléculaire et cellulaire de leur rétine.

Objectifs

La maladie de Stargardt est une maladie qui affecte l’œil, et constitue la forme de dégénérescence maculaire héréditaire la plus fréquente chez l’Homme. Elle touche souvent des personnes jeunes et provoque un handicap visuel lourd dû à la perte de la partie centrale de la rétine, nommément la macula qui est riche en cônes. Les mécanismes pathogènes ont été largement analysés dans une souche de souris modifiée qui n‘exprime pas le gène responsable. Néanmoins, ces souris ne présentent pas les déficits observés chez les patients. Contrairement aux rongeurs nocturnes (rat et souris), le rongeur diurne appelé Rat des Sables (Psammomys obesus) présente des caractéristiques uniques pour modéliser cette maladie, car nous avons montré que sa rétine riche en cônes ressemble fortement à celle de l’homme. L’objectif du projet qui est un projet multisite se déroulant dans deux établissements utilisateurs est de développer un nouveau modèle animal dans lequel le gène responsable sera invalidé spécifiquement dans la rétine. Les conséquences de la mutation induite seront étudiées par des méthodes non-invasives permettant de suivre la dégénérescence lente de la rétine grâce à l’évaluation longitudinale de la fonction de la rétine et à l'obtention d'images de l’œil. Des analyses cellulaires et moléculaires viendront compléter l’étude. Ainsi, ce modèle permettra d’éclaircir les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie de Stargardt. Si le modèle récapitule les caractéristiques principales de la maladie il sera utilisé dans une deuxième phase pour tester une thérapie génique, potentiellement capable de contrecarrer la dégénérescence et maintenir la fonction des photorécepteurs. Une modification a été déposé afin d'inclure une cararctérisation électrorétinographique plus fine, sans ajout d'animaux.

Bénéfices attendus

L’utilisation du modèle rongeur Psammomys obesus, dont la rétine est riche en cônes comme chez l’homme, va permettre d’étudier les mécanismes de la maladie de Stargardt et de tester une potentielle thérapie génique. Il est évident que si des effets bénéfiques suite à l’administration de la thérapie géniques ont constatés, cela ouvre des perspectives importantes pour les patients atteints de la maladie de Stargardt, qui est actuellement sans traitement.

Procédures

Les procédures décrites dans ce projet comprennent une injection sous-rétinienne (EU1/2) réalisée sur animal anesthésié ainsi que des analyses structurales et fonctionnelles de la vision réalisées avec des méthodes non invasives, également sur animal anesthésié. Il s'agit de l'électrorétinogramme (EU1/2), de la tomographie par cohérence optique (EU2/2) et du fond d'oeil (EU2/2). Ces 3 analyses seront réalisées chacune à 3 reprises.

Impact sur les animaux

L’injection sous-rétinienne chez les nouveaux nés de Psammomys obesus, n’engendre, en général, aucune lésion ni altération de la fonction visuelle. Toutefois nous ne pouvons exclure l’apparition d’une infection, d’une inflammation ou de dommages à l’œil injecté lors de son développement ou d’une douleur transitoire. L’ERG et l’imagerie sont des méthodes non invasives, ne provoquant pas de souffrance particulière mais une inflammation de l’œil n’est pas à exclure suite à l’ERG, même si son occurrence est minimisée à travers l’utilisation de gel ophtalmique. Le transport entre les deux EU pourra induire un stress aigu transitoire chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyses ultérieures moléculaires et cellulaires de la rétine.

Remplacement

A ce jour aucun modèle in vitro ne permet de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles (ce qui nous concerne ici). Toutefois, la technique de modification du gène responsable de la maladie de Stargardt a été validée par analyse génomique et par nos observations expérimentales précédentes.

Réduction

Pour la majorité des expériences chaque animal est son propre contrôle. A savoir un œil est injecté avec une construction contrôle et l’autre avec une construction qui permet d'obtenir l’inactivation du gène impliqué dans la maladie de Stargardt. Le nombre d'animaux a été évalué au maximum en prenant en compte le risque potentiellement engendré par l’injection, ainsi que la variabilité interindividuelle pour aboutir à des résultats significatifs lors de la comparaison entre l’œil contrôle et l’œil traité. Il s'agit également d'une étude où le même animal est suivi à plusieurs temps après injection (étude longitudinale) ce qui contribue à réduire le nombre d'animaux utilisés. Dans cet avenant le nombre total d’animaux de la procédure 1 a été réduit car les données obtenues ont permis de déterminer que la dégénérescence débute précocement et que les temps de mise à mort tardifs initialement prévus ne sont pas nécessaires.

Raffinement

Afin de respecter / stimuler les interactions sociales, les animaux sont hébergés avec leur mère et leur fratrie jusqu’au sevrage, puis ensuite par groupes sociaux comprenant 2 à 3 individus de même sexe. L’environnement est enrichi (matériel de nidification, bâton à ronger, tunnel) afin de stimuler leur activité motrice. . Les animaux reçoivent de l'eau et de la nourriture ad libitum, qui est adaptée selon l’état physiologique des animaux (mère allaitante, animaux sevrés, adultes). Lors de l’injection sous-rétinienne les animaux au stade de développement P10-20 sont placés sur tapis chauffant et sous anesthésie générale, à laquelle est rajoutée une anesthésie locale de l’œil. Après l’intervention, l’application d’un gel ophtalmique permet d’éviter un desséchement de la cornée. Lors de l’ERG, de l'OCT et du fond d'œil, les animaux sont placés sous anesthésie, complétée d’une analgésie locale pour l’ERG. L’application de gel ophtalmique permet ici aussi d’éviter tout desséchement de l’oeil. Un suivi quotidien est assuré par du personnel spécialisé afin de mettre en évidence d'éventuels signes précoces de mal être : deux fois par jour le jour d’une intervention (injection, FO + OCT, ERG), puis une fois par jour jusqu’à la fin de la procédure. Pendant ces surveillances, l’aspect des yeux sera minutieusement inspecté. En cas d’infection ou de douleur manifeste, les animaux seront mis à mort immédiatement selon une méthode adaptée à l’âge de l’animal. Les deux sites expérimentaux sont distants de moins de 10 km. Les animaux sont transportés entre sites expérimentaux, en présence de la personne habituée à les manipuler, dans des boites de transport pour animaux de laboratoire contenant litière et enrichissements type bâton et frisure, nourriture et eau gélifiée. Lors du précédent projet, les animaux n'ont montré aucun signe de stress à leur arrivée dans chacun des sites.

Choix des espèces

Pour cette étude nous utiliserons un modèle rongeur diurne Psammomys obesus. Par comparaison avec la souris, la rétine de Psammomys obesus est de plus grande taille et est enrichie en cellules nerveuses photosensibles (ou photorécepteurs) de type cônes (40% versus souris 3%). Ce modèle est donc parfaitement adapté pour l’injection sous rétinienne et l’étude des cônes, qui sont impliqués dans la maladie de Stargardt. Nous utiliserons des animaux aux stades postnataux P10-20 (jours après la mise bas), car ce stade correspond à la période où la maladie de Stargardt se déclare chez l’homme (entre 7 et 12 ans), et la protéine ciblée n’est encore que peu exprimée dans les photorécepteurs.

L'objet réel de ce projet est une lignée de souris créée par l'équipe elle-même : 120 souris mâles privées d'un récepteur du goût du gras au niveau de la langue vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées d'eau six heures, elles subissent une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie profonde, un enregistrement de vingt minutes de l'activité de leurs nerfs autonomes, puis une ponction intracardiaque juste avant la mise à mort. Le porteur signale la peur liée à la contention et les douleurs causées par la chirurgie. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à mieux connaître cette lignée pour qu'elle serve ensuite de modèle à l'étude de la préférence pour le gras, et le porteur juge ce modèle "indispensable" puisqu'il n'existe que chez la souris.

Objectifs

Le goût du gras représente une sixième saveur de base aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. Les récepteurs gustatifs, sur les cellules des papilles gustatives, permettent la détection des saveurs. Pour les lipides, ce sont les récepteurs lipidiques qui sont responsables de la perception du goût du gras et du renforcement de la préférence pour le gras. Le signal gustatif est transmis de la langue au cerveau par les nerfs gustatifs puis le cerveau communique avec le système digestif pour préparer le système digestif à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue (papilles gustatives) – cerveau – intestin. Pour étudier spécifiquement le rôle d’un des récepteurs lipidiques dans la perception du gras, nous avons développé un modèle de souris n’exprimant pas ce récepteur au niveau de la langue. Nous avons observé que ces souris perdent la préférence pour le gras. De plus, elles développent des troubles métaboliques tels que des augmentations de la glycémie, de l’insulinémie et de la glucagonémie. L’insuline et le glucagon, sont des hormones sécrétées par le pancréas, qui permettent de réguler la glycémie. Elles sont sous le contrôle du système nerveux autonome, qui assure la communication entre le cerveau et l’intestin. Ces observations nous suggèrent que l’absence de d’un récepteur lipidique dans les papilles gustatives perturbe la communication entre la langue, le cerveau et l’intestin. Afin d’explorer le rôle du système nerveux autonome dans les perturbations métaboliques observées chez ces souris, nous prévoyons de mesurer l’activation de ces nerfs en réponse au dépôt de lipides sur la langue. Ces mesures seront effectuées chez des souris normales ou n’exprimant pas un récepteur lipidique au niveau des papilles gustatives.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra de mieux comprendre une nouvelle souche de souris génétiquement modifiée, n’exprimant pas un des récepteurs lipidiques au niveau de la langue. Ces souris pourront donc servir de modèle animal pour étudier la préférence pour le gras.

Procédures

Toutes les souris (120 souris) sont concernées par les points suivants : - Privation d’eau uniquement pendant 6 heures avant le début de la procédure. - une seule intervention chirurgicale suivie d’un seul enregistrement d’activité nerveuse par souris (souris profondément anesthésiées) ; durée de la chirurgie 20 minutes au maximum et durée de l’enregistrement nerveux 20 min. - un seul prélèvement sanguin en intracardiaque par souris durée de 2 minutes maximum. Prélèvement sanguin sur souris profondément anesthésiées juste avant mise à mort.

Impact sur les animaux

Le projet requiert de mettre à jeun hydrique les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaires lors des manipulations. Les souris peuvent subir des douleurs causées par la chirurgie.

Devenir

A l’issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort, pour étudier leurs organes et tissus.

Remplacement

L’activité nerveuse autonome ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de l’expérimentation in vivo. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique, valable avec un test adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien-être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur (le manipulateur portera une blouse propre jetable et des gants nettoyés avec l’alcool 70%), désinfection des surfaces, utilisation d'un champ stérile, stérilisation des outils de dissections, tonte de la zone d’incision et désinfection de la peau. La délimitation des points limites permet d’éviter au maximum les douleurs sévères ou souffrance chez la souris afin de favoriser un état stable dans le bien-être animal. La douleur de la souris est en amont, prise en charge via l’utilisation d’analgésiques,15 minutes avant l’anesthésie. Ceci permettra entre autres de calmer l’animal et de maximiser l’effet de l’anesthésie. Des aiguilles fines biseautées seront utilisées lors des injections et des prélèvements, pour minimiser la douleur.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la régulation nerveuse du système gastrointestinal et du comportement alimentaire. Cette technique est plus difficile à réaliser chez la souris que chez le rat, mais notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils d’analyse biologique contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et la modification de gènes s’exprimant au niveau de la langue étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Les souris mâles utilisées auront minimum 2 mois car avant 8 semaines, les souris sont trop petites pour effectuer une chirurgie.

Tous tués à l'issue pour vérifier l'exposition aux molécules testées, 2 100 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une neurochirurgie de deux heures pour recevoir dans le cerveau une toxine qui détruit les neurones et reproduit la maladie de Parkinson, suivie de rétention urinaire, de perte d'appétit et de perte de poids. 900 d'entre eux vivent avec une ration limitée à 20 ou 25 grammes par jour pendant deux à six mois, en cage individuelle sur toute la durée du projet, avec trente minutes de contact avec leurs congénères par semaine dans ce que le porteur appelle une "cours de récréation". Le rat est décrit comme l'espèce "idéale" pour ce travail, en raison des similitudes entre son cerveau et celui de l'être humain, et parce que les rats adultes récupèrent plus facilement après la chirurgie.

Objectifs

La maladie de Parkinson résulte de la destruction progressive d'un réseau spécifique de neurones dans le cerveau, perturbant le fonctionnement de certains circuits neuronaux, ce qui cause les principaux symptômes moteurs de la maladie : la rigidité, la difficulté à initier les mouvements (akinésie) et les tremblements de repos. Le principal problème de cette maladie est que les symptômes moteurs apparaissent quand environ 60 à 80 % des neurones sont détruits. La maladie se détecte donc très tard, quand la plupart de ces neurones ont disparu. Les traitements actuels soulagent seulement les symptômes moteurs de la maladie sans la guérir. Bien que ces traitements soient efficaces plusieurs années, ils provoquent à long terme des effets secondaires importants (mouvements involontaires), parfois plus graves que les symptômes de la maladie elle-même. Il est donc crucial de trouver des moyens de détecter la maladie plus tôt, avant l'apparition des symptômes moteurs, pour intervenir rapidement, ralentir son évolution et améliorer la qualité de vie des patients sur une plus longue période. Pour développer de nouvelles thérapies contre la maladie, on utilise souvent des tests comportementaux. Bien qu'ils soient utiles, ils manquent parfois de sensibilité pour détecter l'efficacité de nouveaux traitements. Dans ce projet, nous proposons d'utiliser des tests fonctionnels en enregistrant directement les perturbations causées dans le cerveau. Pour cela nous allons enregistrer l'activité électrique du cerveau. Cette technique est utilisée en clinique et en recherche préclinique, ce qui permet de passer facilement de l’un à l’autre. Nous nous basons sur des études cliniques qui ont montré des changements dans l’activité électrique de certaines parties du cerveau chez les patients parkinsoniens. Nous étudions ces activités cérébrales dans un modèle animal de la maladie, le rat parkinsonien. Des études préliminaires ont montré des activités cérébrales anormales chez ces animaux, similaires à celles observées chez les patients parkinsoniens. Ces signatures électriques nous aideront à évaluer plus efficacement les nouvelles thérapies dans des tests à court et long terme.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier, sélectionner et valider de nouveaux candidats médicaments pouvant traiter la maladie de Parkinson

Procédures

Génération des rats parkinsoniens : une neurochirurgie d’environ 2 heures sera réalisée sous anesthésie générale sur un sous-groupe d’animaux de ce projet. Certains animaux vont recevoir pendant 15 jours une injection quotidienne d'un traitement anti-parkinsonien qui induira des rotations et des mouvements involontaires pendant quelques heures. Contrôle alimentaire : en dehors des phases critiques - à savoir l’établissement du modèle et la période de récupération post-chirurgicale (7 jours) - tous les animaux (900) recevront une ration quotidienne limitée de 20 à 25 g de nourriture, et ce, pendant toute la durée de l’étude à laquelle ils participent (2 à 6 mois). Tests pharmacologiques en administration de courte durée : • Des administration orales (durée : moins d’une minute par administration par animal) et des injections (durée : 30 secondes par animal) pourront être utilisées. Tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique) : les administrations pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Différents prélèvements sanguins pourront être faits au cours des procédures expérimentales. Ils seront conduits sous anesthésie générale si nécessaire, en fonction du protocole établi dans chaque étude (durée : moins de 20 min par prélèvement, fréquence : une à deux fois par semaine maximum). Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout le long du projet (entre 2 à 6 mois).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une neurochirurgie d’environ 2 heures durant laquelle ils recevront une injection intracérébrale unilatérale de toxine,qui induit la maladie, afin de reproduire la pathologie de Parkinson. La lésion des neurones peut engendrer une rétention urinaire, une perte temporaire de la motivation pour boire et manger causant une perte de poids (3 à 5 jours post chirurgie), une diminution transitoire du transite digestif. Les administrations de composés pharmacologiques peuvent causer un stress aigu et une douleur brève lors de leur injection. Lors d’injections répétées, un hématome ou des dommages tissulaires superficiels peuvent apparaitre aux sites d’injections (récupération en deux semaines). Les injections chroniques de molécule pour l’induction des mouvements involontaires (15 jours) engendrent des mouvements et rotations involontaires non-interruptibles, pouvant causer un stress aigu et une fatigue de l’animal (90 minutes post-injection). Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de candidats médicaments sur nos animaux, certains effets indésirables non anticipés peuvent survenir : relachement musculaire, somnolence ou excitation (quelques heures post-administration). Après implantation des électrodes, les animaux seront hébergés en cages individuelles, avec un contact social réduit (plusieurs semaines) ce qui peut engendré du stress. Des prélèvements sanguins peuvent être faits pouvant causer stress et douleur brève au point de piqure.

Devenir

Tous nos animaux seront mis à mort à la fin de la procédure en effet : à l’issue de chaque procédure, il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux nouvelles thérapies testées, à la fois chez les animaux rendus parkinsoniens et chez les animaux sains. Ceci se fera par la réalisation de prélèvements sanguins et de différents tissus.

Remplacement

Ce projet a pour but de démontrer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques sur un modèle animal de la maladie de Parkinson. Actuellement, il n’existe aucune alternative in vitro, ni de modèle computationnel reproduisant dans leur intégralité les circuits neuronaux impliqués dans cet pathologie qui puisse se substituer à ce modèle. De plus, toute demande de mise sur le marché nécessite de prouver l’innocuité et l’efficacité du candidat médicament ou de la nouvelle thérapies testé, les tests précliniques in vivo préalables aux essais cliniques sont dans ce contexte indispensables. L’utilisation d’un organisme vivant est donc nécessaire.

Réduction

Dans le cas de nos études, chaque animal est son propre contrôle, permettant de limiter le nombre d’animaux nécessaire par groupe. Le nombre d’animaux a ainsi été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées.

Raffinement

Les animaux qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Une injection d’analgésique sera faite avant la neurochirurgie et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages d’hébergement avec enrichissement, pour limiter tout stress dû à l’environnement quotidien. Les animaux sont rassemblés 1 fois par semaine dans une « cours de récréation » pour assurer le maintien du contact social. Les animaux d’une même étude (maximum 12 animaux par session) sont rassemblés dans une enceinte fermée sur les cotés avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Cette session dure 30 minutes. Des échelles de cotation de comportement seront utilisées afin de prendre les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. Enfin, afin d’éviter un stress aigu de nos animaux lors des injections, les rats sont habitués à la contention par les techniciens en charge des injections les jours précédents les traitements. Afin de réduire la douleur associée à ces injections, les aiguilles sont à usage unique et les sites d’injections alternés pour éviter d’injecter au même endroit consécutivement.

Choix des espèces

Le rat est considéré comme l'espèce idéale pour ce projet en raison des nombreuses similitudes entre le cerveau du rat et celui de l'humain, notamment en ce qui concerne le circuit neuronal impliqué dans la maladie de Parkinson et ses connexions avec le reste du cerveau. Pour ce projet, nous utiliserons des rats adultes. La maladie de Parkinson étant liée à l'âge, il est essentiel de travailler sur un cerveau adulte et pleinement développé. Un cerveau mature nous permettra également un meilleur positionnement des injections intracérébrales et des électrodes. De plus, les rats adultes récupèrent plus facilement après la chirurgie.

Amenés à 85 ou 90 % de leur poids initial par restriction alimentaire pour rester motivés à chercher de la nourriture, 72 rats Dark Agouti parcourent un labyrinthe à huit bras puis un labyrinthe en croix, après trois injections dans l'abdomen. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré, et le porteur prévoit de proposer tous les rats à l'adoption ou à la réutilisation dans un autre projet de l'unité, la mise à mort ne venant qu'en l'absence de solution. L'objectif est de voir si une molécule qui active le système histaminergique améliore l'oubli des informations inutiles et la mémoire de travail, avec en visée lointaine l'autisme, les troubles de l'attention et la maladie d'Alzheimer. Cette molécule n'est jamais nommée, pas davantage que la dose administrée aux rats.

Objectifs

Le projet vise à mieux comprendre comment un composé qui stimule le système histaminergique influence la mémoire. Plus précisément, il s'agit d'étudier son impact sur l'oubli nécessaire lors de tâches de mémoire spatiale et sur l'efficacité de l'apprentissage dans ces tâches. Pour cela, nous utilisons des rats dans des expériences qui créent différents niveaux de confusion entre anciennes et nouvelles informations. Cela nous aide à voir comment ils gèrent l'oubli et la mémorisation à court terme, ainsi que l'apprentissage à long terme. Nous allons évaluer leurs performances dans un labyrinthe à 8 bras après leur avoir administré un composé qui active le système histaminergique. En activant ce système, nous espérons améliorer leur attention, ce qui pourrait les aider à mieux accomplir les tâches et à mieux mémoriser et/ou oublier des informations.

Bénéfices attendus

Cette étude va examiner si un composé qui stimule le système histaminergique aide à mieux se concentrer et à mieux oublier des informations inutiles. Cela pourrait améliorer la façon dont nous traitons les informations à court terme et renforcer notre mémoire à long terme. Le but final est le traitement des déficits de mémoire de travail qui sont visibles dans des pathologies telles que l’autisme, les troubles de l’attention ou encore la maladie d’Alzheimer.

Procédures

3 piqures (10 secondes chaque) avec administration intrapéritonéale de ringer (J1) et d’un composé activant le système histaminergique (J2), le matin juste avant les deux jours (J1 et J2) de test comportemental en labyrinthe à 8 bras (test de mémorisation) et une un semaine plus tard avant le test en labyrinthe en croix (test d’anxiété).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront 3 administrations intraperitonéales (douleur liée à la piqure). Les autres effets indésirables attendus sur les animaux découlent principalement de la restriction alimentaire qu’ils subiront pendant le test du labyrinthe à 8 bras : les rats seront amenés à 85-90% de leur poids initial durant la semaine d’habituation.

Devenir

Tous les rats (72 au total) seront proposés à l'adoption (interne ou externe = GRAAL) et/ou proposés pour une réutilisation dans un autre projet au sein de notre unité à la fin du projet. La mise à mort pourra être effectuée si aucune solution de replacement n'a abouti.

Remplacement

La nature même de l’expérience ne permet pas d'envisager de remplacement. En effet, elle repose sur une tâche d'apprentissage complexe que les animaux effectuent et ne peut donc pas être réalisée à partir de modèles in vitro ou in silico car nécessitant l’animal entier comme modèle expérimental. On ne peut donc envisager pour l'instant une méthode alternative de modélisation qui ne nécessiterait pas l'utilisation d’animaux. Le rat sera préféré à la souris puisqu’il est moins facilement stressé et possède un répertoire comportemental plus riche, des études pilotes ont été conduites au sein de l’équipe avec des souris et se sont révélées non concluantes pour les tâches comportementales nécessaires à ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum (n = 12 pour chaque groupe, soit 72 animaux) en se basant sur les études précédentes. Ce nombre d’animaux est nécessaire car nous allons étudier différents apprentissages comportementaux ainsi que leurs contrôles et de par la nature des tâches, un rat ne peut en effectuer plusieurs (les phénomènes de sur-apprentissage biaisant les performances comportementales). Le calcul de puissance avec les chiffres connus d’une étude précédente nous indique un nombre d’animaux nécessaires de 11 minimum nous élargissons ce chiffre à 12 dans le cas ou un animal présente des difficultés dans la réalisation des tests (ce qui est probable et connu de part nos précédentes études)

Raffinement

Les animaux seront hébergés en binômes. Tâches comportementales : la restriction alimentaire nécessaire à l’induction de la motivation dans notre tâche d’apprentissage ainsi que ses conséquences seront hautement contrôlées (de précédentes expériences de l’équipe montrent que la perte de poids modérée (maximum 10-15% de leur poids initial) est bien supportée par les rats). Nous adaptons ensuite chaque jour l’apport d’aliments pour que l’animal reprenne un peu de poids chaque jour (2 à 3 g) et reste motivé pour autant. Cela implique un contrôle strict du poids de l’animal chaque matin et adaptation de la dose de nourriture chaque soir. Nous utilisons une grille de suivi avec des points limites adaptés aux tâches comportementales et à la restriction alimentaire, nous permettant d'arrêter l'expérience si l'animal présente un mal-être. L'expérience comportementale sera précédée d’une période d’habituation à l’expérimentateur, à la pièce et au matériel d’expérimentation, dans le but de faire disparaître tout stress lié à la manipulation des animaux ou l’agencement des labyrinthes. La durée de cette période d’habituation sera adaptée aux besoins de chaque animal.

Choix des espèces

Ce protocole nécessite un apprentissage de paradigmes comportementaux. Le rat est donc préféré à la souris quand cela est possible puisqu’il est moins facilement stressé et possède un répertoire comportemental plus riche. Il existe notamment une large littérature traitant des bonnes performances des rats dans des tâches d’orientation spatiale et de planification. La souche Dark Agouti possède une bonne vision ce qui est nécessaire pour nos tâches d'orientation spatiale dans un labyrinthe. Cette souche est également peu agressive et facilement manipulable. Les rats de souche Dark Agouti sont de plus consanguins ce qui permet de réduire la variabilité inter-individuelle. Les animaux auront 7 semaines lors de leur réception et effectueront les test comportementaux à l'age de 10-11 semaines (repos post-transport, habituation a la manipulation, restriction alimentaire, habituation au labyrinthe), ce qui correspond à de jeunes adultes ayant atteint leur maturité cérébrale et étant à leur pic de capacités cognitives, qui resteront inchangées tout au long de l’expérience.

Placées dans des dispositifs qui mesurent leur activité, leur motricité, leur anxiété, leur sociabilité et leur mémoire, 360 souris porteuses de mutations liées au syndrome de Bosch-Boonstra-Schaaf vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Cette version du projet ajoute un test de rotarod, où l'animal court sur un cylindre tournant jusqu'à trois cents secondes, sans augmenter l'effectif. Le porteur écrit pourtant que le seul effet indésirable potentiel sera le stress lié à la nouveauté de l'environnement, et qualifie le phénotype de non dommageable. L'encéphale de chaque souris est prélevé après la mise à mort, au cas où des modifications anatomiques échapperaient à l'observation du comportement.

Objectifs

L’ajout d’un nouveau test comportemental (rotarod) sans ajout d’animaux nécessite une modification du projet initial. Le syndrome de Bosch-Boonstra-Schaaf est une maladie génétique humaine identifiée à ce jour sur une centaine de personnes à travers le monde, souvent chez de jeunes enfants. Ces malades souffrent généralement d'une déficience intellectuelle, d'un retard développemental, de syndromes autistiques ainsi que de modifications comportementales plus ou moins sévères. De plus,cette pathologie est souvent associée à des troubles de la vision. Chez la souris, trois lignées mutantes ont été générées afin d'être au plus près des mutations rencontrées chez l'Homme. L'objectif principale est d'étudier le comportement (activité générale,motricité, apprentissage, mémoire, anxiété, sociabilité) de ces animaux afin de déterminer quel est le modèle (la mutation) le plus proche de l'Homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont importants car cela permettra de valider le modèle animal et de choisir la mutation génétique la plus proche de l'Homme afin de mieux étudier ensuite le neurodéveloppement dans ce modèle et éventuellement de proposer des thérapies comportementales afin de permettre une évolution favorable de ce syndrôme.

Procédures

Les animaux seront soumis à differents tests comportementaux pour étudier leur activité générale; leur motricité, le niveau d'anxiété, le niveau de sociabilité ainsiq ue leur capacité d'apprentissage et de mémorisation

Impact sur les animaux

Le seul effet indésirable potentiel sera le stress que peuvent engendrer certains tests, les animaux étant mis dans un environnement nouveau.

Devenir

Les animaux seront mis à mort et l'encéphale sera prélevé pour d'éventuelles études in vitro à postériori. En effet, si des modifications comportementales sont enregistrées, il sera peut-être nécessaire d'étudier anatomiquement la structure de l'encéphale. Ce n'est pas parce que le phénotype est non dommageable et que le comportement semble normal qu'il n'y a pas des modifications au niveau anatomique ou cellulaire possibles

Remplacement

Les conséquences de certaines mutations sur le comportement ne peuvent pas être testées in vitro. Les interactions sociales, motivationnelles, les capacités motrices et mnésiques ne peuvent être étudiées que sur l'animal vigile. Afin de s'assurer que les résultats soient transférables à l'humain, les expériences seront menées sur la souris qui est un excellent modèle génétique.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé selon un testde puissance (80%) et d'après notre propre expérience afin d'obtenir des résultats robustes. Cela nous permet d'utiliser le strict minimun d'animaux, cad 20 animaux par groupe. Nous utiliserons les mâles et les femelles car il n'a pas été rapporté de différences comportementales entre sexe dans de précédentes études de ce gène.

Raffinement

L'hébergement sera effectué dans l'animalerie où les conditions d'élévage sont parfaitement définies pour un bienêtre animal. Les tests comportementaux seront effectués entre 9:00 et 17:00, avec un seul test par jour pour limiter le stress. Un suivi quotidien des animaux ( week-end et jours fériés inclus) est effectué soit par les animaliers, soit par l'expérimentateur. Les animaux seront amenés en salle d'expérimentation 30 minutes minimum avant le début du test pour s'habituer à la pièce et diminuer le stress. Les expérimenteurs pourront venir éventuellement le weekend afin de travailler dans des conditions optimales. Les animaux ne seront pas soumis à plus de 3 tests par semaines. Si besoin, suite à une évolution du score de la grille d'évaluation, et en accord avec le vétérinaire de l'institut, des mesures seront prises pour traiter l'animal. L'analyse comportementale sera faite par un système d'analyse vidéo automatique afin d'avoir un bon niveau de raffinement des résultats et de permettre d'utiliser un nombre minimal d'animaux. Une application stricte des points limites durant toute la vie de l'animal sera mise en place pour ce projet. Dans le test de rotarod, lors d'une session, si l'animal arrive à 300s lors d'un essai, il ne fera pas les essais suivants dans la mesure où il aura atteint la réponse maximale.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en raison de ses similarités génétiques avec l'homme, ainsi que la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. La souris est un excellent modèle génétique afin d'étudier le comportement suite à la mutation des gènes connus chez l'Homme comme impliqués dans notre syndrome. Ces mutations sont maintenant bien identifiées et les animaux sont en élévage chez les prestataires d'élévage. Les tests comportementaux seront effectués sur des animaux adultes permettant ainsi d'avoir une maturité corticale suffisante.