Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Maintien de lignées murines d’intérêt pour l’étude de circuits néocorticaux avec prélèvement invasif pour génotypage
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Produites sur place pour alimenter des projets sur le néocortex, 11 340 souris de lignées génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque souriceau âgé de sept à dix jours subit un prélèvement du bout de la queue sur animal vigile, ou de l'oreille en cas de nouvel essai, avec un risque de saignement. Le porteur affirme piloter l'élevage "de manière raisonnée" et envisager la cryopréservation, sans dire combien d'animaux naîtront sans porter les mutations recherchées. Ceux-là sont tués faute de pouvoir être replacés, les 5 860 autres passant en utilisation continue dans les projets de l'équipe.
Objectifs
Le néocortex des mammifères est une zone spécifique du cerveau responsable de nombreuses fonctions cognitives essentielles, telles que la perception sensorielle, le contrôle moteur et la mémoire de travail. Il est organisé en différentes aires, ou zones, hiérarchisées. Cette hiérarchie influence la circulation et le traitement de l'information dans le cerveau. L’objectif de nos recherches est de démontrer que ces différentes aires présentent des organisations de circuits neuronaux distinctes et de les caractériser en détail. Ces recherches nécessiteront de travailler avec des modèles de souris génétiquement modifiées. Ainsi l’objectif de ce projet sera le maintien de lignées murines d’intérêt avec un prélèvement invasif pour connaitre leur patrimoine génétique.
Bénéfices attendus
Les maladies du cerveau ont un impact important sur la vie des personnes, affectant leur santé, leur indépendance et leur capacité à travailler. C'est pourquoi il est crucial de comprendre comment fonctionnent les connexions entre les différents types de neurones dans le cerveau. Nos recherches visent à étudier ces connexions en détail, à la fois dans un cerveau sain et dans des situations de maladie. Nous pensons que certains problèmes du cerveau, comme la schizophrénie ou l'autisme, pourraient être liés à un mauvais fonctionnement d'une partie du cerveau appelée néocortex. Ce projet nous permettra de produire des animaux de lignées génétiquement modifiées d’intérêt pour nos projets de recherches. Les bénéfices attendus sont donc liés à ces projets de recherche et concerneront toutes les informations que nous pourrons obtenir pour identifier le fonctionnement du néocortex et l’origine de ses dysfonctionnements. A long terme cela pourrait donc amener à identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients impactés par un dysfonctionnement du néocortex.
Procédures
Un petit prélèvement du bout de la queue sera fait sur une partie des jeunes animaux vigiles (1 fois, moins d’1minute). En cas de problème technique (rare) il pourrait arriver que certains animaux aient un autre prélèvement mais cette fois au niveau de l’oreille (1 fois, moins d’1 minute).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement de l’extrémité distale de la queue pour le génotypage (ou de l’oreille en cas de re-prélèvement). Il existe un risque de saignement suite au prélèvement.
Devenir
Les animaux non porteurs des mutations génétiques d’intérêt seront euthanasiés car ils ne pourront pas être réutilisés ou replacés du fait de leur modification génétique spécifique. La majorité des animaux produits (5860) sera en utilisation continue dans nos projets de recherche.
Remplacement
Nos recherches portent sur l’étude du fonctionnement de zones spécifiques du cerveau et les différentes interactions entre ces zones. A l’heure actuelle aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de modéliser la complexité de ces connexions. Ainsi il nous est nécessaire de recourir à l’utilisation d’animaux pour nos projets de recherche.
Réduction
Le nombre total d'animaux impliqués dans ce projet (11340) est calculé en tenant compte des mesures de réduction. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux strictement nécessaire pour nos projets de recherche et en limitant au maximum le nombre d’animaux produits non porteurs des modifications génétiques d’intérêt. La production des lignées non utilisées en expérimentation est strictement limitée au minimum nécessaire, et la possibilité de recourir à la cryopréservation sera envisagée afin de réduire davantage le nombre d’animaux élevés. S’agissant d’un projet d’élevage il n’y aura pas de tests statistiques. Pour les projets dans lesquels les animaux produits seront transférés, les effectifs par groupe auront été définis sur la base d’études précédentes et à l’aide de tests statistiques si cela est possible. Les données générées seront ensuite analysées à l’aide des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé dans une pièce dédiée, au calme, à l’aide de matériel désinfecté entre chaque animal afin de prévenir tout risque d’infection ou de contamination croisée. Les petits sont replacés rapidement avec leur mère et le reste de la portée pour leur redonner un environnement réconfortant. L’état du souriceau est vérifié immédiatement après le prélèvement puis environ 30 minutes après pour s’assurer qu’il soit bien repris en charge par sa mère. Si un re-prélèvement était nécessaire sur un animal, il n’aura lieu que s’il est justifié auprès de la structure chargée du bien-être animal. La taille des prélèvements est limité au strict nécessaire et est donc la plus petite possible. Les animaux sont observés quotidiennement. En cas d’anomalie un suivi est mis en place par la structure chargée du bien-être animal et des conseils sont donnés à l’équipe de recherche pour assurer une prise en charge rapide et optimale de l’animal. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
La souris permet de modéliser de nombreuses pathologies humaines, en effet sa forte homologie génétique avec l’humain et les nombreux outils disponibles pour générer des modifications génétiques chez cette espèce en font un modèle de choix. Nos projets de recherche portent sur l’étude du fonctionnement de zones spécifiques du cerveau et les différentes interactions entre ces zones. En utilisant différentes lignées de souris génétiquement modifiées nous pourrons étudier l’effet et le rôle de cellules spécifiques pour comprendre le fonctionnement et identifier les interactions entre ces différentes zones du cerveau. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours afin de connaitre le plus tôt possible les mutations génétiques d’intérêt, nous permettant ensuite de réaliser nos procédures à différents stades de développement pour répondre à nos questions scientifiques.
Nanocargos biomimétiques pour améliorer le passage à travers la barrière hématoencéphalique.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Immunodéficientes, donc exposées à une infection par les pathogènes de leur environnement, 213 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une injection intraveineuse sous anesthésie, une injection intrapéritonéale sur animal vigile, une tonte de cinq minutes et quatre séances d'imagerie, pour tester si des nanocargos biomimétiques franchissent la barrière hématoencéphalique. Le porteur signale un inconfort lié à l'inflammation provoquée pour rompre cette barrière. Toutes sont tuées pour prélèvement, sans que l'effectif de 213 soit rattaché à autre chose qu'un logiciel de calcul et une étude pilote qui décidera de la suite.
Objectifs
La barrière hématoencéphalique, qui a la fonction de protéger le cerveau, est un obstacle majeur pour les thérapies des maladies génétiques et infectieuses du système nerveux central. A l’heure actuelle des techniques invasives telles que l’injection de vecteurs viraux directement dans le cerveau sont nécessaires en clinique. Le développement de nouvelles stratégies moins invasives est donc nécessaire. Nous avons développé un système qui permettrait de passer de façon naturelle la barrière hématoencéphalique. En chargeant ce système avec un médicament nous pouvons donc imaginer de pouvoir amener l’agent thérapeutique directement au cerveau en l’injectant directement dans la circulation ce qui rend la méthode moins invasive.
Bénéfices attendus
Proposer une nouvelle approche thérapeutique et non invasive pour traiter les maladies du système nerveux en apportant de façon sûre et efficace le médicament au cerveau.
Procédures
Une injection intraveineuse (moins de 30 secondes), sous anesthésie. Une injection intrapéritonéale (moins de 10 secondes), sur souris vigile. Une tonte du pelage (durée 5 minutes), sur souris anesthésiée. 4 séances d'imagerie (5 minutes maximum), sur souris anesthésiée.
Impact sur les animaux
Les animaux peuvent ressentir une douleur au site d’injection lors des injections dans la circulation sanguine et en intrapéritonéale. Un inconfort lié à l’inflammation permettant la rupture de la barrière hématoencéphalique peut être ressenti. L’immunodéficience des animaux peut entrainer une infection par des pathogènes
Devenir
Les souris seront euthanasiées afin de récupérer des prélèvements qui seront analysés ultérieurement.
Remplacement
Nous souhaitons tester l’efficacité d’un véhicule qui permettrait d’amener un médicament au cerveau une fois injecté dans la circulation sanguine. A l’heure actuelle il n’existe pas de méthodes in vitro permettant de reproduire un organisme aussi complexe que le corps. L’utilisation des animaux est donc indispensable. Néanmoins la pertinence du choix de notre modèle a été validé par des tests in vitro et l’absence de toxicité du produit a déjà été vérifiée.
Réduction
Dans ce projet nous avons prévu une étude pilote qui permettra d’attester l’efficacité ou non de notre approche. Si les résultats ne sont pas ceux attendus nous n’irons pas plus loin dans ce projet. Le suivi du devenir du véhicule se fera par imagerie non invasive qui permet de faire un suivi longitudinal sur un même animal. Nous travaillerons à la fois sur des mâles et des femelles. Le nombre d’animaux a été déterminé en utilisant un logiciel dédié et un test statistique sera réalisé.
Raffinement
Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir ventilé. L’hébergement en portoir ventilé permet de limiter les risques d’infection des animaux par des pathogènes et/ou des opportunistes. Les actes expérimentaux seront réalisés sous anesthésie quand cela est nécessaire et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Une feuille de score est utilisée pour le suivi de l’animal et pour scorer des points limites adaptés au projet. La feuille de score permet de définir des critères d’arrêt des souffrances et propose des mesures conservatoires bien déterminées. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur tout au long du projet.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix en imagerie optique. De plus cette espèce permet d’obtenir des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées à partir d’un âge de 7 semaines correspondant à de jeunes adultes. A cet âge elles ont une taille raisonnable facilitant leur manipulation.
Déterminants cellulaires des syndromes épileptiques associés à des mutations chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la queue entre le troisième et le sixième jour de vie, chirurgie d'une heure trente pour implanter des sondes dans le cerveau et un boîtier sous la peau du dos, puis hébergement seul pendant quatre-vingt-dix jours au plus : 1 263 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Après une semaine de récupération, certaines reçoivent vingt-quatre injections en seize jours, puis restent branchées à un système d'enregistrement jusqu'à dix heures par jour pendant deux semaines. Les souris filmées pour détecter leurs crises perdent tout enrichissement bloquant la caméra, maison et matériau de nidification compris, et une partie des lignées modifiées fait des crises tonico-cloniques à partir de trois mois. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leur tissu cérébral.
Objectifs
Les troubles neurologiques, comme l'épilepsie, sont souvent liés à des problèmes dans l'équilibre des ions dans les neurones, en particulier le chlorure. Un transporteur important joue un rôle clé dans ce processus. Des mutations du gène qui produit cette protéine sont associées à divers troubles, allant de l'autisme à des formes sévères d'épilepsie chez les enfants. Cependant, on ne sait pas encore exactement comment ces mutations provoquent des crises d'épilepsie. Notre projet de recherche cherche à comprendre ces mécanismes en étudiant des souris portant une mutation d’un gène spécifique, avec l'espoir de trouver de nouvelles pistes pour traiter ces maladies.
Bénéfices attendus
Ce projet étudie une mutation d’un gène spécifique, responsable d’une forme grave d'épilepsie chez l'enfant. Les patients ont des crises d’épilepsie dès la première année de vie associée avec un déficit cognitif (problème pour parler, marcher indépendamment). Les crises de ces patients ne répondent pas aux médicaments actuellement disponibles. En comprenant mieux comment cette mutation affecte le fonctionnement des cellules, nous espérons découvrir de nouvelles pistes pour des traitements plus ciblés et personnalisés. La mutation que nous étudions grâce à une nouvelle lignée de souris a été associée avec un syndrome épileptique sévère : l’épilepsie du nourrisson à crises focales migrantes. Les patients atteints ont des crises d’épilepsies fréquentes et non contrôlées par voie médicamenteuse dès la première année de vie avec un délai neurodéveloppemental sévère ou une régression neurodéveloppementale lors de l’apparition des crises. L’identification et la compréhension des mécanismes cellulaires liés à cette mutation à l’origine de ce trouble permettra d’identifier de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques pour une médecine de précision.
Procédures
Une intervention d’une biopsie de queue est réalisée sur souris vigiles à l’âge de 3 à 6 post-natal. Cet acte technique dure moins de 1 minute. Une partie des animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptées pour l’implantation de sondes au niveau du cerveau et d’un appareil en sous-cutané au niveau du dos (1 fois, durée 1h30). Ils seront ensuite hébergés individuellement jusqu’à la fin de la procédure, soit 90 jours maximum. Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, afin d’évaluer l’effet d’un composé sur notre modèle pathologique, certains animaux opérés recevront des injections d’une molécule d’intérêt ou de son contrôle pendant 2 périodes de 8 jours, 2 fois par jour (matin et soir), soit 24 injections maximum (durée inférieure à 1 minute). Ces injections sont faites sur animal vigile. Après minimum une semaine de récupération post-chirurgie, l’activité électrique du cerveau des animaux opérés sera mesurée, pour cela ils seront connectés à un système d’enregistrement, vigiles et libres de se déplacer durant les mesures (maximum 10 heures par jour, pendant 2 semaines maximum). Un groupe de souris sera soumis à une chirurgie sous anesthésie pour induire l’expression d’un gène dans leur cerveau par un virus ou un plasmide (45 min), elles seront ensuite euthanasiées selon une procédure adaptée. Un groupe de souris recevront une injection intrapéritonéale (temps de manipulation inférieur à 1 minute) à un stade précis de développement. Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les manipulations et contentions nécessaires au cours des procédures pourront générer un stress chez les animaux. Les injections peuvent induire une légère douleur et un inconfort au point d’injection. Les étapes d’anesthésie peuvent provoquer une détresse respiratoire, et une perte de chaleur de l’animal. Les actes chirurgicaux peuvent entrainer risque d'infection de la cicatrice ainsi qu’une souffrance locale. L’implantation d’électrodes dans le cerveau peut induire une douleur locale pendant 24 à 48 heures post chirurgie et une légère perte de poids. Les souris implantées devront être en hébergement individuel dès la chirurgie et le resteront pendant toute la durée de l’étude, soit une durée totale d’hébergement individuel de 90 jours maximum. S’agissant d’animaux grégaires, cela pourra générer un stress. Les animaux qui seront pris en vidéo pour détecter des crises n’auront pas d’enrichissement qui bloque visuellement la caméra comme une maison rouge ou de la nidification. La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme est possible. Le prélèvement à la queue induit une douleur lors du prélèvement et un saignement est possible. Une partie des animaux génétiquement modifiés sont sujets à des crises tonico-cloniques à partir de trois mois qui peuvent induire une fatigue ou en cas de crises d’un stade élevé (qui n’ont pas été observés chez ces souris) une atonie et une perte de poids.
Devenir
A l’issue du projet, l’ensemble des animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire afin de prélever et étudier leur tissu cérébral post-mortem.
Remplacement
Les mutations étudiées ici ont été identifiées chez des patients humains. Nous avons d’abord étudié cette mutation avec des modèles cellulaires avec lesquels nous avons pu observer une diminution de l’expression membranaire. Toutefois, ce modèle ne permet pas de tester des effets cellules-spécifiques de cette mutation au cours du développement ni l’apparition de rhythmopathies ou de crises d’épilepsie. Pour cela, le recours à un modèle animal est indispensable.
Réduction
Les expériences antérieures de nos collaborateurs sur ce type d’étude et de modèle animal indique qu’un échantillon de 6 animaux par condition pour une expérience donnée d’histologie et de 10 pour une expérience d’électrophysiologie est suffisant pour mettre en évidence une différence de 20 pour cent. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. A l’aide de ces calculs, nous estimons devoir utiliser 1263 animaux dans le cadre de ce projet. Nous analyserons nos résultats avec les tests statistiques appropriés afin d'avoir une interprétation fiable.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux de 5 individus maximum (sauf en post-chirurgie où ils seront en hébergement individuel, identifié et avec enrichissement complémentaire) et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d’une maison en plastique sauf lors des enregistrements vidéo. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur les animaux seront exclus du protocole. Tout le long des procédures, nous assurerons une prise en charge anesthésique et analgésique adaptée. Au cours de l’anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à un tapis chauffant. Un produit spécifique sera appliqué sur les yeux pour éviter tout dessèchement des cornées. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont placées sur une plaque chauffante, anesthésiées et reçoivent des injections d'analgésiques en pré- et post-opératoire. Après les chirurgies, une litière utilisée spécifique pour les animaux opérés permet de diminuer les risques d'infection de la cicatrice. La surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance et l’analgésie est maintenue sur 48h après l’opération à raison d’une administration par jour. Une grille d'évaluation de l’état des animaux est mise en place comprenant notamment l’évaluation de l’état du poil, la motilité, et le poids de l’animal. Une injection d'analgésique ou l’euthanasie de l'animal sont envisagées en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites. Un délai d’une semaine d’acclimatation sera respecté pour les animaux élevés en dehors de l’institut.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix afin d’étudier le développement du cerveau ainsi que les connexions neuronales chez l’adulte, à la fois car c’est un modèle présentant un développement très bien caractérisé et stéréotypé mais surtout en raison des similarités du développement du système nerveux entre la souris et l’humain. De plus, l’organisation de l’hippocampe et du cortex chez l’adulte est très similaire chez la souris et l’humain (organisation en couches, morphologie…). Nous souhaitons étudier une nouvelle lignée de souris portant une mutation. Au vu des rôles connus de cette protéine et de son expression au cours du développement, nous émettons l’hypothèse que cette mutation pourrait avoir des impacts sur le développement cortical à des stades embryonnaires ou postnataux précoces. Nous allons donc étudier les différences histologiques à des stades embryonnaires et précoce (1 et 4 jours après la naissance). Nous savons aussi que les adultes de cette lignée présentent des crises tonico-cloniques. Nous souhaitons caractériser ces crises ainsi que le décours temporel de leur survenue. Nous étudierons donc également le stade adulte.
Rôle des sous-populations neuronales à POMC dans la régulation énergétique et le développement de l’obésité.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
4 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau et d'autres tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant jusqu'à deux fois en contention dans un tube d'IRM et donnant six gouttes de sang en deux heures après incision du bout de la queue. La moitié d'entre elles, soit 2 160 souris, reçoit un régime hyperlipidique pendant trois semaines à quinze mois pour développer une obésité, avec une prise de poids que le porteur estime pouvoir atteindre 200 % du poids initial. 2 400 subissent en plus une chirurgie cérébrale d'une heure pour injection d'un virus, et 1 920 un gavage quotidien de tamoxifène pendant cinq jours. Le porteur annonce à long terme de nouvelles stratégies contre l'obésité, quand l'objectif immédiat reste de cartographier des sous-populations de neurones de l'hypothalamus.
Objectifs
L'obésité est un problème de santé très sérieux, souvent lié à des maladies comme le diabète ou les problèmes cardiaques. Dans le cerveau, une région appelée l’hypothalamus joue un rôle clé pour contrôler la faim et gérer l’énergie du corps. Cela se fait grâce à des cellules nerveuses spécialisées, appelées neurones, qui aident à limiter la prise alimentaire et à réguler le métabolisme. Si ces neurones ne fonctionnent pas bien, cela peut conduire à l’obésité. Cependant, tous les neurones ne sont pas identiques. Notre objectif est de mieux comprendre cette diversité pour savoir comment ces neurones influencent l'obésité. Pour cela, nous utiliserons des outils génétiques pour marquer ces neurones et suivre leur évolution dans le temps. Nous testerons également une technologie innovante pour activer ou désactiver précisément les certaines sous-population de neurones, grâce à des molécules spécifiques. Cela nous aidera à voir comment ces cellules influencent le métabolisme et le développement de l’obésité. Dans chaque modèle, nous soumettrons la moitié des souris à un régime riche en graisses pour observer l’apparition et l’évolution de l’obésité sur des périodes allant de quelques semaines à plus d’un an. Avec ce projet, nous espérons mieux comprendre le rôle des neurones de l’hypothalamus et leurs sous-populations, afin de trouver de nouvelles stratégies pour prévenir ou traiter l’obésité.
Bénéfices attendus
Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, plus d’un milliard de personnes dans le monde sont touchées par l’obésité, ce qui en fait une priorité de santé publique. Les traitements actuels s'avèrent peu efficaces, et les interventions durables se limitent souvent à des techniques invasives comme la chirurgie bariatrique (opération chirurgicale visant à réduire ou court-circuiter l'estomac), qui n'offre pas toujours de résultats garantis. Face à ce défi, approfondir notre compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans l’obésité devient crucial pour développer des solutions thérapeutiques plus adaptées et efficaces à l’avenir. À court terme, notre projet fournira de nouvelles informations sur les processus qui encouragent la consommation d’aliments hypercaloriques et participent au développement de l’obésité et des comorbidités associées. De plus, il s’inscrit dans un cadre de recherche international visant à déchiffrer les rôles spécifiques des différentes sous-populations de neurones. À plus long terme, ce projet pourrait ainsi mener à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour mieux lutter contre l’obésité.
Procédures
Administration orale (1920 animaux) : Chaque souris recevra un médicament par voie orale une fois par jour pendant 5 jours. Cette procédure est rapide, ne durant que 15 secondes par animal, et ne nécessite pas d’anesthésie. Nous manipulons les souris avec soin pour éviter tout stress. Chirurgie cérébrale (2400 animaux) : Une intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale pour garantir l’absence de douleur. Chaque souris ne subira qu’une seule opération d’une heure maximum au cours de sa vie. Analyse de la composition corporelle (4320 animaux) : Pour mesurer la composition corporelle (graisse, muscles, etc.), une IRM est utilisée. Cette méthode est rapide (moins de 5 minutes) et réalisée en maintenant l’animal en contention pour réduire tout inconfort. Une même souris peut passer cette analyse au maximum deux fois dans sa vie. Tests de tolérance au glucose et à l'insuline (4320 animaux) : Ces tests, réalisés une fois par animal, consistent à mesurer la réponse du corps au glucose et à l'insuline. La procédure ne nécessite pas d’anesthésie et est réalisée de manière à minimiser tout inconfort. Les mesures se font par prises de sang (après avoir créé une minuscule incision à l’extrémité de la queue). Une goutte de sang est récupérée 6 fois en 2 heures. La moitié des souris (2160) seront sous un régime hyperlipidique afin de mimer l’obésité.
Impact sur les animaux
Les souris du premier objectif recevront une administration orale de tamoxifène, un agent pharmacologique qui peut provoquer des effets secondaires. Le tamoxifène induit une réduction temporaire du tissu adipeux, entraînant une perte de poids réversible. Bien que l'administration par gavage oral soit indolore, elle nécessite une immobilisation complète de l’animal, générant un certain niveau de stress. Les souris du deuxième objectif, subissant une injection dans le cerveau à des endroits précis de virus, pourraient également ressentir des douleurs post-opératoires liées à la neurochirurgie. Ces douleurs sont principalement dues à l’incision cutanée du crâne et à la déshydratation associée à l’anesthésie, mais elles devraient diminuer dans les jours suivant l’intervention grâce au traitement analgésique mis en place. Lors du suivi du développement de l’obésité : Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce test nécessite de placer l’animal dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Prise de poids consécutive au régime gras. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. Tests de tolérance au glucose et à l'insuline : Mesure de la réponse du corps au glucose et à l'insuline. La procédure ne nécessite pas d’anesthésie et est réalisée de manière à minimiser tout inconfort. Les mesures se font par prises de sang (après avoir créé une minuscule incision à l’extrémité de la queue). Une goutte de sang est récupérée 6 fois en 2 heures. Ces tests reproduisent les conditions physiologiques suite à un repas. Les hyperglycémies et hypoglycémies sont monitorées mais n’induisent aucun mal-être.
Devenir
Les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem. Toutes les souris sont classées sans réveil.
Remplacement
Le but de ce projet est d’étudier la fonction et le mécanisme de développement de ces sous-populations de neurones associés à un régime obésogène. Dans ce contexte, les neurones que nous étudions interagissent avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques qui influencent l’activité neuronale via des signaux hormonaux. Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et les variables mesurées ici telles que le comportement alimentaire nécessite évidemment un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.
Réduction
La composition corporelle de tous les animaux adultes sera analysée in vivo par résonnance magnétique nucléaire. Ce type d’analyse permet de vérifier les changements de composition corporelle des animaux dans le temps et en fonction des différents régimes alimentaires. Cette approche permet d’éviter de sacrifier plusieurs lots d’animaux à des temps différents pour vérifier les changements de composition corporelle.Nous avons réalisé un test de puissance pour déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires dans les deux sexes afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Pour l’analyse des données, nous comparerons les différents groupes expérimentaux. Le nombre d’animaux demandé correspond au maximum estimé pour le projet. Si, en cours d’étude, nous constatons qu’il est possible de le réduire, nous le ferons bien évidemment.
Raffinement
Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement et seront habitués pendant au moins 2 semaines. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons ces tunnels pour transporter les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement pour les pièces d'hébergement. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique (opération du cerveau pour cibler une zone très précise), qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 3 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération.
Choix des espèces
La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De plus, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Enfin, la forte proximité biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de cette espèce un bon modèle prédictif. Toutes les souris de ce projet arriveront à l’âge de 6 semaines dans notre animalerie, mais nous ne débuterons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines, sur des souris adultes. Il est admis qu’à 8 semaines, la croissance des os est achevée, ce qui facilite les procédures impliquant une chirurgie stéréotaxique (opération du cerveau pour cibler une zone très précise) (car les points de repère anatomiques se situent sur le crâne). Les souris seront logées dans des cages collectives pour favoriser les interactions sociales et seront soumises soit à un régime hyperlipidique induisant l’obésité ou un régime standard pendant 3 semaines, 3 mois, 6 mois, 9 mois ou 15 mois et 2 semaines (en tenant compte des 5 jours de tamoxifène et l’attente d’une semaine). Les souris sont donc utilisées jusqu’à un âge de maximum 17 mois et 2 semaines.
Etude de la neurodégénérescence dans un modèle de maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Prise de sang sur animal vigile maintenu en contention deux minutes, puis anesthésie par injection pour la moitié d'entre elles : 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces souris portent une modification génétique reproduisant les dépôts cérébraux observés dans la maladie d'Alzheimer, et arrivent par cohortes de trois, six et neuf mois d'âge pour suivre la progression des lésions. Le porteur affirme que la pathologie n'est modélisable que dans un "organisme complet" et que seule une approche sur un mammifère fournira ces premières données. Les atteintes décrites se limitent au stress de contention et à la douleur de la piqûre, sans un mot sur ce que la neurodégénérescence elle-même inflige aux animaux pendant qu'elle s'installe.
Objectifs
Cette étude s'inscrit dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, une pathologie qui se caractérise par l'apparition de dépôts anormaux dans le cerveau, perturbant le fonctionnement des neurones et entraînant des troubles de la mémoire et du raisonnement. Les mécanismes exacts à l'origine de ces dépôts restent encore mal compris, bien que leur accumulation soit considérée comme un élément clé du développement de la maladie. Pour mieux les étudier, nous utilisons un modèle de souris spécialement conçu pour reproduire certains aspects de cette pathologie. Grâce à ce modèle, nous pourrons analyser en détail l’évolution de ces anomalies cérébrales et mieux comprendre leur impact sur le fonctionnement du cerveau.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre comment et pourquoi ces dépôts anormaux se forment dans le cerveau et quel impact ils ont sur la destruction progressive des neurones. Grâce à l’utilisation de notre modèle de souris, nous pourrons aussi mieux distinguer le rôle de ces dépôts de celui de l’inflammation, un facteur souvent impliqué dans la maladie. Enfin, les connaissances acquises pourraient aider à mettre au point de nouvelles stratégies pour ralentir ou prévenir l’accumulation de ces dépôts et ainsi ouvrir la voie à de futurs traitements.
Procédures
Les animaux seront soumis à une prise de sang sur animal vigile par contension (2 minutes maximum par animal). La moitié des animaux seront anesthésiés par une injection médicamenteuse (1 minute maximum par animal).
Impact sur les animaux
La contension peut induire un leger stress et la prise de sang une légère douleur au niveau de l'aiguille. L'injection de l'anesthésique peut induire une leger stress et une légère douleur au point d'injection.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de la procédure afin de collecter et d'analyser différents organes.
Remplacement
Cette étude vise non seulement à approfondir nos connaissances sur la maladie d'Alzheimer, mais aussi à ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de traitements plus efficaces et mieux ciblés contre cette pathologie. Celles-ci n'est modélisable que dans un organisme complet, à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques. Par ailleurs, seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Un effectif de 6 animaux par sexe et par condition a été choisi pour visualiser un effet statistiquement significatif et exploitable tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous allons générer des données qui seront analysées à l'aide de tests statistiques adaptés
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Afin de maintenir le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress. Des cages ventilées avec de l’air filtré seront utilisées. Durant l'ensemble des procédures, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être.
Choix des espèces
L'utilisation de la souris comme modèle d'étude est particulièrement pertinente en raison de sa similitude génétique avec l'humain, de la possibilité de manipulations génétiques précises et de son utilisation largement validée dans la recherche sur la maladie d'Alzheimer, permettant une meilleure transposition des résultats vers des applications cliniques. Nous allons recevoir 3 cohortes de 3 âges différents : 3 mois, 6 mois et 9 mois dans le but de suivre la mise en place de la maladie sans laisser les animaux atteindre un stade critique.
Exploration de la contribution des fibres du toucher social dans la modulation de la douleur post lésionnelle. #1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génétiquement privées d'une sous-population de neurones du toucher, 40 souris reçoivent un traitement quotidien pendant cinq jours, deux injections espacées de 72 heures, puis pour une partie d'entre elles quatre injections supplémentaires, avant neuf séances de stimulation mécanique de la patte arrière étalées sur quarante jours. La moitié d'entre elles est utilisée dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, l'autre moitié dans des procédures modérées. Toutes sont tuées pour prélever les tissus, après un transfert vers un second établissement où l'activité électrique de leur moelle épinière est explorée pendant trois semaines au maximum. Le porteur conclut que ses données antérieures "ne montrent aucun effet délétère" et ramène les nuisances à un isolement en box de deux heures et à la stimulation de la patte, alors que la moitié des souris est déclarée en souffrance sévère dans le même document.
Objectifs
Cette étude a pour but de comprendre le rôle d’une sous-population spécifique de neurone dans la modulation de la douleur. Pour ce faire, nous utilisons une souris génétiquement dépourvue de cette sous-population de neurone. Nos données démontrent, pour la première fois, un rôle majeur de cette sous-population dans la modulation de la douleur. Afin d’élucider les mécanismes sous-jacents à ce nouveau rôle anti-douleur de cette sous-population neuronale, nous souhaitons, dans cette étude (impliquant 2 établissements utilisateurs), explorer l’activité électrique mise en jeu au niveau de la moelle épinière. Les données émanant de cette nouvelle étude offriront une nouvelle base pour le développement de nouveaux traitements adaptés à différents types de douleurs, dont souffrent notamment les patients atteints de cancer.
Bénéfices attendus
La prise en charge de la douleur est actuellement un enjeu majeur. En effet, 1/5 de la population mondiale est atteinte de douleurs chroniques, ce qui représente un problème socio-économique important et souligne que les mécanismes moléculaires et cellulaires intervenant dans la mise en place et le maintien des douleurs chroniques restent peu compris. Dans ce projet, nous allons nous intéresser à une sous-population spécifique de neurone ayant un rôle majeur dans la modulation de la douleur. A court terme, ce projet permettra donc d’accroitre nos connaissances fondamentales sur les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans les douleur chronique. Ainsi, nos travaux offriront à long terme une nouvelle base pour le développement de nouveaux traitements adaptés à différents types de douleurs, dont souffrent notamment les patients atteints de cancer.
Procédures
Au sein de l’établissement utilisateur 1, l’ensemble des animaux recevront, premièrement un traitement une fois toutes les 24h, pendant 5 jours consécutifs. 1 semaine plus tard, l’ensemble des souris recevront deux injections espacées de 72h. Ensuite, et seulement une partie des souris, recevront, 4 semaines minimum après l’injection, quatre injections espacées de 48h. Les animaux mentionnés dernièrement feront l’objet d’une étude comportementale sur une durée de 40jours pour un total de 9 sessions de stimulations mécaniques de la patte arrière. Chaque session est composé d’un maximum de 7 stimulations mécaniques espacées sur une durée d’une heure. Cette étude a pour but d’évaluer la sensibilité mécanique de l’animal. L’ensemble des animaux de ce projet seront ensuite transférés de établissement utilisateur 1 à l’établissement utilisateur 2 pour l’exploration de l’activité électrique mise en jeu au niveau de la moelle épinière, pour une durée n’excédant pas 3 semaines.
Impact sur les animaux
Les nuisances du test comportemental sont l'isolement de l'animal en box individuel pendant une durée maximale de 2h ainsi que la stimulation mécanique de la patte arrière. Ces nuisances sont susceptibles de générer du stress mais le personnel est formé à la réalisation de ces actes. Nos données, issues d’études précédentes, ne montrent aucun effet délétère.
Devenir
Tous les animaux impliqués dans chaque procédure seront euthanasiés afin de prélever les tissus nécessaires aux besoins de l'analyse.
Remplacement
Notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. L’étude comportementale, constituant le point de départ de notre étude, est le résultat d’une intégration complexe de l’information sensorielle de la périphérie vers le cortex somatosensoriel. Ainsi, l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet. De plus, l'utilisation de la souris en tant que modèle expérimental nous permet d'étudier le rôle de populations neuronales définies dans la physiologie de la douleur, grâce à la génération de modèles murins génétiquement modifiés.
Réduction
Sur la base d’études pilotes, nous avons réduit au minimum nos effectifs permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. L’optimisation de notre plan expérimental (enchaînement de différents tests comportementaux non-invasifs sur le même animal, partage de tissus) permet d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaire. L’utilisation d’outils informatiques prenant en compte la variabilité liée au traitement, aux tests comportementaux ainsi que le nombre minimum de souris pour obtenir suffisamment de matériel analysable, nous permettent de déterminer au plus juste le nombre d’animaux dans nos tests de comportement, ainsi que dans les analyses électrophysiologiques prévues dans ce projet. Le nombre indiqué tient compte de toutes ces variables.
Raffinement
Les stratégies d’optimisation suivantes seront mises en place au cours du projet afin de réduire au mieux voir supprimer la souffrance chez l’animal : a) planification des procédures expérimentales (disponibilité de locaux d'expérimentation, de matériel, période d'acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation) limitant le stress des animaux et favorisant la validité des expériences ; b) recours à l'anesthésie/analgésie ; c) établissement d’une grille de score et des points limites les plus précoces possibles. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs est assuré par un transporteur agréé (température et hygrométrie contrôlée pendant le transport). Les animaux arrivant à destination font l'objet d'une période d'acclimatation de 3 jours (au minimum) avant toute utilisation, afin de limiter le stress des animaux.
Choix des espèces
Notre sous-population neuronale d’intérêt étudiée chez la souris est similaire à celle décrite chez l'homme. Les animaux utilisés dans cette étude seront utilisés à partir de 3semaines d’âge, tel qu'il a été décrit dans la littérature.
Rôle du polymoprhisme TaqIA dans la vulnérabilité aux pathologies psychiatriques et métaboliques.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 920 souris portant une mutation qui reproduit un variant génétique humain vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, certaines isolées jusqu'à deux semaines dans une cage de calorimétrie. Elles subissent une chirurgie abdominale pour implanter une puce de température ou une chirurgie du crâne, portent des fibres optiques fixées sur la tête pendant les enregistrements, reçoivent un régime engraissant jusqu'à trois mois et sont maintenues à 90 % de leur poids normal pendant l'apprentissage des tâches de motivation. Des mesures à 30 et à 13 degrés complètent le protocole. Le porteur annonce à terme des approches nutritionnelles et pharmacologiques personnalisées contre les troubles alimentaires et l'obésité, quand ce qui est certain ici est l'isolement, la restriction alimentaire et la mort de 1 920 souris.
Objectifs
La surconsommation d'aliments à forte densité énergétique est aujourd'hui clairement identifiée comme l'un des principaux responsables de l’obésité. Cependant, dans ce contexte, tous les individus ne deviennent pas obèses, suggérant que nos gènes entrent également en interaction avec notre environnement et influencent notre santé. C’est dans ce contexte que l’on porte de plus en plus d’attention aux facteurs génétiques qui pourraient influencer nos comportements. Le polymorphisme génétique correspond aux variations naturelles dans la séquence d’ADN qui existent dans la population ; l’un des plus étudiés dans les maladies psychiatriques est appelé TaqIA. Affectant environ 50% de la population, ce polymorphisme est corrélé à une vulnérabilité accrue au développement de comportements addictifs, mais également aux troubles des comportements alimentaires et à l’obésité. Cependant, ce polymorphisme n’est observé que chez l’espèce humaine, ce qui empêche de comprendre son rôle causal dans les troubles neuropsychiatriques et métaboliques. Nous avons ainsi généré une mutation ponctuelle chez le rongeur reproduisant le contexte humain du polymorphisme TaqIA et permettant d’enfin étudier son rôle causal dans le développement de l’addiction, des troubles du comportements et de l’obésité. Un total de 1920 animaux sur 5 ans sera utilisé pour répondre à ces questions. La règle des trois R sera respectée, le nombre d’animaux sera réduit au minimum en optimisant au maximum les groupes expérimentaux (réutilisation des animaux dans différentes procédures n'entrainant pas de douleur ou de stress) et en raffinant les procédures pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme une meilleure connaissance du rôle du système de la récompense dans le contrôle du comportement et du métabolisme, ainsi que du rôle du polymorphisme TaqIA dans la modulation de l’activité des neurones dopaminergiques dans un environnement alimentaire normal ou obésogène. A moyen et long terme, l’objectif sera de développer et valider des approches nutritionnelles et/ou pharmacologiques personnalisées basées sur le polymorphisme génétique humain pour traiter les troubles psychiatriques, alimentaires et métaboliques.
Procédures
- Pour deux lots, les animaux seront soumis à des études de calorimétrie et/ou de métabolisme du glucose. Pour les études calorimétriques, les animaux resteront isolés au maximum 2 semaines lors d'une première exposition aux cages. Ces mesures en cages de calorimétrie indirecte pourront être répétées plusieurs fois sur un même animal, mais la durée d'exposition aux cages sera limitée à une semaine maximum dans ce cadre. Une partie des animaux sera également exposée à une chirurgie abdominale (15 min) pour implanter une puce de relevé de température. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles pourront également être également réalisés après un gavage de glucose ou l’injection d’insuline (environ 4h pour chaque test). Enfin la moitié de ces animaux réaliseront ces tests après l’exposition à un régime hyperlipidique (maximum 3 mois). - Pour deux lots, les animaux seront soumis à des études comportementales visant à étudier les comportements alimentaires, les comportements motivés et les comportements de type anxieux. Dans le cas où les animaux sont évalués dans plusieurs tests, chaque test est espacé a minima de 7 jours. Enfin la moitié de ces animaux réaliseront ces tests après l’exposition à un régime hyperlipidique (maximum 3 mois). - Enfin, pour deux lots, les animaux seront soumis à une chirurgie (1 h), suivie d'une période de repos. Les animaux effectueront ensuite des tâches comportementales visant à étudier les comportements alimentaires, les comportements motivés et les comportements de type anxieux. Dans le cas où les animaux sont évalués dans plusieurs tests, chaque test est espacé a minima de 7 jours. Enfin la moitié de ces animaux réaliseront ces tests après l’exposition à un régime hyperlipidique (maximum 3 mois).
Impact sur les animaux
- La prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisance pour les souris (nuisance modérée). - La calorimétrie indirecte demande un hébergement individuel des animaux pendant 7 jours maximum (nuisance modérée). Une partie des expérimentations se fera à 30°C et 13°C pour évaluer l'adaptation themrique des animaux pendant 3 jours au maximum (nuisance modérée). - Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux (nuisance légère). Enfin, les procédures de conditionnement opérant nécessitent une restriction alimentaire légère limitée à la phase d’apprentissage (maintien à 90% du poids ad libitum, nuisance modérée). - Les nuisances attendues suite à la chirurgie (badominale ou stéréotaxique) sont bien identifiées au laboratoire, après plusieurs années d'expérience de cette procédure (nuisance modérée). Notamment, la baisse de température corporelle induite par l’anesthésie est contrôlée par l’installation des souris sur un tapis chauffant assurant le contrôle de température. Ainsi, la température est maintenue en permanence à 37°C. Le dessèchement oculaire potentiel est prévenu par l’application d’un gel ophtalmique. - Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress (nuisance modérée). Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable. Cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. Nous nutiliserons pas également les invértébrés, car ils ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements, nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles). De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques.
Raffinement
Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, des bâtons de bois ou des tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé : notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permettent un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. De plus, ce projet nécessite l'utilisation de stratégies transgéniques et virales disponibles uniquement dans des modèles murins. Toutes les souris seront utilisées à l’âge adulte (au moins 9 semaines) afin que les réseaux neuronaux soient bien en place.
Rôle des afférences cholinergiques du cortex préfrontal dans l’attention
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent une heure par jour, cinq jours par semaine, dans des tests d'attention, subissent une chirurgie intracérébrale de 45 minutes, reprennent les tests pendant plusieurs semaines, puis une chirurgie terminale permet de prélever leur cerveau. Le porteur annonce des médicaments plus efficaces contre les troubles de l'attention, la schizophrénie et la maladie d'Alzheimer, quand l'objet immédiat reste la description de deux voies cholinergiques du cortex préfrontal. Il présente le rat comme un "compromis phylogénétique", assez proche de l'être humain pour valoir modèle et assez éloigné d'espèces "plus sensibles éthiquement" comme les primates non-humains, et prévoit 20 % de pertes en cours d'expérience.
Objectifs
La libération d'acétylcholine dans le cortex préfrontal médial est essentielle à de nombreuses fonctions cognitives et des perturbations de la transmission cholinergique corticale ont été impliquées dans plusieurs troubles tels que le trouble d'hyperactivité avec déficit de l'attention , la maladie d'Alzheimer ou la schizophrénie. Nous avons précédemment montré l'existence de deux voies cholinergiques distinctes qui innervent différentes régions du cortex préfrontal. Cependant, à ce jour, l’implication de ces deux voies cholinergiques dans l’attention n’a jamais été étudiée. Le but de ce projet est donc d’étudier le rôle de ces deux voies cholinergiques dans les processus attentionnels.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche contribuera à mieux comprendre les processus neuronaux cortex préfrontal sous-tendant l'attention. Ces informations contribueront à faire progresser la neurobiologie de l’attention en soi, mais conduiront également au développement de médicaments plus efficaces pour améliorer la cognition dans d’autres troubles neurologiques et neuropsychiatriques dans lesquels l’attention est dysfonctionnelle, comme les troubles de l'attention, la schizophrénie ou la maladie d’Alzheimer. De tels médicaments amélioreront potentiellement la santé mentale et le bien-être des personnes souffrant de troubles de l'attention.
Procédures
Tous les animaux effectueront des tests comportementaux pour mesurer leurs capacités attentionnelles à raison 1h/ jour, 5 jours par semaine. Ils seront ensuite soumis à une chirurgie intracérébrale (45 min en moyenne). Après récupération, les animaux effectueront de nouveaux les tests comportementaux pendant plusieures semaines. Enfin, à la fin des expériences, ils subiront une chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil en vue du prélèvement du cerveau.
Impact sur les animaux
Ces animaux sont soumis à différents actes expérimentaux dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Les nuisances attendues sont celles liées à la manipulation lors des tests comportementaux, et celles suite à la chirurgie qui comprennent un possible risque d’inflammation ou d’infection, des douleurs, l’apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée, une perte des points de suture avant cicatrisation complète.
Devenir
Les animaux ayant complété la procédure expérimentale seront mis à mort afin de prélever leurs cerveaux afin d'effectuer des analyses post mortem.
Remplacement
L'utilisation d'animaux se justifie du fait que les processus attentionnels sont des processus cognitifs et comportementaux qui ne peuvent pas etre étudiés sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro ou in silico, et qu'il n'existe pas encore de modèles mathématiques permettant de les modéliser.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire au projet est réduit au minimum. Un effectif de 15 rats par groupe est un compromis rationnel, compte tenu de l’exigence éthique de réduction du nombre d’animaux et des contraintes expérimentales propres au projet. En effet, pour que nos expériences soient concluantes au plan statistique, il faut obtenir un effectif final minimum de 12 individus. Etant donné que le pourcentage d’attrition est estimé à 20% en fin d’expérience, il faut démarrer l’expérience avec un groupe de 14 rats. Enfin, les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques paramétriques, principalement des analyses de variance, avec comparaisons inter-groupes et mesures répétées, suivies de tests a posteriori.
Raffinement
Les animaux sont logés par groupe dans des cages munies d’un environnement enrichi. Toutes les chirurgies sont réalisées sous analgésie et anesthésie et sont effectuées en conditions aseptiques, sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l'animal est réhydraté et placé sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture pour faciliter sa récupération. Les animaux sont ensuite replacés avec leur congénères et feront l'objet d'une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter le plus rapidement possible les éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et de pouvoir y remédier rapidement. Toutes les procédures sont effectuées par du personnel formé.
Choix des espèces
Le choix du rat de laboratoire constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche de l’homme d’un point de vue phylogénétique (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 MYA) pour servir de modèle animal valide des processus cognitifs par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (e.g., invertébrés) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (e.g., primates non-humains). Les espèces invertébrées (e.g., C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider les mécanismes neuronaux ou génétiques de certains comportements cognitifs mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’homme pour constituer des modèles animaux valides de la cognition et de l'attention. Chez l'Homme, les troubles de l'attention sont une pathologie qui se manifeste tôt dans la vie d'un individu et qui a des répercussions importantes tout au long de la vie adule de l'individu. Dans ce projet, les animaux utilisés seront de jeunes adultes en fin d’adolescence en début d’expérience (i.e., âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité au développement de troubles attentionnels.
Le récepteur 5-HT4 comme biomarqueur de vulnérabilité, de résilience et de réponse aux antidépresseurs dans un modèle de stress social chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Mises en présence d'une souris dominante cinq à dix minutes par jour pendant dix jours, les souris subissent des attaques physiques et développent évitement social, anxiété et perte de motivation, effets attendus qui persistent plusieurs semaines après la fin du protocole. 364 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles passent huit tests comportementaux à deux reprises, reçoivent un antidépresseur pendant cinq semaines et sont anesthésiées une heure par examen d'imagerie TEP, l'objet réel étant de valider un traceur radioactif du récepteur 5-HT4 avant son usage chez l'être humain. Le porteur présente la TEP comme une méthode "ne nécessitant pas de mise à mort des animaux" et permettant leur réutilisation, alors que toutes les souris sont tuées et leur cerveau prélevé.
Objectifs
Les troubles mentaux liés au stress représentent des conditions souvent chroniques, particulièrement prévalentes et incapacitantes. La dépression, en particulier, est l’une des principales causes de morbidité dans le monde, produisant les coûts socio-économiques associés à la santé parmi les plus importants. Si les interventions pharmacologiques peuvent être bénéfiques, une part significative des patients (30 à 40%) sont résistants à ces traitements. Du fait de la grande hétérogénéité nosographique de la dépression et des profils de réponse aux traitements très variables, il est urgent de développer des biomarqueurs permettant la compréhension des mécanismes de résistance aux traitements. Dans ce cadre, les récepteurs de la sérotonine 5-HT4 présentent un grand intérêt pour affiner le diagnostic, le développement de thérapies innovantes ainsi que leur suivi. Ce projet vise donc à évaluer précisément la pertinence du récepteur 5-HT4 en tant que biomarqueur et cible thérapeutique dans les troubles dépressifs. Ainsi, après avoir développé un radiotraceur fluoré qui permettra de quantifier in vivo l’expression du récepteur 5-HT4, notre objectif sera de tester le potentiel du radiotraceur du récepteur 5-HT4 en tant que biomarqueur de vulnérabilité, d’état et/ou de réponse au traitement dans le modèle de dépression, le stress de défaite sociale (SDS) chez la souris, grâce à l’imagerie longitudinale in vivo par tomographie par émission de positons (TEP) et à une cartographie à haute résolution post-mortem de l’expression cérébrale du récepteur 5-HT4 avec un microscope scanner de lames. En combinant chez la souris des marquages immunofluorescents et l’hybridation in situ, nous décrirons le profil d’expression à l’échelle cellulaire et anatomique du récepteur 5-HT4, pour l’instant peu connue, ainsi que les changements qualitatifs et quantitatifs associés au modèle. Ces objectifs vont donc définir précisément si les profils d’expression du récepteur 5-HT4 peuvent représenter dans le modèle (a) un marqueur prédictif de vulnérabilité, (b) un marqueur d’état dépressif et/ou (c) un marqueur de réponse au traitement, apportant ainsi des connaissances primordiales pour le raffinement d’outils thérapeutiques ciblés et l’utilisation du traceur en clinique.
Bénéfices attendus
La modulation du système sérotoninergique demeure la première cible thérapeutique dans la dépression. Cette efficacité est cependant relative et imparfaite. Une hypothèse majeure pour expliquer cette variabilité d’efficacité thérapeutique est la grande complexité des différents récepteurs cellulaires de la sérotonine, avec 14 sous-types de récepteurs, des localisations cérébrales différentes, et des effets antagonistes en fonction du sous-type de récepteur. Un certain nombre d’études a récemment mis en avant que le récepteur 5HT4 pourrait avoir un rôle déterminant dans l’action antidépressante. Cependant, ces études n’ont pas été réalisées sur des modèles comportementaux pertinents, aucun marqueur moléculaire du récepteur 5HT4 cliniquement viable n’est disponible chez l’homme, et la cartographie cellulaire de ce récepteur est très mal caractérisée. Les bénéfices de ce projet seront donc multiples, il permettra 1) de valider le développement d’un radio ligand spécifique du récepteur 5HT4 chez l’animal, étape nécessaire avant son déploiement chez l’homme, 2) de préciser le potentiel du récepteur 5HT4 comme marqueur de la vulnérabilité au stress, 3) préciser les effets du stress sur l’expression de ce récepteur, 4) étudier comment l’expression de ce récepteur est affectée par mais également prédictive de la réponse thérapeutique à un antidépresseur. A long terme ce projet aboutira donc sur des connaissances fondamentales avec une translation possible directe vers la clinique.
Procédures
Mise en contact de souris expérimentales mâles et femelles avec des souris dominantes pendant 5 à 10 minutes par jour pendant 10 jours (Defaite sociale) 8 tests comportementaux seront réalisés à 2 reprises par animal (avant et après traitement), et chacun dure entre 5 ou 30 minutes suivant le test. Un traitement antidépresseur sera administré par voie orale 1 fois par jour pendant 5 semaines. Les souris seront anesthésiées par voie respiratoire pour les imageries TEP qui durent environ 60 minutes. A la fin de la procédure, les souris pourront ensuite être perfusées sous anesthésie générale ce qui entrainera leur mort.
Impact sur les animaux
Modèle de stress sociale : Le risque principal de ce modèle est un stress et dominance physique sur la souris lors de l’interaction avec une souris dominante (En cas de blessure, la souris est prise en charge par les expérimentateurs) Nous attendons également des répercussions psychiques et observables sur le comportement de la souris et permettant de modéliser la dépression : Augmentation des comportements de type évitement social et anxiété, persistance tout au long du protocole et quelques semaines après la fin. Perte de motivation ou plaisir, altération du poids et troubles du sommeil.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures et leur cerveau sera prélevé pour des études ultérieures
Remplacement
A ce jour, aucune méthode in vitro n’est disponible pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux
Réduction
Les effectifs sont calculés et optimisés de manière à utiliser un minimum d’animaux tout en conservant une grande puissance statistique. Il faut également que la taille d’effectif soit suffisante pour tenir compte de la variabilité inter-individuelle.
Raffinement
Les conditions d’élevage seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (papier absorbant, cabanes et/ou tubes). Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique jusqu’à la disparition des signes de douleur. En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Une surveillance accrue est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être et intervenir si nécessaire (injection de serum physiologique pour l’hydratation, nourriture appétente). Les expérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués : les animaux surveillés sont pesés et auscultés quotidiennement. La décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine. Dans ce cas, une euthanasie sera réalisée afin d'éviter toute souffrance supplémentaire. La neuroimagerie TEP est une méthode de nécessitant pas de mise à mort des animaux, c’est une méthode idéale permettant un suivi longitudinal et une réutilisation des animaux dans une autre expérience. Cette procédure est intégralement réalisée sous anesthésie afin de diminuer le stress que pourrait engendrer le dispositif. De plus, cette procédure est réalisée en collaboration un personnel hautement spécialisé dans l’imagerie TEP sur petit animal
Choix des espèces
Le choix de la souris est un modèle pertinent pour notre problématique. L’étude du cerveau de la souris s’avère être un modèle très puissant pour l’étude des fonctions cognitives, troubles mentaux du cerveau humain. En effet, il y a une grande homologie génétique dans le développement du cerveau, se traduisant également par une analogie des aires cérébrales et des mécanismes neurobiologiques. Dans cette étude nous utiliserons de souris adultes.
Réseaux neuronaux contrôlant le système moteur pendant le sommeil paradoxal murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
37 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux opérations du cerveau de deux à trois heures, pour une partie d'entre elles une privation de sommeil paradoxal de 48 heures, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie qui permet de prélever le cerveau. L'objet déclaré est de cartographier les réseaux nerveux responsables de la paralysie musculaire du sommeil paradoxal, sans application clinique annoncée à court terme. Le porteur reconnaît que les organoïdes, les cultures sur puces et la modélisation informatique se développent, mais conclut qu'ils ne constituent "pas encore d'alternatives crédibles", et qualifie d'"indispensable" l'isolement des souris en barils individuels pendant une dizaine de jours.
Objectifs
Le sommeil paradoxal est commun à tous les mammifères incluant les humains. Il se caractérise par une forte activité cérébrale semblable à celle de l’éveil mais paradoxalement associées à une paralysie musculaire, expliquant notre immobilité pendant la nuit. De récentes recherches expérimentales chez le rongeur ont identifié les mécanismes nerveux qui conduisent à cette paralysie réversible de nos muscles. Des atteintes neurodégénératives peuvent cibler ces réseaux de neurones provoquant alors une maladie, le trouble comportemental en SP, qui est un signe diagnostic précoce de la maladie de Parkinson ou la maladie à corps de Lewy. Chez ces patients endormis, les muscles ne sont plus paralysés favorisant la survenue de mouvements violents et incontrôlés qui reflèteraient le contenu de nos rêves. En revanche, nous ne savons toujours pas comment et où dans notre cerveau ce sommeil particulier est généré. Ce projet a pour ambition de progresser sur ces questions d’apparence fondamentale mais qui sont un prérequis pour comprendre ses fonctions physiologiques et cognitives, et ses dysfonctionnements dans de pathologies neurologiques assez fréquente comme le trouble comportemental en SP, la narcolepsie, le syndrome des jambes sans repos ou les apnées/ronflements du sommeil. Dans ce contexte, notre stratégie expérimentale repose sur la spécificité fonctionnelle dorénavant solidement établie des mécanismes nerveux impliqués dans la paralysie et l’utilisation de nouveaux outils génétiques, moléculaires et viraux pour circonscrire chez la souris la(s) parties du cerveau activée(s) pendant le SP et capable(s) de controler la paralysie musculaire. La description fine de ce substrat anatomique et fonctionnel devrait ouvrir des champs d’investigations nouveaux dans le domaine de la physiologie du SP et de ses pathologies.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à renforcer les connaissances sur les réseaux neuronaux et les mécanismes neurobiologiques sous-jacents à l’apparition et la régulation du SP. A ce jour, beaucoup de structures ont été identifiées comme pouvant moduler les différents paramètres du SP mais aucun réseau permettant de faire le lien entre elles n’a solidement été décrit. Nous avons précédemment confirmé que la voie SLD vers vmM génère l’atonie musculaire spécifique à l’état de SP chez la souris. Il reste à utiliser cette porte d’entrée préférentielle et solide vers les réseaux du SP. Ainsi, ce projet vise à identifier les structures projetant sur la voie SLD vers vmM tout en confirmant leur implication dans l’état de SP. Ces connaissances fondamentales sont susceptibles d'ouvrir sur le long terme des pistes pour comprendre comment le SP est généré par le cerveau, un prérequis à l’étude de ses diverses fonctions vitales.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Une ou deux interventions chirurgicales sous anesthésie de 2h à 3h selon la procédure - Période de récupération post-opératoire de durée variable selon la procédure - Protocole de privation/rebond de sommeil paradoxal de 48h pour la procédure 3 précédant mise à mort - Perfusion intracardiaque sous anesthésie en fin de procédure avec prélèvement de biopsies
Impact sur les animaux
Les procédures sont classifiées de sévérité modérée. Selon la procédure, les souris subiront une ou deux interventions chirurgicales sous anesthésie, d’une durée variant de 2 à 3h. Ces interventions entrainent une douleur modérée, traitée efficacement par administrations médicamenteuses adaptées avant, pendant et après l’intervention chirurgicale. Pour les enregistrements du sommeil, les souris devront être isolées en barils individuels jusqu’à la fin de la procédure. Nous n’attendons pas de dérèglement du cycle veille-sommeil grâce à la période d’habituation à l’isolement social en barils individuels. Cependant, nous serons vigilants pour détecter d’éventuels signes de mal-être liés aux procédures.
Devenir
Tous les animaux subiront le processus d’euthanasie pour collecter et préserver les tissus cérébraux afin de réaliser des études d’anatomopathologie et d’immunohistochimie.
Remplacement
Il est impossible d’étudier une fonction vitale comme le sommeil hors d’un organisme vivant. Aussi, les modèles animaux demeurent essentiels pour reproduire, comprendre et modéliser des mécanismes neurobiologiques complexes. La souris est particulièrement bien adaptée aux études neurophysiologiques (faible prise de poids et de volume corporel avec l’âge, lignées génétiquement modifiées). Par ailleurs, ses mécanismes nerveux du cycle veille- sommeil sont communs à tous les mammifères, incluant l’homme. Des animaux moins évolués comme la mouche, le vers ou le poisson zèbre sont parfois utilisés (activité/inactivité) mais ils ne possèdent pas de sommeil paradoxal et leur cerveau ne présente pas la même complexité anatomique et fonctionnelle. D’autres méthodes prometteuses se développent comme la modélisation in-silico et l’intelligence artificielle, les cultures cellulaires sur puces ou les organoïdes mais elles ne constituent pas encore d’alternatives crédibles et pertinentes aborder des processus aussi complexes que le sommeil et comprendre des pathologies invalidantes qui l’affectent comme les apnées du sommeil, le ronflement, le trouble comportmeental en SP ou la narcolepsie. Par ailleurs, la dissection fine des réseaux neuronaux et de mécanismes complexes ne peut être abordée chez l’homme par les techniques globale mises en œuvre en recherche clinique (imagerie cérébrale). La compréhension de mécanismes neurobiologiques à l’échelle cellulaire et moléculaire nécessite la mise en place de techniques invasives, inapplicables pour l’heure chez l’homme.
Réduction
La détermination de la taille de l'échantillon est essentielle pour le succès et la reproductibilité des résultats dans toute étude scientifique. Notre estimation porte sur un besoin de 37 souris réparties en 3 procédures expérimentales. Les expériences proposées ont été conçues pour minimiser le nombre d'animaux tout en maximisant les effets statistiques. La taille de chaque lot expérimental a ete calculée et optimisée sur la base de nos propres études récentes chez la souris. Ces calculs prennent en compte les « erreurs et échecs » aux différentes étapes de chaque procédure expérimentale et la variabilité interindividuelle des paramètres physiologiques considérés, mais aussi la nécessité de ne pas compromettre la reproductibilité et la significativité des données obtenues (utilisation systématique de tests statistiques adaptés aux petits échantillons).
Raffinement
Pour minimiser le stress individuel et favoriser aussi longtemps que possible les interactions sociales, les souris dès réception seront hébergées par paire en cage conventionnelle ainsi que pendant les procédures quand cela est techniquement possible. Des enrichissements environnementaux seront mis en place systématiquement pour la durée des procédures pour entretenir leur bien-être. Les conditions d’hébergement, les soins post-chirurgies et les différentes étapes expérimentales seront contrôlés pour réduire le risque de détresse. Pour la partie physiologique du projet, les animaux seront hébergés en baril individuel pour une dizaine de jours seulement. Des enrichissements conventionnels (roue, coton, bâtonnet de bois, lanière de carton) seront fournis pour la fabrication du nid et limiter l’anxiété générée par cet isolement social indispensable. Les animaux seront suivis quotidiennement dès la phase post-opératoire pour optimiser leur récupération (médicaments adaptés si nécessaire, suivis du poids, de la mobilité et du comportement). Notre préoccupation est de détecter rapidement si certains paramètres physiologiques et comportementaux se dégradent pendant les procédures, constituant des points limites avec mise à mort pour prévenir une quelconque souffrance
Choix des espèces
Il s’agira de souris sauvages, jeunes adultes âgées 10-12 semaines au début des procédures. Elles auront donc atteint leur maturité cérébrale et fonctionnelle avec un cycle veille-sommeil stabilisé et consolidé. La souris a été largement utilisée dans la recherche sur le SP et constitue le modèle mammifère le plus adapté pour l’utilisation d’outils moléculaires, génétiques et cellulaires prévus pour ce projet. Ainsi, la compréhension des mécanismes régulant le SP à l’échelle cellulaire et moléculaire passe par des techniques invasives encore impossibles chez l’homme mais applicables chez la souris. Le SP est une caractéristique commune aux mammifères, incluant l’homme. Les modèles animaux alternatifs plus simples que la souris (mouche, poisson zèbre) parfois utilisés sont dépourvus de SP et ne sont donc pas pertinents pour comprendre le sommeil, ses fonctions et les pathologies qui l’affectent chez l’homme.
Rôle du microbiote intestinal dans la neuroprotection d’une supplémentation maternelle en polyphénols, dans le cadre de l’hypoxie-ischémie néonatale
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Gavés une fois par jour de leur naissance au septième jour, les ratons subissent ensuite une ligature de l'artère carotide gauche suivie de deux heures d'hypoxie, qui provoque une lésion cérébrale. Séparés de leur mère à plusieurs reprises, ils passent deux examens d'IRM sous anesthésie, l'un de 30 à 45 minutes, l'autre de deux heures, puis des tests de réflexes précoces, de mémoire et d'anxiété à six âges différents. 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour mesurer si des polyphénols donnés à la mère protègent le cerveau du nouveau-né par l'intermédiaire du microbiote intestinal. Tous sont tués pour prélèvement d'organes, le porteur précisant que les lésions cérébrales induites interdisent de les utiliser dans un autre projet.
Objectifs
L'hypoxie-ischémie néonatale est une condition qui se produit lorsque le cerveau d'un nouveau-né ne reçoit pas suffisamment de sang, ce qui réduit les apports en oxygène et en nutriments essentiels. Cette situation est préoccupante, car elle est responsable de 20 % des décès chez les nouveau-nés et d'un quart des cas de problèmes moteurs et cognitifs. Actuellement, la seule option de traitement disponible est l'hypothermie, mais près de la moitié des nouveau-nés ne réagissent pas bien à cette thérapie. Cela souligne l'urgence de trouver de nouvelles stratégies pour protéger le cerveau des bébés. Nos récentes téudes ont montré, chez le rat, que donner des polyphénols, des substances bénéfiques que l'on trouve dans certains aliments, aux mères pendant la grossesse et l'allaitement pouvait avoir un effet protecteur sur leurs petits après un épisode d'hypoxie-ischémie néonatale. Les ratons dont les mères avaient reçu des polyphénols avaient moins de lésions cérébrales et de meilleures capacités motrices et sensorielles que ceux dont les mères n'avaient pas été supplémentées. Les polyphénols semblent influencer la composition des bactéries présentes dans l'intestin, et il y a un intérêt croissant pour le lien entre ces bactéries et le cerveau. Pour mieux comprendre comment la protection d'une supplémentation maternelle avec des polyphénols fonctionne, ce projet vise à étudierl'impact de ces bactéries intestinales. L'objectif de cette recherche est donc de déterminer comment la supplémentation en polyphénols chez les mères peut aider à protéger le cerveau des nouveau-nés contre les effets de l'hypoxie-ischémie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - Avancées scientifiques : Le projet contribuera à une meilleure compréhension des mécanismes de neuroprotection associés à la modulation du microbiote intestinal par les polyphénols. Les résultats pourraient éclairer les interactions entre l'alimentation maternelle, le microbiote et le développement neurologique des nouveau-nés. - Innovation thérapeutique : L’étude explore une approche novatrice de neuroprotection basée sur la supplémentation en polyphénols et la transplantation fécale, ouvrant la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour prévenir ou atténuer les effets de l'hypoxie-ischémie chez les nouveau-nés. - Amélioration des soins néonataux : Les résultats de l'étude pourraient potentiellement mener à des recommandations cliniques pour la supplémentation en polyphénols chez les femmes enceintes, en particulier celles à risque de complications néonatales, contribuant ainsi à améliorer les soins néonataux.
Procédures
Gavages en vigile : durant 7 jours, 1 fois par jour, durée : 2 minutes Procédure chirurgicale sous anesthésie : une fois d'une durée inférieure à 10 minutes Examens d'imagerie résonance magnétique (IRM) sous anesthésie : 1 fois durée : 30 - 45 min et 1 fois 2 h Tests de comportement en vigile : réflexes précoces (durée : 5 min), mémoire (durée 10 min), anxiété (1 fois ; durée : : 10 min).
Impact sur les animaux
Les diverses séparation des ratons et de leur mère, induites pas la procédure expérimentale pourraient être source de stress pour la mère et les petits. Le gavage, réalisé de P0 à P7 pourrait entraîner un stress pour les ratons. Les transplants fécaux pourraient provoquer une gêne digestive (quelques heures) ou un inconfort physique (quelques minutes). Les anesthésies (examens IRM) pourraient induire une détresse cardio-respiratoire, du fait de la variabilité de la sensibilité aux anesthésiques. Une anesthésie prolongée pourrait mener à la déshydratation de l'animal. Suite à l'opération (HI), la plaie suturée pourrait s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser, ce risque est faible. La ligature de l'artère carotide commune gauche, couplée à l'hypoxie de 2 h, entraînera la formation d'une lésion cérébrale. Les différents tests comportementaux pourraient induire stress et anxiété pour les animaux.
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem. L'induction de lésions cérébrales par hypoxie-ischémie ne permettra pas d'utiliser les animaux pour un autre projet.
Remplacement
Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de déterminer le rôle du microbiote dans la neuroprotection contre l'HI induite par une supplémentation maternelle polyphénolique et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.
Réduction
Une réduction des animaux est rendue possible par le fait que l'imagerie par résonance magnétique est une technique d'investigation non-invasive qui permet un suivi des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.
Raffinement
Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés (7 jours) à leur arrivée et seront élevés en cage collective. Les chirurgies (HI) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les IRM sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardio-respiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.
Choix des espèces
Le rat est utilisé depuis plusieurs années dans ce modèle d'hypoxie-ischémie, ainsi de nombreux groupes témoins dans la littérature permettent de faire des comparaisons et limitent le nombre de témoins. De même nos précédents travaux nous permettent d'avoir déjà des données sur des groupes non-gavés, ce qui réduit le nombre d'animaux à inclure dans l'étude. Nous souhaitons suivre les animaux par IRM à 4 stades de développement : par IRM de diffusion afin d'évaluer l'effet neuroprotecteur précoce des traitements administrés en phase aigüe de la pathologie (3 h et 48 h après l'hypoxie ischémie), à 30 jours de vie afin d’évaluer les effets neuroprotecteurs à long terme et à 50 jours de vie, par IRM fonctionnelle, pour évaluer les effets de la neuroprotection sur le remodelage des circuits neuronaux et la récupération fonctionnelle. En parallèle, des tests comportementaux seront réalisés à 8, 10, 12, 24, 28 et 45 jours de vie afin d'évaluer les effets du microbiote dans la récupération fonctionnelle, dans un contexte d'hypoxie-ischémie néonatale.
Mise au point de l’injection intranasale comme méthode d’accès pharmacologique non-invasive au cerveau chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Une injection dans chaque narine, six secondes en tout, puis une perfusion de fixateur directement dans le cœur : 36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. L'objectif est de vérifier qu'une molécule fluorescente atteint la muqueuse olfactive et le bulbe olfactif, en vue de projets futurs sur l'obésité et le diabète. Le porteur revient cinq fois sur le caractère "non-invasif" de cette voie d'accès, alors que la validation du protocole passe par la mort de toutes les souris et le prélèvement de leur museau et de leur cerveau. Il indique que l'injection pourrait entraîner une gêne respiratoire, et prévoit trois minutes de pause entre les deux narines pour laisser l'animal récupérer de la contention.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de mettre au point une injection intra-nasale d'une molécule pharmacologique chez la souris. Cette voie de pénétration dans l'organisme par le museau de l'animal a le grand avantage d'être non-invasif.
Bénéfices attendus
En procédant à la mise au point de l'injection intranasale de l'exendine-4, cette étude pilote nous donnera la possibilité de maitriser une méthodologie de pénétration intracérébrale de cette molécule de manière non-invasive et ainsi de contribuer ultérieurement à mieux comprendre ses effets centraux.
Procédures
L'intervention consiste à procéder à une injection intranasale qui durera 6 secondes (2 * 3 secondes par narine).
Impact sur les animaux
L'injection intranasale pourrait entrainer une gêne respiratoire comme nuisance.
Devenir
Tous les animaux auront une perfusion intracardiaque de PFA 4% avant de procéder au prélévement des tissus (muqueuse olfactive dans le museau; bulbe olfactif dans le cerveau) afin de vérifier la présence de la molécule d'exendine-4 fluorescente. Cela permettra de valider le protocole d'injection intranasale non-invasive de ce produit pharmacologique chez les souris femelles et mâles.
Remplacement
Le but de ce projet pilote est de pouvoir injecter et faire pénétrer une molécule pharmacologique dans le cerveau par voie intranasale afin d'avoir une voie d'accès non-invasive. Cela nécessite un animal vivant et de procéder à une injection in vivo.
Réduction
Le nombre de souris pour ce projet pilote est réduit à son minimum afin d'avoir une preuve de concept méthodologique validée avant de travailler avec cette méthode non-invasive sur des projets futurs autour de l'obésité et du diabète dans les modèles murins. Ainsi, l'observation de la pénétration de la molécule fluorescente d'exendine-4 dans la muqueuse olfactive et le tissu cérébral après injection intranasale de 3 souris par sexe, par dose et par temps de pénétration constituera une preuve de concept méthodologique. 2 doses à 3 temps de pénétration pour chaque dose et l'étude des 2 sexes conduisent à 36 souris.
Raffinement
Toutes les souris seront acclimatées à l'animalerie pendant au moins une semaine avant de procéder aux expériences. Elles seront hébergées dans des cages avec enrichissement sensoriel (nid, bois à ronger, tunnel). Les animaux seront regulièrement examinés (poids, apparence, comportement). Les souris seront habituées à la contention avant la procédure expérimentale. Pour éviter tout problème respiratoire pendant l'injection intra-nasale chez la souris, il sera procédé à une injection par narine à la fois avec un temps de pause de 3 minutes entre chaque injection pour laisser le temps à la souris de récupérer de la première contention et également d'observer son comportement. Pour procéder à la perfusion intracardiaque avec une respiration et des battements cardiaques à l'arrêt, une euthanasie sera réalisée par injection intrapéritonéale d'une dose d'anesthésiant à dose élevée, précédée 15 minutes avant d'une injection intrapéritonéale d'un sédatif.
Choix des espèces
Nos souris sont très bien caractérisées à l'âge adulte au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, et représentent un modèle animal adéquat pour l'étude comme modèle d'étude des maladies humaines. De plus, nous avons l'expertise du suivi du bien-être de l'animal après injection, du phénotypage métabolique des souris.