Système nerveux

Le bord de la paupière est incisé puis suturé sur un œil de ratons qui n'ont pas encore ouvert les yeux, intervention de dix minutes sous anesthésie gazeuse et analgésie oculaire locale. Douze rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués ensuite pour prélever le tissu cérébral. L'œil reste fermé quatre, sept ou dix jours pour reproduire l'amblyopie humaine, la mère tentant régulièrement d'arracher les points sur ses petits, ce qui conduit le porteur à prévoir 25 pour cent d'échec. Le stade choisi correspond aux jours 13 à 24 après la naissance, période où le fonctionnement du système visuel dépend le plus de l'expérience visuelle.

Objectifs

Notre projet est de comprendre la capacité de transformation (plasticité) des neurones lors de l’adaptation à une différence de vision entre les deux yeux dans l’enfance afin de mieux traiter l’amblyopie, une perte de vision d’un œil, l’une des principales causes de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Ce n’est pas une maladie de l’œil, l’œil étant fonctionnel. Elle est due à une perte de la capacité des neurones à répondre aux signaux visuels en provenance de l’œil le plus faible ou déviant. L’acuité visuelle à la naissance est faible à cause de l’immaturité du système nerveux. Pendant une période précoce, chez le petit enfant où la capacité du système nerveux à se modifier en fonction de l’expérience du monde environnant est la plus grande, des différences de réfraction, d’alignement entre les deux yeux ou une opacité d’un œil amènent à un défaut de fonctionnement des neurones excités par les signaux provenant de l’œil faible. Le traitement, seulement possible avant 6-7 ans, se fait d'abord en corrigeant le défaut visuel, puis en rééduquant l’œil amblyope par pénalisation de l’œil dominant. Ce projet propose de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires des transformations neuronales induites par des signaux visuels discordants entre les deux yeux au cours du développement neuronal en mimant l’amblyopie sur le jeune raton, par suture d’une paupière avant l’ouverture des yeux.

Bénéfices attendus

L’amblyopie est un déficit visuel fonctionnel chez l’humain qui, s’il n’est pas traité dans une période de temps limité, avant 6-7 ans, est irréversible. C’est la principale cause de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Le but de ce travail est d’identifier les mécanismes neuronaux à l’origine de la perte de réponse du cerveau aux stimuli visuels dans l’objectif d’allonger la fenêtre thérapeutique au-delà de l’enfance.

Procédures

Le bord des paupières d’un œil de l’animal seront suturés avant l’ouverture des yeux. Le raton sera disposé sur un matelas chauffant sous anesthésie gazeuse profonde associée à une analgésie locale oculaire. Avant de procéder aux points de suture, une incision devra être faite sur le bord de la paupière pour permettre aux deux paupières de se coller l’une à l’autre durant le processus de cicatrisation. Après le réveil le raton sera remis à la mère. Durée totale de l’intervention : 10 minutes.

Impact sur les animaux

Suite à la procédure de privation visuelle monoculaire par suture des paupières, l’apparition d’effets indésirables sera contrôlée quotidiennement, en particulier : - risque d’infection au niveau des points de suture - risque d’arrachement des points de suture. Dans ces deux cas, l’animal sera écarté pour ne pas fausser les résultats expérimentaux et sera immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance.

Devenir

Euthanasie préalable au prélèvement du tissu cérébral sur lequel seront réalisées les expérimentations.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est indispensable dans le cadre de ce projet dans la mesure où il est nécessaire de priver le système nerveux d’entrées sensorielles au cours du développement. L’utilisation de culture de neurones est donc naturellement exclue.

Réduction

• Les structures cérébrales étudiées ne présentant pas de différences entre mâles et femelles, nous utiliserons les animaux des deux sexes ce qui limitera le nombre d'animaux à euthanasier. • Le temps de suture de 10 jours est le plus délicat à obtenir sans ouverture de l’œil, car il est connu que les sutures se relâchent au bout de quelques jours et que la mère des ratons tente d’enlever les points sur les petits non sevrés. Le travail étroit avec un vétérinaire qui interviendra et formera le personnel permettra de réduire le nombre d’essais et donc de réduire le nombre d’animaux. Notamment l'incision du bord de la paupière qui sera entrepris permettra une fermeture pérenne de la paupière supérieure avec la paupière inferieure et donc une diminution du taux d’échec et du nombre d’animaux. • L'analyse de l'expression des gènes nécessitera peu de tissu animal. A partir d’un cerveau de rat congelé, une quarantaine de coupes fines seront obtenues. Nous aurons besoin pour atteindre une significativité statistique pour chaque temps de privation monoculaire de lumière de 3 rats suturés pour chacune des 3 durées de suture. Nous prévoyons d’après notre expérience passée 25 % d’échec du maintien de la fermeture de l’œil. Nombre de rat = 3 rats suturés pour chacune des 3 durées (4, 7, et 10 jours) = (3 x 3) + 25 % = 12 rats

Raffinement

Pendant la suture de la paupière, les ratons seront maintenus sur un matelas chauffant sous anesthésie gazeuse profonde associée à une analgésie locale oculaire. Les ratons seront remis sous la mère immédiatement après le réveil post-anesthésie, et surveillé quotidiennement par un personnel expérimenté. Vérification sera faite que la mère les reprendra bien en charge lors du change des cages. Ils seront observés quotidiennement pour vérifier qu’ils sont bien nourris, que les sutures sont en place et bien tolérées. Nous utiliserons des morceaux de papier ciselé comme matériaux de nidification, des bûchettes en peuplier pour répondre aux besoins naturels des rongeurs ainsi que des tunnels en cartons pour réduire l‘ennui et diminuer le stress en stimulant l‘activité et en procurant un sentiment de sécurité aux animaux. Les animaux auront libre accès à la nourriture et à l’eau, seront maintenus à une température et une hygrométrie ambiante contrôlées avec un cycle lumière/obscurité artificielle de 12 h. En cas de problème lié à la suture (par exemple une infection) l’animal sera écarté du lot pour ne pas fausser les résultats expérimentaux et sera immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Le rat est le modèle animal le plus utilisé comme décrit actuellement dans la littérature pour l’étude des mécanismes neuronaux de la plasticité du système visuel. Entre les jours 13 et 24 postnataux, pendant la période critique de développement au cours de laquelle le fonctionnement du système visuel est particulièrement dépendant de la qualité de l’expérience visuelle dont bénéficie le sujet.

Des injections dans l'œil détruisent les cellules à mélanopsine de la rétine, une chirurgie cérébrale de trente à quarante-cinq minutes vient ensuite moduler une structure du cerveau. 546 Arvicanthis ansorgei, un rongeur diurne, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever rétine et cerveau. Dès l'âge de vingt jours et jusqu'à la fin des procédures, chaque animal est isolé dans une cage individuelle pour mesurer son activité locomotrice, puis placé quinze à vingt jours en obscurité constante, afin d'évaluer les effets d'une exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence. Le porteur annonce sept tests comportementaux "validés" sans préciser lesquels, et qualifie l'obscurité constante de procédure standard n'induisant "aucune nuisance".

Objectifs

Le cycle lumière/obscurité de 24 h synchronise l'horloge biologique du cerveau. La lumière a des effets positifs et négatifs selon ses caractéristiques (moment, durée, intensité, spectre, etc.). La littérature montre qu'une exposition aberrante à la lumière, notamment bleue la nuit, altère les rythmes, la cognition et induit des états dépressifs chez l'animal et l'Homme. Les cellules à mélanopsine de la rétine jouent un rôle clé dans la médiation de ces effets. La lumière pénètre dans l'organisme par la rétine, captée par par des cellules particulières, sensibles à la lumière bleue, convertissant le signal lumineux en un signal biochimique transmis aux structures cérébrales régulant les rythmes biologiques, l'humeur et la cognition. Les adolescents, plus sensibles à la lumière, présentent un risque particulier d'exposition nocturne à la lumière bleue, car les troubles mentaux surviennent souvent avant 25 ans. Nous émettons l’hypothèse que l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l'adolescence contribue au développement de troubles circadiens (par exemple un décalage du cycle veille sommeil ou un retard chronique à l'endormissement), affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Cette étude sera réalisée sur le modèle diurne Arvicanthis ansorgei, plus pertinent que les rongeurs nocturnes comme les rats ou souris. Les objectifs sont : 1) Étudier l'impact de la lumière bleue nocturne sur le système circadien, l'humeur et la cognition via des tests comportementaux validés. 2) Analyser les conséquences sur la rétine, son fonctionnement et ses projections cérébrales. 3) Caractériser les effets dans les régions cérébrales cibles des cellules à mélanopsine régulant ces systèmes. Cette analyse, de la cellule au comportement, aura des résultats déterminants pour la recherche fondamentale et clinique. Avenant : Nos résultats montrent que les animaux exposés à la lumière nocturne ont un retard de rythme biologique, indiquant une perturbation de leur horloge interne. Une procédure étudiera le rôle de la sérotonine dans cette perturbation. Une autre teste si cet impact affecte leur capacité à se réajuster après un changement d'heure. Enfin, une troisième examine si la lumière bleue nocturne les rend plus sensibles au stress.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de décortiquer l’impact de l'exposition à la lumière bleue nocturne pendant l’adolescence sur le développement des troubles circadiens, affectifs et cognitifs à l’âge adulte. Les données obtenues permettront d’élaborer de nouvelles stratégies pour limiter les effets délétères d’une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents.

Procédures

Pour définir l'impact d'une exposition nocturne à la lumière bleue, notre projet comporte 4 interventions. La première, l'électrorétinographie (ERG), évalue la fonction visuelle. Le test est similaire à celui chez l'homme, mais l'animal est endormi pendant l'enregistrement. Chaque test dure 45-60 min, avec deux passages : un avant et un après l'exposition à la lumière pour évaluer son impact. Ensuite, les animaux passeront 7 tests comportementaux validés pour étudier l'impact de la lumière sur leur système circadien, l'humeur et la cognition. La durée d'un test varie, mais chaque animal est testé environ 5 min. Pour étudier le rôle des cellules à mélanopsine rétiniennes, les animaux recevront des injections oculaires : une avec un "traceur" pour marquer les projections rétiniennes vers le cerveau, et une seconde avec des molécules pour cibler spécifiquement les cellules à mélanopsine et les détruire. Ces injections se font sous anesthésie et analgésie. Enfin, pour vérifier l'implication d'une structure cérébrale régulant l'humeur et la cognition, une chirurgie sera réalisée sous anesthésie. Des molécules pharmacologiques seront injectées pour moduler l'activité de cette structure. La procédure dure entre 30 et 45 min. Après récupération, un activateur de ces molécules sera injecté dans la cavité abdominale pour inhiber certains neurones. Avenant : suite aux premiers résultats, les animaux recevront une injection (moins d'une minute par animal) sur animal vigile pour bloquer un messager chimique spécifique. Ils subiront ensuite des changements de cycle lumineux. D’autres animaux seront soumis à des cycles lumineux simulant des décalages horaires ou à du stress par immobilisation (quotidiennement, pendant 2h maximum, et sur 3 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent être soumis à différentes interventions, susceptibles de causer des nuisances: 1) Impact généré par l'exposition à la lumière : nous nous attendons à une altération du système circadien, visuel, de l’humeur et de la cognition (objet même de la question). 2) A partir de 20 jours d'âge et jusqu’à la fin des procédures, les animaux seront placés individuellement dans des cages afin de mesurer le rythme de leur activité locomotrice en continu. L’isolement de l'animal sur une longue période est susceptible d’induire du stress chez les rongeurs. 3) Afin d’évaluer les paramètres de leur horloge biologique, les animaux seront placés pendant 15-20 jours à l’obscurité constante. Le placement de l’animal en obscurité constante est la procédure standard utilisée afin d’évaluer le fonctionnement endogène du système circadien, ce qui n‘induira aucune nuisance. 4) Pour étudier l’impact de la lumière sur l’humeur et la cognition, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux susceptibles d’induire du stress. 5) Les animaux seront soumis à différents types d'injections, toutes réalisées sous anesthésie. 6) Les animaux seront également soumis à une technique d'électrorétinographie (ERG - permettant d'évaluer la fonction visuelle) susceptible d’induire des anomalies oculaires dans certains cas (inflammation, infection, rougeur, opacité…). 7) Les animaux seront soumis à une exposition à des cycles lumineux perturbants, et à une immonilisation pouvant provoquer du stress, des perturbations physiologiques, un incofort temporaire et une altération du comportement. avenant : l’administration de molécule dans l'abdomen peut causer une légère douleur et un inconfort temporaire à l’endroit de l’injection. Le décalage horaire simulé (jet lag) peut créer du stress, perturber leur activité et nuire à leur sommeil. Ces effets peuvent durer entre 10 et 15 jours, selon la rapidité avec laquelle l’animal se réajuste. Enfin, l’immobilisation peut provoquer une douleur, du stress, des comportements inhabituels, comme des bruits ou de l’agitation, une réduction de l’activité, une perte de poids ou un manque d'appétit. Ces effets varient en fonction de l'animal et de la durée et de l'intensité de l'immobilisation.

Devenir

Suite à l'ensemble des procédures les animaux seront mis à mort, les organes tels que la rétine et le cerveau seront prélevés afin de réaliser des analyses post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est d’évaluer l’impact d’une exposition aberrante à la lumière durant l’adolescence sur le système circadien, visuel, la cognition et l’humeur. A ce jour, il n’est pas possible de modéliser informatiquement les différentes structures du cerveau sur lesquelles reposent ces fonctions, ni de reconstruire l’ensemble des structures impliquées, de la rétine aux régions cérébrales cibles, ce qui nécessite donc d’avoir recours au modèle animal. Le projet nécessite la réalisation d’expériences dans un environnement intégral, à l’échelle de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé par méthode mathématique à l'aide de logiciels conçus à cet effet et sur la base notre connaissance du modèle de rongeur utilisé, des techniques mentionnées et de nos expériences à ce sujet, ainsi que sur la littérature scientifique actuelle. De plus afin de réduire le nombre total d'animaux: - Nous utilisons certaines approches non invasives (tests comportementaux) et longitudinales (ERG) ne conduisant pas à la mise à mort de l'animal. - Plusieurs prélèvements de tissus ainsi que certaines mises au point techniques seront réalisés chez le même animal. L'effet délétère de la lumière bleue sera évalué entre les groupes par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux tout au long des procédures. - Durant toute la durée des procédures les animaux seront placés individuellement dans des cages dans une pièce avec d'autres animaux isolés. Les animaux peuvent se voir et ont accès aux odeurs et bruits générés par leurs congénères. Ils restent ainsi en contact visuel et olfactif avec leurs congénères hébergés dans la même pièce. De plus, pour pallier à l'isolement des animaux, un enrichissement est apporté dans chaque cage (matériel de nidification et baton à ronger). Les procédures considérées comme invasives seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Durant ces procédures la température de l’animal sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Les animaux sont ensuite suivis tous les 2 jours à l’aide d’une grille de score permettant d’objectiver différents paramètres (apparence, poids, examen clinique, comportement) et d’établir des points limites permettant d’interrompre les procédures et donc de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le choix de notre modèle animal s'est porté sur l'espèce de rongeur Arvicanthis ansorgei. En effet, notre étude multi-échelle (allant du comportement à la cellule) vise à identifier les effets délétères d'une exposition aberrante à la lumière bleue chez les adolescents (P20), afin in-fine, d'élaborer de nouvelles stratégies pour limiter son impact. Il semble donc plus pertinent d'utiliser un modèle diurne (période d'activité le jour, période de repos la nuit), comparable à la physiologie de l'homme. L’objectif du projet est d’exposer les animaux à de la lumière bleue nocturne à l’adolescence (P20) et d’évaluer ensuite les conséquences de cette exposition sur le système circadien, l’humeur et la cognition au stade adulte (P40).

Du chocolat administré au début de la phase de sommeil pour empêcher 90 souris de dormir, des électrodes qui détruisent au courant électrique les neurones du noyau suprachiasmatique : 674 souris et 284 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Les interventions chirurgicales durent de trente minutes à une heure et se répètent, avec pose d'un cathéter dans la veine du cou, injections de virus dans le cerveau, tests de comportement et de sommeil à 3, 6 et 12 mois. Certains animaux passent deux semaines isolés pour mesurer la perturbation de leurs rythmes, dans des cages transparentes voisines qui leur permettent de voir leurs congénères. Le porteur retient souris et rats pour comparer deux physiologies, garde les animaux jusqu'à 18 mois après le début des expériences et n'en laisse survivre aucun, y compris dans les groupes témoins.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer est la démence la plus fréquente chez les personnes âgées dont la prévalence augmente exponentiellement après 65 ans et qui touche 23% de la population après 80 ans. Compte tenu du vieillissement démographique, le nombre de personnes touchées pourrait doubler d’ici à 2050. Comprendre le développement de la maladie est donc primordial. Cette démence se caractérise en partie par une accumulation et une agrégation d'une protéine, la protéine Tau, provoquant la dégénérescence des neurones touchés. Les atteintes cérébrales sont variées : hippocampe, cortex, … mais également l’hypothalamus et en particulier les neurones du Noyau Supra-Chiasmatique (NSC) impliqués dans le contrôle des rythmes circadiens (rythme biologique qui régule l'alternance veille/sommeil). Les troubles du sommeil représenteraient un marqueur précoce de la maladie avant l’apparition des troubles cognitifs mais également un facteur de risque. Notamment, il a été montré qu’une privation de sommeil chez l’animal et chez l’Homme conduit à une élévation des protéines Tau toxiques dans le liquide céphalorachidien. De plus, le travail de nuit, occasionnel ou habituel, qui concerne environ 15% des salariés en France soit 3,5 millions de personnes, constitue une préoccupation majeure de santé publique du fait des effets sanitaires divers qui lui sont associés, en particulier des troubles cognitifs et d’une augmentation du risque de démences. En outre, il a été montré récemment que les cellules bordant le troisième ventricule du cerveau, nommées les tanycytes, étaient également dégradées dans la maladie d’Alzheimer. Or, ces tanycytes pourraient être impliquées dans la clairance de la protéine Tau contenue dans le liquide céphalorachidien. De plus, il a été récemment suggéré que les neurones du NSC pourraient communiquer avec les tanycytes pour réguler certaines fonctions circadiennes.

Bénéfices attendus

Le projet apportera une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux impliqués dans l’arrivée de la maladie d’Alzheimer. Les résultats de ces recherches pourraient permettre d’évaluer l’impact des troubles du sommeil ou les horaires de travail décalés sur le développement de la maladie d’Alzheimer et également d’autres démences, et ainsi aider les autorités sanitaires à mettre en place des actions afin de limiter ces facteurs de risques. D’autre part, la dégradation des tanycytes et le manque de nettoyage du liquide céphalorachidien au cours des phases de sommeil profond par ces cellules spécialisées, les tanycytes, pourraient être à l’origine d’autres pathologies et ouvre la voie à de nouvelles recherches. En effet, l’accumulation d’autres protéines dans le liquide céphalorachidien, tel que l’Orexine, pourrait être responsable de troubles métaboliques observés chez les personnes ayant des troubles du sommeil ou en travail posté.

Procédures

Un premier groupe d'animaux (100 souris/100 rats) sera nécessaire pour étudier les changements des tanycytes induits par une lésion des NSC. Une chirurgie cérébrale détruira les neurones des NSC par l’introduction d’électrodes qui envoient un courant électrique. Ces animaux subiront une deuxième chirurgie 2 semaines après afin d'injecter dans le cerveau une protéine Tau fluorescente et un cathéter sera placé dans la veine du cou afin d'effectuer des prélèvements de sang réguliers. Les animaux seront euthanasiés 10 jours après, soit au total 24 jours après le début des expériences afin de prélever les cerveaux et étudier leurs morphologies. Un deuxième groupe d'animaux sera utilisé pour vérifier l'impact d'une perturbation du rythme circadien (travail posté, mauvais sommeil) sur les fonctions cognitives des souris soit par lésions des NSC, soit par une manipulation environnementale. Un premier sous-groupe de 240 souris (90 souris sauvages, 90 souris modèles de la maladie d'Alzheimer et 60 souris contrôles) subiront une chirurgie de lésion cérébrale des NSC; un deuxième sous-groupe (90 souris avec chocolat en phase de sommeil et 60 souris contrôles avec chocolat en phase de veille) se verra administrer un aliment appétant (chocolat) au début de la phase de sommeil afin de les empêcher de dormir. Toutes ces souris seront testées 3, 6 et 12 mois après par des tests de comportements et par des tests du sommeil. Un troisième groupe d'animaux sera utilisé pour étudier un changement des gènes dans les tanycytes à court et à long terme induit par une lésion des NSC sur 80 souris et 80 rats. Les animaux subiront une lésion des NSC puis après 1, 3, 6, 12 et 18 mois, une chirurgie cérébrale permettra l'injection d'un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Ces animaux seront euthanasiés 2 semaines après l'injection du virus pour des expériences de transcriptomique. Un quatrième groupe d'animaux permettra de voir l'impact de l'activation ou l'inhibition des neurones des NSC à la fois sur la morphologie et sur la modification des gènes des tanycytes. Deux sous-groupes (52 souris et 52 rats chacun) auront une injection cérébrale de virus permettant d’activer ou d’inhiber sélectivement les neurones des NSC et un virus qui rendra les tanycytes fluorescents. Deux semaines après l’injection cérébrale, les animaux seront mis à mort 30min après l’activation ou l’inhibition des neurones. Chacune des interventions chirurgicales durera entre 30 minutes et 1 heure.

Impact sur les animaux

Toute manipulation des animaux peut provoquer du stress, de la fatigue et de l’inconfort et des mesures de raffinement seront mises en place pour les limiter au maximum. En particulier, les expériences de chirurgie ou de prélèvements de sang sont faites sous anesthésie générale avec l'administration d'analgésique pour éviter toute douleur à l'animal lors de son réveil. Afin d’évaluer la perturbation des rythmes circadiens, il sera nécessaire d’isoler les animaux individuellement pendant 2 semaines (évaluation du poids, de l’absorption d’eau et d’aliments, expériences d’optogénétique). Cet isolement reste limité et sera effectué dans des cages transparentes à coté les unes des autres afin de permettre à chaque souris/rat de voir ses congénères. La lignée de souris transgéniques est une lignée de souris mimant la maladie d'Alzheimer. Ce modèle murin développe une perte des fonctions cognitives progressives, à partir de l’âge de 3 mois, avérée à 6-7 mois et maximale à 12 mois. Ces animaux n'ont pas de problème de déplacement et ne souffriront pas de cette pathologie. D’autres manipulations seront effectuées sur les animaux vigiles : des tests de comportement (sur 390 souris) consistant à déterminer l’activité locomotrice, l’anxiété et le stress des souris ou les performances cognitives. Ces expériences n’entraînent aucune douleur, mais peuvent générer du stress suite aux manipulations; les expériences seront réalisées par le même manipulateur et une habituation est effectué avant chaque test. Les molécules (anesthésiques, analgésiques, activateur/inhibiteur) devront parfois être injectés dans le péritoine de l’animal et nécessiteront la contention et l’injection de l’animal; un analgésique local peut être utilisé pour limiter la douleur de l'injection.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés dans chacune des procédures sera euthanasié à terme même ceux qui servent de contrôles. La durée maximale de conservation des animaux après le début des expériences est de 18 mois. Les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude pour faire des analyses de transcriptomique ou étudier la morphologie des populations cellulaires, par l’injection d'une euthanasiant chimique.

Remplacement

Les expériences prévues ont été planifiées en tenant compte de la règle des 3R. L’étude des communications entre différentes régions cérébrales nécessite, en particulier au niveau du cerveau, d’utiliser des organismes entiers. Aucun système cellulaire n’est capable à l’heure actuelle de mimer toutes les interactions entre différentes régions cérébrales et les influences périphériques. Les tanycytes de l’éminence médiane sont des cellules placées au cœur d’une région cérébrale impliquée dans la régulation des fonctions endocrines et préserver l’influence des différentes parties de l’organisme sur cette communication cérébrale est indispensable pour notre projet. Les modèles de rongeurs rats et souris sont donc pertinents pour ce type d’étude et permettront une étude comparée des deux espèces ayant des physiologies différentes.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est calculé de façon à avoir un nombre minimal et homogène d’animaux et que ce nombre soit suffisant pour une analyse statistique. Le calcul du nombre d’animaux est basé sur un calcul statistique d’effectif (seuil de significativité de 5%, puissance égale à 85%, différence entre les moyennes de 15 et écart-type de 10) pour une comparaison entre deux lots et un test statistique bilatéral. Ce calcul évalue le nombre minimum de souris par groupe entre 6 et 10.

Raffinement

Le raffinement est obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses, la formation du personnel, un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, le recours à des procédures non invasives et non douloureuses, le suivi des signes cliniques et des points limites, le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, le suivi post anesthésie de l’état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux. Différentes mesures sont prises pour réduire le stress, l’inconfort et la douleur. * Les animaux sont manipulés individuellement, et dans le calme, afin de limiter tout stress des animaux non manipulés. Ils seront également habitués à la manipulation. * Les manipulations (administrations et sacrifices) s'effectuent à distance des autres animaux. * Les hébergements seront enrichis. * Pour les prélèvements sanguins, les animaux sont anesthésiés dès que possible par anesthésie gazeuse. *Une surveillance quotidienne est effectuée afin de détecter le plus tôt possible une éventuelle souffrance (suite à l’infection). En cas de signes cliniques défavorables et/ou si une perte de poids supérieure à 20% survenait, les animaux concernés seront mis à mort par un euthanasiant chimique. La souffrance, la détresse, l’inconfort des animaux de laboratoire seront évalués en se basant sur les cinq paramètres suivants : 1. variation du poids de l’animal 2. apparence physique externe (horripilation, accélération de la respiration, tremblements, consistance anormale des fèces associée à une distension de l’abdomen) 3. signes cliniques mesurables (hypothermie) 4. changement du comportement (diminution des soins, animal prostré) 5. réponses comportementales aux stimuli externes (réaction violente de douleur associée à des vocalisations) Un stress momentané est possible suite aux manipulations mais celui-ci sera réduit grâce aux bonnes pratiques de la préhension des animaux.

Choix des espèces

L’utilisation du modèle rongeur est essentielle pour décrypter les mécanismes impliqués dans le développement de la maladie d’Alzheimer. La communication entre différentes populations cérébrales impliquées nécessite l’utilisation de l’animal entier. Par ailleurs, la possibilité d’utiliser des souris transgéniques THY-Tau22 mimant le déclin cognitif est un plus et nécessite l’utilisation de souris transgéniques et wild-type. L’utilisation des technologies DREADD et d’optogénétique nécessite également l’utilisation de souris et de rats, technologies aujourd’hui indispensables pour moduler des populations neuronales et en déduire leurs fonctions. La physiologie des souris et des rats étant différente, il nous parait nécessaire d'étudier dès que possible ces 2 espèces afin de permettre leur comparaison. Tous les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux adultes de 8 semaines à 21 mois. Toutes les expériences démarreront à l’âge de 8 semaines et se poursuivront sur 14 ou 24 jours pour les études à court-terme, ou sur 3 mois, 6 mois, 12 mois et 18 mois pour les études sur le long-terme (au maximum, les animaux seront âgés de 20,5 mois).

Tués à la fin des procédures pour vérifier l'emplacement des marqueurs dans leur cerveau, 576 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie cérébrale d'environ une heure trente, puis une tâche comportementale d'une heure par jour pendant trois mois, sous rationnement alimentaire maintenu pendant la même durée pour le garder à 90 ou 95 % de son poids. Le porteur qualifie l'impact de ce rationnement de très faible, une "légère sensation de faim" qui garantit la motivation à obtenir une récompense. L'objectif déclaré est de comprendre les circuits neuronaux de la décision entre choix familiers et choix nouveaux, et le porteur conclut que ces fonctions cognitives ne s'étudient que sur des "organismes entiers".

Objectifs

Tous les jours nous prenons des décisions qui peuvent être familières ou non. Les décisions familières sont celles qui ont déjà été prises auparavant et dont l’issue est prévisible. Au contraire, les décisions non familières sont celles auxquelles on n’a jamais fait face auparavant et pour lesquelles on a peu ou pas d’expérience. Lorsque l’on fait face à une décision non familière, il faut alors utiliser nos expériences de choix passées pour guider nos actions, par exemple on peut admettre une proposition en raison de son lien avec une proposition préalablement tenue pour vraie. Ainsi, lorsque l’on a déjà pris une décision dans laquelle A>B et C>D, on peut se référer à cette situation passée lorsque l’on fait face à une nouvelle décision non familière entre B et C. Le but de ce projet est de comprendre les circuits neuronaux qui sous-tendent la prise de décision en particulier entre les situations de choix familières versus les choix nouveaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les processus de prise de décision. De nombreuses maladies neuropsychiatriques sont caractérisées par des déficits cognitifs et notamment des troubles de la prise de décision. Ainsi ce projet va permettre une meilleure connaissance fondamentale de ces processus cognitifs complexes mais également aider à mieux comprendre certains troubles neuropsychiatriques impliquant un déficit de prise de décision.

Procédures

Tous les animaux subiront une tâche comportementale de 1h max/jour pendant 3 mois maximum ainsi qu’un rationnement alimentaire léger pendant 3 mois maximum. Les animaux subiront une chirurgie cérébrale d’environ une heure trente.

Impact sur les animaux

Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en rationnement alimentaire léger (pour les maintenir à 90-95% de leur poids corporel initial) ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire) mais peut entrainer du stress. Cette restriction temporaire est en partie compensée par la nourriture obtenue au cours de la tâche comportementale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour l’analyse des marqueurs biologiques et les vérifications anatomiques.

Remplacement

Elucider les bases neuronales de fonctions cognitives ne peuvent, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche cognitive chez l’humain n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De plus, les espèces d'invertébrés n'ont pas la capacité pour les comportements décisionnels étudiés dans ce projet et, à l'heure actuelle, ces comportements n'ont été démontrés que chez les mammifères et les corvidés. De même, l’approche neurocomputationelle faisant appel à la modélisation est utile, mais complémentaire des approches invasives in vivo permettant de vérifier la véracité des modèles prédictifs. Dans ce contexte il demeure nécessaire d’avoir recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous cherchons à utiliser le nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs et exploitables. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour que nos tests conservent assez de puissance en tenant compte des pertes inévitables

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables dans notre recherche, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté et seront hébergés en cage collective. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales. Le suivi post-opératoire sera effectué quotidiennement pendant 3 jours pour s’assurer de la récupération complète des animaux. Des points limites généraux et spécifiques, des mesures conservatoires ainsi que des critères d’arrêt ont été identifiés afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort. Tous les expérimentateurs et soigneurs sont formés et compétents dans les procédures requises pour ce projet et ont suivi les formations obligatoires.

Choix des espèces

D’une façon générale, les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille et garantir une constance dans les coordonnées stéréotaxiques. Cet âge a également été choisi pour être cohérent avec les données de la littérature.

Deux incisions de six millimètres sont pratiquées dans la peau du dos de 164 souris pour déclencher la formation de neurofibromes, tandis que 196 puis 32 autres sont isolées quinze jours en cage individuelle, au sevrage ou à un an. L'effectif déclaré est pourtant de 188 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leur peau soit disséquée. Le porteur annonce une douleur aiguë et une baisse d'activité après les incisions, malgré la lidocaïne appliquée au préalable, ainsi qu'un stress lié à l'isolement. Il conclut néanmoins que les tumeurs développées par ces souris n'entraînent "pas de phénotype dommageable", au motif qu'elles restent invisibles à l'œil nu, quand les mêmes tumeurs chez les patients humains provoquent, selon son propre texte, démangeaisons et douleurs.

Objectifs

La neurofibromatose de type I est une maladie génétique qui touche environ 1 personne sur 3000. Elle se caractérise par l'apparition de nombreuses tumeurs bénignes appelées neurofibromes cutanés, qui se développent au niveau des terminaisons nerveuses de peau. Ces tumeurs, dont le nombre peut atteindre des milliers peuvent causer des démangeaisons et des douleurs et ont un impact majeur sur la qualité de vie du patient. Les mécanismes responsables de leur développement sont mal connus, et il n'existe pas de traitement efficace pour prévenir ou stopper leur développement. A l’aide d’un modèle murin de la Neurofibromatose de type 1 nous avons récemment montré que (i) le trauma de peau induit le développement de neurofibromes cutanés, (ii) le développement des neurofibromes cutanés est transitoire et suit 3 phases : initiation, progression et stabilisation, chacune caractérisée par des changements cellulaires et moléculaires. En caractérisant ces différentes phases, nous avons identifié deux protéines comme potentielles cibles thérapeutiques pour traiter les neurofibromes cutanés en phase de progression (croissance) et en phase de progression (croissance) ou de stabilisation (stade mature), respectivement. Le but de la première partie de ce projet est ainsi d’explorer le rôle et potentiel thérapeutique de ces deux protéines dans le développement des neurofibromes cutanés. Pour cela nous utiliserons le modèle murin de la Neurofibromatose de type 1 développant des neurofibromes cutanés en combinaison avec des outils génétiques ou pharmacologiques. De plus, nous avons observé que dans la peau saine de souris mutantes de la Neurofibromatose de type 1 sans trauma et sans neurofibromes cutanés, la densité de cellules de Schwann (cellules à l'origine des neurofibromes cutanés) était plus importante que dans la peau saine d’animaux sains (contrôles). La deuxième partie de ce projet vise ainsi à caractériser plus en détail la peau saine des souris mutantes pour la neurofibromatose de type 1 et la comparer à celle de souris saines (contrôles).

Bénéfices attendus

Les mécanismes responsables du développement des neurofibromes cutanés sont mal connus, et il n'existe pas de traitement efficace pour prévenir ou stopper leur développement. Les rôles de deux protéines: la Ténascine-C et la Périostine dans leur développement n’ont jamais été explorés et constituent de nouvelles pistes mécanistiques et thérapeutiques. La peau saine d’individus atteints de la Neurofibromatose de type 1 n’a jamais été caractérisée en détails bien que ce soit une question importante puisque à ce jour, l’hétérogénéité en nombre, taille et localisation des neurofibromes cutanés observée chez les patients reste inexpliquée.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale courte (de l’ordre de 10 min) correspondant à l'induction de deux petites lésions incisionnelles manuelles de 6 mm de longueur et moins de 1 mm de profondeur (l'incision est réalisée sur l'épaisseur totale de la peau de la souris qui est très fine, de l'ordre de moins d'1 mm). Cela concerne 164 animaux. Certains animaux seront isolés dans des cages individuelles dès le sevrage à 1 mois, pendant 15 jours avant d’être mis à mort, cela concerne 196 animaux. Finalement 32 animaux seront isolés dans des cages individuelles à partir de l'âge d'un an, pendant 15 jours avant d'être mis à mort.

Impact sur les animaux

Les neurofibromes cutanés développés par les souris mutantes NF1 sont des tumeurs qui restent superficielles et se développent en région dorsale à partir de 2 mois. Elles sont plates et peuvent atteindre un diamètre de quelques millimètres mais leur épaisseur demeure très fine (de l’ordre de 1 mm maximum), ce qui les rends non détectables à l’oeil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence. Leur volume est donc négligeable par rapport à celui de la souris. Leur nombre peut être d’une quinzaine par souris. Aucun effet nuisible ou indésirable lié à l’absence de Ténascine-C ou à l’inhibition de Périostine n'est attendu en prenant en compte des travaux similaires récemment publiés. Des nuisances sont cependant à prévoir suite à l'induction de lésions manuelles (douleur aigüe, diminution des mouvements et de l’activité normale due à l’inconfort), bien que de la lidocaïne soit appliquée préalablement pour en atténuer les effets. Des nuisances liées au stress des manipulations, à la contention des souris, à l’anesthésie générale et aux gestes techniques d’injections sont également à prévoir. Enfin, lorsque les souris seront gardées seules dans des cages isolées, du stress est à prévoir.

Devenir

A la fin de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort pour que leur peau puisse être disséquée et analysée.

Remplacement

Pour le Remplacement ; à notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des neurofibromes cutanés et permettant d’évaluer le rôle de ces deux protéines dans ce processus. De plus, il n’existe pas d’inhibiteur pharmacologique pour inhiber l’activité de la Tenascine-C, il est donc nécessaire d’utiliser les animaux mutants pour inactiver la Ténascine-C de façon génétique et évaluer son rôle dans le développement des neurofibrmes cutanés. Enfin, l’hébergement des souris en isolation est le seul moyen de prévenir les morsures et donc les lésions de peau induisant le développement des neurofibromes cutanés.

Réduction

Pour la réduction du nombre d'animaux dans ces procédures expérimentales, nous nous sommes basés sur des expériences similaires déjà documentées dans la littérature. En effet, la connaissance approfondie du modèle de souris NF1, le traitement à la cilengitide, l'inactivation génétique de la Tenascin-C, ainsi que la réalisation de lésions cutanées nous permet d’utiliser des modèles maîtrisés. Cela évite les mises au point préalables, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires. De plus, en se basant sur une analyse statistique, le nombre d'animaux est optimisé pour garantir des résultats statistiquement significatifs avec le minimum d'animaux nécessaires. Cela inclut l'utilisation de techniques comme l'analyse de puissance pour déterminer le nombre d'animaux requis.

Raffinement

Pour le Raffinement ; de la lidocaïne sera appliquée sur la peau du dos des souris avant la réalisation des lésions afin de limiter la douleur liée à cette procédure. À la suite des lésions, l’état des souris sera évalué une fois par jour pendant une semaine puis deux fois par semaine pour le reste de la durée du suivi (1 mois). Lors de ces visites le poids, l’activité, d’éventuels signes d’inflammation au niveau des points d’injection, une éventuelle paralysie, l’état de stress et de douleur des souris (poils hérissés) seront évalués. En présence de tels signes persistants (plus de 24h), les souris seront mises à mort via une anesthésie générale par dislocation cervicale. Le personnel de l’animalerie nous informe également régulièrement (lors des changements de cages notamment) de l’état de santé des souris. Pendant toute la durée de l’expérimentation les animaux seront hébergés dans des cages contenant du coton ainsi que des maisons et rouleaux en carton. Contrairement aux patients atteints de la Neurofibromatose de type 1, les souris mutantes pour la Neurofibromatose de type 1 développent des neurofibromes cutanés dont la taille est limitée (les tumeurs ne sont pas visibles à l’oeil nu sans utilisation d’une loupe à épifluorescence) n’entrainant donc pas de phénotype dommageable. Au cours de l’anesthésie générale, pour éviter l’hypothermie, les souris seront maintenues sur un tapis chauffant. Leurs yeux seront également enduits d’un onguent ophtalmique dès la perte de conscience afin de prévenir un dessèchement de la cornée. Les souris gardées seules dans des cages isolées seront hébergées dans un environnement enrichi contenant du coton ainsi que des maisons et rouleaux en carton. Ces animaux sont également gardés dans des cages transparentes permettant le contact visuel avec les animaux des cages voisines. De plus, les expériences seront réalisées rapidement après isolation, ce qui limitera le temps passé en isolation.

Choix des espèces

Nous avons récemment concu un modèle de souris génétiquement modifiées qui récapitule fidèlement le développement des neurofibromes cutanés et qui sera utilisé dans ce projet. A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, permettant d’étudier les NFc et le rôle de la Ténascine-C et de la Périostine dans leur développement, ou d'étudier la peau saine mutante NF1. Des animaux adultes âgés de 6 semaines seront utilisés pour qu'ils n'aient pas encore développé de neurofibromes cutanés. Des animaux adultes âgés de 1 an seront également utilisés afin qu'ils aient développé des neurofibromes cutanés matures.

Soumises à des contentions répétées destinées à produire un état de stress, puis à l'injection d'une substance inflammatoire, 2 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent une perte d'appétit, une chute de température et un retrait social, que le porteur nomme "comportement de maladie" et présente comme contribuant à leur rétablissement. Il écrit par ailleurs que la contention laisse l'état général des souris stable, sans perte de poids ni changement d'activité, tout en s'en servant comme modèle de stress. Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus, et la rubrique consacrée au remplacement décrit un travail sur les oméga-3 et les régimes alimentaires, quand l'objectif annoncé porte sur un récepteur de la neuroinflammation.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de dépression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, unique cellule immunitaire du cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents composés biologiques d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces molécules bioactives a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels ces composés influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes neuroinflammatoires impliqués dans les troubles psychiatriques, notamment via le rôle du récepteur HCAR2 dans les cellules immunitaires du cerveau et de la périphérie.

Procédures

Pour désactiver le gène spécifique HCAR2 dans certaines cellules immunitaires du cerveau (positives pour le gène CX3CR1), les souris recevront une injection par jour pendant cinq jours. Trois semaines plus tard, un groupe de souris modifiées et un groupe témoin recevront une substance inflammatoire pour observer leur réaction. Leur état sera suivi pendant les 48 heures suivantes. À la fin de l’expérience, les souris seront endormies sans douleur grâce à un anesthésiant, suivi d’une injection pour mettre fin à leur vie. Chaque injection ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dans ce projet sont limitées et soigneusement contrôlées grâce à des protocoles rigoureux et des mesures adaptées. La contention répétée est une méthode utilisée pour modéliser un état de stress. Bien qu’elle puisse entraîner un inconfort temporaire, l’état général des souris reste stable, sans perte de poids ni altération de leur activité habituelle, selon notre expérience et les données disponibles. L’injection d’une substance inflammatoire entraîne une activation temporaire du système immunitaire, provoquant un malaise passager caractérisé par des modifications de la température corporelle, du métabolisme énergétique, une perte d’appétit et un comportement de retrait social. Ce phénomène, appelé « comportement de maladie », contribue au rétablissement des animaux et disparaît en 48 heures. Les évaluations comportementales sont conçues pour minimiser l’impact sur le bien-être des souris, avec des durées d’exposition réduites et des manipulations adaptées. De plus, les lignées utilisées sont bien caractérisées, et un suivi rigoureux permet de détecter rapidement tout effet inattendu. Pour garantir le bien-être des animaux, des mesures spécifiques sont mises en place : une surveillance quotidienne par l’expérimentateur et bihebdomadaire par les animaliers, ainsi qu’une évaluation systématique de la douleur après chaque manipulation, avec administration d’analgésiques si nécessaire. L’enrichissement de l’environnement, des manipulations douces et une attention constante visent à réduire au maximum les effets indésirables tout en assurant des conditions optimales pour les expériences.

Devenir

A la fin de chaque procédure expérimentale ou si les points limites sont atteints au cours de l'une d'entre elle, les souris seront euthanasiés afin de préléver les tissus nécéssaires aux analyses.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier les mécanismes neurobiologiques et rôle des acides gras polyinsaturés oméga-3 dans la prévention des altérations cognitives et émotionnelles suite à un stress chronique. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié. Les expériences ne peuvent pas être effectuées sur des cultures cellulaires ou dans des modèles computationnels ou encore chez l’homme, car aucune de ces approches ne permet de réaliser toutes ces expériences chez un même sujet. Le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des troubles de l’humeur reste une nécessité expérimentale majeure.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de lipidomiques et/ou moléculaires et protéomiques, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude et de ne pas euthanasier des animaux pour rien. De plus grâce à des études menées précédemment dans notre laboratoire montrent que pour avoir une puissance statistique suffisante, nous avons montré que 15 souris sont nécessaire par groupe afin de permettre une robustesse des données.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement ainsi que des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientique.En fin d'expérimentation, les animaux seront mis a mort par une anesthésie sans reveil avec au préalable une analgésie pour limiter la douleur pendant la procédure.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris en raison de leur petite taille, qui permet de les héberger facilement dans des conditions d’élevage optimales en animalerie. Nous privilégions la souris plutôt que le rat, car de nombreuses lignées transgéniques sont déjà disponibles dans notre laboratoire, contrairement aux rats. Ce choix s’inscrit également dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, les cellules immunitaires de la souris et de l’homme partagent de nombreux gènes en commun, ce qui facilite la transposition des résultats obtenus chez l’animal à l’humain. Les différentes lignées transgéniques générées arriveront dans notre animalerie à l’âge de 6 semaines et bénéficieront d’une période d’acclimatation de 2 semaines avant de commencer les protocoles de stress. Les tests comportementaux débuteront sur des animaux âgés de 12 semaines au maximum.

384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les femelles gestantes opérées pour introduire des marqueurs fluorescents dans le cerveau de leurs fœtus, les nouveau-nés placés huit jours dans un air appauvri en oxygène. Environ 10 % des embryons ne survivent pas à l'intervention, une perte que le porteur dit difficile à distinguer d'une mortalité naturelle. Le manque d'oxygène provoque un retard de croissance et des lésions cérébrales, et le projet cherche à savoir si la L-Carnitine limite ces atteintes dans un modèle de grande prématurité. Les souriceaux sont tués pour prélèvements, les femelles qui n'ont pas été opérées pouvant être réutilisées comme allaitantes dans les expériences suivantes.

Objectifs

Quand un bébé naît très prématurément, ses poumons ne sont pas encore complètement formés, ce qui peut entraîner des périodes où il manque d’oxygène (appelées hypoxies). Ce manque d’oxygène perturbe le fonctionnement du cerveau, qui a du mal à produire l’énergie dont il a besoin, et peut provoquer des dommages dans le cerveau. Même si le cerveau des bébés a une meilleure capacité de réparation que celui des adultes, ces réparations ne sont pas toujours parfaites. Ainsi, les enfants nés très prématurément ont un risque plus élevé de développer des problèmes cognitifs (comme des difficultés d’apprentissage) à l’adolescence. Cela pourrait être dû à des connexions anormales entre les neurones. Des expériences chez la souris, dans un modèle qui reproduit la grande prématurité (avec un manque d’oxygène à la naissance), montrent que ce stress provoque un problème dans les "usines à énergie" des cellules, appelées mitochondries. Ce problème persiste même à l’âge adulte. Ce projet vise à tester si une molécule appelée « L-Carnitine », qui aide les mitochondries à mieux fonctionner, peut limiter ces problèmes cérébraux. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de grande prématurité et une méthode spéciale qui rend certains neurones fluorescents pour les étudier plus facilement. Nous voulons répondre à deux questions principales : 1) Est-ce que la L-Carnitine aide le cerveau à mieux se développer chez les bébés prématurés ? ; 2) Quel est le meilleur moment pour commencer ce traitement, et combien de temps doit-il durer pour être efficace ?

Bénéfices attendus

Ce projet a une double finalité, à la fois fondamentale et translationnelle (préclinique) puisqu’il vise à comprendre comment le manque d’oxygène affecte le développement du cerveau et à tester si un traitement protecteur pour les "usines à énergie" des cellules, appelées mitochondries, peut limiter ces effets à long terme.

Procédures

Une technique appelée électroporation sera utilisée chez des souris portantes pour introduire des protéines fluorescentes dans les cerveaux des fœtus, ce qui permettra d’observer les cellules cérébrales et leurs "usines à énergie" (mitochondries). Après la naissance, la moitié des souriceaux seront placés dans un environnement pauvre en oxygène pendant 8 jours afin de reproduire le manque d’oxygène associé à une naissance très prématurée. De la L-Carnitine, un traitement protecteur pour les "usines à énergie" des cellules, appelées mitochondries, sera donnée à tous les souriceaux dans l’eau de boisson à différents moments pour évaluer son efficacité à limiter les effets du manque d’oxygène sur le développement cortical et déterminer la durée optimale du traitement. Les souriceaux seront soumis à des tests pour évaluer leur comportement, puis leurs cerveaux seront analysés pour mesurer les effets de l’hypoxie et du traitement.

Impact sur les animaux

Pour les femelles, une chirurgie invasive permet d’introduire des marqueurs fluorescents dans les neurones et mitochondries. Bien que rare, des difficultés lors de la mise bas ou des infections sont possibles, mais évitées grâce à des règles d’hygiène strictes. Pour les souriceaux, environ 10 % des embryons peuvent ne pas survivre à la procédure, bien qu’il soit difficile de distinguer cette perte d’une élimination naturelle. L’hypoxie (manque d’oxygène) entraîne un retard de croissance et des lésions cérébrales, mais les souriceaux rattrapent leur croissance après et les lésions semblent réparées à l’échelle visible. Cependant, des troubles cérébraux subtils à long terme, comme des problèmes d’apprentissage ou de comportement, peuvent persister et sont détectables lors de tests spécifiques.

Devenir

Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique. Une réutilisation des femelles n'ayant pas subi de procédure chirurgicale sera envisagée, notamment comme souris allaitante pour les expériences suivantes. Une utilisation des souriceaux surnuméraires sera envisagée, notamment pour la collecte de tissus. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements post mortem.

Remplacement

Les recherches menées dans ce projet s’appuient sur des modèles animaux pour mieux comprendre les conséquences du manque d’oxygène sur le cerveau. Les interactions complexes entre les cellules, l’inflammation et la réponse immunitaire ne peuvent pas être étudiées en laboratoire sans l’utilisation d’animaux. Les traitements testés ont d’abord été évalués sur des cellules isolées avant d’être appliqués à des organismes complets pour mieux comprendre leurs effets dans des conditions réelles.

Réduction

Pour limiter l’utilisation d’animaux, chaque cerveau est utilisé pour plusieurs analyses différentes, et des techniques innovantes permettent d’extraire un maximum d’informations. Les procédures chirurgicales respectent des normes strictes, avec des soins postopératoires attentifs pour minimiser le stress des animaux. Les mères et souriceaux bénéficient d’un suivi quotidien, et des pratiques comme l’alternance des femelles entre cages permettent de garantir une alimentation de qualité pour les petits tout en réduisant le stress.

Raffinement

Ce projet utilise des méthodes bien maîtrisées pour assurer le bien-être des animaux. Les opérations sont réalisées dans des conditions strictes d’hygiène, avec anesthésie et gestion de la douleur. Une attention particulière est portée à la récupération après les interventions et à la réduction du stress autour de la naissance, grâce à des aménagements qui encouragent les mères à préparer un nid confortable. Les souriceaux sont surveillés pour repérer rapidement tout signe d’inconfort. Les mères sont échangées entre les cages normoxiques et hypoxiques pour garantir une bonne production de lait et réduire leur stress.

Choix des espèces

Le cerveau de la souris est proche de celui de l’humain, tant dans sa structure que dans son fonctionnement, ce qui en fait un modèle idéal pour étudier les maladies du développement cérébral et le fonctionnement du cortex. Les techniques nécessaires pour ce projet sont bien maîtrisées sur cette espèce, garantissant la faisabilité de l’étude. Les souris femelles utilisées seront des adultes en bonne santé, âgées de 8 à 24 semaines. Leurs petits seront mis à mort à différents âges pour comprendre comment un manque d’oxygène peut affecter des étapes clés du développement des connexions dans le cerveau et si un traitement qui stimule l’énergie produit par les cellules peut limiter ces problèmes cérébraux.