Système nerveux

Créées sur place ou reçues d'autres établissements, des lignées de souris et de rats génétiquement modifiés sont élevées, tatouées et biopsiées pour vérifier qu'elles portent bien la mutation commandée. 320 000 souris et 30 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, ceux qui ne partent pas vers un autre projet d'expérimentation étant tués, sans placement possible puisqu'ils appartiennent au scientifique commanditaire. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et quatre prélèvements sanguins par jour, et exprimer du seul fait de sa mutation un phénotype douloureux tel qu'une arthrite. Le porteur ajoute que la mise à mort peut être programmée à un âge précis pour éviter que l'animal n'exprime ce phénotype, et que les scientifiques "s'engagent par écrit" à ce qu'il n'existe pas de solution de remplacement à leur lignée.

Objectifs

Ce projet a pour premier objectif le maintien de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des modifications/symptômes physiques ou cliniques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes, et l’évaluation de l’impact de ces caractéristiques sur leur bien être ; comme deuxième objectif la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée génétiquement modifiées, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Ce test est important car dans l’élevage de lignée génétiquement modifiées, tous les animaux nés ne sont pas porteurs de la mutation, il est donc primordiale de le vérifier pour pouvoir utiliser les animaux d’interet uniquement et donner des résultats fiables. Enfin, certaines mutations génétiques ne font effet qu’après l’injection d’une hormone ou d’un antibiotique. Pour induire cette mutation d’interet et que l’animal exprime physiologiquement cette mutation, une injection de l’hormone pourra ainsi également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 350 000 animaux (ajout de 15% dû à l’augmentation de l’utilisation de ces modèles) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement modifiés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait du être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptée à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement modifiées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le bon modèle pour leurs expérimentations.

Procédures

Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : - A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute - A des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite). Dans de rare cas, l’administration de ligands peuvent être fait via des injections en intrapéritonéale ou en gavage (durée : moins de 5 minutes, fréquence peut varier d’une expérimentation à une autre, mais n’excédant pas une fois par jour pendant 7 jours, en cas de protocole nécessitant de dépasser ces limites, cela devra au préalable être valider par la SBEA) (durée et fréquences décrites dans la procédure 4, et recommandées par la littérature).

Impact sur les animaux

EExpression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité inatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dûs à l'injection d’un produit.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont soit en utilisation continue dans des projets d’expérimentation, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).

Remplacement

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.

Réduction

Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, ne sont utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypag. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européenes (au moins 7 animaux de chaque sexes et génotypes, sur 2 générations).

Raffinement

En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Dans le cas de lignées pouvant présenter un phénotype dommageable, si le phénotype le requiére, des observations cliniques plus fréquentes et plus spécifiques avec des points limites et des raffinements précis seront mise en place. Afin de limiter la douleur pour l’animal, une euthanasie pourrait être demandé en automatique à un point limite ou âge précis afin d’éviter que l’animal n’exprime le phénotype. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est mis à mort.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5jours après la fécondation.

Trois heures d'anesthésie, l'ouverture du crâne et l'injection d'un virus dans deux zones du cerveau : douze ouistitis subissent cette chirurgie, quatre autres recevant deux injections intraveineuses de virus à quinze jours d'intervalle. Les seize animaux vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, puis tués pour prélèvement de tissus. Le projet compare les connexions neuronales du cortex préfrontal chez des individus porteurs de variantes différentes d'un gène lié à la vulnérabilité à la dépression, la retombée annoncée pour les patients étant renvoyée au long terme. Le porteur signale par ailleurs que le rasage de la tête peut perturber les interactions sociales de l'animal, et affirme que le primate non humain est "le seul modèle approprié".

Objectifs

La dépression et, plus largement, les troubles liés au stress constituent un enjeu majeur dans nos sociétés. Ces affections ont des origines multiples, avec une forte composante génétique. Des études ont montré que des modifications de l'activité de certaines zones du cerveau jouent un rôle clé dans les symptômes de ces troubles. Parmi un grand nombre de gènes décrits dans la littérature scientifique, nous nous sommes concentrés sur un gène précis dont les variantes présentes naturellement dans les populations humaines influencent la vulnérabilité ou la résilience face à la dépression. Il est intéressant de noter que l’effet de ces variantes est également observé chez les primates non humains. Pour approfondir notre compréhension, nous souhaitons examiner les éventuelles différences au niveau des connexions des neurones chez les animaux portant des variations différentes de ce gène.

Bénéfices attendus

Les troubles dépressifs sont des pathologies graves ayant un fort taux de rechute et d’échec thérapeutique. Mieux comprendre l’influence des différentes variantes d’un gène impliqué dans la dépression permettra de mieux appréhender ces maladies. Les données issues de ce projet permettront à long terme une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Pour la première procédure : les 12 animaux du lot 1 seront anesthésiés (durée 3h), puis une injection de virus sera réalisée dans deux zones du cerveau. Pour la seconde procédure : 4 animaux seront anesthésiés (durée 30 min) lors d’injections intraveineuses de virus. Chaque animal aura 2 injections de virus à 2 semaines d’intervalle.

Impact sur les animaux

Stress : un stress inhérent à la capture, aux anesthésies et aux piqûres. Chirurgie : douleurs liées à l’ouverture du crâne, potentiel problème d’interaction sociale dû au faite de raser la tête de l’animal, risque d’infection au niveau de la plaie. Injection intraveineuse : apparition d’un hématome qui pourrait masquer une inflammation

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvements de tissus en vue d’analyses.

Remplacement

Il est très difficile de comprendre comment fonctionnent les circuits neuronaux dans notre cerveau. Les méthodes utilisées chez les humains ne sont pas assez résolutives. De plus, il n'existe pas de modèle artificiel des circuits étudiés permettant une simulation informatique. Pour mieux comprendre ces mécanismes, nous avons besoin d'un modèle qui soit proche de l’humain sur le plan anatomique et comportementale. En raison de la proximité anatomique et fonctionnelle des structures étudiées avec celles de l'humain, le primate non humain (PNH)est le seul modèle approprié.

Réduction

Nous réduirons le nombre d'animaux utilisés au minimum accepté par la communauté scientifique. Les études anatomiques sur le primate non humain sont généralement réalisées sur un minimum de 4 animaux par groupe (dans notre cas 2 groupes x4 = 8 individus). Nous avons prévu un nombre supérieur à 8 animaux, prenant en compte une possible erreur dans la localisation des sites d’injections. Nous estimons avoir besoin de 12 animaux pour ce projet auquel il faut ajouter 4 animaux pour les injections intraveineuses.

Raffinement

Nous mettrons en place des points limites préalablement définis. Les procédures chirurgicales seront effectuées sous anesthésie générale et une médication appropriée (analgésie) sera fournie dans le but d'éviter toute souffrance liée aux chirurgies. Les animaux sont hébergés en groupe social (2 individus minimum par groupe), dans des espaces enrichis dont les dimensions dépassent la règlementation actuelle. Tester la validité de l’approche ‘injection intraveineuse’ ouvrira le champ à des expériences futures moins invasives pour les animaux.

Choix des espèces

Notre étude s’intéresse à comprendre comment certaines caractéristiques génétiques humaines contribuent à la vulnérabilité face aux maladies psychiatriques, notamment la dépression. En raison de la proximité anatomique et fonctionnelle des structures étudiées avec celles de l'humain, le primate non humain (PNH) est le seul modèle approprié. Nous avons besoin d’animaux matures de plus de 18 mois pour notre étude. Avant 18 mois, les individus sont juvéniles, leur système nerveux n'est pas encore complètement développé.

Pour savoir si la microglie participe à l'ouverture de la période critique du cerveau, 547 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. La microglie est appauvrie pendant la vie intra-utérine par un traitement mêlé à la nourriture des mères, ou une inflammation prénatale est provoquée par une injection intrapéritonéale sur femelle gestante vigile. Après transfert vers un second établissement, la moitié des souriceaux de chaque groupe subit la suture d'une paupière sous anesthésie, puis une imagerie du cortex visuel d'environ deux heures, avant d'être mise à mort sans avoir été réveillée. L'effectif compte 67 mères, dont 40 ne sont utilisées que pour accompagner leurs petits pendant le transport.

Objectifs

La plasticité cérébrale décrit la capacité du cerveau à remodeler ses connexions en fonction de l'environnement et des expériences vécues par l'individu. Cette plasticité est élevée peu après la naissance et diminue chez l’adulte. Elle est maximale au cours d’une période limitée dans le temps, appelée « période critique », pendant laquelle les circuits neuronaux sont particulièrement susceptibles d’être remodelés en réponse à un changement de l’environnement. Ainsi, une pathologie touchant par exemple la vision pendant la période critique aura des impacts irréversibles sur la perception visuelle par le cerveau. Comprendre les mécanismes permettant la mise en place des périodes critiques est donc essentiel pour espérer un jour rouvrir chez l’adulte une forte plasticité et recouvrer, après un handicap ou un environnement inadéquat pendant leur mise en place, des réseaux neuronaux optimaux. Cependant, nos connaissances sur ces mécanismes restent profondément incomplètes, et le présent projet a pour objectif d’étudier si la microglie participe à l’établissement de la période critique. La microglie est en effet une population de cellules du cerveau dont le rôle est d’assurer la défense immunitaire grâce à ses capacités phagocytaires. Des données préliminaires ont montré qu’une altération du niveau de microglie chez l’embryon de souris induisait une modification profonde des circuits neuronaux après la naissance. En particulier, certains de ces circuits neuronaux sont connus pour être des régulateurs importants de l'ouverture de la période critique. Cela suggère donc un rôle majeur de la microglie dans l’établissement de la période critique. Le but de ce projet est maintenant de tester si des changements de plasticité ont lieu in vivo dans le but de confirmer ces résultats préliminaires et de caractériser ainsi les conséquences de modifications prénatales des microglies sur la période critique. Ce projet, qui est multisite, a déjà fait l’object d’une demande similaire, qui a été validée, avec le même nombre d’animaux. Aucun animal supplémentaire n'est donc ajouté ici par rapport au projet principal déjà autorisé.

Bénéfices attendus

D’un point de vue fondamental, nos connaissances concernant le rôle de la microglie dans l’établissement des périodes critique est profondément incomplet. De plus, la compréhension des mécanismes qui sont impliqués ouvre donc des perspectives thérapeutiques de pouvoir réinstaller une plasticité neuronale chez l’adulte et rétablir des connexions corticales normales suite à une pathologie pendant l’enfance.

Procédures

Les animaux seront produits par accouplements contrôlés dans le premier établissement utilisateur (EU2/2), pour produire les 3 groupes d’animaux : 1) ceux dont lesquels la microglie aura été déplétée pendant le développement in utero (par traitement pharamacologique non dommageable présenté dans la nourriture), 2) ceux qui auront été exposé à une procédure mimant une inflammation prénatale (injection à un stade précis de la gestation- geste réalisé par des expérimentateurs entrainés (injection de quelques secondes réalisée sur animal vigile) et suivi intensifiés dans les 3 jours suivants (voir ci -dessous)), et 3) un groupe non manipulé d’animaux contrôle. Les animaux seront ensuite transférés dans un deuxième établissement utilisateur situé à proximité (EU1/2), dans des cages de transport scellés, avec des congénères de chaque portée, et ont une période d’acclimatation d’au moins une semaine après ce transport. Certains animaux devront être transporté avant sevrage pour leur laisser une semaine d’adaptation, et dans ce cas particulier, les mères seront également transportées. Dans le deuxième établissement utilisateur (EU1/2), nous procéderons à 3 actes sur les animaux. Pour la moitié des animaux de chaque groupe, nous réaliserons une fermeture transitoire de la paupière par suture chirurgicale, réalisée sous analgésie et anesthésie contrôlée (20 minutes environ pour l’entièreté de l’acte) et avec suivi post-opératoire pendant 3 jours. Après 3 jours, la plasticité induite par cette fermeture, ou l’absence de fermeture (autre moitié de chaque groupe), sera évaluée dans le cortex visuel par imagerie (environ 2h), réalisée sous analgésie et anesthésie contrôlée, et qui seront euthanasiés par méthodes règlementaires avant réveil.

Impact sur les animaux

L’induction des modèles d’étude se fera sur les mères et leurs embryons soit par l’alimentation sans contrainte autre que le changement de l’aliment, soit par une injection intrapéritonéale qui peut induire un stress lors de la contention une douleur de courte durée lors de l’injection au point de piqûre. Les animaux seront ensuite transportés dans un autre établissement ce qui pourra induire un léger stress. Dans le second établissement, la procédure chirurgicale mise en œuvre est rapide mais entraîne néanmoins un stress thermique et des risques liés à l’anesthésie générale. De plus, cela peut mener à un inconfort dans les jours suivants tels que grattages et petites plaies autour de l’œil. En fin de période de maintien, les animaux subiront une imagerie sous anesthésie (stress thermique/risques anesthésiques) puis seront euthanasiés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par méthodes règlementaires, ce qui permet de réaliser les analyses et prélèvements nécessaires.

Remplacement

Des données préliminaires obtenues in vitro par notre équipe indiquent que les circuits neuronaux impliqués dans la période critique sont modifiés suite à une altération de la microglie in utero. La prochaine étape consiste à tester directement cette hypothèse in vivo au sein d'un organisme complexe. Il n’est pas alors possible de remplacer les enregistrements du cerveau intact par des simulations ou par des cultures de cellules du cerveau.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés, la taille de chaque lot a été optimisé pour pouvoir réduire au maximum le nombre d’animaux utilisé, mais pouvoir établir des conclusions scientifiquement et statistiquement fiables. Nous estimons à 10 animaux la taille optimale par lot, ce qui porte à 547 le nombre total d'animaux (480 animaux seront enregistrés, auxquels s'ajoutent 40 mères qui devront accompagner les animaux en plus bas âge au moment du transport et 27 mères ayant subies des traitements). Nous avons également choisi de réaliser un groupe contrôle unique pour les deux conditions expérimentales, afin de réduire le nombre total d’animaux.

Raffinement

Sur l’ensemble de la trajectoire de vie des animaux, et donc sur les deux établissments utilisateurs, nous utiliserons les analgésiques et anesthésiques appropriés pour limiter au maximum l’inconfort des animaux. Suite à la manipulation des souris gestantes, nous aurons un suivi particulier de ces animaux et de leur descendance (grâce à des points limites définis, et protocoles analgésiques dédiés). Pour les mères un suivi sera effectué en même temps que leur progéniture pour déceler des changements dans leur comportement et leur apparence. Pour le transport, nous veillerons à maintenir les congénères de chaque portées et une semaine d’adaptation. Suite à la chirurgie de fermeture d’un oeil, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant 3 jours et une attention particulière sera donnée si l’animal se gratte et présente une plaie autour de l’oeil. Dans ce cas, nous procéderons à une désinfection de la zone opérée et, à l’application d’un anesthésique local. Nous examinerons en parallèle le comportement et l'apparence des souris opérées pour détecter tout inconfort et un analgésique pourra être injecté si besoin. Pour l'expérience d'imagerie, la procédure sera réalisée sous anesthésie et préparée par une injection analgisante. De plus, la technique d'imagerie utilisée pour l’enregistrement de l’activité cérébrale est minimalement invasive et ne nécessite pas de chirurgie lourde. Tous les animaux seront logés à plusieurs dans des cages enrichies à l'aide de coton pour faire leur nid et boisson et nourriture à volonté, dans les deux établisssments utilisateurs.

Choix des espèces

Nous utiliserons le modèle murin qui est un modèle idéal puisque son développement est proche de celui de l’homme. La souris est l’espèce animale la plus répandue dans les laboratoires de Neurosciences aujourd’hui. Elle permettra une meilleure reproductibilité des résultats et une meilleure comparaison avec ceux publiés dans la littérature. De plus, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de parents. Ces animaux seront testés soit aux jours post-nataux 21, 28, 50 et 100. Ces âges constituent des âges remarquables pour la plasticité visuelle chez la souris car : - La période critique pour la dominance oculaire chez la souris est maximale vers le jour post-natal 28. - Au jour post-natal 21, la période critique commence à s’ouvrir. - Au jour post-natal 50, la plasticité est largement réduite - Au jour post-natal 100 la période critique est totalement fermée.