Système nerveux

Une craniotomie, l'injection d'un virus dans le cerveau et deux heures trente de chirurgie pour poser un dispositif d'imagerie attendent une partie des 2 210 souris de ce projet, toutes tuées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. S'y ajoutent des injections abdominales trois à cinq jours de suite, puis des tests d'anxiété et de locomotion, de mémoire sur trois jours, de préférence sociale, de sociabilité face à une femelle puis à un mâle, et de dominance dans un tunnel traversé cinq fois par jour. L'objet déclaré est le rôle des astrocytes et de l'ocytocine dans les interactions sociales, avec pour horizon lointain des traitements de l'autisme. Le porteur indique que le dispositif d'imagerie pèse 2 grammes, soit environ 10 % du poids d'une souris, et que les tests comportementaux pourraient augmenter l'anxiété des animaux dont il mesure précisément la sociabilité.

Objectifs

Les astrocytes sont des cellules du cerveau qui jouent un rôle important en aidant les neurones à communiquer efficacement. Cette communication est essentielle pour les pensées, les émotions et les comportements. Ce projet vise à mieux comprendre comment ces cellules influencent les interactions sociales, en étudiant l’effet de l’ocytocine, une hormone qui favorise les liens sociaux.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines molécules et signaux dans le cerveau, en particulier ceux liés à l’ocytocine et au calcium, influencent les interactions sociales. À long terme, cette recherche pourrait conduire à de nouveaux traitements pour des troubles comme l’autisme, en agissant sur ces signaux pour améliorer la sociabilité.

Procédures

Injection dans la cavite abdominale (environ 5 minutes, une fois par jours 3 à 5 jours de suite par souris) Injection intracerebrale (environ 30 minutes, une seule fois par souris) Chirurgie pour utiliser le dispositif (environ 2h30, une fois par souris) Tests comportement anxiété/locomotion (10 min, une fois par souris) Test comportement mémoire (10 min le premier jour, 20 min le deuxième jour, 10 min le troisième jour, une seul fois par souris), Test de préférence sociale (3 x 10 minutes, une fois par souris), Test comportement de sociabilité directe (10 minute le premier jour face à une femelle, 10 minutes le deuxième jour face à un male), Test de dominance (la souris traverse le tunnel 5x pendant 3 jours pendant l'entrainement puis test pendant 10 minutes maximum)

Impact sur les animaux

L’injection dans la cavité abdominale peut induire une douleur et un stress légers à la piqure et une irritation abdominale en lien avec le produit injecté. La craniotomie réalisée pour l'injection de virus et/ou l'implantation peut générer des douleurs. Le dispositif utilisé pour l'imagerie pèse 2g ce qui représente environ 10% du poids de la souris et pourrait causer des nuisances. Les tests comportementaux réalisés pourraient induire une augmentation de l'anxiété.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de pouvoir prélever leur cerveau pour des études en histologie ou biochimie.

Remplacement

Le but majeur du projet est d'étudier le rôle des interactions neurogliales dans les interactions sociales, qui nécessité une approche in vivo sur modèle animal. Il n'existe pas encore de modèles mathématique ou in silico alternatifs permettant l'étude de comportements. De plus, les interactions sociales sont des processus multidimensionnels qui ne peuvent pas être récapitulée sur des lignée cellulaires humaines ou animales ou tout autre modele in vitro, cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux, nous utiliserons le même animal lorsque cela est possible pour analyser les effets au niveau de nos deux régions d'intérêts. Nous estimons qu’une quinzaine de souris est nécessaire lors des expériences de test comportementaux pour obtenir des résultats suffisamment fiables pouvant être testés à l’aide d’un test statistiques. Cependant, compte tenu de possibles aléas liés à l’injection du virus , nous ajoutons 5 souris supplémentaires soit un maximum de 20 groupes par groupe testé. Pour les expériences de séquençage et de caractérisation microscopique et biochimique, une quinzaine de souris est nécessaire pour être testés à l’aide d’un test statistiques.

Raffinement

Les animaux ayant reçus un acte chirurgical seront placés sous surveillance jusqu’au réveil des animaux. Puis, les animaux sont replacés dans leur cage d’origine (avec leur congénères) et seront sous une surveillance renforcée. Les points limites sont définis par des changements dans l'aspect physique/comportement ou si des blessures sont constatées. Les animaux seront euthanasiés si leur bien-être est compromis. Les animaux sont suivis quotidiennement pendant les 5 jours qui suivent la chirurgie. De plus, nous utiliserons la grille d'évaluation du bien-être animal validée par le comité éthique pour suivre quotidiennement les animaux. En cas de douleurs ou de souffrances observés à la suite des chirurgies, nous injecterons un antalgique en sous-cutanée. Avant le premier test de comportement, nous procéderons à une habituation des souris à l'expérimentateur en réalisant une habituation pendant 3 jours consécutifs. Pour les tests d'imagerie endoscopique, les animaux seront habitué pendant 5 jours consécutifs à porter le miniscope sur leur tête pendant 10 minutes.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus répandue dans les laboratoires de Neurosciences aujourd’hui et toutes les lignées transgéniques utilisées ici se basent sur cette espèce. Elle permettra une meilleure reproductibilité des résultats et une meilleure comparaison avec ceux publiés dans la littérature. De plus, ce modèle permet d’étudier les interactions neurones-astrocytes in vivo dans des aspects comportementaux complexes. Dans le but d’étudier les propriétés neuronales et astrocytaires et leurs interactions, les expériences seront réalisées chez la souris adulte (2-5 mois). Contrairement aux jeunes souris en phase de croissance ou aux souris âgées, les adultes ont une certaine stabilité hormonale et comportementale, ce qui peut réduire la variabilité expérimentale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées chez des souris âgées de 1 à 5 mois et les études de comportements seront réalisées au moins 3 semaines après injections stéréotaxiques.

Cinq chocs électriques de 0,6 milliampère en dix minutes : c'est le protocole de stress aigu appliqué à une partie des souris de ce projet sur les mécanismes cérébraux du trouble de stress post-traumatique. 1 100 souris au total vont être utilisées, 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 300 un niveau léger, chacune subissant une chirurgie d'injection dans le cerveau et, pour certaines, une biopsie de queue vers le sixième jour après la naissance. Le porteur annonce vouloir modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale sur simulateur informatique pour diminuer à l'avenir le nombre d'animaux utilisés, sans que cette perspective n'entame les 1 100 souris engagées ici. Toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé et analysé ex vivo.

Objectifs

Les troubles du stress post-traumatique (TSPT) sont des troubles psychiatriques qui surviennent après un événement traumatisant. Ils se traduisent par une souffrance morale et des complications physiques qui altèrent profondément la vie personnelle, sociale et professionnelle." (INSERM). Ces troubles surviennent suivant des épisodes de peur intense, où le souvenir de cet évènement est ensuite revécu par la personne. Ainsi, les TSPT ont pour cause le souvenir anormalement fort de l'événement traumatisant. Leur encodage nait de l'interaction de plusieurs régions cérébrales, parmi lesquelles l'amygdale centrale joue un rôle prépondérant. De plus, cette structure est à la base des réponses autonomes, comportementales et émotionnelles de la peur, faisant de ce noyau une structure de choix pour l’étude des TSPT. Nous nous intéressons tout particulièrement à un type de cellulaire : les astrocytes. Ces cellules ont pour rôle principale d’assurer le bon fonctionnement des neurones à proximité, fonction dont dépend leur morphologie. Aujourd’hui, il est établi que l’ocytocine (OT) via son récepteur (OTR) présent sur les astrocytes de l’amygdale centrale permet la modulation de la réponse émotionnelle lors d’une anxiété, d’une peur ou d’un stress aigu. Ce projet vise à comprendre comment l’OTR, via les astrocytes, module l’activité neuronale. Pour cela, nous couplerons pharmacologie et pharmacogénétique à des enregistrements d’activité des neurones et d’imagerie de fluorescence des astrocytes. Cette étude apportera de nouvelles connaissances quant aux mécanismes d’action des TSPT, via une meilleure compréhension des interactions neurone-astrocyte.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes cérébraux mis en place notamment l’impact de la gliotransmission sur le réseau neuronale au cours d’un stress aigu ce qui permettrait d'ouvrir des voies thérapeutiques permettant de réduire les symptômes de personnes traumatisées ou excessivement anxieuses.

Procédures

La totalité des souris subiront une procédure chirurgicale d'injection cerebrale et une chirurgie terminale pour perfusion avec prélèvement sur animal anesthésié. Certains animaux subiront une biopsie de queue sur animal vigile autour de 6 jours post natal pour réaliser leur génotypage. Enfin, des souris subiront en plus un protocole de stress pendant 10min.

Impact sur les animaux

Pour les expériences sans protocole de stress, la nuisance se limite à l'insertion d'une aiguille pour injecter les anesthésiques. Les injections virales peuvent entrainer des démangeaisons et une légère douleur au site d'incision ainsi qu’une perte de poids sont attendues après l'opération. Le protocole de stress aigu est un protocole qui provoque un stress, une angoisse ainsi qu'une douleur courte et transitoire ne pouvant être evités etant l'essence même de notre étude.

Devenir

Les animaux seront systématiquement mis à mort afin de réaliser une biopsie du cerveau et analyse ex vivo.

Remplacement

Notre étude porte sur l’analyse de l’activité complexe de réseaux neuronaux qui ne peuvent être pour le moment reproduits in vitro ou in silico. Il n’est donc pas possible, à ce jour, de remplacer l’usage d’animaux vivants. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef. Ce projet est donc une étude de physiologie intégrée, reposant sur un dialogue entre le cerveau et le corps.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au strict nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. L'effectif a été évalué en se basant sur les travaux réalisés précédemment dans l'équipe. Cependant, nous comptons modéliser le réseau astro-neuronal de l'amygdale à l'aide du simulateur Brian2 afin de permettre par la suite de tester si les conclusions concernant le rôle des astrocytes dans la neuromodulation de l'amygdale sont aussi vraies dans d'autres structures avec seulement quelques expériences clef. Lors de notre étude, nous allons modéliser les réseaux neuronaux avec les astrocytes au niveau de notre structure nous permettant à l'avenir de diminuer le nombre d'animaux utilisés

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupes sociaux dans des cages enrichies. Les souris seront observées quotidiennement (aspect du pelage, mobilité, absence de prostration). Une attention particulière sera portée aux signes de stress, qui sera limité au maximum par une manipulation des animaux au moyen d’un tunnel. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie et analgésie adaptées. Nous utiliserons aussi des tapis chauffant afin de maintenir la température corporelle des animaux tout au long de la chirurgie. Un gel hydratatnt sera aussi placé sur les yeux pour éviter leur dessèchement. Après la chirurgie, de la nourriture hydratée et des croquettes seront déposés dans la cage afin de faciliter l'hydratation et la prise de nourriture. Des points limites précoces et spécifiques aux procédures ont été établis ce qui permettra d'interrompre les procédures à tout moment et donc soustraire l'animal à la souffrance. Pour le protocole de stress, des tests préalables ont déjà été réalisés dans nos études précédentes sur : 1) le nombre de choc (5) et 2) la l'intensité de ces derniers (0,6mA) qui correspondent à la bibliographie du domaine.

Choix des espèces

Le modèle expérimental chez la souris est un standard pour ce type d'expérience et comporte une série de symptômes superposables avec la pathologie humaine. La grande majorité des expériences réalisées à ce jour concernant l'action de l'ocytocine au sein de l'amygdale ont été effectuées chez la souris. Ainsi, il nous pourrons aisément comparer et interpréter les résultats et pour la qualité des mesures effectuées, il est préférable de travailler chez cette espèce. De plus, nos différentes procédures ont besoin de modèles génétiquement modifiés qui n’existe que chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, ce qui correspond à environ 5 semaines. En effet, nous nous intéressons ici à un mecanisme qui n'est pas développemental et pour cette raison nous souhaitons utiliser des animaux matures. Sachant que l'encéphale se développe encore jusqu'à la cinquième semaine, nous avons donc choisi d'utiliser des animaux à partir de 5 semaines.

Une ou deux chirurgies d'une heure chacune, espacées de deux semaines, pour injecter des traceurs dans le cerveau et la moelle épinière : 540 souris vont être utilisées, toutes tuées, lors d'une chirurgie terminale ou plus tôt lorsque leur génotype ne convient pas. 440 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 100 un niveau léger, une biopsie d'oreille sur animal éveillé servant au génotypage des lignées transgéniques. Le projet cherche à savoir si des neurones de la formation réticulée compensent la perte des neurones moteurs dans la sclérose latérale amyotrophique. Le porteur justifie la souris par la disponibilité de plusieurs lignées mutantes et par le fait que la multiplication des modèles est, écrit-il, désormais requise pour convaincre la communauté scientifique.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la plus fréquente des maladies neurodégénératives du neurone moteur adulte. Elle induit une paralysie progressive des patients et conduit irrévocablement au décès 2 à 5 ans après l’apparition des premiers signes. Elle demeure encore incurable. Environ 10% des patients présentent des mutations dans des gènes qui ont été identifiés et ont permis le développement de souris transgéniques qui reproduisent les symptômes de la maladie. La SLA découle de la mort de neurones impliqués dans le contrôle des muscles et présents dans deux régions : 1) la partie supérieure du cerveau (cortex cérébral) et 2) la moelle épinière. Ces neurones qui dégénèrent au cours de la SLA sont en interaction avec une troisième population neuronale impliquée dans le contrôle des muscles et situées entre ces deux populations, dans une région appelée formation réticulée. Malgré ces interactions, on ne connaît ni le devenir au cours de la maladie, ni la contribution à la maladie des neurones de la formation réticulée. Partant de résultats scientifiques obtenus dans d’autres contextes pathologiques, nous émettons l’hypothèse que les neurones de la formation réticulée pourraient compenser les pertes des neurones directement ciblés par la SLA, et représenter une population neuronale d’intérêt thérapeutique. Pour tester cette hypothèse, nous proposons 1) de marquer et quantifier les neurones de la formation réticulée, et 2) de marquer et quantifier les neurones du cortex cérébral (en amont), qui se connectent directement aux neurones de la formation réticulé

Bénéfices attendus

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative pour laquelle il n’existe aucun traitement curatif. Histologiquement et cliniquement elle se définit comme la dégénérescence des neurones moteurs du cortex cérébral et de la moelle épinière. Cependant, ceux-ci sont en interaction avec d’autres neurones moteurs, notamment dans la formation réticulée, dont la contribution à la maladie n’a pas encore été évaluée, et qui pourraient compenser, sur le plan fonctionnel, les pertes des autres neurones, et représenter de fait une nouvelle population neuronale d’intérêt thérapeutique. Dans ce contexte, nous nous proposons d’évaluer le devenir des neurones moteurs de la formation réticulée dans des modèles de sclérose latérale amyotrophique, afin de développer de potentielles nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à trois types d’intervention : - Une biopsie de l’oreille sur animal vigile pour permettre le génotypage des animaux transgéniques. - Une chirurgie unique, ou deux chirurgies successives, sur animaux anesthésiés, espacées de deux semaines, d’une durée de 1 heure maximum chacune pour injecter au sein du cerveau ou de la moelle épinière les traceurs permettant d’identifier les neurones d’intérêts et leurs connexions. - Une chirurgie terminale, sur animaux anesthésiés, pour prélever les organes d’intérêt : cerveau et moelle épinière.

Impact sur les animaux

1. Un stress induit par la séparation souriceaux/ mère, une contention douce, et une douleur légère à l’oreille lors de la biopsie requise pour le génotypage des animaux. L’ensemble de la procédure dure moins d’une minute. 2. Une partie des animaux pourraient présenter de légères atteintes motrices et une perte de poids inférieure à 10%. 3. Des chirurgies qui peuvent entraîner des douleurs modérées dues à une inflammation transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes d’intérêt (cerveau et moelle épinière), ou en raison d’un génotype non conforme.

Remplacement

Ce projet consiste à déterminer, dans un contexte neurodégénératif, le devenir et le rôle de neurones impliqués dans le contrôle moteurs, et en interaction avec deux populations neuronales situées en amont et en aval et ciblées par la SLA, au sein du système nerveux central de mammifère. Une telle complexité des réseaux neuronaux ne peut pas, à l’heure actuelle, être reproduite in vitro. En effet, les organoïdes ne permettent actuellement que de modéliser deux des trois régions du cerveau qui sont investiguées ici. En conséquence, dans le cadre de la question biologique posée, le modèle animal ne saurait être remplacé par un modèle cellulaire ou in sillico.

Réduction

D’après les travaux préliminaires de notre consortium de recherche (composé d’experts de la moelle épinière, de la formation réticulée et du cortex cérébral), un nombre minimum de 8 animaux (4 femelles et 4 mâles) pourrait suffire pour mettre en évidence une modification statistiquement significative des populations neuronales d’intérêt ou de leur connectivité. Ici, nous proposons des groupes de 10 animaux afin de pouvoir exclure éventuellement un (ou plusieurs) animal(aux) si la qualité de certaines chirurgies s’avérait insuffisante. Nous proposons donc de commencer les expériences avec 8 animaux par groupe, et de n’inclure davantage d’animaux que si nécessaire. Le nombre d'animaux a été évalué pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Pour limiter le nombre total d’animaux générés, nous proposons ici d’utiliser les femelles et les mâles issus de mêmes portées.

Raffinement

L’enrichissement de l’environnement des animaux (bâtonnets à ronger, coton compressé pour faire des nids, frisure, tunnels), le maintien des interactions sociales et la surveillance quotidienne des animaux permettront d’assurer leur bien-être et de détecter rapidement tout changement de comportement associé ou non à la pathologie étudiée afin qu’il puisse être pris en charge. Les animaux seront utilisés avant l’apparition de symptômes moteurs sévères. Nous appliquerons également le principe de raffinement au niveau des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoires. Enfin, des points limites spécifiques au phénotype des animaux, ou aux chirurgies ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Parmi les modèles de SLA, les souris sont les plus appropriées à notre étude car 1) elles présentent le niveau de complexité du cerveau et de la moelle épinière adéquat, 2) il existe plusieurs lignées de souris qui, dans leur ensemble, couvrent plusieurs mutations retrouvées chez les patients contrairement aux modèles de primates (très rares) ou de rats (peu fréquents), et la multiplication des modèles est désormais requise pour convaincre la communauté scientifique, et 3) elles permettent davantage de manipulations génétiques, par croisement, qui permettent en outre de répondre également à des questions mécanistiques. Les animaux seront utilisés à partir de 45 jours et jusqu'à 90 jours ou 120 jours maximum selon les lignées, et dans tous les cas avant l’apparition de symptômes moteurs sévères.

820 poissons zèbres juvéniles vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, certains passant deux à trois heures dans un test de mémoire dont une heure entière de stimulations électriques. Ils subissent aussi la coupe d'un fragment de nageoire caudale sous anesthésie brève, des séances d'imagerie, et pour d'autres une exposition à des agents pharmacologiques par bain ou par injection. Le porteur qualifie ces chocs de faible intensité et affirme qu'ils n'induisent pas de douleur, tout en retenant le nombre de stimulations reçues par un même individu comme l'un des deux points limites de la procédure. Les poissons expérimentaux sont tués à l'issue, les reproducteurs porteurs de la mutation liée au syndrome Kabuki étant gardés en vie pour maintenir la lignée.

Objectifs

Le syndrome Kabuki, principalement causé par un exemplaire non fonctionnel d'un gène identifié chez l’homme, est caractérisé par une déficience intellectuelle et des troubles immunologiques pour lesquels il n'existe à l'heure actuelle aucun traitement. Les mécanismes à l'origine de ce syndrome ne sont pas élucidés. Les 3 principaux objectifs du projet sont : (1) de modéliser les anomalies au niveau du système immunologique et du système nerveux du syndrome Kabuki grâce à une lignée de poissons dont l'un des 2 exemplaires du gène correspondant n’est pas fonctionnel; (2) de caractériser chez ces poissons les problèmes induits par le défaut génétique au niveau des cellules nerveuses et immunitaires, et enfin (3) de tester l’effet thérapeutique de plusieurs agents pharmacologiques.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait d’abord valider l'utilisation du modèle pour étudier les troubles immunologiques et du système nerveux du syndrome Kabuki. Une fois ce modèle validé, il nous aidera à déterminer quels sont les gènes et les types cellulaires plus spécifiquement impliqués dans la survenue des problèmes immunologiques et nerveux associés à ce syndrome. Enfin, les tests avec des agents à visée thérapeutique réalisés à la fin de ce projet pourraient aboutir à de nouvelles pistes pour le développement de traitements pour les patients.

Procédures

L’utilisation d’une lignée de poissons-zèbre déficiente pour un gène particulier portant une mutation nécessite de vérifier la présence de cette mutation. Pour cela, une unique procédure d'identification à partir du prélèvement d’un fragment de tissu de la nageoire caudale est réalisée sous anesthésie générale brève (

Impact sur les animaux

La nageoire régénérant rapidement et spontanément chez cette espèce, le prélèvement d'un fragment de tissu de la nageoire caudale ne crée pas de gêne ou d’incapacité durable chez les animaux maintenus en hébergement. Réalisée par un personnel qualifié, elle n’induit généralement aucune douleur. Au cours des tests comportementaux, la stimulation électrique sera calibrée de façon à ne pas interrompre l'exploration spontanée des animaux selon des protocoles bien documentés qui n’induisent pas de douleur. Une attention particulière sera toutefois portée : 1) aux signes de stress, notamment lors de l’introduction dans la zone de test, et 2) au nombre de stimulations subi par un même individu lors de la phase de conditionnement. Ces deux paramètres constituent les points limites majeurs pour cette procédure. Lors des tests pharmacologiques, qui peuvent générer du stress et/ou de l’inconfort sur les animaux, le comportement de nage et la prise alimentaire des animaux expérimentaux seront donc surveillés avec attention durant et après le traitement selon des grilles de scoring adaptées.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à l’issue des procédures décrites dans cette demande d'autorisation de projet, exceptés les animaux portant un exemplaire non fonctionnel du gène d'intérêt, et identifiés après une procédure de vérification de la présence de cette mutation. Ces derniers seront gardés en vie afin de maintenir la lignée à l'état hétérozygote pour assurer la reproduction lors du projet.

Remplacement

Le comportement des poissons et le fonctionnement des cellules immunitaires ne peuvent être étudiés qu’in vivo au niveau d’un organisme entier, il n’est donc pas possible de remplacer l'utilisation d'animaux vivants pour ce projet de recherche. Le comportement examiné et les cellules immunitaires d'intérêt n’étant matures qu’aux stades juvéniles, il n’est pas possible de mener cette étude à des stades précoces du développement.

Réduction

Nous réaliserons une expérience pilote chez des larves de moins de 5 jours de développement afin de déterminer quel agent thérapeutique de notre panel compense le mieux les effets de la mutation de notre gène d'intérêt chez l’espèce étudiée et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. Le nombre d’individus à utiliser a été calculé afin d’obtenir des résultats fiables et statistiquement significatifs. Enfin nous avons établi des procédures en étapes successives, ce qui permet de stopper l'expérimentation dès que les objectifs scientifiques sont atteints.

Raffinement

Les poissons utilisés sont maintenus avec un seul exemplaire du gène d'intérêt non fonctionnel, ce qui permet d'éviter l'apparition de défauts dommageables pour le bien être des animaux au cours de l'expérimentation. Des grilles d'évaluation seront utilisées pour effectuer un suivi complet du bien-être des animaux selon leur aspect, leur activité, leur prise alimentaire et leur comportementet afin de définir des points limite adaptés en fonction de leur âge. Cette surveillance fine permet, à chaque étape du projet, de prendre des mesures adaptées pour réduire les nuisances sur le bien-être des animaux voire d'interrompre l'expérimentation. Une grande attention sera portée aux conditions d’hébergement et le comportement de nage ainsi que la prise alimentaire des animaux reproducteurs seront l’objet d’une surveillance régulière, trois fois par jour.

Choix des espèces

Le poisson-zèbre a été choisi pour ce projet car les processus biologiques étudiés (mémoire, immunité) ont été bien décrits chez cette espèce. De plus, une lignée de poissons mutante pour le gène d’intérêt a déjà été générée et son étude à des stades précoces a montré l’existence d'atteintes chez ces poissons semblables à celles du syndrome Kabuki. Ces résultats indiquent donc que le poisson-zèbre est un modèle de choix pour permettre à la fois d’étudier les mécanismes de la maladie humaine et de procéder à des tests pour de nouveaux agents thérapeutiques. Les poissons seront utilisés à des stades juvéniles (1 à 2 mois de vie) pour toutes les procédures décrites et sont justifiés scientifiquement par des études préalables qui ont démontré que : 1) le comportement que nous allons tester chez les poissons mutants se développe seulement à partir de 3 semaines de vie, et que 2) concernant l’étude immunologique, les cellules d’intérêt sont impliquées dans la régénération de la nageoire entre 3 et 8 semaines de vie. Une étude pilote utilisant des jeunes larves sera également menée afin de sélectionner de façon rapide et fiable le(s) meilleur(s) candidat(s) parmi les agents pharmacologiques à tester ensuite à des stades plus tardifs.

Toutes tuées à l'issue pour des analyses histologiques, 900 souris porteuses d'une mutation qui reproduit la maladie d'Alzheimer vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Certaines subissent une chirurgie cérébrale d'une heure pour marquer les nouveaux neurones, d'autres un gavage suivi de quatre prélèvements espacés d'une heure, dont le porteur reconnaît que la douleur dure quelques jours jusqu'à cicatrisation. L'objet est de comparer l'effet d'un accès volontaire à une roue d'exercice selon qu'il commence à l'adolescence ou à l'apparition des troubles de mémoire. Les roues sont retirées la journée, et les trois tests comportementaux censés mesurer la mémoire ne sont pas nommés.

Objectifs

Le projet vise à étudier si l'exercice physique volontaire, pratiqué avant ou après le développement post-natal du cerveau, c’est à dire pendant ou après l’adolescence, déclenche des mécanismes biologiques différents et responsables d’effets bénéfiques sur le cerveau. Des données cliniques et épidémiologiques montrent que l'activité physique est une stratégie efficace pour promouvoir le vieillissement en bonne santé et ralentir le déclin de mémoire lié à certaines maladies neurologiques, comme la maladie d'Alzheimer (MA). L'exercice, tant chez les animaux que chez les humains, est une composante accessible de l’hygiène de vie. Il favorise un état anti-inflammatoire, améliore la fonction antioxydante et stimule la plasticité du cerveau. De plus, des facteurs sanguins sécrétés après l'exercice contribuent à son action neuroprotectrice : une étude a montré que le transfert de sang d'une souris active à une souris sédentaire imite les effets de l'exercice au niveau du cerveau, soulignant son effet systémique. Le microbiote intestinal, modifié par l'exercice, pourrait également jouer un rôle crucial dans la promotion de la santé. Comprendre quand et comment l'exercice retarde l'apparition de la MA est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques efficaces. Nous faisons l’hypothèse que la période de la vie durant laquelle l'activité physique est pratiquée a une influence sur les bénéfices engendrés pour prévenir ou ralentir le déclin de mémoire. Des données de la littérature suggèrent que comparé à l'exercice à l'âge adulte, l'exercice à l'adolescence affecte différemment les processus de mémoire et la plasticité du cerveau chez les rats adultes. Ainsi, nous examinerons d’abord si une activité physique volontaire à l'adolescence ou au début de l'âge adulte entraîne un effet optimal sur le ralentissement du déclin de mémoire dans le modèle murin de la MA, à l’aide de tests comportementaux. Ensuite, nous explorerons les changements biologiques (centraux et périphériques) induits par l'exercice, susceptibles d’engendrer des effets différents sur la mémoire, à l'âge adulte.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à fournir des perspectives complètes sur l’impact de l'exercice physique dans la maladie d'Alzheimer (MA) en utilisant un modèle murin. En comparant l’impact de l’activité physique initiée pendant l'adolescence ou au début des symptômes de la MA sur la mémoire, nous déterminerons la période de vie pendant laquelle l’activité sportive a un effet optimal. Les investigations moléculaires rechercheront des changements dans certains mécanismes cérébraux décisifs pour les processus de mémoire, qui sont affectés dans la MA et qui pourraient être rétablis par l’exercice physique. L’étude de marqueurs périphériques circulants permettra d’identifier des mécanismes spécifiques activés par l'exercice ayant pour effet de protéger le cerveau. L’analyse des changements du microbiote permettra d’établir des profils de présence et/ou absence de certains marqueurs (changement dans la proportion de bactéries, changement dans la perméabilité intestinale …) en fonction des différents groupes. Finalement, cette recherche vise à approfondir notre compréhension du décours et des mécanismes induits par l'exercice physique et permettant d’améliorer la résistance du cerveau malgré la MA, ce qui pourrait éclairer de futures stratégies thérapeutiques.

Procédures

Certains animaux auront un gavage oral qui dure 30 secondes. Ces mêmes animaux auront 4 prélèvements espacés de 1h chacun. Pour certains animaux, 3 tests comportementaux seront effectués au cours de 2 à 3 semaines. Ils peuvent induire du stress du fait du déplacement des souris vers de nouvelles pièces et de la mise en contact avec de nouveaux objets. Pour limiter ce stress, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs expérimentaux. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Pour certains animaux, une injection sera réalisée par jour, pendant 4 jours consécutifs. La prise en contention et l’injection sont susceptibles de causer un stress léger, ainsi qu’une douleur légère qui dure environ 2 minutes. Finalement, certains animaux seront soumis à une chirurgie permettant de marquer des nouveaux neurones. Chaque chirurgie durera 1h maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables peuvent être dus à l’activité physique qui peut induire une légère perte du poids. Aussi, la prise en contention des animaux est susceptible de causer un stress léger. Certains animaux recevront une substance par gavage oral. Cette procédure représente une nuisance légère pour l’animal en raison de l’insertion d'une sonde dans l'œsophage. Ces mêmes animaux, auront des prélèvements qui peuvent induire une douleur légère. Ces prélèvements sont répétés 4 fois, avec un intervalle de 1h entre chaque. La douleur due aux prélèvements dure quelques jours jusqu’à cicatrisation de la plaie. Ceci représente une nuisance modérée car les prélèvements sont réalisés juste après le gavage. Certains animaux seront évalués dans des tests comportementaux. Ceux-ci ne provoquent qu’un stress léger ou modéré pour les animaux. De plus, pour quelques animaux, des injections sont susceptibles de causer une légère douleur. Ceci représente une nuisance légère. D’autres souris seront soumises à une chirurgie. Des effets indésirables de cette procédure peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : isolement, indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire ou une perte de poids. De plus, les chirurgies peuvent induire une douleur modérée au stade post opératoire durant quelques jours. Ceci représente une nuisance modérée.

Devenir

A l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort en vue d’analyses histologiques quantitatives.

Remplacement

Le projet a pour but d’évaluer, in vivo, l’impact de la période de la vie de l’animal (à l’adolescence ou au début des symptômes mnésiques à l’âge adulte) où l’exercice physique ralenti de façon optimale le déclin de mémoire associé à la MA. Un aspect important de ce projet est donc de pouvoir mesurer les capacités mnésiques des souris après l’exercice physique. Pour cela, un modèle animal est indispensable. De plus, nous allons étudier l’impact de l’activité sportive sur la physiologie de l’animal au niveau central (cerveau) et périphérique (sang, intestin…) où un dialogue et des interactions complexes se produisent entre le cerveau et les organes, des processus qui ne sont pas modélisables à ce jour.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe (n= 15) a été déterminé sur la base de nos études antérieures chez ce modèle murin et à l’aide de la littérature correspondante. Ce nombre est réduit au minimum pour permettre d’obtenir une puissance statistique suffisante pour les analyses statistiques nécessaires aux comparaisons intergroupes (8 groupes) et intra-groupes (comparaison des prélèvements à différents moments de la vie de l’animal). Ce nombre prend également en compte l’éventualité certains animaux ne montreront pas d’exercice physique volontaire en présence de la roue et seront donc retirés de l’étude. Ce nombre prend aussi en compte l’existence d’une variabilité inter-individuelle dans les études comportementales. Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les animaux seront testés dans plusieurs tests comportementaux et nous utiliserons les mêmes animaux pour les études comportementales et post-mortem.

Raffinement

Les souris sont hébergées par 4 ou par 2 dans des cages contenant du matériel de nidification ainsi qu’une buchette pour l’enrichissement. Les roues d’exercice seront retirées pendant la période d’inactivité (la journée) pour encourager le repos des animaux. Pour limiter le stress lié au déplacement des souris vers de nouvelles pièces et à la mise en contact avec de nouveaux objets lors des tests comportementaux, les souris disposeront de périodes d’habituation aux pièces et aux dispositifs. Pour chaque souris, le temps maximal de tests sera limité à 1h30 par jour. Deux jours de manipulation sont également prévus afin que les souris s’habituent à l’expérimentateur dans la salle des tests comportementaux. Une attention particulière sera portée aux souris pendant les périodes d’exercice physique où le poids sera surveillé 1 fois par semaine et comparé au poids de référence avant le début de l’activité sportive. De plus, les animaux seront suivis quotidiennement par des personnes formées au soin. Les critères évalués sont l’aspect général de l’animal (pelage, peau, yeux, bouche), les fonctions corporelles (respiration), le comportement (posture, locomotion, réaction à la manipulation, isolement) et le poids (pesée une fois par semaine). Pendant les chirurgies, les animaux seront placés sur une couverture chauffante permettant de contrôler leur température corporelle. Un gel oculaire sera appliqué afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux seront surveillés jusqu'à leur réveil complet (déplacements spontanés dans la cage, prise d'eau et de nourriture) et 6 heures plus tard. Après l’opération, l’animal sera isolé dans une cage propre contenant du papier ; il sera maintenu au chaud en prêtant une attention particulière à son hydratation et son état sera contrôlé. Les souris recevront une injection d'anti-inflammatoire après la chirurgie et le lendemain pour éviter les éventuelles douleurs post-opératoires. La cicatrisation de la plaie sera également contrôlée dans les jours suivant la chirurgie.

Choix des espèces

Dans cette étude, nous utiliserons une lignée de souris transgéniques modèles de la maladie d’Alzheimer (MA). Cette lignée est l'un des modèles précliniques de MA les plus étudiés, en raison de l’évolution progressive de la pathologie, qui ressemble à ce qui est observé chez les patients atteints de MA. Les souris de cette lignée développent avec l’âge des plaques amyloïdes, comme chez le patient. Cette lignée constitue donc un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice physique à diverses périodes de la vie, sur le déclin de mémoire lié à l’âge dans la MA. Les animaux les plus jeunes inclus dans le projet auront 28 jours (P28) (soit plusieurs jours après le sevrage) et les animaux les plus vieux auront 10 mois (adulte). Nous allons évaluer l’impact de l’exercice physique sur le déclin de mémoire lié à la MA en fonction la période de vie à laquelle l’exercice est pratiqué : pendant le développement post-natal (P28) ou au début des symptômes cognitifs (à 6 mois). Ceci explique que des animaux jeunes mais sevrés (P28) soient nécessaires.