Système nerveux

Placées dès le sevrage, à trois semaines, sous régime hyperlipidique ou standard pendant douze semaines, 1 300 souris mâles et femelles enchaînent ensuite quatre tests comportementaux espacés d'au moins 48 heures. Une partie subit une chirurgie stéréotaxique d'une heure, une partie des femelles une ovariectomie, et 52 d'entre elles un jeûne de cinq heures suivi de sept prélèvements sanguins en deux heures. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, le conditionnement de peur pouvant provoquer un stress aigu durant 24 heures et la chirurgie une perte de poids limitée à 13 %. Toutes finissent par une mesure de masse grasse de deux minutes, un dernier prélèvement de sang, puis la mise à mort pour récupérer les cerveaux.

Objectifs

Si l’obésité est un réel problème de santé publique, générant une diminution de l’espérance de vie en raison des maladies qu’elle entraîne (hypertension, cancers, diabètes …), elle est également associée des déficits de mémoire. Ceci est d’autant plus problématique pendant l’enfance et l’adolescence qui représentent des périodes de maturation de certaines structures du cerveau indispensables pour la mémoire, comme l’hippocampe. Notre équipe a récemment mis en évidence chez la souris que la consommation d'une nourriture hyperlipidique (HL) pendant l'adolescence, en plus d'entrainer l’obésité, perturbe la mémoire et ceci implique un important système neuromodulateur, le système endocannabinoïde (SEC), au sein d’une structure particulière du cerveau (l'hippocampe). Nos études, tout comme la quasi-totalité des études de la littérature, ont utilisé des souris mâles comme modèle de l'obésité. Cependant chez l'humain, l'obésité affecte hommes et femmes de façon équivalente. Ainsi, pour élargir l'étendue de ces découvertes chez l'Homme, l’équipe s’est récemment intéressée aux deux sexes en incluant l'utilisation de souris femelles. Il a pu être démontrer que la nourriture HL consommée à l’adolescence a bien des effets délétères sur la mémoire des souris femelles, semblable à ceux observés ultérieurement chez les mâles. Bien que le SEC soit également impliqué chez la femelle, les types cellulaires et/ou les structures cérébrales mis en jeu semblent différentes de celles des mâles. L'objectif du présent projet est d'identifier les mécanismes neurobiologiques impliqués dans les déficits de mémoire induit par la consommation d'un régime obésogène hyperlipidique à l’adolescence chez les deux sexes, afin de mieux considérer l'effet genre. Pour cela, des souris mâles et femelles seront exposées pendant 12 semaines à un régime hyperlipidique (HL) ou standard (Cont) avant de réaliser des tests comportementaux simples permettant d’évaluer la mémoire. L’ensemble des procédures proposées est en conformité avec les directives européennes 2010/63/UE et françaises, dans le respect des nouveaux standards de soin et de bien-être des animaux (règle des 3Rs).

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux subiront, à au moins 48h d’intervalle, quatre tests comportementaux. Chaque étape de ces tests dure entre 6 et 10 minutes. Une partie des animaux (52) subira une fois un jeune de 5h préalablement aux mesures métaboliques (7 prélèvements sanguins sur une durée de 2 h). Une partie des animaux subira une intervention chirurgicale. La chirurgie stéréotaxique, réalisée sous anestésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire, dure 1h avec une phase de réveil de 20 minutes. Une partie de femelles subira également une ovariectomie, réalisée sous anesthésie gazeuse et en présence d'antalgique et d'anti-inflammatoire. Cette intervention dure 15 minutes avec une phase de réveil de 5 minutes. Tous les animaux subiront en fin d’expérimentation, une seule analyse en imagerie d’une durée de 2 min afin d’évaluer la répartition de leur masse grasse/masse maigre et un seul prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

L’alimentation obésogène donnée pendant 12 à 15 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes, comme ceux utilisés dans notre étude. Les tests de comportement, ainsi que les injections intra-péritonéales peuvent induire un stress qui sera limité par une habituation à la manipulation et à l'injection avant expérimentation. Les prélèvements de sang à la queue durant le test de tolérance au glucose (GTT) pourront engendrer une légère douleur aux animaux. La chirurgie stéréotaxique pourra entraîner dans les 48h suivant l’opération une douleur et un stress se traduisant par une perte de poids qui doit se limiter à 13% du poids initial. La phase d'acquisition du conditionnement de peur pourrait induire une gêne passagère des animaux et entraîner un stress aigu qui pourrait se poursuivre pendant 24h, mais nos précédents tests n’ont pas montré d’effet sur l’état général ou le poids des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en vue de récupérer leurs cerveaux pour des analyses biochimiques ou des contrôles histologiques.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et du fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène et il n’est pas possible de le remplacer par des approches cellulaires sur des modèles in vitro ou in silico. Les tests comportementaux utilisés font appels à des comportements spontanées chez les rongeurs. Les chirurgies sont courtes mais nécessaires pour réaliser des manipulations chémogénétiques dans le cerveau et restent peu invasives dans la vie de l'animal. Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire les souffrances inutiles et réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. De plus, le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats concluants et permettre des comparaisons statistiques fiables. Cela représente un total de 1300 (702 femelles et 598 mâles) sur 5 ans. Ces expériences devraient permettre une meilleure compréhension des effets d'une nourriture HL sur le cerveau et la mémoire en identifiant certains mécanismes afin d'envisager potentiellement à plus long terme des stratégies thérapeutiques.

Raffinement

Un soin particulier sera porté au bien-être de l'animal tout au long de sa vie. Les souris recevront de l’eau et de la nourriture à volonté et seront surveillées régulièrement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré- et post-opératoire pour limiter la douleur. Toutes les précautions d'asepsie et de confort seront prises pour limiter l'inconfort des animaux (application d'un gel ophtalmique, opération sur tapis chauffant, ré-hydratation post-chirurgie). Les jours suivant la chirurgie, les animaux sont surveillés attentivement une fois par jour pour s’assurer de leur bon rétablissement. Avec la mise en place de points limites, si un animal présente une anomalie, il sera immédiatement isolé, surveillé et soigné par la prise d’un anti-inflammatoire pendant 3 jours jusqu’à amélioration. Durant les mois suivant la chirurgie, les animaux seront surveillés tous les jours de la semaine et pesés 1 fois par semaine par un personnel qualifié. S’il n’y a aucun signe de mal-être chez l’animal, il passera en phase comportementale qui sera optimisée pour durer le moins de temps possible. L’expérimentateur prendra le plus grand soin en manipulant l’animal et les tests comportementaux seront le moins stressant (lieu calme, acclimaté et inoffensif) et les souris seront remises avec leurs congénères entre chaque phase de test. Les injections pharmacologiques seront réalisées de façon aigüe de sorte à limiter les interventions sur l’animal.

Choix des espèces

Le modèle de rongeur soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. En particulier, les tests comportementaux permettant d’évaluer chez l’animal vigile les dimensions cognitives et émotionnelles sont une nécessité expérimentale pour évaluer la réalité physiologique de nos résultats. Les souris seront exposées aux régimes obésogène ou contrôle dès le sevrage (3 semaines d’âge) et pendant 12 semaines afin de couvrir la période de l'adolescence. Les approches immunohistochimiques et biochimiques permettent d’appréhender les mécanismes physiologiques régissant l’effet de différents apports nutritionnels sur les fonctions cérébrales.

Opérés un jour après leur naissance, au cours d'une chirurgie de quinze minutes, 240 ratons Wistar vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les seuls effets déclarés sont une fatigue et un ralentissement de la prise de poids pendant les 24 heures suivantes. L'objet du projet est de comparer le métabolisme énergétique du cerveau des nouveau-nés mâles et femelles, le porteur écrivant que les organoïdes et les modèles d'hypoxie cellulaire "s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier". L'effectif est présenté comme intégrant une marge pour les injections qui n'auraient pas fonctionné, sans chiffre associé, et les 240 ratons sont tués pour prélèvement du cerveau.

Objectifs

Le cerveau, bien qu’il ne représente que 2 % de la masse corporelle d’un adulte, consomme à lui seul 25 % des besoins énergétiques totaux, une proportion qui atteint jusqu’à 40 % chez les enfants. Si le glucose demeure la principale source d’énergie pour le cerveau adulte, le rôle du lactate dans son métabolisme est également un sujet d'exploration. Une meilleure compréhension du métabolisme énergétique cérébral chez le nouveau-né, en prenant en compte les différences liées au sexe, pourrait permettre de définir de nouvelles pistes thérapeutiques dans un contexte de pathologies cérébrales pédriatiques caractérisées par un déficit énergétique.

Bénéfices attendus

Il est attendu de ce projet de combler une lacune dans le domaine de la neuroénergétique. Ce projet offrira une compréhension de la coopération cellulaire qui sous-tend les différences entre le cerveau des nouveau-nés masculins et féminins.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule intervention. Un jour après la naissance, ils subiront une chirurgie d'une durée de 15 minutes.

Impact sur les animaux

Fatigue et ralentissement de la prise de poids modérés pendant les 24h suivant le geste chirurgical.

Devenir

Mise à mort de tous les aniamux pour prélèvement du cerveau post-mortem (n=240).

Remplacement

Des modèles d’organoïdes ainsi que des modèles d’hypoxie cellulaires existent (OGD : oxygen glucose deprivation), cependant, ces modèles s’affranchissent de la (patho)physiologie de l’organisme entier. Le but final de notre projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative, prenant en compte, entre autres la dimension sexuée. De ce fait, notre projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de comprendre le métabolisme cérébral en fonction du sexe il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Notre projet est construit avec un nombre d’animaux prenant en compte un nombre d’animaux pour lesquels les injections n’auraient pas fonctionné. Si les injections sont réussies à 100%, nous utiliserons moins d’animaux. Les différences inter-groupes seront mises en évidence par des tests statistiques.

Raffinement

Lors des chirurgies, avant anesthésie un antalgique sera administré. Le réveil des ratons et la récupération de la température corporelle s’effectueront dans un caisson ventilé. Les ratons seront surveillés plusieurs fois par jour pendant 3 j puis de manière hebdomadaire. La mise en place d’une grille de scorage et l’utilisation de points limites adaptés permettront la délivrance d’un antalgique si une douleur est constatée. La cicatrisation sera contrôlée ; en cas d’infection de la plaie un désinfectant et un antalgique seront administrés. Au niveau de l'hébergement, les animaux seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un sizzle pad (lanière de papier kraft vierge).

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat Wistar. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences. Enfin, cette étude viendra complétée les investigations menées par nos collaborateurs.

Six macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à la fin du projet pour une étude post-mortem du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie d'implantation pouvant durer six heures, des injections répétées de neurotoxine sur quatre mois qui les rendent parkinsoniens, un isolement de 72 heures après chaque injection, une tâche de vigilance de deux heures trois jours par semaine et des tests de latence d'endormissement de trois heures répétés au moins dix fois par condition. Un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place pour maintenir leur motivation. La luminothérapie ayant déjà été publiée chez la souris et le rat, avec des essais cliniques en cours, le porteur affirme qu'une étude chez le primate non humain reste "nécessaire" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les troubles du sommeil sont très fréquents dans la population et leur fréquence augmente considérablement chez les patients atteints de la maladie de Parkinson. Ce projet vise à évaluer l’effet de la lumière proche de l’infrarouge appliquée de façon non invasive sur les troubles du sommeil et leur répercutions sur la qualité de l’éveil dans la maladie de Parkinson. Les expérimentations seront réalisées chez l’animal sain puis rendu parkinsonien. La lumière sera appliquée de deux façon différente : en aigue (effet thérapeutique) et en semi-chronique (effet préventif). Dans ces 2 cas, le protocole sera identique, seul le mode d’administration de la lumière sera différent.

Bénéfices attendus

Environ 70 pourcents des patients atteints de la maladie de Parkinson souffrent aussi de troubles du sommeil. Dans la population 1 français sur 3 souffrent d’un mauvais sommeil. Un trouble du sommeil retentit sur la qualité de l’éveil, la physiologie et l’activité des structures cérébrales, ainsi un meilleur sommeil contribuerait à considérablement améliorer la qualité de vie et la santé des sujets sains ou atteints de maladies neurologiques. Ce projet propose d’évaluer l’effet de la luminothérapie, appliquée de façon non invasive, sur les troubles du sommeil. Le contrôle des troubles du sommeil permettrait une meilleure prise en charge des patients atteints de la maladie de Parkinson et contribuerait à améliorer leur qualité de vie. Enfin, il apparait que les troubles du sommeil sont des facteurs aggravants dans les maladies neurodégénératives, ce projet permettrait aussi d’envisager la dimension neuroprotectrice du sommeil.

Procédures

Tout au long du projet, les animaux réaliseront une tâche comportementale de vigilance qui prendra au maximum 2h par jour, à heure fixe et 3j sur7. Elle se déroulera à l’état conscient dans la cage à laquelle ils sont habitués et sur une chaise pour primates, sur laquelle ils sont entrainés à aller. La chirurgie d’implantation sera peu invasive, et durera au maximum 6h. De l’équipement, pour des enregistrements de sommeil, sera placé sur le crâne et sous la peau. Des enregistrements de sommeil, sans fil, se feront dans la cage d’hébergement de l’animal sans manipulation. Un maximum de 10 nuits et de 10 jours de 12h pourra être enregistré dans chaque condition : animal sain, animal sain avec illumination la nuit, animal parkinsonien, animal parkinsonien avec illumination la nuit. Des tests de latence d’endormissement seront réalisés dans une cage de sieste, à laquelle ils sont habitués. Le test dure 3h et sera effectué au moins 10 fois dans chaque condition. Les animaux seront rendus parkinsoniens par des injections de neurotoxine. Après chaque injection les animaux seront isolés pendant 72h jusqu’à l’élimination de la toxine. Les injections permettent l’obtention d’un syndrome parkinsonien modéré et stable. Cette phase dure 4 mois. Les prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien seront réalisés sous une légère anesthésie et espacés de un mois pour le premier et deux mois pour le deuxième.

Impact sur les animaux

Si nécessaire, afin d’obtenir une motivation maximale de l’animal pour réaliser des tests de memoire et d'attention, un contrôle partiel de la ration d'eau pourra être mis en place selon un protocole adapté à chaque animal et développé à partir de « Avis et recommandations sur le contrôle d'eau pour les protocoles scientifiques chez les primates non-humains », Comité national de réflexion éthique sur l’expérimentation animale, 2021. Cela permettra un maximum de motivation sans impact sur l'état de santé de l'animal. La chirurgie d’implantation peut engendrer une douleur post-opératoire suite à l’implantation du matériel d’enregistrement télémétrique. L’état de santé des animaux sera suivi avec attention et des traitements adaptés seront donnés en cas de douleur. Cet effet indésirable peut durer jusqu’à 1 semaine après l’implantation. Le test de la latence d’endormissement ne devrait pas induire d’effet indésirable chez les animaux car il se fera dans une cage de comportement à laquelle l’animal aura été habitué. Les expériences sur les rongeurs montrent que la luminothérapie ne crée pas de nuisances. Une évaluation de l’impact de la luminothérapie chez l’animal sain sera réalisée en début de projet et les paramètres de son application seront réglés à ce moment. Des injections de toxine engendreront un syndrome parkinsonien modéré présent jusqu’à la fin de l’étude . Lors de la période d’intoxication, les injections de toxine nécessiteront un isolement de 72h toutes les deux semaines pour ne pas contaminer ses congénères ainsi que le personnel. Ce syndrome sera surveillé et des traitements adaptés seront donnés en cas de détection de mal être de l’animal.

Devenir

A la fin du projet il est nécessaire de mettre à mort les animaux afin d’effectuer une étude post-mortem du cerveau pour constater l’effet de l’illumination sur le cerveau. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres seront commandés uniquement en cas de problème.

Remplacement

Le singe Macaque fascicularis, utilisé dans cette étude, est un animal qui présente une des structures cérébrales qui contrôlent le sommeil (le cortex, l’hypothalamus et le tronc cérébral) similaire à celles connues chez l'humain, ce qui sous-entend que les mêmes mécanismes se mettent en place au cours du sommeil chez ces 2 espèces. D’ailleurs, il présente un comportement de veille/sommeil similaire à celui des humains, avec un éveil diurne et une nuit organisée en au moins 7 cycles de sommeil. C’est aussi un modèle de choix dans cette étude car une intoxication avec une toxine permet de développer des troubles du mouvement et du sommeil similaires à ceux présents dans la maladie de Parkinson. Des résultats de la luminothérapie ont été publiés chez la souris et le rat, des essais cliniques très ciblés sont en cours, mais l’étude exhaustive des effets de la luminothérapie chez le primate non humain rendu parkinsonien sont nécessaires avant la mise sur le marché d’un tel dispositif pour les patients. A ce stade des avancées sur la luminothérapie, cette étude ne peut se faire qu’au niveau préclinique, donc chez le primate non humain, il nous est donc impossible de remplacer cet animal par un modèle rongeur, un modèle cellulaire ou de simulation informatique. Le recours à ces animaux est donc nécessaire dans cette étude qui constitue une étape vers la validation d’un dispositif thérapeutique utilisable par l’humain.

Réduction

C’est une étude dans le temps et préclinique dans laquelle l’animal est son propre contrôle, peu d’animaux seront donc nécessaires. La répétition des mesures dans les différents états (sain avec ou sans luminothérapie, parkinsonien avec ou sans luminothérapie) permettra d’évaluer l’impact de la luminothérapie avec un test statistique. Le nombre utilisé espéré d'animaux est de 3, les 3 autres sont prévus et seront commandés uniquement en cas de problème.

Raffinement

Durant la chirurgie, des analgésiques, des anesthésiques et des antibiotiques seront administrés aux animaux afin de supprimer les douleurs et de diminuer les risques d’infections. En post-opératoire il sera aussi administré des analgésiques et des antibiotiques afin de réduire au maximum les douleurs et les risques d’infections. Lors de la phase d’intoxication à la toxine les animaux serons isolé pendant 72h toutes les deux semaines. Afin de diminuer le stress des animaux, un programme d’habituation aux conditions expérimentales est mis en place dans l’animalerie. Ces habituations consistent en des entrainements et se feront selon un protocole progressif, dans lequel chaque étape est apprise progressivement et est récompensée. Un tableau de progression est utilisé pour suivre les progrès des animaux. Les techniciens de l’animalerie et les membres de la cellule bien-être animal s’assureront par des visites régulières qu’aucune souffrance ou mal être n’est ressenti par l’animal au cours de l’expérimentation. Le personnel impliqué sur le projet est formé au bien-être animal. Des points limites suffisamment précoces et adaptés à la procédure expérimentale ainsi qu'un arbre décisionnel pour intervenir le plus rapidement possible pour limiter la souffrance animal sont mis en places.

Choix des espèces

Le primate non-humain fait partie des mammifères les plus proches de l’espèce humaine. Son anatomie cérébrale est très proche de celle du cerveau humain. Les Macaques fascicularis, qui ne constituent pas une espèce de primates menacée d’extinction, possèdent des circuits neuronaux proches de ceux de l’humain et permettent ainsi la compréhension des circuits neuronaux impliqués dans les mécanismes du comportement de veille/sommeil, ce qui n’est pas le cas des rongeurs qui ont un rythme inversé avec des cycles plus courts. Il est possible de reproduire chez cet animal un syndrome parkinsonien similaire à celui observé chez les patients s'accompagnant de plus d'un trouble de sommeil comme chez le patient parkinsonien. Des adultes seront utilisés dans cette étude car les traitements à développer à la suite visent des patients adultes.

Une injection d'ARN interférents dans le ganglion trigéminal provoque une douleur modérée, puis des filaments fins sont appliqués sur la face et un jet d'air envoyé toutes les trente minutes pendant quatre heures. 150 rats mâles et femelles vont être utilisés, tous tués pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Il s'agit de savoir si moduler l'activité des cellules satellites gliales perturbe la transmission de la douleur, avec une comparaison entre les sexes. La description des procédures se limite à la mesure de sensibilité cutanée, sans préciser la durée de l'injection intra-ganglionnaire ni les modalités du modèle de migraine que la rubrique réduction mentionne.

Objectifs

L'objectif de cette étude est de moduler l'activité des cellules satellites gliales du ganglion trigéminal à l'aide d'ARN interférents (siRNA) pour observer l'impact sur les mécanismes de la douleur chez les rats. Les cellules gliales jouent un rôle clé dans la réponse à la douleur en produisant des médiateurs inflammatoires qui amplifient la douleur. En ciblant ces cellules par siRNA, l'étude cherche à déterminer si la modulation de leur activité perturbe la transmission de la douleur, ce qui pourrait améliorer la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la douleur. L'étude inclura aussi des comparaisons entre rats mâles et femelles pour explorer les différences liées au sexe dans la réponse à la douleur, en tenant compte des influences hormonales et génétiques sur l'intervention gliale.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre comment la douleur se transmet en modifiant l'activité de cellules spécifiques, les cellules satellites gliales, qui jouent un rôle clé dans la douleur, notamment dans des pathologies comme la migraine. En ciblant ces cellules, nous espérons découvrir de nouvelles cibles pour des traitements plus efficaces, notamment contre les douleurs chroniques. Nous comparerons aussi les réponses à la douleur entre les rats mâles et femelles pour voir si le sexe influence la douleur, ce qui pourrait mener à des traitements plus personnalisés. En résumé, ce projet pourrait améliorer les traitements de la douleur en les adaptant mieux à chaque patient.

Procédures

Mesure de la sensibilité cutanée : le jour de l'injection pendant 4h ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air toutes les 30 min pendant 4 h après l'injection des molécules en intra-ganglionnaire (chaque application dure 3 secondes).

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle par injection de siRNA qui provoque une douleur modérée de l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels. Afin de diminuer le stress lié aux tests de comportement et aux injections, les animaux ont une période d’adaptation suite à la livraison suivie d'une période d’habituation. Une grille de score est mise en place afin d'évaluer le bien-être des animaux au quotidien suite aux injections. Enfin, les stimulations mécaniques ou les jets d’air induisent un retrait de la face/patte signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention. Cette stimulation dure au maximum 3 secondes. S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation et seront mis à mort.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est fixé à un maximum de 10 pour assurer une étude fiable, en tenant compte des étapes clés comme l’habituation, les injections, les observations comportementales, les prélèvements et la préparation des échantillons. Les études comportementales étant un facteur limitant, nous prévoyons suffisamment d'animaux pour garantir des résultats solides pour ce modèle de migraine. Enfin, pour prendre en compte les différences entre mâles et femelles dues aux hormones, l’étude inclura les deux sexes.

Raffinement

Avant les études comportementales, les animaux sont placés dans des cages enrichies (tunnels et contacts sociaux) pendant une semaine, puis habitués au nouvel environnement pendant 4 jours pour réduire leur stress. Avant les injections, les rats sont anesthésiés, vérifié par l'absence de réflexe de retrait. La douleur est la principale nuisance identifiée, et pour les stimulations mécaniques, nous suivons les recommandations internationales pour limiter leur durée et intensité.

Choix des espèces

Le rat est couramment utilisé au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature.

Aucun des six macaques à longue queue de ce projet ne sera tué à l'issue, le porteur prévoyant de les transférer vers d'autres études sans retirer chirurgicalement le matériel implanté. Ils vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance modéré, avec des injections intramusculaires d'aripiprazole par périodes de deux semaines sur quatre mois, quinze scans d'imagerie cérébrale sous anesthésie répartis sur plus d'un an, l'implantation par vis en titane d'un plot de tête et d'une chambre d'enregistrement ouvrant sur une craniotomie de 10 mm sur 10, puis trente injections intracérébrales hebdomadaires sur huit mois. Le porteur reconnaît un risque d'infection lié à la chambre et des lésions cérébrales à prévoir avec la répétition des pénétrations d'électrode, tout en jugeant une lésion débilitante "extrêmement rare". Le maintien en vie s'explique par la valeur acquise par ces animaux, entraînés à réaliser des tâches cognitives sur écran tactile et donc réutilisables pour des approches invasives.

Objectifs

L’aripiprazole est un antipsychotique de troisième génération indiqué dans le traitement de différentes maladies neuropsychiatriques présentant un déséquilibre dopamine-sérotonine, telles que le syndrome de Gilles-de-la-Tourette, la schizophrénie et les troubles bipolaires. Bien que son utilisation s’accroisse, les mécanismes d’action de l’aripiprazole restent peu compris. Les objectifs du présent projet sont d’identifier où et comment ce traitement agit dans les différentes régions cérébrales pour moduler de multiples fonctions cognitives et motrices.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour répondre à des questions en lien avec des problématiques cliniques, mais aussi pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et l’importance de la balance dopamine-sérotonine dans le contrôle comportemental. Ainsi, notre projet va permettre de recueillir des informations inédites concernant le mode d’action de l’aripiprazole, désormais traitement de première intention pour de nombreux patients atteints de troubles psychiatriques. Une meilleure compréhension des mécanismes d’action de l’aripiprazole et des effets cognitifs induits par ce traitement ouvrira certainement une meilleure prise en charge thérapeutique de ces patients, avec une approche de plus en plus individualisée. En combinant différentes modalités d’imagerie cérébrale, nous allons avoir l’opportunité de caractériser comment la balance dopamine-sérotonine module l’activité neuronale de repos à l’échelle du cerveau entier. Cette balance étant défectueuse dans de nombreuses pathologies (ex : dépression, anxiété, schizophrénie, Tourette, addictions), nos résultats seront donc d’intérêt pour de nombreuses applications. En complément, l’apport de l’electrophysiologie va nous permettre d’étudier des aspects plus fonctionnels de l’action de l’aripiprazole et de la balance dopamine-sérotonine au niveau des neurones du striatum. Nos résultats devraient ainsi démontrer l’importance de cette structure sous-corticale dans le contrôle de certains biais décisionnels, et définir quels types de troubles émergent lorsque la balance dopamine-sérotonine devient dysfonctionnel dans cette région du cerveau.

Procédures

(i) Traitement pharmacologique systémique par aripiprazole en semi-chronique (plusieurs périodes de 2 semaines, injections en IM). Ces tests s’étendront sur 4 mois, afin de tester comportementalement plusieurs doses de traitement. (ii) Examens d’imagerie cérébrale sous anesthésie générale. L’action de l’aripiprazole sur les systèmes dopaminergiques et sérotoninergiques sera étudiée via 5 traceurs ciblant différents récepteurs (5 traceurs x 3 doses d’aripiprazole = 15 scans par animal). Ces imageries s’étendront sur une période de plus d’un an. (iii) Implantation chirurgicale d’un plot de tête et d'une chambre avec craniotomie sous anesthésie générale (1 fois,

Impact sur les animaux

La partie pharmaceutique du projet impliquant un traitement chronique par aripiprazole ne constitue pas une source potentiel de nuisances importantes. L’aripiprazole est une molécule fréquemment utilisée en clinique humaine avec très peu d’effets secondaires nuisibles, il est rapporté un effet sédatif et orexigène (augmente l’appétit) bien moindre que pour les autres neuroleptiques. Les imageries cérébrales vont nécessiter l’injection d’un produit de contraste pouvant induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques. Pour limiter ces risques, les imageries seront espacées d’au moins deux semaines et des analyses sanguines seront réalisées pour contrôler les enzymes hépatiques. Ainsi, aucun effet nuisible significatif n’est spécifiquement prévu suite à l’accumulation des imageries sur animal anesthésié. La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. La chambre d’enregistrement donnera sur une craniotomie (10 x 10mm) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode au moment des sessions d’expérimentation. La présence de cette chambre d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les phases d’imagerie, de pharmacologie et d’électrophysiologie de l’étude soit délétère pour la santé de l’animal. La partie de l’étude intégrant les examens d’imagerie et le traitement par aripiprazole étant classée en procédure légère, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives sur écran tactile. Les animaux ayant une chambre implantée seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches invasives telles que l’électrophysiologie ou des perturbations intracérébrales. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude pré-clinique, combinant des approches d’imagerie TEP/IRM avec de l’électrophysiologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle du cerveau. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, certains radiotraceurs TEP utilisés dans cette étude ne sont disponibles et utilisables que chez le primate non-humain, faisant de ce modèle un élément irremplaçable pour la conduite de cette étude.

Réduction

Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 6 animaux dans le protocole. Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques pharmacologiques chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=2). Nos approches seront réversibles et complémentaires, ce qui permettra de répéter les tests et de comparer différentes doses d’agents pharmacologiques sur les mêmes animaux pour ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les données électrophysiologiques recueillies sur quatre animaux permettront également d’atteindre un échantillon de neurones striataux importants le plus représentatif possible en fonction des différents territoires cérébraux étudiés.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bien-être des animaux. Un suivi quotidien des animaux sera effectué permettant de contrôler différents facteurs tels que le poids, la prise de nourriture, le comportement social et la mobilité. Dépendamment du score des animaux sur notre grille d’évaluation comportementale, un traitement adapté sera fourni et l’étude pourra être suspendue, voir définitivement arrêtée si les points limites sont atteints. L’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité neuronale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. En combinant simultanément différentes modalités d’imagerie grâce à une caméra hybride, nous allons réduire (/2) le nombre de scans pour pouvoir collecter un jeu de données suffisants. Les animaux ne seront implantés qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Des traitements analgésiques seront utilisés en périodes pré-, per- et postopératoires. Notre grille d’évaluation de la douleur permettra d’adapter le traitement et le protocole si nécessaire en fonction de divers points limites. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiqueront comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Phylogénétiquement, ce modèle animal préclinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. -Différents troubles comportementaux ont déjà pu être induits chez le macaque suite a une perturbation d’activité localisée au niveau du striatum antérieur. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. -Toute information physiologique ou physiopathologique obtenue chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les animaux reçus sont généralement des adolescents (3 ans). Ils arrivent souvent déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. Une recommandation sera formulée en ce sens auprès de nos fournisseurs pour favoriser des groupes sociaux compatibles.

580 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour éviter la souffrance liée à la croissance de la tumeur. Chacune reçoit une injection de cellules de glioblastome humain directement dans le cerveau, parfois accompagnée de la pose d'un implant, avec un suivi par IRM hebdomadaire. Une partie d'entre elles fait, à chaque séance de radiothérapie, un trajet routier de 95 kilomètres entre deux établissements, soit deux heures de transport aller et retour. Le porteur écrit qu'il n'existe "pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques" pour ses questions, après avoir décrit les études protéomiques et la modélisation informatique déjà conduites sur cellules.

Objectifs

L’identification récente de nouvelles "cibles", pouvant constituer de véritables moteurs de la maladie cancéreuse fait naitre de nouveaux espoirs de prise en charge du glioblastome (GB), tumeur du cerveau la plus fréquente et la plus agressive chez l’homme. L'objectif de ce projet est : - dans un premier temps d'étudier la tumorigénicité et la radiorésistance, en utilisant la radiothérapie externe aux rayons X en tant que traitement de référence, des cellules de Glioblastome humaines exprimant ces "cibles" et en parrallèle, de concevoir des thérapies spécifiques dirigés contre ces "cibles" - dans un second temps d'appliquer ces thérapies dans le GB pour anéantir la fonction tumorigénique de ces "cibles". Deux modalités d’administration locorégionale sont envisagées : l’injection directe sur la tumeur en place et l’application d'implants pour une délivrance « long terme » au sein des cavités de résection. Ce projet permettra d’explorer davantage ces "cibles" dans le GB et de qualifier de nouveaux outils afin si possible d’ouvrir la voie à des essais chez l’homme. Le projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs (ici référencés EU1 et EU2).

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l'innovation thérapeutique par le ciblage de nouvelles cibles thérapeutiques sur une tumeur en place. Mais également une meilleure compréhension des effets d'implants interventionnels au sein des cavités d'éxérèse dans le glioblastome en synergie avec d'autres thérapeutiques pour une amélioration de la prise en charge de ces tumeurs ultérieurement chez l'homme.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés et soumis à des actes expérimentaux modérées telles que : - l'injection intracérébrale de cellules tumorales (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de cellules tumorales associée à la pose d'implants (durée d'environ 1h30) réalsiée à l'EU1 - l'injection intracérébrale de thérapies spécifiques (durée d'environ 30 minutes) réalisée à l'EU1. En fonction de la procédure concernée un animal peut subir d'un seul acte jusqu'à 2. Pour toutes les procédures, les suivis IRM (durée d'environ 30 minutes) sont réalisés de manière hebdomadaire à l'EU1. L'un des actes, la radiothérapie externe sera réalisé à l'EU2 et inclut un transport d'environ 95 kilomètres (soit environ 1 heure) pour aller à de l'EU1 à l'EU2 et la même durée pour revenir à l'EU1.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus par les procédures chirurgicales peuvent être comportementales et physiques, exemples : fatigue, stress, réponses au stimulus altérés, mauvaise cicatrisation, perte de poids, prostration... Ces effets indésirables peuvent être présents, plus ou moins prononcés ou même absents selon les procédures subies et les animaux eux-mêmes. L'effet attendu de l'implantation des cellules tumorales est le volume de la tumeur qui peut être plus ou moins important selon les traitements appliqués par la suite aux animaux. Pour plus de détails, voir le tableau des points limites adaptés en annexe 1. En ce qui concerne le transport, celui-ci peut induire une fatigue et un stress nécessitant pour les animaux du repos.

Devenir

Tous les animaux du projet sont mis à mort pour éviter toute souffrance liée à la pousse du glioblastome.

Remplacement

Le projet ici proposé a pour but l’étude de "cibles" et leur ciblage par une thérapeutique innovantes sur tumeur en place et au travers de bio-implants polymères sur cavité d'exérèse pour l’éradication de tumeurs cérébrales. Si sa mise en place nécessite l’utilisation d’animaux dans des modèles dédiés pour valider les étapes finales de caractérisation des "cibles" (tumorigénicité, radiorésistance des lignées) et celle d’élimination (au travers de l’application de procédures de traitement par SiRNA et ASOs sur tumeur en place et sur la cavité d'exérèse), alors de nombreuses étapes amont, ont été réalisées in vitro sur des modèles cellulaires pour répondre aux normes de remplacement. Des études protéomiques et la modélisation informatique de ces données ont été faites sur des cellules hors du contexte animal. Par ailleurs justement pour ces dernière validation dans le contexte réel, il n'y a pas d'alternatives ni d'explants, ni d'organoides, ou coupes organotypiques sur lesquelles nous pourrions répondre à nos questions de tumorigénicité et de réponse au traitement dans le contexte global.

Réduction

En amont de ces expériences chez l'animal, divers essais sur ces lignées cellulaires contrôles et exprimant les "cibles" ont été réalisés limitant aux seuls prototypes utiles alors implantés chez l'animal la réalisation de cette étude. Le nombre d'animaux utilisés a été défini pour pouvoir générer des données statistiquement interprétables.

Raffinement

Les mesures spécifiques pour réduire les nuisances sur le bien-être animal dans les procédures expérimentales incluent : une surveillance accrue, des soins pré et post-opératoires, des mesures de gestion de la douleur, de bonnes conditions d'hébergement, l'enrichissement du milieu. Les mesures de raffinement pour le transport des animaux incluent : l’évaluation de la santé des animaux pour ne transporter que les animaux en bonne santé, le choix des contenants appropriés, la température et humidité contrôlées (véhicules climatisés), l’alimentation et hydratation, la minimisation du stress et la planification de l’arrivée.

Choix des espèces

Nous étudions la tumorigénicité de "cibles" d'intérêts dans des lignées cellulaires humaines qui nécessite donc que ce modèle soit utilisé chez la souris CB17-SCID. Les souris seront utilisés à 8 semaines car elles seront, à ce stade, de jeunes adultes matures.

Deux sessions de douze heures pendant lesquelles l'animal s'injecte lui-même de la cocaïne, puis cinq sessions de deux heures : 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement du cerveau. Chacun reçoit un cathéter intraveineux posé sous anesthésie, jusqu'à quinze pesées et quatorze injections, et 96 d'entre eux subissent une chirurgie crânienne sans réveil de deux à quatre heures. Le projet vise à raccourcir un protocole d'auto-administration déjà en usage, qui sera validé si plus de 90 pour cent des rats rechutent. Le porteur retient le rat parce qu'il s'auto-administre spontanément toutes les drogues consommées par les humains, ce que d'autres espèces font moins facilement.

Objectifs

L'addiction aux drogues est une maladie chronique qui a des conséquences importantes sur la santé, la société et l'économie. Un des problèmes principaux de l'addiction est le risque de rechute, même après une longue période d'arrêt. Ce risque est lié à des changements durables dans le cerveau causés par la drogue. Comprendre ces changements est essentiel pour développer de nouveaux traitements qui aident les personnes dépendantes à rester abstinentes. Pour étudier l'addiction et la rechute à la cocaïne, les chercheurs utilisent un modèle sur des rats où les animaux s'administrent eux-mêmes de la drogue pendant 10 sessions de 6 heures, avec une session par jour. Ce projet a pour but de modifier ce protocole pour rendre les expériences plus efficaces tout en réduisant l'exposition des rats à la drogue. L'idée est de remplacer les 10 sessions habituelles par une ou deux sessions plus longues (de 8 à 12 heures), suivies de 5 sessions plus courtes de 2 heures. Les chercheurs veulent voir si ces changements donnent les mêmes résultats que le protocole classique, en observant le comportement des rats et l'activité de leurs neurones. Ce projet s'inscrit parfaitement dans tous les axes de recherche de l'équipe en proposant un nouveau protocole d'auto-administration, qui est complémentaire des travaux actuels et permettra de mettre en place de façon plus efficace des projets pilotes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider ou non un nouveau protocole d’auto-administration de cocaïne chez le rat afin de proposer une optimisation des expériences au laboratoire (moins de sessions, sessions plus courtes). Ce protocole sera validé si plus de 90 pour cent des animaux rechutent (taux de rechute comparé aux résultats publiés) et si l’activité dopaminergique est diminuée significativement comparé aux animaux contrôle.

Procédures

Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter intraveineux (durée : 15minutes par animal, 192 animaux) pour permettre l’auto-administration. - chirurgie crâniale sans réveil avec enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (2-4 heures par animal, 96 animaux). Sur animaux vigiles : - en amont de chaque chirurgie, 1 injection sous cutanée d'antalgiques (192 animaux) - après la chirurgie, 2 injections sous cutanée d’antalgiques (192 animaux) - au maximum 15 pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (2 fois par semaine, sur toute la durée du projet, 192 animaux) - 1 injection intraveineuse (par le cathéter), les 5 premiers jours après la chirurgie d’implantation de cathéter et tous les jours d’auto-administration (14 injections , 192 rats) -au maximum 7 sessions d’auto-administration (2 sessions de 12 heures et 5 sessions de 2 heures, 1 session / jour, 192 animaux) - test de recherche de drogue (1 session / rat de 6 heures, 96 rats)

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont : -Chirurgies : inconfort transitoire au réveil, douleur minimisée par le traitement antalgique pendant et après la chirurgie -Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience -Période d’abstinence : peut causer un léger stress -Isolement : stress modéré -L’acte de pesée, l'injection sous-cutanée et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour des prélèvements et analyse des cerveaux.

Remplacement

Cette recherche vise à comprendre les effets des drogues sur le comportement en utilisant des animaux vivants, car il est essentiel d'observer leur comportement dans des situations réelles. Cela ne peut pas être fait avec des cellules en laboratoire ou des modèles informatiques. En effet, pour étudier le comportement, il faut que les réseaux de neurones soient intacts et fonctionnent comme dans un cerveau vivant, ce qui n'est possible qu'avec des animaux entiers. Après vérification, aucune méthode alternative en laboratoire ou sur ordinateur ne permet de mener ce type d'étude, donc l'utilisation d'animaux est nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires pour ce projet est basé sur un calcul qui tient compte des variations dans les tests de comportement et d’activité cérébrale. Ce calcul permet de déterminer combien d'animaux par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables et détecter des différences significatives entre les groupes. Pour cette étude, nous nous appuyons sur des expériences précédentes et des analyses statistiques. Nous avons calculé que 24 animaux par groupe sont nécessaires pour obtenir des résultats solides. Comme il existe des différences entre les mâles et les femelles dans le phénomène de rechute, nous devons inclure des groupes des deux sexes. Toutefois, pour réduire le nombre d'animaux utilisés, nous commencerons avec 12 mâles et 12 femelles par groupe. Si les premiers résultats montrent des tendances à la différence, nous ajouterons 12 mâles et 12 femelles supplémentaires pour atteindre les 24 animaux par groupe. Au total, pour cette étude, un maximum de 192 rats pourrait être nécessaire. Si, après l'analyse des données de deux groupes d'animaux, aucune tendance n'est observée, l'étude sera arrêtée. À l'inverse, si un effet significatif est détecté avant d'atteindre un total de 24 animaux/lot, l'étude sera également interrompue. Par conséquent, le nombre d'animaux indiqué correspond à un maximum prévu et non à une valeur absolue.

Raffinement

Le bien-être des animaux est une priorité à chaque étape du projet. Nous surveillons régulièrement leur état de santé, y compris leur alimentation, leur apparence et leur comportement. Si un problème est détecté, des actions correctrices sont mise en place immédiatement, selon une grille d’évaluation précise. Nous utilisons un système de points limites qui nous permet d'intervenir rapidement si un animal montre des signes de souffrance. Si un animal atteint l'un de ces points limites, il est pris en charge sans délai. Les rats sont pesés chaque semaine pour suivre leur état de santé. Ils sont hébergés dans des conditions normales, avec une température et une humidité contrôlées, dans des cages ventilées. Des éléments pour ronger, comme des bâtonnets ou des morceaux de bois, sont fournis pour répondre à leur besoin naturel de ronger. Ils ont accès à de la nourriture et de l'eau en permanence. Avant de commencer les procédures, les rats s'acclimatent pendant au moins 7 jours à leur nouvel environnement. Pendant les chirurgies, les animaux sont sous anesthésie générale et locale, avec des médicaments contre la douleur et un tapis chauffant pour maintenir leur température. Le traitement contre la douleur se poursuit pendant 48 heures après la chirurgie, pour un total de 72 heures avant et après. De plus, les animaux sont habitués à la manipulation par l’expérimentateur deux fois avant la chirurgie pour réduire leur stress.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. En effet, les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec d’autres espèces, pour lesquelles la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Humain. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).

Toutes tuées à l'issue pour que leurs tissus soient prélevés, 368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une mutation qui les fait cesser de prendre du poids vers dix semaines, développer une pathologie musculaire vers un an, puis une atteinte cardiaque qui les tue autour de quatorze mois, avec une survie médiane de 10,8 mois. À 5 et 10 mois, elles passent une semaine de tests comportementaux que le porteur qualifie d'inoffensifs sans les nommer, avant une chirurgie sans réveil. Sur le remplacement, il indique que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier des profils de comportement et affirme devoir passer par la souris, y compris pour accéder à des tissus inaccessibles chez l'humain.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative. Elle se déclare à l'âge adulte (40-80 ans) et évolue, en 3 à 5 ans, vers la paralysie complète et le décès du patient. Elle est causée par la mort de certains neurones, entraînant un affaiblissement progressif et une atrophie des muscles. A ce jour, il n'existe pas de traitement contre la SLA car les mécanismes sont méconnus. La SLA touche les deux sexes et son incidence augmente avec l'âge à partir de 40 ans. De manière intéressante, elle peut dans certains cas être associée à des troubles de type démence. Des travaux précèdent sur une cohorte de patients souffrant de cette forme de démense, avait permis d’identifier une mutation sur un gène . Un modèle murin a été créé et caractérisé. Parmi tous les facteurs impliqués dans la pathogenèse, certains défauts dans la cellule s’avèrent essentiels et pourrait contribuer à la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Nous émettons l'hypothèse qu’un type de désorganisation cellulaire déclenche des cascades dans le système nerveux central, contribuant à la pathogenèse des maladies neurodégénératives. Nous voulons ainsi tester l’inhibition de cette cascade sur la neurodégénération.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément les mécanismes moléculaires conduisant à la neurodégénérescence. Ils pourraient également permettre le développement de modèle pouvant être utilisés pour développer de nouveaux médicaments ciblant les mécanismes imlpliqués, pour permettre de prévenir ou freiner le développement des maladies neurologiques chez les patients. Dans cette optique, notre partenaire va tester sur des modèles cellulaires l'efficacité de l'Elamipretide (un médicament déjà utilisé dans des essais cliniques en phase précoce). A plus long terme, un essai préclinique dans notre modèle murin pourrait être développé. Ce projet présente également potentiellement des bénéfices clinique et sociétal : Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un projet financer par l'Agence Nationale de la Recherche et il se fait en collaboration avec des cliniciens. Ainsi les résultats obtenus ont le potentiel d'améliorer la prise en charge de plusieurs maladies rares en termes de diagnostic moléculaire et d'engagement des patients/public. En mettant l'accent sur les processus pathogènes dans les maladies mitochondriales reconnues et les maladies neurodégénératives, ce projet contribuera à la définition de cibles thérapeutiques. Actuellement, les traitements pour les maladies mitochondriales et les maladies neurodégénératives sont inefficaces et la prise en charge des patients a un coût important en termes de santé publique en raison de la gravité de l'invalidité présentée par ces patients. Les avantages économiques de cette recherche sont difficiles à évaluer à ce stade. Néanmoins, les bénéfices pour les patients en termes d'optimisation du diagnostic sont inestimables et les possibilités thérapeutiques potentielles permettront de réduire le coût des soins.

Procédures

Des tests comportementaux seront effectués sur les animaux de 5 et 10 mois pendant 1 semaine. Aucune nuisance d’ordre général n’est attendue durant ses tests compte-tenu de leurs innocuités. Une étape d’habituation sera effectuée en amont pour limiter les perturbations dues à la manipulation. Une chirurgie sans réveil sera effectuée avant analyse de certains tissus.

Impact sur les animaux

L'étude de la lignée murine réalisée par nos collaborateurs indique qu’elles sont normales à la naissance mais à partir de 10 semaines commencent à moins prendre de poids. Vers l'âge d'un an, elles présentent une pathologie des muscles . Leur état s'aggrave rapidement avec une perte de poids importante et des tremblements, et elles développent une pathologie du coeur sévère, conduisant à la mort des animaux vers 14 mois. Cette étude indique également que le modèle présente une altération des capacités d'apprentissage et de mémoire dès 10 mois. L’atteinte neurologique est mesurable mais reste limitée et n’est pas responsable de la mortalité, qui est principalement liée à la pathologie cardiaque. Les signes cliniques apparaissent au stade terminal, débutant par une perte de poids importante. De même, l’apparition de symptômes tels qu’un affaiblissement partiel de l’extension des pattes ou des tremblements, combinée à l’incapacité de la souris à se retourner sur le flanc en moins de 15 secondes, indiquera une réduction significative de la mobilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car leurs tissus seront récoltés pour analyse.

Remplacement

La caractérisation du modèle a d’abord été réalisée avec des modèles cellulaires. Les expériences réalisées sur des fibroblastes issus de patients porteurs de la mutation d'intérêt ont permis d'identifier de potentiels mécanismes impliqués dans les atteintes mitochondriale et neurodégénérative. Cependant, pour l’étude de maladies neurodégénératives avec des composantes motrices et cognitives, les modelés cellulaires ne peuvent pas être utilisés pour disséquer les effets des variations moléculaires sur des profils de comportements. C’est pourquoi nous devons utiliser le modèle murin pour mieux comprendre la pathologie au cours du temps et pour tester si l’inactivation d’un processus moléculaire peut ralentir ou inverser les processus pathologiques permettant d’envisager des voies d’intérêt thérapeutiques dans l’avenir. L'utilisation de modèles murins, permet aussi d'accéder à des tissus auxquels on n'a pas accès chez l'homme.

Réduction

Avec l’aide des statisticiens de notre institut de recherche, les protocoles permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement ont été établis, réduisant au maximum le nombre d’animaux. Ainsi dans un but de réduction du nombre d’animaux à utiliser pour cette étude, des statistiques prédictives ont été réalisées dans le but d’utiliser le minimum d’animaux nécessaires et les effectifs des groupes expérimentaux ont été ajustés : - en tenant compte de notre expérience, - en fonction de la nature de l'expérience et des paramètres mesurés, - de la variabilité de ces paramètres, - de façon à produire des résultats interprétables, permettant d'atteindre une signification statistique, vérifiée par les statisticiens.

Raffinement

Un suivi quotidien des animaux inclus dans le projet, axé sur leur état général de santé, est prévu. Il sera associé à l’utilisation d’une fiche d'observation détaillée permettant un suivi optimal des animaux. Ce suivi quotidien permettra d’identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Le phénotype de notre modèle murin étant associé à une perte de poids. En effet à partir de l'âge de 10 semaines, les souris malgré un apport calorique normal ne prennent plus de poids normalement. Les courbes de poids au cours des 5 dernières semaines de vie montrent qu’une perte rapide de poids peut être observée avant le stade final. De plus l'analyse de survie a révélé que les souris avaient une survie significativement réduite par rapport à leurs compagnons de cages non génétiquement modifiés, avec une survie médiane de 10.8 mois. Ainsi, dès 8 mois, en plus d’être pesés une fois par semaine, une surveillance accrue sera mise en place : la fréquence du suivi augmentera, de l'eau et de la nourriture gélifiées seront placées au sol dans la cage pour éviter des complications si les animaux éprouvent de l'inconfort ou des difficultés à atteindre la trémie alimentaire et la source d'eau. De plus si des signes de stress sont observés, l’enrichissement de la cage sera amplifié (avec litière en cellulose, tunnels en carton, rouleaux de coton, etc.). Enfin, lors de cette surveillance quotidienne, si la perte de poids dépasse un seuil par rapport à la pesée précédente, cela conduira à la mise à mort.

Choix des espèces

La caractérisation du modèle murin a permis de mieux comprendre comment la mutation étudiée (chez l'Homme) d'un gène codant pour une protéine mitochondriale est impliqué dans le dysfonctionnement mitochondrial. Cette caractérisation a en particulier permis de montrer que le modèle murin présente des déficits moteurs ou cognitifs qui sont liés à un déficit de traitement des signaux de communication chez la souris mesurée par des méthodes d’électrophysiologie L'analyse du phénotype neurodégénératif des souris pourra permettre d’étudier si l’invalidation de certains gènes permet une protection contre la neurodégénérescence. L'évolution du phénotype pourra également être étudiée au cours de la vie relativement courte de l'animal et seul le modèle murin permet cette étude comportementale. Nous avons identifié les stades de développement intéressant à étudier sur la base de résultats publiés précédemment. - stade précoce, apparition des premiers signes moléculaires = 5 mois de vie : dans ce modèle l’atteinte neurologique est mesurable mais reste limitée et n’est pas responsable de la mortalité, qui est principalement liée à la cardiomyopathie. Ce modèle ne présente aucun phénotype avant l’âge de 6 mois et le stade 5 mois correspond à l’apparition d’une atteinte mitochondriale au niveau moléculaire. - stade final précédant l'atteinte finale de la maladie = 10 mois de vie : à partir de l’âge de 6 mois les animaux commencent à perdre du poids et développent une cardiomyopathie mitochondriale fatale avant l’âge de 14 mois (survie médiane de 10.8 mois).

1 250 souris vont être utilisées, dont cinquante pour entraîner le geste chirurgical et quinze par donneur humain, avec des mises à mort échelonnées sur trois dates. Une partie est immunodéficiente, donc exposée aux infections et aux tumeurs, ce que le porteur nomme un phénotype dommageable. Chacune subit deux chirurgies de la moelle épinière à quarante-huit heures d'intervalle, l'une pour détruire la myéline, l'autre pour y greffer des cellules immunitaires humaines, puis des tests de traversée d'une barre crantée et de force des pattes avant. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour fabriquer le modèle animal de sclérose en plaques qui manque aujourd'hui.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire et démyélinisante du système nerveux central. Dans cette pathologie les macrophages et lymphocytes du sang pénètrent le cerveau et la moelle épinière et viennent détruire une composante essentielle du système nerveux : la myéline. On distingue différent type de lésions décrites chez les patients atteints de sclérose en plaques. Un type de lésion en particulier est associé à une maladie plus agressive. Mais, à l’heure actuelle, aucun modèle animal ne permet l’étude de ce genre de lésion. L’objectif de ce projet sera de développer un nouveau modèle animal de lésions chroniques actives afin d’étudier la formation et l’évolution de ces lésions que l’on observe chez les patients atteints de forme agressive de la maladie.

Bénéfices attendus

En France, plus de 130 000 personnes vivent avec la sclérose en plaques (SEP), une maladie qui touche 2,8 millions de personnes dans le monde. Elle est souvent diagnostiquée entre 25 et 35 ans, mais peut aussi apparaître plus tôt ou plus tard. Chaque année, 5 000 nouveaux cas sont recensés en France. La SEP concerne principalement les femmes (trois malades sur quatre), mais leur progression vers le handicap est plus lente que chez les hommes, qui présentent un risque plus élevé de complications neurologiques. Il existe deux formes principales de la maladie : La forme rémittente (RR) : elle évolue par poussées, avec des symptômes qui apparaissent puis disparaissent. C'est la forme la plus fréquente et elle débute souvent entre 25 et 35 ans. Avec le temps, elle peut évoluer vers une forme plus sévère. La forme progressive (PP) : plus rare, elle se développe généralement après 40 ans et entraîne un handicap progressif, sans poussées distinctes. Les traitements actuels sont efficaces pour la forme rémittente, mais restent très limités pour la forme progressive, qui est la plus sévère. Certains types de lésions sont associés à cette forme aggressive de de la maladie, mais il manque aujourd’hui un modèle animal permettant de étudier en détail la formation et le développement de ce type de lésion. Notre recherche vise à mieux comprendre ces lésions et, à terme, à tester de nouveaux traitements pour améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Une partie des animaux auront une seule procédure chirurgicale pour optimiser le geste chirurgical menant à une lésion de démyélinisation de la moelle épinière. Les animaux participeront à deux tests comportementaux afin d’évaluer leurs capacités motrices. Dans le premier test, l'animal est placé sur une barre crantée et on mesure la durée de la traversée de la barre et le nombre d'erreurs, l'animal étant libre de ces mouvements durant le test. Dans le deuxième test l'animal est placé sur une grille sur laquelle l'animal s'accroche ce qui nous permet de mesurer la force de ses pattes avant. Ces deux tests comportementaux durent respectivement 90 secondes et 60 secondes. Les animaux réaliseront 2 procédures chirurgicales sous anesthésie générale et analgésie adaptée, à 48 heures d’intervalle, l’une pour la mise en place de la lésion de démyélinisation et la deuxième pour l’injection de cellules immunitaires humaines sur le site lésionnel. Chaque chirurgie durera 15 minutes. Une dernière procédure sous anesthésie générale et analgésie adaptée sera réalisée pour évaluer les voies sensorielles de l’animal entre une zone stimulée et le cerveau (1 fois, 30 minutes maximum par animal). Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédure expérimentale par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Une partie des animaux utilisés dans le projet sont immunodéficients (phénotype dommageable) et seront donc susceptibles de contracter des infections et des tumeurs. Les tests comportementaux pourront générer un stress aux animaux dû au changement d’environnement et aux manipulations. Les procédures chirurgicales (lésion de démyélinisation, greffe de cellules humaines) génèreront une douleur et un inconfort post-opératoire, et pourront être associées à des complications inattendues telles qu’un saignement ou une infection. L’anesthésie générale nécessaire pour leur réalisation impliquera une hypothermie, une sécheresse oculaire et un risque de dépression cardio-respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements post-mortem nécessaires pour répondre à notre question scientifique.

Remplacement

Le seul moyen à notre disposition pour décortiquer le processus de remyélinisation endogène et de démyélinisation chronique est d’utiliser un modèle animal bien établi du processus de démyélinisation/ remyélinisation développé il y a 20 ans que nous avons réadapté pour le rendre plus proche des conditions pathologiques des patients. En ce qui concerne la souche de souris immunodéficiente utilisées, la greffe de cellules humaines nous contraint à utiliser les souris les plus adaptée pour éviter le rejet de greffe. Pour étudier le processus de développement d’une lésion chronique l’utilisation d’un modèle animal est nécessaire. En effet des alternatives pour étudier la remyélinisation existe (comme l’utilisation de culture ex vivo de cervelet) mais celles-ci ne peuvent pas être utilisé dans notre cas car nous étudions l’évolution d’une lésion à long terme (3mois). De plus l’étude de tissus humain ne nous permet l’étude qu’à un temps donné des lésion chronique et non l’évolution. Il nous est donc impossible de substituer ces travaux par d’autres méthodes n’utilisant pas ces animaux

Réduction

Pour l'optimisation du geste chirurgical, des souris seront utilisées. Nous avons défini qu’un maximum de 50 souris pourrons être utilisées sur les 5 années du projet afin de perfectionner la technique d’injection dans le cordon dorsal de la moelle épinière. De plus, nous allons étudier la mise en place d’une lésion chronique en greffant les lymphocytes de deux types de patients atteints de sclérose en plaque, nous aurons 2 groupes de patients avec 20 patients par groupe et 40 donneurs sains, soit 80 sujets au total. Pour chaque patient, nous injecterons 15 souris puis nous échelonnerons les euthanasies sur 3 temps différents nous permettant ainsi d’avoir au final 5 souris par temps d’euthanasie et par patient. Par expérience nous savons que cet effectif sera suffisant pour des tests statistiques fiables. Pour les analyses statistiques nous aurons donc pour chaque temps 400 souris au total, 100 pour le premier groupe de patient avec une forme modérée de la maladie , 100 pour le deuxième groupe de patient avec une forme aggressive de la maladie et enfin 200 pour le groupe de donneurs sains. Nous aurons donc besoin au total de 1250 souris au total.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés et dans des conditions de température et d’hygrométrie définies par les normes européennes (directive européenne 2010/63/UE) soit 22Cplus ou moins 2C pour la température et entre 45 et 65 pourcent d’hygrométrie avec un cycle jour,nuit progressif de 12h. De plus, ils seront hébergés dans un environnement enrichi (animaux hébergés en groupe avec carré de coton et bâton à ronger) et observés quotidiennement. Ils bénéficieront d’une semaine d’acclimatation à leur arrivée. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désignée si nécessaire. Les animaux sont hébergés dans des cages à ventilation individuelles, des précautions lors de la manipulation sont prises comme manipulation sous hotte, changement de gant et nettoyage de l’endroit de manipulation entre chaque cage. Ils seront ensuite habitués à l’expérimentateur pendant 1 semaine avant le début des procédures pour réduire leur stress. Les animaux auront une période d’acclimatation aux pièces à raison de 30min à 1h avant chaque début des expériences comportementales, acclimatation également aux tests comportementaux à raison de 3 essais/tests/jours avant d’établir la performance basale de l’animal, pour diminuer le stress de l’animal. Entre chaque essais l’animal aura un temps de repos au minimum égal à son temps passé à faire le test. De plus les animaux seront manipulés de façon à diminuer le stress Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une prise en charge analgésiques adaptée. Une surveillance renforcée sera mise en place en période post-chirurgie pendant 2 jours et puis 2 fois par semaine après la première semaine afin de s’assurer de la bonne récupération des animaux et afin d’adapter la prise en charge analgésique en fonction de l’observation de signes de douleurs une grille de score (mise au point avec la structure du bien être animal est utilisée pour définir la prise en charge de l’animal. En cas de signe de mauvaise santé (stress, blessure, comportements anormaux) un avis vétérinaire sera demandé, Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

Notre projet nécessitant un acte chirugical d’injection dans la moelle épinière, nous prévoyons d’optimiser le geste chirurgical des personnes (étudiants ou ingénieurs) associés à ce projet sur des souris immunocompétentes avant de réaliser ce geste ainsi que les injections de cellules humaines aux souris immunodéficiences. Notre projet nécessitant des greffes de cellules immunitaires humaines, nous utiliserons des souris immunodéprimées. En effet, ces souris présentent un système immunitaire déficient, elles sont donc de bonnes candidates pour la greffe de cellules humaines car il n’y aura pas de rejet de greffe. Les souris sont utilisées car le modèle de démyélinisation a été bien décrite chez la souris et nous avons une grande expérience de ce modèle dans notre équipe. Les animaux utilisés sont âgés d’au moins 8 semaines afin d’avoir une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes).