Système nerveux

Gavées quinze jours ou nourries trois mois avec des compléments, certaines recevant en plus une injection de LPS pour déclencher une inflammation aiguë, 1 280 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé. Le projet cherche à démontrer qu'une supplémentation nutritionnelle limite le déclin cognitif et les troubles de l'humeur liés à l'âge. Le porteur annonce des tests comportementaux de cinq à dix minutes étalés sur trois semaines, sans préciser lesquels, et ramène les effets attendus du gavage quotidien à une irritation de l'œsophage.

Objectifs

Le projet vise à étudier l’impact de nutriments/ combinaison de nutriments sur les capacités cognitives chez des souris adultes et âgées ainsi que les mécanismes d’action mis en jeu dans ces processus (neuroinflammation par exemple).

Bénéfices attendus

Le projet a pour objectif de démontrer qu’une supplémentation nutritionnelle en nutriments permet 1) de limiter et de prévenir le déclin cognitif lié à l’âge et donc de favoriser le vieillissement en santé, véritable enjeu de santé publique dans une population toujours plus vieillissante ; 2) de limiter les symptômes les troubles de l’humeur (anxiété, diminution de l’interaction sociale, dépression) associés au vieillissement. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de recherche portant sur la nutrition préventive et personnalisée. Les résultats attendus sont donc une amélioration des troubles de l’humeur et de la cognition au cours du vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions afin d’évaluer l’impact de la supplémentation nutritionnelle sur la santé cognitive et mentale. Les supplémentations nutritionnelles seront données soit dans leurs croquettes pendant 3 mois, soit par gavage gastrique pendant 15 jours. Enfin, certains animaux recevront une seule injection de LPS en ip afin d’induire une inflammation aigue qui sera évaluée 2h après. Les tests comportementaux d'une durée de 5 à 10 min sont étalés sur environ 3 semaines et chaque test est séparé du suivant d'au moins 2 jours pour le bien-être des animaux.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas d’effets indésirables attendus induits par la supplémentation nutritionnelle car l’alimentarité du produit a été démontré. Cependant le gavage quotidien peut avoir des effets indésirables légers comme une irritation de l’œsophage. Les tests comportementaux induisent un stress de courte durée (le temps du test) chez l’animal. L’injection de LPS peut induire un malaise aigu pendant quelques heures après l’injection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les cerveaux et réaliser des analyses biochimiques ou immunohistologiques.

Remplacement

L’étude des comportements de type cognitifs et troubles de l’humeur ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro

Réduction

Le nombre d'animaux sera réduit au mieux en se basant sur des expériences préalablement menées au laboratoire qui ont montré́ par le biais de tests statistiques des différences entre plusieurs groupes. La significativité́ de différence statistique entre plusieurs groupes sera déterminée par analyse de variance ou t-test ou tests non paramétriques en fonction des comparaisons souhaitées. D’après les études déjà menées au laboratoire sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 16 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique/sédatif avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. L’hébergement se fera en cage collective et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. Les animaux seront soumis à plusieurs tests comportementaux toujours espacés d’au moins 2 jours afin de limiter le stress. Des points limites ont été quantifiés pour limiter toute douleur chez les animaux.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. C’est un animal sur lequel les traitements nutritionnels et les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Les souris seront utilisées soit adultes pour valider les déficits comportementaux des animaux âgés (groupe contrôle), soit âgées pour évaluer l’impact de la supplémentation sur la prévention des troubles cognitifs et de l’humeur liés à l’âge.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie d'une heure trente, une exposition à la nicotine huit heures par jour pendant vingt jours, une mesure du seuil de retrait de la patte, et deux mois de test quotidien de recherche de récompense alimentaire, cinq jours par semaine. Le projet cherche à relier la vulnérabilité à la nicotine et la sensibilité à la douleur en passant par l'impulsivité, avec l'espoir de nouvelles pistes contre le tabagisme. Le porteur écrit que l'imprégnation en nicotine "n'a pas d'effets nuisibles" et que les tests, hors chirurgie, sont "sans douleur" pour l'animal.

Objectifs

Le trouble lié à l'utilisation du tabac, impliquant les produits dérivés du tabac tels que les cigarettes, les e-cigarettes ou le snus (forme de tabac conditionné en sachets, contenant une poudre de tabac à sucer ou à chiquer), est l’une des addictions les plus répandues. En France, la consommation de tabac entraîne 73 000 décès chaque année, posant l'un des défis de santé publique les plus importants de notre époque. Malgré son importance, la comorbidité liée à l'utilisation du tabac avec une hypersensibilité à la douleur passe souvent inaperçue. Il est donc impératif de prendre en compte ces troubles conjointement, et de les traiter simultanément pour améliorer les approches thérapeutiques contre le tabagisme.

Bénéfices attendus

D'un point de vue de santé publique, notre objectif est d'adopter une approche transdiagnostique pour explorer l'interaction entre l'utilisation de la nicotine/du tabac et la douleur. Cette approche permettra d’identifier des mécanismes partagés et offrira de nouvelles pistes pour tester si des médicaments spécifiques peuvent être des candidats prometteurs pour de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à traiter la sensibilisation à la douleur chez les sujets impulsifs, réduisant les troubles liés à l'utilisation du tabac chez ces individus.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des interventions chirurgicales (durée 1h30). Tous les animaux suivront des tests comportementaux : mesure du seuil de retrait de la patte (10min, 1 fois), comportement dirigé vers une récompense alimentaire (1h/ jour pendant 2 mois, 5 jours/sem), exposition à la nicotine (8h/jour pendant 20 jours), enregistrements in vivo (1h/jour de 1 à 15 jours). Selon les procédures, certains animaux seront injectés (quelques secondes, de 1 à 3 semaines, 5jours/semaines)

Impact sur les animaux

Les procédures chirurgicales peuvent être source de douleurs post-opératoires pour lesquelles des traitements antalgiques et un suivi post-opératoire sont mis en place. Les animaux sont également exposés à une solution de nicotine qui permet une imprégnation en nicotine, objet de l'étude pour l'addiction, mais cela n'a pas d'effets nuisibles. Le comportement sensoriel des animaux consistera à définir un seuil de réaction à une stimulation mécanique sur animal en libre mouvement. Ce test n'engendre pas de douleur. Les injections intrapéritonéales sont réalisées par un personnel compétent et n'engendrent pas de douleur autre que celle de la piqure. La contention des animaux lors de la connection/déconnection des fibres peut être source de stress, même si les animaux sont au préalable habitués au geste. Les autres tests expérimentaux sont sans douleur sur l'animal et n'engendre pas de nuisances ou d'effets néfastes.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Nous utilisons le modèle animal pour modéliser la pathologie humaine de l'addiction à la nicotine. Les similitudes entre homme et rongeurs en terme de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que de caractéristiques neuronales justifient l’utilisation de la souris dans nos études. De plus, notre projet d'étude des comorbidités entre addiction à la nicotine et sensibilité à la douleur repose sur une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal et impliquant le fonctionnement du système nerveux dans son intégrité. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro ou in silico.

Réduction

Nous prévoyons d'utiliser le nombre minimal de souris nécessaires pour obtenir des analyses statistiques fiables et cohérentes. Pour les études comportementales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous effectuerons lorsque cela est possible sans biaiser les résultats de l'expérience, plusieurs tests sur les mêmes souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cages collectives (10/cage maximum) dans un milieu enrichi (litière de cellulose, carrés de cellulose et papier ouaté). La surveillance des animaux est réalisée quotidiennement par le zootechnicien. Toute anomalie ou souffrance évidente est signalée à l'expérimentateur et au responsable du projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites fixés. Des fiches de suivi post-opératoires sont mises en place, ainsi qu’une grille d’évaluation sur laquelle des critères d’arrêt et des mesures conservatoires sont décrites. Avant toute procédure, les animaux connaissent une période d’acclimatation de minimum 7 jours, durant laquelle ils sont délicatement manipulés (handling) de façon quotidienne. Cette approche permet de limiter le stress des animaux lors du démarrage des procédures en les habituant à la préhension et à la contention.

Choix des espèces

Les similitudes entre homme et rongeurs en terme de développement, de symptomatologie comportementale ainsi que de caractéristiques neuronales justifient l’utilisation de la souris dans nos études. Nos travaux considèrent la souris in vivo, et mettent à profit différents protocoles comportementaux irréalisables matériellement et/ou scientifiquement sur d'autres espèces. L'organisation du cerveau de souris est proche de celle du cerveau humain, ce qui permet de proposer des hypothèses de fonctionnement du cerveau humain dans le cadre des comportements spécifiques liés à la toxicomanie. Les animaux débuteront les expérimentations à l'âge de 56 jours, soit l’âge adulte. Nous choississons ce stade dévelopemental qui correspond à une maturation complète du cerveau.

Tester des candidats médicaments antiépileptiques pour le compte d'industriels du médicament : 1 200 rats issus de deux lignées sélectionnées pour être épileptiques vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un tiers subit une neurochirurgie d'environ une heure sous anesthésie générale, puis vit seul en cage, l'isolement social suivant l'implantation des électrodes d'enregistrement. Les injections peuvent être quotidiennes pendant quatre mois au maximum, et le porteur signale des effets indésirables non attendus possibles, perte de tonus musculaire, somnolence ou excitation selon les molécules. 1 000 rats seront tués pour prélever cerveau et tissus, 200 pourront être réutilisés pour de la formation ou un autre plan d'étude, l'effectif total reflétant selon le porteur "l'activité envisagée de la société" sur cinq ans.

Objectifs

L’épilepsie représente l’une des atteintes neurologiques les plus prédominantes, avec environ 0.8 à 1 % de la population mondiale souffrant d’un syndrome épileptique. Il existe différents types d’épilepsies pouvant être catégorisées suivant l’origine de la maladie mais également suivant l’origine cérébrale des décharges épileptiques. Dans ce projet, nous nous sommes intéressés à une forme généralisée d’épilepsie ; l’épilepsie-absence. Cette forme d’épilepsie se caractérise par l’apparition de décharges épileptiques généralisées non convulsives associées à une brève interruption de conscience et un arrêt de toute activité. Au niveau électroencéphalographique, des activités épileptiques sont observées. Ces crises sont appelées décharges pointes-ondes. Le développement clinique de nouvelles drogues antiépileptiques requiert tout d’abord le test sur des épilepsies pharmaco-résistantes en polythérapie puis en monothérapie. Ces nouvelles molécules doivent ensuite montrer une efficacité sur des épilepsies généralisées de type absence en polythérapie puis en monothérapie. L’épilepsie-absence a pu être modélisée chez le rat par croisement successif. Il existe 2 lignées obtenues de cette façon. Des études pharmacologiques sur ces modèles ont montré une sensibilité aux mêmes antiépileptiques que les patients, mais aussi une même sensibilité aux molécules induisant une aggravation chez les patients. Ces modèles, au cours des années, sont devenus des références pour évaluer les effets curatifs et éventuellement aggravants de nouvelles molécules en développement. Les traitements actuels contre l’épilepsie ne sont pas satisfaisants, il est donc nécessaire de valider de nouveaux candidats médicament. Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouveaux médicaments afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles. Ce projet permettra une meilleure sélection et validation de nouveaux médicaments contre l’épilepsie absence et d’optimiser les chances de succès lors des phases cliniques.

Bénéfices attendus

Les traitements actuels contre l’épilepsie ne sont pas satisfaisants, il est donc nécessaire de valider de nouveaux candidats médicament. Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouveaux médicaments afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles.

Procédures

1/3 des animaux de ce projet va subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des enregistrements une à deux fois par semaine. Lors de ces enregistrements des traitements pharmacologiques en courte durée seront administrés (injections aigues durant quelques minutes), Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées une fois par jour, sur une durée maximum de 4 mois. Des prélèvements sanguins (d'une durée de quelques minutes) pourront être faits au cours de la procédure expérimentale en fonction du plan expérimental établi.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir une neurochirurgie d’environ une heure comprenant la période d’anesthésie. Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation due au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social. Les prélèvements sanguins pourront produire une douleur modérée (piqure d’aiguille). Les animaux présentent un phénotype d’épilepsie d’absence : les animaux présentent des absences momentanées de courtes durées.

Devenir

Dans la procédure 1 : les animaux pourront être réutilisés au besoin pour de la formation, si leur bien-être le permet et s’ils n’ont pas reçu toutes les administrations prévues dans les procédures. Dans la procédure 2 : les animaux seront mis à mort dans le but de faire des prélèvements et des analyses du cerveau et des tissus. Si les animaux ne sont pas mis à mort, ils pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d'injection maximum n'a pas été atteint - le bien être de l'animal le permet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle implique des mécanismes pathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou fait par ordinateur). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Nous pouvons estimer notre utilisation à 4 lots par an sur 5 ans (soit 400 animaux). Un maximum de 20 rats par lot est prévu, selon le protocole expérimental établi. Ce nombre permet d’obtenir une bonne fiabilité des résultats et une puissance statistique suffisante pour conclure sur l’efficacité du composé testé. Pour la procédure 2, nous planifions l’utilisation de 2 lots par lot d’animaux passant en procédure 1 (2x4x20x5 rats) sur 5 ans pour les dosages pharmacocinétiques. Un lot représente un dosage sur un plan d’étude croisée : utilisation de 4 animaux par condition (en moyenne 5 conditions par plan d'étude). Les animaux pouvant être testés sur 2 plans d’étude croisé, ce nombre de lots reflète l’activité envisagée de la société dans les 5 prochaines années, soit 800 animaux. Ce nombre d’animaux est un nombre maximal, l’utilisation dépendra de la demande. Ce nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en gardant un nombre suffisant pour ne pas compromettre la validité des expériences qui seront menées.

Raffinement

Le projet implique la mise en place d’un système d’enregistrement de l'activité des neurones chez le rongeur avec une chirurgie. Cependant, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Une analgésie est réalisée avant et après la chirurgie de manière à réduire la douleur pouvant survenir lors de l’acte chirurgical. A leur arrivée, les animaux passent 1 semaine en acclimatation dans l’animalerie avant toute expérience. Les animaux sont rassemblés 1 fois par semaine dans une « cours de récréation » pour assurer le maintien du contact social. Les animaux d’une même étude (maximum 12 animaux par session) sont rassemblés dans une enceinte fermée sur les cotés avec litière et divers enrichissements, leur permettant une liberté de mouvement plus grande et une interaction entre congénères. Cette session dure 30 minutes. Des points limite ont été définis et une prise en charge de la douleur avec utilisation d’analgésique sera effectué en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer dans la compréhension des épilepsies. Les lignées des rats épileptiques ont été développées en sélectionnant des lignées de rats naturellement épileptiques, qui présentent le même type d’anomalies comportementales et neuronales que l’humain. Les activités neurologiques, visibles à l’enregistrement de neurones ont des tracés similaires à ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie-absence : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les modifications comportementales sont similaires à celles d’un humain pendant une crise absence : brève rupture de contact se traduisant par une activité motrice figée et une fixité du regard. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues. Des animaux adultes sont utilisés (âge minimum de 2 mois). Pour que les implantations des électrodes et leur fixation sur la boite crânienne se fassent sans douleur, il faut que la structure osseuse soit mature, c’est-à-dire que l’animal ait fini sa croissance osseuse. De plus, les crises d’épilepsie apparaissent et sont stables à adulte dans les 2 souches.

816 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit l'implantation d'un cathéter intraveineux et une chirurgie crânienne d'une heure pour y fixer un dispositif d'enregistrement des neurones et une électrode de stimulation, puis dix sessions quotidiennes d'auto-administration de drogue de six heures et un test de recherche de drogue de six heures. Les rats sont ensuite soumis à une stimulation magnétique transcrânienne de dix minutes, adaptée d'une technique déjà employée chez des personnes dépendantes, et vivent seuls en cage sur les périodes d'isolement prévues. Le porteur conclut qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne permettrait cette étude et que l'utilisation de l'animal y est "indispensable".

Objectifs

L’addiction aux drogues est une maladie chronique qui affecte gravement la santé, la société et l'économie. Une des principales difficultés de cette maladie est le risque élevé de rechute, même après une longue période d’abstinence. Ce risque est probablement dû à des changements durables dans certaines régions du cerveau causés par la consommation de drogues. Mieux comprendre ces changements est essentiel pour développer de nouveaux traitements qui aideront les personnes à rester abstinentes. Dans ce projet, nous étudions chez le rat comment certaines parties du cerveau sont modifiées par la prise de drogue et comment cela influence le comportement. Nous utilisons des fibres optiques pour observer en direct l’activité des neurones dans ces régions du cerveau pendant que l’animal est éveillé et réalise certaines tâches. Ensuite, nous allons stimuler une autre région du cerveau qui est déjà une cible thérapeutique chez les humains pour traiter l'addiction. Nous testerons si cette stimulation peut inverser les changements provoqués par la drogue. Cette technique, appelée stimulation magnétique transcrânienne, est déjà utilisée chez les humains pour traiter certaines addictions. En adaptant ce type de stimulation aux rats, nous espérons mieux comprendre comment elle influence les circuits cérébraux de l'addiction et, à terme, améliorer les traitements pour les personnes dépendantes.

Bénéfices attendus

La mesure de l'activité des neurones avec une fibre optique est une technique importante pour comprendre comment certaines parties du cerveau fonctionnent quand un animal cherche à prendre de la drogue ou à y replonger après une pause. En regardant directement ce qui se passe dans le cerveau pendant que l'animal agit, on peut découvrir quelles parties du cerveau sont responsables de ces comportements, et comment elles changent en fonction de ce qui se passe. Cela nous aide à trouver des moyens d’empêcher les rechutes chez les personnes qui essaient d’arrêter la drogue. Par exemple, en voyant comment l'activité du cerveau change, on pourra tester si des traitements, comme la stimulation d’une zone spéciale du cerveau peuvent aider à calmer les envies de drogue. Les résultats de cette étude nous aideront à mieux comprendre comment fonctionne le cerveau quand il devient dépendant, et pourront nous montrer de nouvelles façons d'aider les personnes à ne pas retomber dans l’addiction.

Procédures

En fonction des groupes, toutes les interventions ne se feront pas sur tous les animaux. Sur animaux anesthésiés : - chirurgie d’implantation de cathéter intraveineux (durée : 15minutes par animal) pour permettre l’auto-administration de drogue. - chirurgie crâniale pour implantation du dispositif d’enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (1 heure par animal). - implantation d’électrode de stimulation des neurones : 1 fois (acte réalisé en même temps que la chirurgie crâniale citée ci-dessus ; 30 minutes par animal) Sur animaux vigiles : - en amont de chaque chirurgie, 1 injection sous cutanée d'antalgiques - après la chirurgie, 2 injections sous cutanée d’antalgiques - au maximum 14 pesées par animal, d'une durée d'environ 1 minute (1 fois par semaine , sur toute la durée du projet) - 1 injection intraveineuse (par le cathéter), les 5 premiers jours après la chirurgie d’implantation de cathéter et tous les jours d’auto-administration (15 injections) - 10 sessions d’auto-administration (1 session / jour, 6h/session) - test de recherche de drogue (1 session / rat de 6 heures) - stimulation cérébrale (1 session / rat de 10 minutes) - enregistrement de l’activité cérébrale

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour ce projet sont : -Chirurgies : inconfort transitoire au réveil, et douleur post-opératoire minorée par des antalgiques -Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience -Période d’abstinence : peut causer un léger stress -Isolement : stress modéré -Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’enregistrement -Dispositif de stimulation cérébrale : gène légère pendant la durée de la stimulation -L’acte de pesée, les injections sous-cutanées (5 injections) et les tests comportementaux sur animal vigile peuvent induire un léger stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mis à mort par une méthode reglementaire afin de réaliser des prélèvements et analyse des cerveaux.

Remplacement

Ce type de recherche vise à développer une technique permettant d'enregistrer l'activité des neurones directement chez un animal éveillé pendant qu'il effectue des tests comportementaux. Pour étudier ce processus, il est essentiel d'observer des réseaux de neurones qui fonctionnent normalement, ce qui n'est possible que chez un animal vivant. Après vérification, il n'existe actuellement pas de méthode alternative, comme des tests en laboratoire sur des cellules (in vitro) ou des simulations informatiques (in silico), qui permettrait de réaliser cette étude sans utiliser d'animaux vivants. C'est pourquoi l'utilisation de l'animal est indispensable pour ce type de recherche.

Réduction

L'estimation du nombre d'animaux de ce projet est basée sur la variabilité naturelle et permet d'obtenir des résultats fiables sur le plan statistique. Dans la première expérience, des groupes de 12 rats seront nécessaires, afin de déterminer les meilleures conditions d’expérimentation tout en utilisant le moins d’animaux possibles. Pour les autres expériences, 24 rats par groupe seront nécessaires, selon des calculs statistiques pour obtenir des résultats fiables. L'approche se fait étape par étape, avec certaines étapes réalisées uniquement si les résultats de l'étape précédente sont concluants. Le nombre d'animaux indiqué représente un maximum. Ainsi, notre projet nécessitera un maximum de 816 rats répartis en différents groupes et tests .

Raffinement

Le bien-être des animaux est une priorité tout au long de l’expérience. Nous veillons régulièrement à leur état de santé en surveillant leur alimentation, apparence et comportement. Une grille de score précise et un plan d’intervention permettent d’identifier rapidement les signes de souffrance et d’agir avant que l’animal ne souffre trop. Si un animal atteint un seuil critique, il est pris en charge sans délai. Les animaux sont pesés chaque semaine, et dès leur arrivée à l’animalerie, ils sont hébergés dans des cages ventilées, à température et humidité contrôlées. Pour répondre à leurs besoins naturels, ils ont des objets à ronger et un accès libre à l’eau et à la nourriture. Avant toute procédure, les animaux bénéficient d’une période d’adaptation de 7 jours. Lors des chirurgies, les rats reçoivent une anesthésie générale et locale, avec des analgésiques pour gérer la douleur, et leur température est maintenue grâce à un tapis chauffant. Après l'opération, un traitement antidouleur est poursuivi pendant 48 heures, couvrant ainsi les 72 premières heures post-opératoires.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus souvent utilisé pour étudier l’addiction, car ses réactions aux drogues ressemblent beaucoup à celles des humains. Comme les humains, les rats peuvent s’auto-administrer spontanément toutes les drogues que l’on abuse, ce qui n’est pas toujours le cas avec d’autres espèces animales. Ces caractéristiques en font un modèle idéal pour comprendre l’addiction. Dans cette étude, nous utiliserons des rats de la lignée "Sprague-Dawley". Ces rats ont une diversité génétique importante, ce qui est utile pour refléter la variabilité que l’on observe chez les humains. Nous choisirons des rats « jeunes adultes », âgés de 7 à 8 semaines, un âge souvent utilisé dans nos recherches pour éviter les variations dues à l’adolescence, qui pourraient influencer les résultats.

Test de suspension, marche sur poutre, réflexe sensitif, test de force, couloir de marche, sensibilité à la chaleur : six épreuves motrices et sensorielles étalées sur trois jours, et pour d'autres souris un électromyogramme du nerf sciatique de trente minutes sous anesthésie profonde. 190 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs nerfs périphériques. Elles développent une neuropathie auto-immune qui peut provoquer des sensations douloureuses et une paralysie. Le porteur retient des femelles tuées à 20 semaines, avant que les atteintes nerveuses soient détectables, d'autres à 35 semaines quand ces atteintes sont assez avancées pour être caractérisées, et 36 mâles pour le maintien des colonies.

Objectifs

Les nerfs périphériques sont les cibles de complications auto-immunes majeures : les neuropathies périphériques. Aucune piste thérapeutique n'est pour l'instant envisagée pour tenter de soigner cette pathologie nerveuse très invalidante pour les malades. L'identification des gènes qui interviennent dans le développement de cette maladie est un premier pas pour la découverte d'un traitement qui permettrait de protéger voire réparer les nerfs atteints.

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension de l'implication des facteurs qui régulent l'activité des lymphocytes dans la survenue de la neuropathie périphérique ouvre la voie à de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement de la complication la plus commune et la plus invalidante qui touche les nerfs périphériques.

Procédures

Les animaux adultes seront soumis à une série de test pour étudier leur démarche, leur équilibre et leur coordination motrice : 1) test de suspension : 20s par animal, 2) marche sur poutre : 3 x 1 min avec 10 min d'attente entre chaque passage, 3) reflexe sensitif : moins de 10 s par animal, 4) test de force : 2 x 20s par animal avec 10 minutes d'attente entre les deux mesures, 5) couloir de marche : 3 x 30s par animal avec 30 minutes d'attente entre chaque passage, 6) sensibilité à la chaleur : 30s maximum par animal. Les animaux ne subiront ces tests qu'une seule fois et étalés sur 3 jours pour limiter leur fatigue. D'autres animaux seront profondément endormis pour analyser le fonctionnement de leurs nerfs sicatiques par électromyogramme. Il faut compter 30 min par animal pour ce test.

Impact sur les animaux

La survenue de la neuropathie occasionne des atteintes neurologiques qui peuvent être délétères pour le confort de l'animal (sensations douloureuses, paralysie...).

Devenir

tous les animaux utilisés pour cette étude seront sacrifiés et leurs nerfs périphériques seront prélevés pour mener à bien les études tissulaires et cellulaires nécessaires à une meilleure compréhension des atteintes nerveuses constatées

Remplacement

Les complications neurologiques font intervenir de multiples acteurs cellulaires et systémiques qui ne peuvent être modélisés in vitro. Le fonctionnement des nerfs et les conséquences fonctionnelles de leurs altérations nécessitent l’analyse de composantes sensori-motrices propres aux animaux vivants.

Réduction

Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux nécessaire pour atteindre la puissance statistique suffisante pour l'analyse des altérations comportementales induites par la perturbation du système sensori-moteur. Nous soumettrons les données au test satistique le plus adapté pour que nos analyses soient pertinentes avec un minimum d'animaux utilisés.

Raffinement

Un suivi spécifique de la douleur due à la survenue de la neuropathie sera mis en place tout au long du projet pour limiter au maximum la souffrance des animaux. Une grille spécifique d'évaluation de la douleur a par ailleurs été mise en place pour prendre en charge l'éventuelle souffrance des animaux chez qui l'intégrité des nerfs périphériques peut être compromise. Les animaux seront quotidiennement surveillés et des dispositions seront prises pour palier les possibles altérations de la locomotion qui compromettraient la capacité des animaux à se nourrir et s'hydrater (mise à disposition de gel d'hydratation et de croquettes au fond de la cage, pesée régulière...).

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères au systême métabolique et physiologique suffisamment proche de l’Homme pour servir à une meilleure compréhension de la neuropathie périphérique et à l’évaluation de l’importance d'un réceptur spécifique des celluels immunitaires et leur ligand sur l'apparition et le développement de la pathologie. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de ces gènes sont très bien adaptées chez la souris. L’analyse comportementale ainsi que les techniques biochimiques et histologiques envisagées pour étudier l'étendue de la neuropathie nous permettront d’apporter des réponses claires quant à l’implication des lymphocytes et de l'auto-immunité sur la neuropathie périphérique. - 3 lots de souris femelles (30 individus/lot) sont sacrifiés à l'âge de 20 semaines, lorsque le diabète spontané est censé se déclarer mais que les atteintes neurologiques ne sont pas détectables. - 3 lots de souris femelles (30 individus/lot) sont sacrifiés à l'âge de 35 semaines, lorsque les atteintes nerveuses déclarées sont suffisemment avancées pour que l'on puisse les caractériser le mieux possible. - Seuls 36 mâles seront utilisés pour assurer le maintien des colonies d'animaux.

Ovariectomisées puis pourvues d'un implant sous-cutané d'œstradiol, 256 souris femelles reçoivent pendant douze semaines une alimentation riche en graisses et en fructose associée à un mélange de phtalates. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélever leurs micro-vaisseaux cérébraux. La treizième semaine, elles reçoivent une injection de progestérone, parfois une injection intrapéritonéale de colorant, puis sont mises à mort dix minutes ou trois heures après. Le porteur qualifie les effets du régime de "très limités voire inexistants", tout en listant la douleur post-chirurgicale, les irritations et infections de sutures et une prise de poids qui nuirait à la mobilité.

Objectifs

Le projet a pour but d’étudier l’effet d’une co-exposition à un régime alimentaire riche en graisses et en fructose, mimant une alimentation déséquilibrée à l’origine de désordres métaboliques (régime obésogène et diabétogène), associée à l’exposition chronique à des doses environnementales de phtalates, composés chimiques utilisés comme plastifiants et reconnus comme perturbateurs endocriniens susceptibles de modifier le fonctionnement du système hormonal, sur les micro-vaisseaux cérébraux chez la souris femelle adulte : intégrité de la paroi des capillaires cérébraux, inflammation du tissu cérébral et dégénérescence neuronale. Ce travail permettra d’évaluer les effets sur les micro-vaisseaux cérébraux des inter-relations possibles entre alimentation obésogène-diabétogène, et contamination chimique environnementale par les perturbateurs endocriniens de type phtalates, qui pourraient être une des causes d’une altération de la santé reproductive chez la femelle.

Bénéfices attendus

Le projet se place dans le contexte de la transition alimentaire, des changements des comportements de consommation et de l'exposition environnementale aux perturbateurs endocriniens. Le projet analyse les altérations générées sur la fonction cérébrovasculaire et les positionne dans une perspective intégrative, permettant de progresser sur la notion de vulnérabilité des populations sensibles. A terme, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental pourront participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ce projet servira de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs.

Procédures

Les animaux sont exposées pendant 12 semaines à un régime alimentaire riche en graisses et en sucre ou contôle, associé ou non à un mélange de phtalates mimant l’exposition environementale à des phtalates, composés chimiques perturbateurs endocriniens largement utilisés comme plastifiants, entre autres, dans les contenants alimentaires. Les études publiées précédemment indiquent que les souris supportent assez bien ces troubles métaboliques lorsqu’elles sont nourries et abreuvées ad libitum, ce qui sera le cas tout au long des expérimentations. Pour cette étude, toutes les souris femelles doivent avoir le même statut homonal. Pour ce faire, après la semaine d'habituation à l'animalerie, les animaux subissent sous analgésie et anesthésie préalables, une ovariectomie (10 min) associée à une supplémentation en oestradiol à l'aide d'un implant sous-cutané (3 min). Une semaine après rétablissement, les souris sont exposées au régime alimentaire pendant 12 semaines. Au début de la 13ème semaine, les souris vigiles reçoivent une supplémentation en progesterone par injection sous-cutanée (2 min), 4 à 5 heures avant leur euthanasie. Enfin, toujours à l’issue de ces 12 semaines et après l'injection de progesterone, une partie des animaux à l’état vigile reçoivent en plus une injection unique par voie intrapéritonéale (durée 1 min) d'une solution de colorant puis sont euthanasiés 10 min ou 3 h après. Tous les animaux sont euthanasiés par différentes méthodes réglementaires selon les analyses à réaliser.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables liés au régime alimentaire sont, à priori, très limités voire inexistants. Ce régime alimentaire décrit dans la littérature n'est pas connu pour causer des troubles digestifs et la surveillance quotidienne des animaux et des cages (litière) permet de prévenir tout inconfort (diurèse augmentée). Les nuisances qui pourraient survenir sont celles liées 1) aux injections intra-péritonéale et sous-cutanée : inconfort passager dû à la manipulation et à la contention et douleur légère passagère au point d’injection ; 2) à l’ovariectomie et à la pose d’implant sous-cutané : douleur post-chirurgicale, problèmes liés aux sutures (irritations, infection); 3) une prise de poids qui nuirait à la mobilité; 4) effets indésirables de l'anesthésie inhérents à toute chirurgie et risques/contraintes opératoires (hypothermie, réveil/arrêt cardiorespiratoire (peu probable).

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire pour effectuer les analyses post-mortem à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire dans les régions cérébrales concernées par l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène associé à une exposition à des doses environementales de phtalates.

Remplacement

La modélisation ou les études in vitro (lignées cellulaires, co-cultures, organoïdes, …) ou sur les invertébrés ne permettent pas l’étude de l’impact d’un régime alimentaire obésogène-diabétogène (mimant le régime alimentaire occidental actuel) associé à l’exposition aux perturbateurs endocriniens environementaux, sur les micro-vaisseaux du cerveau et leur environnement. Les modèles in vitro de micro-vaisseaux cérébraux existant actuellement ne permettent pas encore ce type d’étude intégrée demandant de s’intéresser non seuleument aux vaisseaux cérébraux mais également à leur environnement, en lien avec les organes périphériques tels que les ovaires chez la femelles. Les invertébrés ne présentent pas de capillaires cérébraux de structure et de fonction semblables à ceux des mammifères. La modélisation nécessite des données cellulaires pour permettre d’apporter des informations sur le fonctionnement du cerveau et des micro-vaisseaux en particulier. De plus, les résultats obtenus sur ce modèle expérimental mimant un mode de vie occidental doivent pouvoir participer à l'évaluation du risque pour la santé humaine vis-à-vis de l'exposition environnementale aux phtalates. Ils serviront de support aux recommandations pour la nutrition humaine, en termes de sécurité alimentaire, de toxicité des emballages, mais aussi pour les changements de comportement des consommateurs. La souris est le modèle animal le plus approprié pour ce type d’étude physio-physiopathologique.

Réduction

Un total de 256 souris est nécessaire pour ce projet. Le dimensionnement des groupes expérimentaux pour chaque cohorte est déterminé au plus juste pour obtenir des données quantitatives permettant une analyse statistique robuste, recevable pour publication scientifique dans des journaux internationaux à comité de lecture, et en prenant en compte l’hétérogénéité inter-individuelle et les besoins et nécessités des protocoles expérimentaux, selon la règle des 3R. Ce projet est un projet de recherche original et ne bénéficie pas de résultats déjà existants sur lesquels s’appuyer. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été confirmé par un calcul de puissance et des tests statistiques pertinents seront faits pour une interprétation fiable des résultats. Les protocoles utilisés sont adaptés pour limiter le nombre d'animaux.

Raffinement

Les souris proviennent d’un fournisseur extérieur agréé, sont réparties par 5 maximum dans chaque cage pour éviter l’isolement et hébergées dans une pièce dédiée de notre animalerie dans des conditions contrôlées. Dès leur arrivée, les animaux sont manipulés régulièrement afin de réduire le stress lors des expérimentations. Les cages sont en portoirs ventilés et contiennent de la sciure enrichies avec du nid végétal ; elles sont transparentes, placées les unes à côté des autres. Les animaux ont libre accès à la nourriture et à la boisson. Aucune procédure expérimentale ne nécessite l’isolement d’animaux. La surveillance quotidienne des animaux et des cages (litière) par au moins une personne formée et compétente permet de prévenir tout inconfort (diurèse augmentée). Les données relatives à ces contrôles sont enregistrées et validées par la structure bien-être animal (SBEA) locale et des points limites définis pour permettre de repérer rapidement tout animal malade, blessé ou en souffrance (inconfort, stress, angoisse) et de prendre les mesures appropriées en interagissant avec la SBEA locale et le vétérinaire référent. Pour les actes chirurgicaux, les animaux sont anesthésiés et la douleur est prise en charge en pré- et post-opératoire par l’administration d’antalgiques. La surveillance post-opératoire est assurée 2 fois par jour pendant 3 jours lors de l’administration des antalgiques. Les animaux sont euthanasiés par différentes méthodes réglementaires selon les analyses à réaliser.

Choix des espèces

La souris est un des modèles les mieux caractérisés pour les études métaboliques et il existe de nombreux outils biotechniques disponibles pour ce modèle animal (anticorps, lignées transgéniques...). Cela permet également de comparer les résultats obtenus avec ceux de la littérature et avec nos résultats précédents pour affiner nos hypothèses de travail. Le projet vise à étudier les effets d'une exposition à une alimentation déséquilibrée, associée à des perturbateurs endocriniens environementaux sur la fonction cérébrovasculaire chez la souris femelle adulte: l'exposition au régime est donc faite chez l'adulte, il convient d'utiliser des animaux au stade adulte, âgés de 8 semaines au début du traitement. Les animaux sont commandés chez le fournisseur à l’âge 7 semaines pour éviter les effets du transport sur les derniers stades de maturation du système nerveux central. Les animaux sont acclimatés pendant 1 semaine dans notre animalerie (nouvel environnement).