Système nerveux

Toutes tuées à l'issue pour que leur cerveau soit analysé, 400 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cent d'entre elles reçoivent deux chirurgies cérébrales successives, lésionnelle puis implantation de sondes, de deux à deux heures trente chacune, espacées de dix jours. Suivent trente jours d'hébergement individuel, la coupe des vibrisses et une restriction alimentaire d'une vingtaine de jours qui les ramène à 85 % de leur poids initial, condition posée par le porteur pour qu'elles exécutent la tâche comportementale. Il affirme que ces mécanismes ne peuvent s'étudier que chez des animaux vigiles et qu'aucun modèle in vitro ne peut être utilisé ici.

Objectifs

La prise de décision dirigée par la perception est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette intégration des fonctions sensoriels et de la motricité fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à une restriction alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). La finalité des tests comportement est d’étudier la prise de décision lorsqu’elle est dirigée pas la perception. Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes pendant 30 jours.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie.● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour qu’elles atteignent 85% de leur poids initial, soit une réduction maximal de 15%. •La coupe des vibrisses.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Les animaux sont hébergés et manipulés dans le cycle jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Pour respecter leur rythme de vie et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit hébérgés avec de la lumière. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle jour/nuit inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase nocturne, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent effectivement dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Des points limites spécifiques suffisamment précoces seront définis.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Une restriction alimentaire ramenant les animaux à 85 % de leur poids initial conditionne la tâche comportementale : 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une ou deux neurochirurgies de deux à deux heures trente, lésion cérébrale, implantation de sondes ou les deux, puis trente jours d'hébergement individuel pour éviter l'arrachement du matériel, et une coupe des vibrisses. Les tests durent une vingtaine de jours, avec jusqu'à soixante essais quotidiens sur environ deux heures, et le porteur revendique des conditions "quasi-naturelles" obtenues en laboratoire. Le projet relève de la science fondamentale, ses retombées cliniques restant à l'état d'orientation pour des études ultérieures.

Objectifs

La prise de décision dirigée par la perception est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette integration des fonctions sensoriels et de la motricité fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à une restriction alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). Ces tests comportementaux permettront d'étudier la prise de décision lorsqu'elle est dirigée par la perception. Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes pendant 30 jours.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie. ● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour atteindre une réduction maximale à 85% de leur poids initial. ● Coupe des vibrisses

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Les animaux sont hébergés et manipulés dans le cycle jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Pour respecter leur rythme de vie et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit hébergés avec de la lumière. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle jour/nuit inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase nocturne, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent effectivement dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Trois chocs électriques de deux secondes à 0,5 milliampère servent à conditionner la peur chez des souris dont les mères ont été privées de litière et d'enrichissement pendant les vingt et un premiers jours de leur vie. 3 325 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit ces chocs comme n'entraînant pas d'altération de l'état général des animaux, et présente la réponse de stress induite chez les mères et leurs petits comme "nécessaire au projet scientifique". Toutes, géniteurs compris, sont tuées pour prélever le cerveau et des organes périphériques. Il annonce enfin jusqu'à cinq tests comportementaux à l'âge adulte, pour un total de 93 minutes, sans préciser lesquels.

Objectifs

Le stress précoce englobe un large éventail d'événements défavorables survenant pendant la période périnatale critique, tels que la maltraitance, la négligence, la pauvreté, la famine et la séparation parentale. Une des principales conséquences de l'exposition au stress précoce est un risque accru de troubles mentaux à l'âge adulte, notamment le trouble de stress post-traumatique. Ce dernier est associé à des altérations des comportements sociaux et cognitifs et, s'il n'est pas traité, peut avoir un impact grave sur la qualité de vie d'une personne. Des études ont montré que les souris exposées à un stress précoce présentent des anomalies cognitives et psychologiques. Un acteur clé dans ce processus est la microglie, la population résidente de cellules immunitaires du système nerveux central, qui joue un rôle important dans le développement cérébral. Pendant le stress précoce, la fonction de la microglie est perturbée, ce qui entraîne un développement du cerveau anormal, contribuant aux troubles de comportements observés. Les vésicules extracellulaires participent dans le cerveau à la communication entre les cellules. Les vésicules extracellulaires sont capables de transporter une grande variété de molécules avec des effets sur les cellules du cerveau. Cependant, dans le contexte du stress précoce, l'implication des vésicules extracellulaires dérivées de la microglie est inconnue. Par conséquent, l'objectif global de ce projet est d'explorer le rôle des vésicules extracellulaires du cerveau dans les mécanismes à l'origine de l'impact négatif de l'exposition à un stress précoce sur la fonction cérébrale normale chez la souris. Enfin, nous avons démontré des bénéfices sur la santé du cerveau d’approches nutritionnelles permettant une augmentation des acides gras de type Omega-3. Nous testerons dans le projet les effets protecteurs d’une augmentation des Omega-3 dans le contexte du stress précoce.

Bénéfices attendus

Notre étude explorera le rôle des EVs dérivées de la microglie comme nouvelle cible dans la pathologie et la progression des troubles liés au stress précoce. Cela apportera un nouvel éclairage sur les mécanismes impliqués dans les troubles liés au stress précoce en tant que trouble développemental, un domaine de recherche encore peu exploré. Nous prévoyons que de nouvelles cibles moléculaires seront identifiées, ce qui pourrait offrir des perspectives prometteuses pour la compréhension et le traitement des troubles liés au stress précoce. Ce sujet est d'intérêt public actuel en raison du fardeau croissant des sujets souffrants de conséquences de stress précoces et des estimations selon lesquelles environ 60 % des enfants sont exposés à une forme de stress précoce.

Procédures

1- stress précoce : 21 jours en limitation de litière et absence d'enrichissement. 2- procédure chirurgicale durant moins de 30 minutes avec un suivi du bien être des animaux. 3- test de peur conditionnée à l'âge adulte nécessitant une association entre 3 chocs de 2 secondes et 0,5mA d'intensité durant la phase d'acquisition en J1. 4- les souris sont soumises à maxium 5 tests comportementaux à l'âge adulte pour une durée totale de 93 minutes (1 test par jour, séparé de minimum 24heures).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale est susceptible d'induire un épisode de nuisance chez l'animal nécessitant un suivi de son bien être avant sa complète convalescence. La procédure de stress précoce va induire une réponse de stress chez les descendants et la mère, nécessaires au projet scientifique. Les animaux subiront des chocs électriques de faible intensité pour le test de peur conditionnée, sans entrainer d'altération de l'état général des animaux. les autres tests ne durent que quelques minutes et n'induisent pas d'altération de l'état général des animaux. Les animaux transgéniques utilisés ne présentent pas d'altérations de l'état général de santé.

Devenir

Les animaux incluant les géniteurs seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules du cerveau, ainsi que des organes périphériques nécessaires pour les études du projet.

Remplacement

L'étude des effets du stress précoce nécessite l'utilisation d'animaux vivants, car il s'agit d'un stimulus environnemental qui ne peut être reproduit à l'aide de modèles cellulaires. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que chez des animaux vivants et éveillés. L'objectif général du projet est de comprendre les conséquences comportementales et les causes des troubles liés au stress précoce au niveau cellulaire chez la souris. Comme les causes initiales de la pathologie liée au stress précoce sont encore inconnues, il est impossible de les modéliser efficacement en culture cellulaire. Par conséquent, l'utilisation de modèles animaux pertinents et appropriés pour des études in vivo reste une nécessité expérimentale. Ce projet s'efforce d'identifier de tels déclencheurs moléculaires de la pathologie liée au stress précoce, afin que des études futures puissent adopter une approche in vitro. À ce jour, aucune duplication des travaux proposés n'a été identifiée.

Réduction

Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés pour ces expériences, nous avons adopté une approche statistique pour calculer les tailles d’échantillons nécessaires par groupe afin de démontrer un effet significatif. Nous avons alors choisi un nombre permettant un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre dans les destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer, notamment concernant l'étude des exosomes. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communeauté scientifique.

Choix des espèces

Nous avons changé le paragraphe comme suit : « Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris, et l'ajout de nouvelles données issues d’un modèle murin permettra de raffiner les données existantes grâce à une analyse conjointe avec les données nouvellement générées. Dans le cadre d’une étude explorant le lien entre la nutrition et le cerveau, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste une nécessité expérimentale pour comprendre la réalité physiologique de nos résultats. Les stades de développement décrits ici sont conformes à la littérature actuelle, qui suggère que les souris sont les plus susceptibles de développer des symptômes similaires au syndrome post-traumatique pendant le développement postnatal précoce (P0-P21). Par conséquent, nous visons à surveiller les changements dans les vésicules extracellulaires au cours de cette période ainsi qu'à des stades adultes ultérieurs afin de déterminer si ces changements sont durables. »

Trois à quatre chirurgies de trois à cinq heures chacune, plus une heure d'IRM sous anesthésie : 6 macaques à longue queue de plus de trois ans vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour que leur cerveau soit retiré du crâne et congelé. Le porteur signale des douleurs et des infections possibles après la pose des électrodes, et des troubles respiratoires ou cardiaques liés aux anesthésies répétées. Il qualifie les impulsions électriques envoyées dans le cerveau de "sans danger pour l'animal". Le macaque est retenu pour la ressemblance de son cortex et de ses ganglions de la base avec ceux de l'humain, et le porteur indique avoir choisi six individus faute de données antérieures permettant de calculer un effectif.

Objectifs

Le globus pallidus externe est une structure cérébrale qui joue un rôle central dans le contrôle de nos comportements. Son fonctionnement est également perturbé dans de nombreuses maladies neurologiques et psychiatriques. Longtemps, on a pensé que cette région du cerveau ne contenait qu’un seul type de neurones. Cependant, des recherches récentes menées chez les rongeurs, les primates non humains et même chez l’humain ont révélé la présence de deux catégories distinctes de neurones. Malgré cela, leur connectivité (c’est-à-dire les zones du cerveau auxquelles chaque type de neurone envoie des signaux), leur rôle dans les fonctions cérébrales, et l’impact potentiel de leur dysfonctionnement restent encore à determiner. Pour y parvenir, nous allons donc stimuler différentes zones du cerveau et observer comment ces stimulations influencent l’activité des deux types de neurones chez des singes anesthésiés. Ce projet se deroulera sur 2EU différents.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de déterminer les connexions dans le cerveau de deux populations de neurones distinctes qui composent une région cérébrale essentielle dans le contrôle de nos comportements et dont le dysfonctionnement est mis en cause dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques humaines. L'étude de cette connectivité anatomique chez les primates non humains revêt donc une importance translationnelle significative. En effet, les primates non humains disposent d'un large éventail de comportements, proches de ceux de l'homme, et leur cerveaux présente une organisation similaire à celle de l'humain. Cela permettra donc d'étendre les conclusions de cette recherche à l'homme et participer au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients souffrants d'un dysfonctionnement de cette région du cerveau.

Procédures

Chaque animal subira une imagerie par résonnance magnétique pour obtenir une image morphologique en 3 dimension du cerveau (15min de transport et 60min de procédure). Chacun des animaux sera également soumis à 3 à 4 chirurgies d'une durée de 3 à 5h chacune. Chaque chirurgie permettra l’enregistrement de l’activité neuronale (quelques minutes) durant la procédure de stimulation cérébrale, c'est-à-dire durant l’application impulsions électriques monophasiques uniques de faible intensités, sans danger pour l’animal (durée de 0.1-0.3 ms, intensité de 0.05-0.5 mA) à des fréquences de 0.1-1Hz

Impact sur les animaux

Au cours de la procédure d'imagerie par résonnance magnétique, les nuisances sont essentiellement liées à l'anesthésie qui peut entrainer une baisse de la température corporelle, des troubles respiratoires et/ou cardiaques. De plus, des douleurs/infections peuvent survenir suite aux interventions chirurgicales pour le placement des électrodes d'enregistrement et de stimulation.

Devenir

Une fois la procédure terminée, les animaux seront profondément anesthésiés et euthanasiés afin de pouvoir effectuer des analyses histochimiques post-mortem qui sont indispensables pour localiser les sites d'enregistrements de l'activité neuronale. Après constatation de la mort de l’animal, le cerveau sera retiré du crâne, congelé pour procéder aux analyses histologiques.

Remplacement

Notre projet à pour but de caractériser l'anatomie/connectivité d'une structure du cerveau qui contrôle nos comportements et qui dysfonctionne dans de nombreux troubles neurologiques et psychiatriques, et de faciliter le développement de nouvelles approches thérapeutiques visant à normaliser son activité chez des patients souffrant de son dysfonctionnement. De ce fait, le recours au PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) est nécessaire.

Réduction

Pour mener notre étude, nous avons réduit au minimum le nombre d'animaux utilisés en planifiant soigneusement et en maximisant les données recueillies pour chaque animal. Comme nous ne disposons pas de données préalables dans la littérature pour déterminer précisément la taille de l'échantillon, nous avons choisi une méthode statistique qui recommande un échantillon de 5 à 10 animaux pour garantir des résultats fiables, et nous avons décidé d'utiliser six animaux. Ce petit nombre est suffisant pour des tests statistiques valides dans notre domaine, où les études sur les primates non humains utilisent souvent 3 à 5 animaux à cause de leur complexité.

Raffinement

Les singes seront hébergés dans des conditions standard (cycle lumière/obscurité de 12h avec lumière allumée de 7h00 à 19h00, ~ 60% d'humidité et ~ 22°C). Les animaux seront hébergés en groupe et bénéficieront d'un environnement enrichi (jouets, musique, fourrage). Le transport de l’animal vers la plateforme de bio imagerie située à proximité de l’animalerie se fera à l’aide d’une boîte de transport dédiée mise sur un chariot et protégée des regards extérieurs par une housse. L’animal anesthésié sera maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillotte. Durant le transport et l'acquisition de l'imagerie par résonnance magnétique (15min de transport + 60min de procédure), les constantes physiologiques de l'animal seront contrôlées à l'aide d'un oxymètre. La chirurgie sera réalisée de façon stérile et sous anesthésie profonde à l'isoflurane/oxygène, après une induction à la kétamine. Une couverture antalgique avec de la Buprénorphine en préopératoire et du Metacam en postopératoire sera utilisée pour limiter la douleur de l’animal après l’intervention chirurgicale. Nous administrons un anesthésique local avant incision. Une sonde sera insérée dans le rectum des animaux pour contrôler la température. Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. La perte de poids, la déshydratation, la perte de poils et/ou un repli sur soi inhabituel entraineront une surveillance accrue de l'animal et les mesures nécessaires seront prises de concert avec le vétérinaire. Si la situation ne se normalise pas, l'animal sortira immédiatement du protocole.

Choix des espèces

Contrairement à d'autres espèces de vertebrés (e.g., rongeurs), le macaque possède une organisation corticale et un réseau des ganglions de la base semblables à celle de l'homme. Les enregistrements électrophysiologiques seront réalisés sur des animaux de plus de 36 mois, âge où leur système nerveux central est mature. Cela garantit une meilleure comparaison des résultats avec les caractéristiques observées chez l'adulte humain.

200 rattes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit une ovariectomie de trente minutes sous anesthésie générale, toutes reçoivent une injection de produit inflammatoire dans la face, puis passent chaque jour des tests censés mesurer leur douleur. Le porteur attend de l'injection une hypersensibilité douloureuse, et de l'ablation des ovaires une douleur post-opératoire, un risque d'infection, un risque d'hémorragie et des modifications de l'appétit et du comportement social. Les retombées annoncées se limitent à la recherche préclinique elle-même, au conditionnel, et les tests comportementaux quotidiens ne sont jamais nommés.

Objectifs

Ce projet comporte deux objectifs : 1) Évaluer l’influence du cycle hormonal dans le développement d’une hypersensiblité douloureuse lors d’une stimulation tactile normalement non-douloureuse 2) Évaluer l’influence du cycle hormonal dans l’inflammation faciale et la réactivité cellulaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre le dimorphisme sexuel dans l'inflammation et le développement de douleur chronique faciale. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique s'intéressant aux douleurs chroniques.

Procédures

Groupe 1: 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de la douleur en comportement (1 fois par jour) Groupe 2: 1 ovariectomie (30 min) sous anesthésie générale + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de la douleur en comportement (1 fois par jour) Groupe 3: 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale tests de mesure de l’inflammation(1 fois par jour) + stimulation (10min) sous anesthésie générale Groupe 4: 1 ovariectomie (30 min) sous anesthésie générale + 1 injection sous-cutanée (1 par animal:2min) sous anesthésie générale + tests de mesure de l’inflammation(1 fois par jour) + stimulation (10min) sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Les opérations chirurgicales d'ovariectomie chez la rate peuvent entraîner plusieurs nuisances : - douleur et inconfort (modéré): Comme pour toute intervention chirurgicale, l'ovariectomie peut provoquer une douleur post-opératoire. Les animaux peuvent montrer des signes d'inconfort, tels que des vocalisations, une agitation ou une diminution de l'activité. -infection (modéré) : Il existe un risque d'infection au site chirurgical, ce qui peut entraîner des complications supplémentaires. Les signes d'infection incluent une rougeur, un gonflement, une chaleur ou un écoulement au niveau de l'incision. -hémorragie (modéré) : Des saignements peuvent survenir pendant ou après l'opération, ce qui peut nécessiter des interventions supplémentaires pour contrôler l'hémorragie. -changements hormonaux (modéré) : L'ovariectomie entraîne une diminution des hormones sexuelles, ce qui peut affecter le comportement et le métabolisme de l'animal. Cela peut se traduire par des changements d'appétit, de comportement social ou d'activité. Suite à l’injection du produit inflammatoire (sujet de l'étude), nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse (modéré).

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort car ils ne peuvent pas être utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique. Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de produit inflammatoire.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales. Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif. Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections, comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats sont préalablement anesthésiés. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.