Système nerveux

Les souris de ce projet portent une mutation du gène Tau qui leur fait développer, à partir de quatre mois, une paralysie progressive des membres postérieurs. 676 d'entre elles vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 436 et modéré pour 240. 240 subissent une biopsie de la queue pour génotypage et 304 une injection dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, geste qui peut provoquer une ulcération de la cornée ou une exophtalmie, afin de faire produire dans leurs neurones un fragment de protéine censé bloquer l'agrégation de Tau. Certaines sont tuées un mois après l'injection, d'autres à cinq mois pour éviter des symptômes moteurs plus graves, et d'autres encore, écrit le porteur, "pour fin d'accouplement et génotype sans intérêt".

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est notamment caractérisée par le dysfonctionnement de la protéine Tau dans les neurones du système nerveux central. Cette protéine, dont la dégradation normale est altérée dans la maladie, s’accumule et s’agrège de façon toxique dans les neurones et finit par entraîner la dégénérescence du cerveau. Nous avons mis en évidence qu’une protéine X interagissait avec Tau. Nous avons également constaté que l’expression de cette protéine X est faible dans le cerveau de patients atteint de la maladie d'Alzheimer et que cette baisse est associée à l’apparition des formes pathologiques de Tau dans les neurones. La partie de la protéine X impliquée dans l’inhibition de l'agrégation de la protéine Tau a été identifiée. Nous proposons dans ce projet d’étudier l’impact thérapeutique potentiel de cette partie de la protéine X sur la progression de cette maladie de Tau chez la souris. Pour cela, nous disposons au laboratoire d’un modèle de souris porteur d’une mutation du gène de Tau générant une maladie proche de la maladie d'Alzheimer et présentant une accumulation de Tau dans les neurones du cerveau et de la moelle épinière. Notre objectif à court terme est de produire dans le cerveau et la moelle épinière de souris deux formes plus ou moins longue de cette partie de la protéine X afin de déterminer à moyen terme leur efficacité à ralentir/guérir la maladie.

Bénéfices attendus

Si la production dans les neurones des parties de la protéine X, dont nous savons qu'elles sont capables d'empêcher l'agrégation de Tau, agit sur l'évolution de la maladie chez ces souris, de nouvelles perspectives thérapeutiques seraient envisageables chez l'homme atteint de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Une biopsie de la queue de courte durée sera effectué sur 240 animaux. Pour l'expérimentation, 304 animaux issus d'accouplement de souris homozygotes Tau seront soumis à une injection intraveineuse. Une injection rapide (moins de 20 secondes) est effectuée sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Certaines souris seront génotypées. La contention et la biopsie de queue sont des gestes bien maîtrisés mais qui peuvent générer de légères douleurs et un court moment de stress chez la souris. Le modèle de souris Tau présente un trouble moteur se développant spontanément et progressivement à partir de 4 mois d’âge et développe une paralysie légère et progressive des membres inférieurs pénalisant la mobilité de la souris. Les expériences d’injection intraveineuse dans le sinus rétro-orbitaire peuvent présenter dans de très rares cas une opacité/ulcération de la cornée ou une exophtalmie.

Devenir

Certaines souris seront euthanasiées pour fin d'accouplement et génotype sans intérêt. D'autres seront euthanasiés à 1 mois post-injection et cela avant l'apparition des troubles moteurs (à partir de 4 mois) pour vérifier la présence de la partie de la protéine X dans les neurones. Enfin certaines souris vieilliront jusqu'à 5 mois d'âge pour vérifier l'effet de la partie de la protéine X sur l'agrégation de Tau dans les neurones, âge auquel elles seront toutes euthanasiées pour limiter l'apparition de symptôme moteur plus grave pour les souris.

Remplacement

Nos résultats obtenus sur des neurones en culture tendent à montrer un effet inhibiteur de cette partie de la protéine X sur l’agrégation et l’accumulation de la protéine Tau. Le passage sur un modèle souris est nécessaire pour évaluer les bénéfices potentiels de ces fragments de protéine au plan moléculaire et surtout au plan fonctionnel sur la motricité de l'animal. En effet, nous voulons voir dans ce modèle si ces fragments peuvent 1) être exprimé dans les neurones, 2) protéger ces cellules de la toxicité de Tau et 3) prévenir une perte fonctionnelle lié à la toxicité de ces neurones. N’ayant aucun autre modèle disponible pour cette évaluation indispensable avant des études possible chez l’homme, ce passage sur modèle animal est incontournable.

Réduction

Nous récupérerons les cerveaux et moelles épinières des animaux soumis aux tests de motricité pour l’analyse moléculaire. Afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à notre étude, le cerveau et la moelle épinière de chaque souris seront coupés en deux. Chaque partie sera analysée par deux types d'analyses. Le calcul du nombre d'animaux nécessaire a été effectué par des tests statistiques et basé sur une comparaison de deux moyennes (témoins/traités) au cours du temps dans chaque expérience.

Raffinement

Le modèle de souris utilisé présente un trouble moteur léger à partir de 4 mois d’âge qui progresse jusqu’à 5 mois d’âge. Afin de limiter une possible souffrance de l’animal liée à un trouble moteur, la nourriture sera déposée directement et systématiquement dans la cage à partir de 4 mois d’âge. L’ensemble des expériences d’injection seront réalisées sur des souris anesthésiées. Une observation attentive de la douleur sera effectuée. Après réveil de l’animal, une évaluation hebdomadaire du mal être des animaux basée sur une observation attentive de 5 minutes du comportement de l'animal, sera effectuée par l’expérimentateur et/ou les animaliers sur différents critères (voir tableau scoring). Des analgésiques pourront être administrés par voie sous cutanée pour réduire au minimum une possible souffrance des animaux. Cette observation sera renforcée par un portoir dit "intelligent" dans lequel les souris seront analysées sur leurs motricité 24h/24h, 7j/7j. Cette activité nous permetta d’identifier les cages de souris présentant des niveaux de motricité anormales (agressivité, immobilité …) et d'intervenir précocément pour améliorer en conséquence le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Etant donné nos résultats positifs sur l’efficacité de la région de la protéine X à inhiber l’agrégation de la protéine Tau purifiée, nous avons choisi d’étudier ce modèle murin qui présente certaines anomalies observées dans la pathologie humaine aussi bien sur le plan moléculaire que comportemental. Ce modèle, déjà bien caractérisé, fait l’objet de nombreuses publications scientifiques et nous donne une bonne base de travail pour la mise en place de ce projet. La production de la région d'intérêt de la protéine X sera induite à 1 (stade précoce) et 3 (stade médian) mois d'âge; l’évolution de la tauopathie sera suivie au niveau moléculaire et fonctionnel sur la locomotion des souris et comparée à l’évolution des animaux témoins.

Pour tester des molécules développées par des compagnies pharmaceutiques sous contrats de confidentialité, 440 souris privées du gène de l'orexine vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes subissent à six jours une coupe du bout de la queue pour génotypage. Cent vingt d'entre elles sont ensuite opérées deux heures sous anesthésie générale pour recevoir un implant, puis gavées avec les molécules testées, et quatre-vingts subissent en plus une privation de sommeil de 48 heures. Le porteur écrit que tous les animaux des deux procédures sont tués et leur cerveau prélevé, quand les données déclarées avec le résumé comptent 220 souris rendues à l'élevage.

Objectifs

Les patients atteints de narcolepsie de type 1 (avec cataplexie) ont une qualité de vie très dégradée. A ce titre, il est nécessaire de développer des traitements ciblés et efficaces. A ce jour, tout développement de nouveau traitement nécessite d’être testé sur un modèle animal avant d’envisager des tests chez l’homme. Ce projet est développé dans le cadre de contrats de confidentialités et de collaboration. La narcolepsie-cataplexie est une maladie neurologique rare qui se caractérise par une hypersomnolence pendant la journée et une intrusion de composantes du sommeil paradoxal pendant l’éveil. Nous avons montré que cette pathologie est la conséquence de la dégénérescence des neurones à hypocrétine aussi connus sous le nom d’orexine. Les neurones à hypocrétine sont des neurones de l’éveil ayant une double action. Ils activent tous les systèmes d’éveil et suppriment le sommeil. L’un des symptômes majeurs est la cataplexie. Les épisodes de cataplexie sont des pertes de tonus musculaire pendant l’éveil, qui peut conduire à la chute, à des blessures. Aussi, le développement d’un traitement ciblé et original, permettant de supprimer la somnolence et les cataplexies, facile à prendre et avec peu ou pas d’effets secondaires, est une nécessité afin d’améliorer la qualité de vie des patients, réduire le coût sociétal lié à la pathologie et de réduire les risques de trauma chez les patients d’autant plus qu’ils avancent en âge. Plusieurs compagnies pharmaceutiques travaillent sur le développement de molécules originales qui agiraient sur les récepteurs à hypocrétine/orexine. L’efficacité d’une première molécule a été récemment publiée mais a engendré une certaine toxicité. D’autres molécules ont donc besoind’être testées.

Bénéfices attendus

Le bénéfice est majeur puisque notre projet permettra de sélectionner une molécule efficace qui induira de l’éveil, reduira la fragmentation du sommeil et abolira les cataplexies. Elle pourra alors être envisagée pour le développement d’un traitement de la narcolepsie de type 1.

Procédures

Tous les animaux (n=440) seront soumis, à l’âge de 6 jours, à un prélèvement d’un bout de la queue pour génotypage. Un peu plus de 25 % de ces animaux (n=120) seront ensuite soumis, à l’âge adulte, à une seule intervention chirurgicale sous anesthésie générale avec réveil, d’une durée estimée à 2h. Quatre-vingt d’entre elles subiront également à l’âge adulte une restriction de sommeil pendant 48h. Les molécules thérapeutiques seront données par gavage sur animal vigile à toutes les souris sélectionnées (n=120).

Impact sur les animaux

Tous les animaux (n=440) seront d’abord génotypés. Cette procédure induit des nuisances du fait de la manipulation de l’animal, et qu’un petit bout de queue est coupé. Les souris sélectionnées ayant le bon génotype (n=120) subiront à l’âge adulte une chirurgie implantatoire, sous anesthésie générale. Les nuisances attendues sont la manipulation de l’animal avant la chirurgie, la chirurgie elle-même, la récupération de l’anesthésie générale en post-opératoire ainsi que la douleur post-opératoire due à la plaie. Dès la veille de la chirugie et pendant toute la procédure, les souris sélectionnées seront maintenues en cage individuelle du fait de leur implant. La nuisance attendue est l’isolement. Quatre-vingt des 120 souris sélectionnées subiront également à l’âge adulte une restriction de sommeil. Les nuisances attendues sont le manque de sommeil. Les molécules thérapeutiques seront données par gavage à toutes les souris sélectionnées. Les nuisances attendues sont la manipulation de l’animal pendant le gavage et le gavage lui-même.

Devenir

Tous les animaux des 2 procédures seront mis à mort. Les cerveaux seront ensuite prélevés post mortem pour analyse.

Remplacement

Il s’agit d’une étude pré-clinique nécessaire pour tester chez l’animal vivant l’effet des molécules en amont de tout test clinique. Le sommeil et les cataplexies sont des phénotypes complexes mettant en jeu de nombreuses structures cérébrales et plusieurs organes (cerveau, muscles) nécessitant pour son étude l’animal entier. Les cataplexies sont déclenchées par des émotions positives, leur étude nécessite donc que l’animal soit vigile. Aucun modèle in vitro ne permet à ce jour de remplacer l’animal vigile pour l’étude de ces comportements.

Réduction

Nos données expérimentales précédentes montrent que 10 souris sont nécessaires pour l’obtention d’une puissance statistique suffisante. Les enregistrements de sommeil des souris seront organisés et archivés sur notre serveur central. Nous générerons ainsi une base de données qui permettra à terme de réduire le nombre d’animaux puisqu’elle sera utilisée comme référence et contrôle pour les projets suivants sur ce même type d’animaux et de problématique similaire. Les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests d’analyses statistiques afin de valider de façon robuste et objective les variations observées.

Raffinement

Pour minimiser le stress individuel et maintenir les interactions sociales, les souris sont hébergées par groupes dans leur pièce de vie. Cependant, si un individu est agressif il est alors séparé du groupe. Le cas échéant, les animaux séparés sont placés dans une cage double munie d’un séparateur grillagé. De cette façon, les animaux ne sont pas totalement isolés et peuvent interagir avec leurs congénères sans toutefois pouvoir s’agresser mutuellement. Des enrichissements systématiques sont mis en place pour le bien-être de l’animal. Un jour avant la chirurgie sous anesthésie générale et pour toute la durée de la procédure, les animaux sont séparés, 1 par compartiment dans une cage double et suivis régulièrement avec une attention quotidienne lors de la phase postopératoire (suivi du poids, de la mobilité et du comportement) grâce a l’utilisation d’une grille de score post-opératoire. Notre préoccupation est d’évaluer quotidiennement, grâce aux fiches de scorage, l’évolution des paramètres physiologiques afin de détecter toute dégradation de l’état de santé général. Celles-ci constituent le point limite des expérimentations avec mise à mort des animaux pour prévenir toute souffrance.

Choix des espèces

La souris orexin-knock-out est un modèle animal reconnu de la pathologie étudiée. Elle exprime l’ensemble des symptômes observés chez l’homme. Dans tous les cas, il s’agira de souris adultes (10-12 semaines au début de la procédure) ayant atteint leur maturité cérébrale, possédant déjà un système locomoteur mature, un cycle circadien et ultradien veille-sommeil stabilisé et consolidé, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et d’une manière générale dans la littérature chez la souris dans ce domaine des neurosciences.

Un score de 2 sur un seul critère clinique, ou de 4 sur la somme des critères, déclenche la mise à mort. 2 205 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 885 d'entre elles et modéré pour 1 320. Elles reçoivent de la vincristine, un anticancéreux qui abîme les nerfs périphériques, puis subissent dix séries de tests de sensibilité tactile aux filaments de von Frey, de sensibilité thermique sur plaque chauffante et de coordination au rotarod, auxquelles s'ajoutent dix mesures électrophysiologiques sous isoflurane avec des stimulations de 4 à 10 millivolts. Le projet porte sur les douleurs neuropathiques, et le porteur écrit qu'aucun analgésique ne sera administré parce qu'il fausserait les résultats, tout en affirmant que les souris traitées à la vincristine "ne présenteront pas de phénotype de douleur".

Objectifs

Ce projet vise à étudier des mécanismes responsables de l’apparition des douleurs neuropathiques, en particulier dans le cadre de neuropathies toxiques comme dans les traitements chimiothérapeutiques à la Vincristine. Ce projet est justifié par la mauvaise compréhension actuelle des mécanismes à l’origine de ces douleurs qui altèrent considérablement la qualité de vie des patients. Ce projet permettra d’étudier les réponses immunitaires mises en jeu, d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de faire le parallèle avec une étude clinique menée en parallèle chez les patients. Pour vérifier le rôle de certains acteurs, certaines molécules et inhibiteurs seront administrés à des souris traitées à la vincristine.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire possède une expertise reconnue dans les modèles de développement de neuroinflammation chez la souris. Cette étude comparative, s’intéresse aux développements de neuropathies inflammatoires et toxiques, dont les mécanismes impliqués sont encore très mal compris. Nos résultats pourront améliorer nos connaissances pré-cliniques du développement de ces douleurs neuropathiques et permettront de transposer ces connaissances vers la clinique. Nous souhaiterions identifier de nouveaux biomarqueurs et permettre la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les humains.

Procédures

Les douleurs neuropathiques des animaux traités à la vincristine seront évaluées par des tests de la sensibilité tactile avec les filaments de Von Frey, de la sensibilité thermique avec la plaque chauffante et de la coordination motrice avec le rotarod. Chaque test sera réalisé 10 fois tout au long des 2 mois maximum de suivi de l'animal. Des mesures d'électro-neuromyogramme seront également réalisées par l’utilisation d’un dispositif de stimulation et de recueil dédié aux mesures électrophysiologiques. Pour cela l’animal sera maintenu endormi sous isoflurane et sur un tapis chauffant tout au long de la mesure. Les stimulations seront réalisées à des voltages progressifs de 4mV à 10mV. Les mesures seront brèves, 10 minutes par animal en intégrant l'installation des électrodes et les stimulations. Comme pour les tests comportementaux, les mesures électrophysiologiques seront réalisées 10 fois tout au long des 2 mois maximum de suivi des animaux.

Impact sur les animaux

Le modèle de développement de neuropathies toxique (Vincristine) va conduire à des inflammations périphériques et centrales, associées à une atteinte des nerfs périphériques. Cette atteinte transitoire du SNP est responsable d'une modificatuin des sensibilités tactile et thermique, sans atteinte des capacités motrices. Ces symptômes des neuropathies, similaires à ceux observés chez l’Homme, se maintiendront environ 2 à 3 semaines après le début des injections. Aucune données de la littérature n'a démontré le niveau de stress des animaux durant cette période inflammatoire. Néanmoins, nous limiterons la manipulations des animaux au minimum durant cette période. Par la suite, les symptômes vont se résorber spontanément en une à deux semaines jusqu'à ce que les animaux retrouvent une sensibilité tactile et thermique normales.

Devenir

Mise à mort des souris pour l'ensemble des 5 procédures. Pour chaque procédure, les souris utilisées en série 1 permettront la réalisation d'une étude comportemntale longitudinale, avec une mise à mort à la fin. Pour les séries 2 à 4, les souris seront utilisées pour la réalisation de prélèvements tissulaires à différents temps pertinents de l'expérience vis à vis des mécanismes cellulaires qui nous intéressent.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental afin d’étudier l’inflammation et la pathologie nerveuse (destruction des gaines de myéline, neuro-inflammation et infiltration cellulaire) au niveau de l’organisme entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. Dans le cadre de ce projet s’intéressant au développement des douleurs neuropathiques et mécanismes associés, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires périphériques et centrales et ses conséquences sur le système nerveux périphérique. Néanmoins, nous avons identifié récemment les neutrophiles comme cellules majeures du développements des douleurs neuropathiques, ces cellules sont actuellement isolées à partir de moelle osseuse de souris et/ou de sang total humain pour être cultivées et étudiées in vitro. Bien que les expériences in vitro soient utilisées dès que possible, aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et la communication cellulaire entre les différents acteurs de la réponse immunitaire. Actuellement, l’expérimentation animale est la seule alternative pour comprendre les interactions des systèmes nerveux/immunitaires et d’examiner la pathologie au niveau moléculaire, cellulaire et comportementale, aspects qui ne peuvent pas être développés in vitro ou in silico.

Réduction

Notre objectif est de conserver une analyse statistique robuste tout en réduisant le nombre d’animaux par lot. - L’étude comportementale est l’approche qui nécessite le plus d’animaux afin de valider la significativité de nos résultats : le groupe de souris traitées comportera n=15 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux pour le groupe contrôle (souris naïves) à n=10. -L’étude par dosages immunologiques sera réalisée à différents temps stratégiques tout au long des 2 mois : des dates de prélèvements sont prévus afin d’obtenir un profil immunologique recouvrant toute la période d’expérimentation. Nous réduisons le nombre d’animaux par prélèvement à n=10 souris/groupe C57Bl6 et n=5/groupe KO. -L’étude histologique, comme pour les dosages, sera réalisée à différents temps de l’expérience : 8 points de prélèvements sont prévus afin de comprendre la dynamique histologique dans notre modèle. De même, nous réduisons le nombre de prélèvements à n=5 souris/chaque groupe. -L’étude d’isolement et caractérisation cellulaire par cytométrie en flux sera également réalisée à différents temps de l’expérience : 9 points de prélèvements sont prévus afin d’identifier des mécanismes cellules spécifiques. De même, nous réduisons le nombre de prélèvements à n=10 souris/groupe C57Bl6 et n=5/groupe KO. Pour comparer de manière pertinente les groupes expérimentaux souris contrôles vs souris traitées, une analyse statistique nous a permis de déterminer le nombre suffisant d'animaux à utiliser.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage à cap standard au nombre maximum de 6 souris par cage avec une période d'adaptation de 7 jours minimum, idéalement 14 jours. Nous disposerons dans les cages dès le début de l'expérience, deux types d'enrrichissement, l'un pour la réalisation du nid et le second pour satisfaire le besoin des souris de ronger. En accord avec la SBEA, nous ferons varier chque type d'enrichissement pour limiter l'habituation et l'ennui des animaux. Selon nos expériences antérieures, soutenues par les données de la littérature, les animaux injectés avec la Vincristine ne présenteront pas de phénotype de douleur comme la prostration, les poils hérissés et la paralysie. Nous ne prévoyons pas d’administrer des analgésiques car ils pourraient influencer et donc invalider les résultats expérimentaux. Par exemple, le paracétamol, l'aspirine ont un effet inflammatoire sur le foie notamment. La morphine n'est pas indiquée car elle induit une dépression de la fonction pulmonaire. La dexamethasone ou les médicaments non-stéroidiens de type inhibiteur de Cox2 ou de prostaglandine tels que l’ibuprofen ou le diclophenac interfèrent avec l'inflammation. Une grille de score clinique sera renseignée pour l'injection de la vincristine et une seconde grille pour les injections des modulateurs, afin d’évaluer les éventuels signes de souffrance (prostration, poils hérissés, perte de poids...). Selon nos expériences antérieures, soutenues par les données de la littérature, les animaux injectés avec la Vincristine ne présenteront pas de phénotype de douleur visible, avec une prise alimentaire normale et donc sans perte de poids. Les animaux seront mis à mort dès que le point limite sera atteint, soit un score de 2 pour l’un des critères, soit un score de 4 sur la somme des critères.

Choix des espèces

La souris de fond génétique C57BL/6 est un modèle reconnu dans le cadre des études des pathologies neurologiques. L’existence de nombreuses lignées transgéniques, dont les lignées cGAS ou STING -/- que nous utiliserons, et la disponibilité d’outils moléculaires spécifiques (eg. Anticorps spécifiques, sondes moléculaires…) ont apporté ces dernières années une meilleure compréhension des neuropathologies et ont conduit aux développements de nouvelles pistes thérapeutiques. Les animaux utilisés seront âgés de 8 à 24 semaines afin d’avoir un système immunitaire et un système nerveux matures et des comportements adultes.

Jusqu'à deux chirurgies cérébrales de une à six heures par animal, six injections espacées de 48 heures, une heure de tête maintenue fixe pour présenter des odeurs juste devant le nez : 3 630 souris adultes subissent ces procédures, dans un projet qui mobilise 9 860 souris au total, 6 230 à un niveau de souffrance léger et 3 630 à un niveau modéré. Le protocole consiste à séparer brièvement des souriceaux de leur mère, parfois sous sédation, et à observer ce que la mère fait d'eux ou de leur odeur, pour situer le rôle de l'ocytocine dans le cortex olfactif. Les 3 630 femelles adultes sont tuées pour prélever leur cerveau, et 1 700 souriceaux le sont aussi faute de pouvoir survivre sans leur mère. Les 4 530 souriceaux restants sont gardés vivants et "proposés à la communauté des utilisateurs" de l'établissement pour un usage futur.

Objectifs

L’ocytocine est une molécule libérée par les neurones du cerveau, connue pour son rôle dans la lactation et lors de l’accouchement. Cependant, des études récentes montrent que l’ocytocine a aussi une action sur le cerveau lui-même, et que cette action favoriserait les comportements sociaux et maternels. Ainsi, l’ocytocine est considérée comme une hormone ayant un effet « pro-social » mais ses mécanismes d’action sont encore méconnus. L’objectif de cette étude est de comprendre comment l’ocytocine agit sur les neurones du cerveau lors des comportements maternels. Chez la plupart des mammifères, l’olfaction joue un rôle central pour les interactions entre individus et en particulier entre adultes et leurs progénitures. Chez la souris, le cortex olfactif présente une densité exceptionnelle de récepteurs à l’ocytocine par rapport à d’autres régions cérébrales, notamment chez les femelles, avec une densité accrue chez les mères par rapport à des femelles vierges. Aux vues de cette forte expression chez les mères, nous faisons l’hypothèse que l’ocytocine dans le cortex olfactif est impliquée dans les comportements maternels chez les souris femelles. Pour tester cette hypothèse, nous réaliserons des expériences de comportement en présence de souriceaux âgés de 1 à 10 jours ou de leurs odeurs, et nous manipulerons la transmission ocytocinergique dans le cortex olfactif pour tester le rôle de l’ocytocine dans ces comportements. Nous enregistrerons également l’activité des neurones du cortex olfactif en parallèle de la respiration lors de ces expériences. Nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. Le grand nombre de neurones enregistrés via cette méthode nous permettra de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des tests statistiques et des études pilotes pour déterminer le nombre d’animaux nécessaires à nos expériences. Pour tester le rôle de l’ocytocine, nous ciblerons les neurones qui libèrent de l’ocytocine ou bien ceux qui répondent à l’ocytocine. Pour cela, des injections d’agents pharmacologiques seront nécessaires et nous devrons faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau grâce à des adénovirus injectés au préalable. Nous quantifierons l’expression des comportements maternels et l’activité des neurones tout en veillant au bien-être des souris et souriceaux.

Bénéfices attendus

Chez les Mammifères, la mise en place des comportements maternels est essentielle pour la survie des petits et de l’espèce en général. Chez l’Homme, il est notamment connu que le lien entre mère et enfant est facilité par la neurohormone nommée oxytocine, libérée dans la circulation sanguine de la mère lors de l’accouchement. Nous savons également que les odeurs jouent un rôle important et bénéfique dans le lien entre mère et enfant, un lien qui peut être affecté dans certaines situations, notamment lors de certains accouchements par césarienne (les taux d’oxytocine libérés sont alors plus limités). Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cerveau s’adapte lorsqu’il s’agit de mettre en place des comportements maternels et le rôle des odeurs dans ce processus. A terme, il pourrait permettre de mettre en place des stratégies pour faciliter l’établissement de ces comportements chez l’Homme dans des situations problématiques liées à la maternité. Cette perspective est d’autant plus réaliste que l’administration d’ocytocine par voie intranasale est déjà réalisée chez des enfants autistes pour améliorer leurs relations sociales.

Procédures

Les souris seront utilisées lors de tâches comportementales en présence de souriceaux ou de leurs odeurs. Ces tâches de courte durée (1h environ) auront lieu quotidiennement pendant les phases d’expérimentation (durée maximum de 2 mois). Notre étude nécessitera de réaliser des injections (moins de 3min par injection/jour, environ 6 injections par souris espacées d’un minimum de 48h) chez les souris adultes. Avant les tâches, les souris seront progressivement habituées aux injections et à la contention associée. Dans une série d’expérience, afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir leur tête en position fixe au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. La durée de contention par maintien de la tête n'excédera pas 1h et sera réalisée après une habituation progressive. Afin de comprendre le fonctionnement du cerveau lors des tâches réalisées, certaines souris seront équipées d’implants cérébraux qui permettent d’enregistrer l’activité de dizaines de neurones en cours de comportement. L’implantation de ces équipements et la réalisation de ces expériences nécessitent la réalisation de chirurgies en amont des tâches (maximum 2 chirurgies par animal, durée 1-6h). A la fin de l'expérimentation, les souris seront soumises à une perfusion afin de préserver les tissus cérébraux et d'effectuer des contrôles histologiques (durée de la procédure inférieure à 20min, réalisée sous traitement anesthésique et analgésique).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet seront mises en présence de souriceaux (ou d’odeurs de souriceaux) et nous observerons leur comportement pour quantifier leur capacité à en prendre soin. Les souriceaux pourront être brièvement séparés de leur mère le temps de réaliser ces tests, ce qui correspond à un stress modéré car réduit dans la durée. Pour limiter ce stress, il sera parfois possible de sédater ou anesthésier les souriceaux, ce qui nécessite d’injecter des substances médicamenteuses via des injections sous-cutanées réalisées à l’aide d’aiguilles très fines. Afin de pouvoir tester le rôle de l’ocytocine dans ces comportements, nous utiliserons des méthodes qui permettent de cibler les neurones capables de libérer de l’ocytocine ou bien les neurones qui répondent à l’ocytocine lorsqu’elle a été libérée. Pour cela, nous devrons faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau des souris adultes grâce à l’expression d’adénovirus injectés au préalable et des injections d’agents pharmacologiques seront nécessaires. Ces injections représentent potentiellement une légère nuisance pour les animaux car elles nécessitent de les maintenir immobiles pendant la durée de l’injection (contention). Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. Un hébergement en cage individuelle enrichie sera parfois nécessaire pour éviter que ces électrodes ne soient pas détruites par les congénères. Les souris pourront être connectées via un câble fin au système d’enregistrement ce qui peut générer une légère gêne. De plus, les odeurs étant très volatiles, il nous faudra maintenir la tête des souris proches de la source d’odeurs dans certaines expériences, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée.

Devenir

L’euthanasie des 3630 souris adultes en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Cette procédure sera réalisée par des expérimentateurs compétents et soucieux du bien-être animal, sous anesthésie profonde avec le degré d’analgésie recommandé par les services vétérinaires. La mise à mort sera ainsi indolore pour les animaux, avec une perte de conscience rapide. Les souriceaux seront aussi mis à mort à la fin des procédures si les mères ne peuvent pas être gardées en vie jusqu'au sevrage car ils ne peuvent être gardés en absence de leur mère (1700 souriceaux concernés). Il est possible de retarder l’euthanasie de la mère pour attendre le sevrage et ensuite les replacer au sein de la communauté des utilisateurs. Si la mère n’est pas utilisée pour des contrôles histologiques, les souriceaux seront gardés en sa présence et proposés à la communauté des utilisateurs pour une utilisation future potentielle, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés dans l’établissement (4530 souriceaux concernés).

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements maternels : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 9860 (3630 souris adultes et 6230 souriceaux) sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris dans des tests comportementaux différents, avec ou sans intervention sur le système ocytocinergique. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences et raffiner notre approche statistique.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début des tests comportementaux, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment aux contentions et injections). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésie et analgésique permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent. Les femelles accouplées seront séparées des mâles et mises en compagnie des « accompagnantes » dès l’arrêt de l’accouplement. Si une accompagnante est agressive, elle sera immédiatement remplacée. Lors des tâches comportementales : si des comportements agressifs envers les petits sont détectés, l’expérience sera immédiatement interrompue. Les souriceaux seront maintenus sur tapis chauffant pour les courtes périodes inter-essais, dans les rares cas où ils ne pourraient pas être retournés à leur mère. Ils seront frottés avec le matériau de leur nid d’origine avant d’être rendus à leur mère afin de favoriser leur ré-intégration (suivi de leur bien-être et points limites définis au préalable).

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans une fonction cognitive complexe, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’effet positif de l’ocytocine sur les comportements sociaux a notamment été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme. Les odeurs jouent un rôle important dans le lien mère-progéniture, aussi bien chez l'Homme que chez la Souris. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Des souriceaux seront utilisés comme stimuli au cours des expérimentations car elles visent à comprendre les bases neurobiologiques des comportements maternels.