Système nerveux

Jusqu'à 25 injections intracérébrales sur animal éveillé, une à deux neurochirurgies de 45 minutes, une à deux semaines en cage individuelle : 6 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le cerveau et d'autres tissus. Le régime hyperlipidique imposé peut doubler leur poids initial, et des jeûnes de 4 à 24 heures alternent avec des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Le porteur veut comprendre le rôle des cellules immunitaires de l'hypothalamus dans la prise de poids, et présente la souris comme un bon modèle prédictif du contrôle de la prise alimentaire humaine. Les retombées thérapeutiques annoncées restent suspendues à l'hypothèse de départ, qu'il formule au conditionnel, "dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse".

Objectifs

L’obésité est un fléau dans nos sociétés modernes. Cette maladie chronique touche presque un quart de la population mondiale et s’accompagne de nombreuses comorbidités (diabète, maladies cardio-vasculaires, anxiété, cancers…). Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité, il est notamment nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Le cerveau orchestre cette régulation en engageant une « communication » avec les différents organes du corps. Pour cela, il reçoit des signaux les renseignant sur l’état énergétique de l’organisme. Ces signaux sont captés par des neurones spécialisés, situés dans l’hypothalamus. Outre les neurones, certaines populations de cellules immunitaires du cerveau sont aussi impliquées dans la régulation du poids corporel. L’hypothalamus réagit à la consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses (High fat diet, HFD), en déclenchant une neuroinflammation locale, qui correspond à une activation des cellules immunitaires hypothalamiques. On peut imaginer que c’est un peu comme quand les cellules immunitaires réagissent à un microbe. Cette inflammation est néfaste à long-terme car elle dérègle le fonctionnement des neurones hypothalamiques, et donc le contrôle du poids corporel. Dans ce projet, nous souhaitons mieux comprendre comment fonctionnent les différentes cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l’inflammation en réponse à un régime HFD qui déclenche l’obésité. Ces connaissances permettront de mettre en place des stratégies pour mieux limiter l’inflammation, prévenir la prise de poids et les comorbidités associées à l’obésité. Notre ambition à terme est de permettre l’ouverture de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints d’obésité. Pour cette étude, nous allons utiliser des approches pharmacologiques et génétiques (utilisation d’animaux mutés génétiquement). Nous utiliserons un modèle animal d’obésité, c’est-à-dire des animaux nourris avec une alimentation hypercalorique obésogène (HFD). Nous réaliserons un suivi métabolique des animaux (prise alimentaire, tests métaboliques et comportementaux), ainsi que de nombreuses études moléculaires à partir des cellules cérébrales isolées. Ce projet comprend huit procédures.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires hypothalamiques dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans l’hypothalamus. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation des cellules immunitaires hypothalamiques afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

1) Analyse de la composition corporelle sur tous les animaux vigiles : 5 min, entre 2 et 5 fois. Nombre d’animaux : 6496. 2) Neurochirurgie sous anesthésie et antalgie, 45 min, entre 1 et 2 fois. Nombre d’animaux : 1712 (1 chirurgie) et 384 (2 chirurgies). 3) Test de tolérance au glucose (GTT) et d’insuline (ITT) sur animaux vigiles : Entre 4 et 6 mesures de glycémie sur une goutte de sang. Chaque mesure dure 10sec, espacées de 10 min), répétée 2 fois (GTT) et 1 fois (ITT). Nombre d’animaux : 3648 (GTT) et 1248 (ITT). 4) Enregistrements de la consommation de nourriture, d’eau, d’oxygène et l’activité physique. Durée : entre 1 et 2 semaines en hébergement individuel. Nombre d’animaux : 992 pour une semaine, 1392 pour deux semaines. 5) Injections intracérébrales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 3-4 min (contention d’une minute maximum). Répétition : entre 14 (toutes les 24h) et 25 fois (tous les 4 jours). Nombre d’animaux : 384 pour le groupe « 14 fois », 864 pour le groupe « 25 fois ». 6) Injections intrapéritonéales de composés pharmacologiques, sur animaux vigiles : Durée : 30 sec max, entre 1 et 9 injections. Nombre d’animaux concernés : 1120. 7) Tests comportementaux de la mesure de l’anxiété. Durée : entre 10 et 40 min, répété 1 fois pour chaque test, espacé de 2 jours. Nombre d’animaux : 2400.

Impact sur les animaux

1. Stress induit par l’hébergement individuel : ceci ne sera réalisé uniquement lorsque la prise alimentaire individuelle est nécessaire. 2. Stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. 3. Prise de poids consécutive au régime gras HFD. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser le double du poids initial. 4. Perte de poids consécutive au jeûne (4h ou 24h). 5. Perte de poids/appétit post-opératoire. Suite aux incisions chirurgicales, une douleur post-opératoire est attendue. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures). 6. Stress induit par les tests comportementaux. La durée réduite de chacun des tests (moins d’une heure, sans manipulation) n’induit pas de nuisances sévères (pas de perte de poids attendue).

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des tissus seront récupérés (cerveaux ou autres), pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle des cellules immunitaires présentes dans une région du cerveau sur la régulation du poids, de la masse grasse et du taux de sucre dans le sang (glycémie). Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. Enfin, les modèles d’animaux génétiquement modifiés (pour tester nos hypothèses) sont largement développés chez la souris.

Réduction

Ce projet a fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures primaires de cellules) afin de tester différentes hypothèses en amont. Nous avons utilisé des tests mathématiques (test de puissance) pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons optimisé la stratégie de croisements des animaux reproducteurs afin d’utiliser tous les animaux d’une même portée (animaux contrôles et génétiquement modifiés sont frères et sœurs) et donc ne pas multiplier le nombre de portée avec des animaux qui ne présenteraient pas les caractéristiques (génotype) attendues. De plus, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Pour l’analyse des résultats, nous comparerons les différents groupes expérimentaux avec l’aide de différentes tests statistiques adaptés au type de mesures comparées.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Période d’habituation avant utilisation en expérimentation de 1 semaine minimum. La surveillance des animaux sera quotidienne et renforcée durant les périodes expérimentales et au constat possible de dégradation du bien-être des animaux. 2) L’évaluation de la prise alimentaire individuelle nécessite parfois l’hébergement individuel des animaux. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres (maintien d’interactions olfactives, visuelles et sonores). L’environnement sonore permettra de limiter le stress des bruits extérieurs (radio). 3) Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique ainsi que l’évaluation du maintien du bien-être animal. 4) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec l’utilisation d’un tableau (arbre décisionnel pour chaque composante étudiée : anatomique, physiologique et comportementale). Si le bien-être animal venait à se dégrader, des mesures conservatoires et des critères d’arrêt de l’expérimentation seront rapidement mis en place, en accord avec notre vétérinaire.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel, du comportement alimentaire et de la glycémie sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux modifiés génétiquement, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, les effets cérébraux d’un régime hypercalorique est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 7 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neurochirurgie ainsi que de s’affranchir des effets de la croissance pubertaire.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour la collecte de sang et de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie stéréotaxique de vingt à vingt-cinq minutes pour l'implantation d'une canule dans le bulbe olfactif, puis vit isolée pour que le dispositif ne soit pas abîmé. Suivent un test de tolérance au glucose de deux heures avec prélèvements sanguins répétés à la queue, cinq heures de privation de nourriture, et un test consistant à chronométrer le temps mis pour retrouver un morceau de cookie au chocolat enfoui dans la litière. L'espoir affiché, un traitement contre l'obésité, repose sur l'hypothèse qu'une protéine stimulerait l'appétit en améliorant l'odorat. Le porteur affirme avoir calculé l'effectif au plus juste, sans donner ni méthode ni chiffre.

Objectifs

La protéine ACBP se lie aux acides gras et interagit avec d’autres molécules. Chez les humains, elle est présente à des niveaux plus élevés chez les personnes obèses et plus faibles chez celles souffrant d’anorexie. Chez les rongeurs, elle stimule l’appétit : lorsqu’on leur administre de l’ACBP, ils mangent davantage et prennent du poids, ce qui peut mener à l’obésité. La majorité des recherches ont étudié son action sur l’hypothalamus, mais son rôle dans le bulbe olfactif (zone du cerveau liée à l’odorat) reste peu exploré, bien qu’il soit connu qu’ACBP y est bien exprimée avec son récepteur GABAarD, rendant son étude dans cette zone pertinente. Puisque l’odorat influe sur l’alimentation, l’ACBP pourrait, en améliorant l’odorat, stimuler l’appétit. Bloquer cette protéine pourrait donc réduire la consommation de nourriture et offrir une piste de traitement contre l’obésité. Pour tester cela, nous allons injecter ACBP dans le bulbe olfactif de souris ou utiliser des anticorps pour bloquer son action, en comparant avec un groupe témoin. Pour se faire, 2 groupes distincts seront mis en place : un premier pour évaluer les effets immédiats sur l’odorat et la régulation du glucose et un second groupe recevra des injections similaires pour observer leur prise alimentaire, avec ou sans aliments appétents. Ce projet cherche à mieux comprendre l’influence d’ACBP sur l’odorat et l’appétit, avec l’espoir de développer des traitements contre l’obésité.

Bénéfices attendus

Chez les rongeurs, la protéine ACBP influence l’alimentation : quand on leur administre cette protéine, ils mangent plus, prennent de la graisse et deviennent obèses sur le long terme. La plupart des études ont examiné l’effet de l’ACBP sur une région du cerveau appelée l’hypothalamus, mais on sait peu de choses sur son rôle dans le bulbe olfactif, la partie du cerveau responsable de l’odorat. Pourtant, l’odorat joue un rôle clé dans l’alimentation. Si l’ACBP améliore l’odorat, cela pourrait expliquer pourquoi les souris mangent davantage. À l’inverse, bloquer cette protéine pourrait réduire l’appétit. Cela pourrait offrir une nouvelle piste pour traiter des maladies comme l’obésité et ses complications.

Procédures

Dans cette étude, les souris subiront une opération d'environ 20 à 25 minutes pour installer un tube dans leur bulbe olfactif, permettant d’y injecter les protéines nécessaires. Ensuite, pour évaluer comment leur corps utilise le glucose, un test de tolérance au glucose sera effectué : leur taux de glucose dans le sang sera mesuré à plusieurs moments (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes) en déposant une goutte de sang sur un appareil similaire à ceux pour humains. De petites quantités de sang (environ 20 microlitres) seront également prélevées aux temps 0, 15 et 90 minutes pour mesurer l’insuline, l’hormone qui régule le glucose, ce qui suffira pour suivre son évolution tout en limitant le volume de sang prélevé. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline durent chacun deux heures. De plus, pour évaluer l'impact de la molécule dans le bulbe olfactif sur la recherche et/ou l'envie pour de la nourriture palatable, des tests comportementaux seront réalisés une fois sur chaque animal, en espacant chacun des tests (métabolique et comportemental) de deux semaines. Le "buried-food test", traduit comme le test de la nourriture enfouie, consiste à mesurer le temps que met la souris à retrouver un bout de nourriture, le plus souvent un morceau de cookie au chocolat odorant, caché dans la litière. Il dure quelques dizaines de minutes et permet d'estimer la performance olfactive de l'aimal, accompagnée de la motivation à chercher de la nourriture. La prise alimetaire d'aliment standard ou d'aliment palatable est également évaluée pendant 3h après une courte période privation de nourriture (5h), ce qui permet de voir si l'animal présente une modulation de son appétit selon la catégorie d'aliment.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirugie stérotaxique, avec inhalation d'anésthesiant et injection d'analgésiant, cependant une douleur modérée est susceptible d'être ressentie au réveil. Concernant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, des nuisances légères peuvent survenir avec les prélèvements de sang à la queue de l'animal (légère douleur) , et avec un faible risque d'hypoglycémie suite à l'administration d'insuline. Les tests comportementaux (capacité olfactive pour retrouver un aliment enfouï, et prise alimentaire) ne présentent pas d'effets indésirables hormis la privation de nourriture préalable au test. Après la chirurgie, les animaux sont isolés afin d'éviter que les cannules de perfusion ne soient endommagées, ce qui représente un stress dû à l'isolement susceptible d'être ressenti par les animaux.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l'étude, afin de collecter du sang et des tissus pour analyses ultérieures. Au cours des procédures, si l'animal ne se remet pas correctement de la chirurgie ou qu'un problème survient malgré le suivi post opératoire, perte de poids ou autres problèmes de santé ou de bien-être (problème de locomotion, prostration et qualité du poil, etc.)), l'animal sera mis à mort.

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôlent les flux d'énergie en fonction des besoins. Il est impossible de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux est encore nécessaire.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé pour que les tests statistiques puissent être fiables et robustes, évitant ainsi de réitérer les expériences, tout en utilisant le nombre d'animaux le plus faible possible.

Raffinement

Nous avons prévu les prélèvements de sang en calculant au plus près les volumes nécessaires aux mesures de l'insuline donc les volumes sont minimes, afin de peu impacter le bien-être animal. Concernant la chirurgie stéréotaxique permettant d’installer les canules d'injection dans le bulbe olfactif, intervenant dans les 2 procédures (et donc toute l’étude), nous avons mis en place une anesthésie et analgésie adaptée avant, pendant et après la chirurgie. Les animaux seront maintenus isolés après chirurgie dans des cages standards avec des milieux enrichis (nids végétaux, tubes) ce qui permettra d'améliorer leur bien-être. Ils seront également observés quotidiennement afin d'identifier les animaux en souffrance et éventuellement d'euthanasier les animaux dont les points-limites auraient été atteints. Une légère perte de poids peut-être observée après les premiers jours suivants l’opération, et un complément alimentaire de type gel enrichi en calorie pourra être proposé aux animaux pour leur permettre une meilleure récupération. Cependant, après une semaine, les animaux qui sont en perte constante de poids (supérieure à 15% de leur poids initial) seront mis à mort. A tout moment, si un point limite est atteint l'animal sera mis à mort pour éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Nos modèles murins, les souris C57BL6 adultes sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre et représentent une souche murine adéquate comme modèle d'étude des maladies humaines. De plus, nous avons l'expertise du suivi du bien-être de l'animal après injection, du phénotypage métabolique des souris.

Seize heures sans nourriture avant le test de l'aliment caché, une nuit de test de préférence au sucre, deux tests d'anxiété, un conditionnement de peur sur deux jours : 504 souris enchaînent neuf épreuves comportementales après sept jours d'instillations nasales d'antibiotiques sous anesthésie. Elles reçoivent ensuite par le nez des bactéries ou du microbiote de patients parkinsoniens, ce qui peut déclencher deux mois plus tard une maladie de Parkinson expérimentale, avec malnutrition, troubles de la motricité et faiblesse musculaire. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées pour l'analyse de leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux. Le porteur présente le recours à la souris comme un moyen d'éviter d'utiliser des primates non humains.

Objectifs

La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus fréquente en France, après la maladie d'Alzheimer. C’est une maladie complexe, d’étiologie encore inconnue, caractérisée par une destruction d’une population spécifique de neurones, entraînant un déficit au niveau de l’initiation et du contrôle des mouvements. Sur le plan moléculaire, des lésions sont retrouvées et correspondent à des amas pathogènes formés par une protéine : l’α-synucléine. Les troubles olfactifs sont fréquents dans la MP et sont souvent présents plusieurs années ou décades avant l'apparition des symptômes moteurs. Les troubles précoces de l’odorat dans la MP pourraient être la conséquence d’un déséquilibre du microbiote nasal. Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse qu’il existe un lien entre le microbiote nasal et les déficits olfactifs de la MP. Ce modèle expliquerait tout d’abord les lésions inflammatoires de la muqueuse olfactive constatées chez les patients MP, ainsi que l'accumulation de la protéine neurotoxique dans les structures olfactives. Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nos trois principaux objectifs sont de clarifier (1) le rôle exact de profils spécifiques de microbiotes nasaux avec les performances olfactives, (2) l’impact de l’environnement sur le microbiote nasal et (3) tester le lien entre microbiote nasal et MP. L’opportunité d’étudier deux populations ayant une exposition environnementale très différente, en France métropolitaine et aux Antilles, devrait permettre d’identifier des anomalies du microbiote spécifiques à la maladie de Parkinson. Les souris constituent un modèle pertinent pour ce projet car (1) elles peuvent facilement être colonisées par des microbiotes d’origine humaine et (2) elles peuvent développer des maladies proches de la MP très rapidement après gavage avec des échantillons provenant de selle de patients MP.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’élucider le rôle du microbiote nasal et de ses métabolites dans la perte de l’odorat observée au décours de la maladie de Parkinson (MP). Nous couplerons notre analyse moléculaire du microbiome avec l’analyse métabolique de la muqueuse nasale et du sérum de patients MP et de souris transplantées avec du microbiote humain de patients MP. Ce projet nous permettra d’identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le déséquilibre du microbiote nasal et de proposer des biomarqueurs et des nouvelles cibles thérapeutiques. Les résultats de ce projet pourraient améliorer la prise en charge médicale des patients.

Procédures

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) - une seule instillation intranasale de bactéries (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) - une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). - Un test d’anxiété (20 minutes) - Un test de reconnaissance de nouveaux objets (20 minutes) - Un test de préférence au sucrose (une nuit) : mesurant leur préférence à boire une solution sucrée plutôt que de l’eau plate (test effectué sur une nuit, biberons additionnés de sucre et biberon normal). - Un second test d’anxiété (10 minutes): - Un test mesurant la perception aux odeurs des souris (15 minutes) - Un test des capacités morices (5 minutes) - Un test d’évitement des prédateurs (10 minutes). - Un test de test de conditionnement de peur (10 minutes pendant 2 jours)

Impact sur les animaux

Chaque animal sera soumis à : - une instillation intranasale d’antibiotiques (30 secondes) tous les jours pendant 7 jours sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. L’instillation intranasale d’antibiotiques provoque un inconfort de courte durée. - une seule instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain (30 secondes) trois jours après la dernière instillation d’antibiotiques, sous anesthésie légère (5 minutes) L’anesthesie gazeuse provoque un inconfort de courte durée. La piqure d'aiguille pour l’injection d’anesthésique entraîne une douleur légère de courte durée. - L’instillation intranasale de microbiote humain ou de bactéries comme des Staphylocoques provoque un inconfort de courte durée et peut induire deux mois après l’instillation une maladie de Parkinson expérimentale chez la souris qui présentera alors des signes de malnutrition, des problèmes de motricité et une faiblesse musculaire. - Une restriction alimentaire de 16 heures avant de passer le test de la nourriture cachée (durée : 15 minutes). La restriction alimentaire induit habituellement un stress physique modéré et de la détresse modérée pendant une durée de 16 heures avant la réalimentation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car il est nécessaire que tous leurs tissus nasaux, nerveux, sanguins et intestinaux soient analysés en détail pour identifier les mécanismes sous-tendant le développement de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Malheureusement, à l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour tester la perception, la mémoire et la coordination motrice.

Réduction

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire le plus possible le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux estimé pour ce projet a été calculé par un biostaticien de manière à ce que, pour chaque expérience, les groupes utilisés soient constitués de 12 souris, le nombre minimal requis pour que l’analyse statistique ultérieure permette une évaluation pertinente des résultats. Nous avons calculé qu’un nombre de 12 souris minimum par groupe est nécessaire.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale est conçue de manière à réduire tout stress et inconfort de l’animal. Après l’instillation intranasale de bactéries ou de microbiote humain, chaque animal fera l’objet d’une évaluation quotidienne pendant 2 jours puis tous les 7 jours pour s’assurer de sa bonne santé (mesure du poids, analyse de l’allure du pelage, de l’état de vigilance, de la posture, du comportement moteur général et du comportement exploratoire dans la cage). Nous allons particulièrement surveiller l’apparition de signes chroniques parkinsoniens comme un trouble de la motricité (allure de la marche, activité locomotrice, comportement exploratoire dans la cage, coordination motrice et équilibre) et une faiblesse musculaire (incapacité à bien se mouvoir sur la grille de la cage). Ces signes cliniques sont habituels dans les modèles expérimentaux de maladie de Parkinson chez la souris. Si l’animal présente des signes parkinsoniens, il fera l’objet d’un suivi plus poussé : Il sera pesé tous les jours et du gel hydrique sera disposé sur la litière pour améliorer la prise alimentaire. Si cet animal en plus des signes parkinsoniens se met à présenter une perte de poids ≥20% du poids basal, est déshydraté ou reste prostré, il sera mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Le système nerveux des souris est proche de celui de l’humain et sensible au développement de pathologies expérimentales parkinsoniennes comme par exemple après l’administration de microbiote intestinal humain provenant de patient parkinsonien. Nous disposons d’un nombre important d’outils et de données avec ce modèle qui devraient nous permettre de tester les liens entre déséquilibre du microbiote nasal et neuropathologie parkinsonienne et d’établir des schémas thérapeutiques, voire préventifs pour les humains, en évitant donc de recourir à des primates non humains. Nous utiliserons des souris surexprimant un gène humain qui nous permettront d’appréhender le facteur génétique de l’hôte dans la pathologie. Adulte, à partir de 6 semaines après la naissance, car la maladie touche les adultes.

Les souris ne faisant pas d'accident vasculaire cérébral spontanément, une chirurgie d'une heure sous anesthésie leur en provoque un, avec les déficits moteurs et cognitifs qui suivent. 350 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Une partie est génétiquement déficiente pour le facteur XII de la coagulation, et l'ensemble reçoit des injections de nano-gouttes fluorescentes puis des séances d'imagerie d'une heure sous anesthésie. Le porteur annonce des procédures ayant "un caractère de stricte nécessité" et une batterie de cinq tests comportementaux, sans préciser lesquels.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Cette pathologie est la 3ème cause de mortalité et la première cause de handicap acquis chez l’adulte dans le monde. En France, cent trente mille nouveaux cas sont répertoriés par an. L’AVC pose donc un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie pour lesquels seul 20% des patients seront éligibles. De ce fait, il existe de nombreux travaux de recherche qui ambitionnent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de traiter un maximum de patients. Pour cela, il est nécessaire de mieux comprendre les processus physiopathologiques des AVC. La thrombectomie, ne conduit malheureusement pas toujours à une reperfusion efficace de la région cérébrale ischémique. L'une des raisons potentielles de ce phénomène pourrait être liée à la formation de microthromboses, dont il a été constaté qu'ils perturbent localement la barrière hémato-encéphalique (BHE). Par conséquent, l'objectif du projet est de caractériser les mécanismes spatio-temporels et fonctionnels de la microthrombose post-recanalisation, également connue sous le nom de phénomène de "no-reflow",puis d’en comprendre les mécanismes sous-jacents afin de déterminer son impact sur l’AVC, en utilisant différents modèles animaux représentatifs de la physiopathologie humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet à pour but d’étudier les interactions entre les cellules des microthomboses et les différents composant de la BHE (Cellules endothéliales, péricites, astrocytes) et comment cela va influencer la physiopathologie de l’AVC. Ces travaux devraient permettre d’identifier des mécanismes cellulaires qui pourraient être de nouvelles voies de développement d’outils thérapeutiques pour le traitement des AVC.

Procédures

Les animaux subiront des chirurgies pour induire des AVC puisque les souris n'en développent pas spontanément. Ainsi, il sera réalisé des chirurgies sous anesthésie générale d'une durée de 1 heure maximum, permettant de générer des déficits moteurs et cognitifs. Des injection de nano-gouttes fluorescentes en intraveineux seront également faites sous anesthésie générale soit pendant l'anesthésie associée à la chirurgie soit au moment des acquistions en imagerie. Il n'y aura donc pas d'aneshtésie spécifique à ce geste expérimental. Le suivi en imagerie microscopique ou imagerie médicale (IRM) sera réalisé également sur animal aneshtésie (durée : 1 heure maximum) afin d'assurer l'immobilité des souris. Une batterie de tests comportementaux (5 au total) seront effectués sur les animaux afin d'évaluer les déficits moteurs et cognitifs. La durée de chaque test ne devrait pas dépasser 15 minutes.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie d’induction de l’AVC, les animaux se trouveront désorientés, avec des déficits neurologiques vecteur de stress. Pour cela une surveillance accrue des animaux sera réalisée sur toute la période post AVC. Il est également attendu des douleurs post-opératoires qui seront prises en charge par une couverture analgésique adaptée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tissus et faire des analyses.

Remplacement

Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité. L’étude de la formation de microthromboses et de leur impact nécessite la réalisation d’expériences sur l’animal, aucune méthode alternative ne peut remplacer l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information

Réduction

Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité grâce à une analyse de puissance statistique. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé a été réduit au maximum. De plus, lorsque cela est possible il est prévu d’utiliser des approches non invasives afin de faire un suivi comportemental et en imagerie.

Raffinement

Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure chirurgicale et/ou douloureuse. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Ce suivi fera l'objet dun scoring afin d'évaluer les points limites. Les animaux seront hébergés dans des cages par groupe de 5 avec de l’enrichissement (domehome, ouate de cellulose) et un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Pour la chirurgie et le suivi en imagerie, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale la plus étudiée dans le domaine des AVC et les techniques employées sont bien décrites et maitrisée. L'anatomie du système nerveux murin, de la barrière hémato-encéphalique et la physiologie de la souris sont également bien connues et proches de celles de l'homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. Toutes les connaissances et l'expérience que nous avons dans le laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences nécessitent l'utilisation d'animaux transgéniques, des souris déficientes pour le facteur XII de la coagulation. Ce modèle transgénique ne peut être produit que chez la souris. De plus, il n'existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés ou des invertébrés moins sensibles, étant donné que leur anatomie et leur physiologie sont très différentes de celles de l'homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6 à 8 semaines correspondant à un stade jeune adulte seront nécessaires. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de pathologies (AVC) et notamment en conditions inflammatoires (inflammation centrale).

Mis en reproduction une nuit, puis soumis à un frottis vaginal sans anesthésie pour dater la gestation, 220 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié des femelles gestantes passent les vingt-deux jours de gestation sous régime pauvre en protéines, avec inactivité et perte de poids attendues. Au seizième jour, chacune subit une laparotomie pour une électroporation in utero de quarante minutes, dont le réveil peut être suivi de douleurs pendant deux à trois jours. Les nouveau-nés sont maintenus en vie jusqu'au prélèvement de leurs tissus à trois, huit ou trente jours. Les mères et les petits surnuméraires sont proposés en interne pour un autre projet avant d'être tués.

Objectifs

Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. C’est une pathologie caractérisée par un retard de croissance général du fœtus en développement qui représente la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. Touchant près de 3 à 9% des naissances dans les pays développés, c’est une insuffisance placentaire qui est le plus fréquemment mise en cause mais il peut également résulter d’une carence alimentaire de la mère dans les pays moins développés. Un tel retard dans le développement du fœtus entraine des déficits cognitifs à long terme caractérisés par des troubles de la concentration, de l’attention, une hyperactivité, un quotient intellectuel plus faible ainsi que des désordres moteurs. Le cortex ainsi que son réseau neuronal est le siège des fonctions cognitives de haut niveau. Ce projet consistera à utiliser le modèle de rat de RCIU pour appliquer une technique innovante qui permet de marquer de manière très claire des neurones isolés pour nous permettre d’apprécier d’une part les morphologies neuronales et d’autre part les interactions des neurones avec les vaisseaux sanguins environnants que l'on pourra mettre en évidence par des techniques classiques d'histologie.

Bénéfices attendus

Etudier les conséquences d’un RCIU sur l’intégrité du système nerveux central et plus précisément sur l’intégrité de ces réseaux neuronaux est indispensable pour mieux comprendre la mise en place de ces déficits cognitifs observés à long terme, afin d’envisager des stratégies thérapeutiques applicables dès la naissance pour limiter ces troubles cognitifs.

Procédures

Deux prélèvements sont effectués dans le cadre de ce projet. Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et deux femelles par cage maximum) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation (22jours). Une chirurgie expérimentale appelée électroporation in utero est appliquée sur chacune de ces femelles au 16e de gestation. La chirurgie ne dure pas plus de 40 minutes à partir de l’anesthésie jusqu’au réveil.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Le régime n’induit pas de perturbation du système digestif, si ce n’est des fèces d’une couleur plus claire. Ces effets indésirables n’ont pas de conséquences sur la mise bas des femelles d’après les projets déjà évalués. La taille des portées issues d’un RCIU peut être plus petite mais aucune mortalité supplémentaire n’est observée. La laparotomie appliquée à ces mêmes femelles au 16e jour de gestation peut également entrainer des changements dans le comportement de la femelle. Le réveil suite à la chirurgie peut être source de stress et suivie d’une inactivité et de douleurs. Ces observations ne durent pas plus de 2 à 3 jours selon les projets déjà évalués.

Devenir

Tous les animaux subissent la chirurgie d’électroporation in utero. En revanche, la moitié des femelles gestantes de ce projet ne sont pas soumis à un régime hypo-protéinée durant la période de gestation pour constituer un groupe contrôle. Après la mise à bas, les nouveau-nés seront maintenus en vie jusqu’au prélèvement des tissus à différents temps (P3, P8 ou P30). Parce que des différences métaboliques et une réaction inflammatoire influençant le développement du système nerveux central peuvent être observées entre les portées d’une femelle ayant déjà subi une intervention chirurgicale et notamment une laparotomie, nous ne réutiliserons pas ces mêmes animaux pour produire d’autres portées. En revanche, les femelles ainsi que les petits surnuméraires seront proposées en interne pour une réutilisation dans un autre projet avant de les mettre à mort.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières hémoencéphaliques (cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier de façon concomitante la mise en place des réseaux neuronaux et vasculaires. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro, et la maturation des neurones ainsi que leur connectivité (entre eux mais aussi avec le réseau vasculaire environnant) ne peuvent être étudiés qu’in situ, dans un animal vivant. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour étudier la pathologie. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec un nombre minimal d’animaux, mais nous devons garantir une pertinence statistique significative. Des calculs statistiques de puissance, ainsi que les expériences passées du laboratoire démontrent que 10 animaux par groupe permettent d'obtenir des résultats significatifs à la suite de tests statistiques bilatéraux non paramétriques sur des échantillons indépendants. Les expériences passées dans le laboratoire ainsi que des recherches bibliographiques démontrent un taux d’efficacité d’électroporation moins important chez le rat que dans les modèles murins à partir desquelles le projet s’est inspiré. Cela signifie qu’un nombre plus important de femelles est nécessaire pour obtenir suffisamment d’embryons pour lesquels l’électroporation a été efficace, positive. Ce nombre est néanmoins réduit car il nous sera possible d’utiliser les résultats des animaux du groupe contrôle d’un projet déjà existant utilisant la même procédure pour deux stades dedévelopement. Notre approche expérimentale nous permet d’analyser plusieurs dizaines de neurones ainsi que leur réseau vasculaire sur un même animal. Par ailleurs, les mêmes cerveaux pourront être utilisés pour d’autres marquages immunohistochimiques, permettant ainsi de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Il existe dans le laboratoire un système de préservation jusqu’à plusieurs années de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissus permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisé. Les mères ayant subi cette procédure, ainsi que les petits surnuméraires, sont proposés en interne pour être réutiliser dans le cadre d’un autre projet.

Raffinement

De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors de ce projet. La mise en reproduction s’effectue en respectant les normes d’hébergement. Nous réunissons au maximum deux femelles et un mâle par cage pour une nuit seulement. Nous surveillons leur comportement et si la moindre violence est observée alors les animaux sont immédiatement séparés. Les femelles gestantes sont pesées tous les trois jours afin de prévenir d’une perte de poids trop importante associée au régime alimentaire. Nous mettons fin au protocole si la femelle perd plus de 10% de son poids initial (pesée le jour de la mise en reproduction). Toute procédure de chirurgie sera accompagnée d’utilisation d’anesthésiques et/ou d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans l’équipe pour plusieurs projets. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les électroporations in utero seront effectuées à 16.5 jours embryonnaires (E16.5) pour nous permettre le ciblage des progéniteurs donnant naissance aux neurones corticaux superficiels. Les animaux seront mis à mort à 3 jours postnatal (P3), P8 et P30. Ces différents temps nous permettront d’analyser l’organisation des réseaux neurovasculaires au cours du développement postnatal et ainsi apprécier des modifications qui persisteraient à long terme.