Système musculosquelettique

Créées sur place ou reçues d'autres établissements, des lignées de souris et de rats génétiquement modifiés sont élevées, tatouées et biopsiées pour vérifier qu'elles portent bien la mutation commandée. 320 000 souris et 30 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, ceux qui ne partent pas vers un autre projet d'expérimentation étant tués, sans placement possible puisqu'ils appartiennent au scientifique commanditaire. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et quatre prélèvements sanguins par jour, et exprimer du seul fait de sa mutation un phénotype douloureux tel qu'une arthrite. Le porteur ajoute que la mise à mort peut être programmée à un âge précis pour éviter que l'animal n'exprime ce phénotype, et que les scientifiques "s'engagent par écrit" à ce qu'il n'existe pas de solution de remplacement à leur lignée.

Objectifs

Ce projet a pour premier objectif le maintien de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des modifications/symptômes physiques ou cliniques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes, et l’évaluation de l’impact de ces caractéristiques sur leur bien être ; comme deuxième objectif la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée génétiquement modifiées, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Ce test est important car dans l’élevage de lignée génétiquement modifiées, tous les animaux nés ne sont pas porteurs de la mutation, il est donc primordiale de le vérifier pour pouvoir utiliser les animaux d’interet uniquement et donner des résultats fiables. Enfin, certaines mutations génétiques ne font effet qu’après l’injection d’une hormone ou d’un antibiotique. Pour induire cette mutation d’interet et que l’animal exprime physiologiquement cette mutation, une injection de l’hormone pourra ainsi également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 350 000 animaux (ajout de 15% dû à l’augmentation de l’utilisation de ces modèles) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement modifiés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait du être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptée à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement modifiées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le bon modèle pour leurs expérimentations.

Procédures

Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : - A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute - A des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite). Dans de rare cas, l’administration de ligands peuvent être fait via des injections en intrapéritonéale ou en gavage (durée : moins de 5 minutes, fréquence peut varier d’une expérimentation à une autre, mais n’excédant pas une fois par jour pendant 7 jours, en cas de protocole nécessitant de dépasser ces limites, cela devra au préalable être valider par la SBEA) (durée et fréquences décrites dans la procédure 4, et recommandées par la littérature).

Impact sur les animaux

EExpression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité inatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dûs à l'injection d’un produit.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont soit en utilisation continue dans des projets d’expérimentation, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).

Remplacement

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.

Réduction

Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, ne sont utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypag. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européenes (au moins 7 animaux de chaque sexes et génotypes, sur 2 générations).

Raffinement

En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Dans le cas de lignées pouvant présenter un phénotype dommageable, si le phénotype le requiére, des observations cliniques plus fréquentes et plus spécifiques avec des points limites et des raffinements précis seront mise en place. Afin de limiter la douleur pour l’animal, une euthanasie pourrait être demandé en automatique à un point limite ou âge précis afin d’éviter que l’animal n’exprime le phénotype. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est mis à mort.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5jours après la fécondation.

Génétiquement hémophiles, 32 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une ponction du genou droit sous anesthésie pour provoquer un saignement articulaire, geste douloureux qui peut entraîner boiterie et gêne locomotrice. L'objectif déclaré est de repérer dans le sang des micro-ARN servant de marqueurs précoces de la dégradation du cartilage et de l'os, deux de ces marqueurs ayant déjà été validés chez des patients hémophiles. Le porteur précise que la souris hémophile, contrairement aux malades humains, ne saigne jamais spontanément et ne saigne que si on la blesse, et justifie la mise à mort par la "nécessité" de prélever tout le sang de l'animal.

Objectifs

L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques où la forme sévère est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Les saignements articulaires répétés, peuvent conduire à une atteinte articulaire handicapante appelée arthropathie hémophilique. Il s’agit d’une complication grave, de la maladie. La présence anormale du sang dans la cavité articulaire conduit à une inflammation et à terme à la destruction progressive de l’articulation. Actuellement, le diagnostic d’une dégradation du cartilage et de l’os se fait par l’examen clinique, la radiographie, l’échographie et l’IRM. Cependant, ces méthodes ne permettent pas de détecter à un stade assez précoce de l’arthropathie. Les biomarqueurs représentent des candidats pour le diagnostic précoce. Les micro-ARN circulants sont présents dans de nombreux fluides, notamment le sang. Ils sont stables et résistants aux analyses et représentent déjà de bons candidats comme biomarqueurs pour le diagnostic et le pronostic d’autres pathologies comme la polyarthrite rhumatoïde. Il existe des similitudes physiopathologiques commune entre la polyarthrite rhumatoïde et l’arthropathie hémophilique dont l’inflammation articulaire et la destruction du cartilage et de l’os. En amont, une étude clinique précoce réalisée par notre équipe a identifié et validé deux micro-ARN circulants comme biomarqueurs de l’arthropathie hémophilique chez les patients hémophiles ayant des lésions avancées d’arthropathie. Nous cherchons à identifier des marqueurs globaux de l’atteinte du cartilage et de l’os pour à terme proposer la détection de certains biomarqueurs permettant le diagnostic de l’arthropathie hémophilique à un stade le plus précoce. Nous avons fait l’hypothèse que l’identification de biomarqueurs précoce de l’arthropathie hémophilique permettrait la mise en place d’un nouvel outil de diagnostics simple et rapide, réalisé lors de bilan sanguin. L’objectif de ce projet est d’identifier des biomarqueurs pour un diagnostic précoce de l’arthropathie hémophilique. Afin de détecter le plus tôt possible la mise en place d’une synovite et ainsi bloquer l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B sévères et à terme chez les patients.

Bénéfices attendus

La comparaison entre les différents stades d’atteinte de l’arthropathie nous permet de cibler les microARN d’intérêts pour le diagnostic de l’arthropathie hémophilique à un stade précoce. La conservation inter-espèce de ces biomarqueurs nous permet également de proposer une étude clinique afin d’évaluer l’efficacité des micro-ARN comme outil de diagnostic clinique chez l’Homme.

Procédures

Les souris subissent une ponction du genou droit sous antalgie et anesthésie générale (2-3 minutes) pour simuler l’arthropathie hémophilique et l’évaluation de l’atteinte ostéochondrale. Le dernier jour, les souris sont mises à mort sous antalgie et anesthésie générale par prélèvement sanguin (5 minutes).

Impact sur les animaux

Le phénotype des animaux comporte une vulnérabilité du point de vue de la coagulation, avec risque de saignement prolongé en cas de blessure mais pas de saignement spontané comme dans la forme humaine de la maladie Les ponctions du genou engendrent une douleur. L’arthropathie induite par la ponction peut occasionner une gène locomotrice, une démarche anormale ou boiterie ainsi qu’une légère douleur lors des déplacements et redressements de l’animal sur ses pattes arrières.

Devenir

La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement tout le sang, non compatible avec le maintien en vie de l'animal.

Remplacement

La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement.

Réduction

En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesure et d’étude sur le même animal. Dans cette étude, chaque souris constitue son propre contrôle pour les mesures biologiques et histologiques, réduisant le nombre de souris et participant à la robustesse de l’étude d’un point de vue statistique.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour préserver le bien-être de l’animal dont l'application des points limites stricts et spécifiques du projet. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges. En cas d’apparition de problème locomoteur (boiterie ou difficulté à la station debout), de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage sont mis à disposition dans la cage. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie.

Choix des espèces

La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.

129 chiens vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, puis renvoyés à leur établissement d'origine : 49 mâles atteints de dystrophie musculaire, 40 femelles porteuses de la mutation et 40 chiens sains. Chaque examen d'IRM dure jusqu'à trois heures sous anesthésie générale, avec induction par injection, intubation et parfois injection d'un produit de contraste. Le porteur décrit une méthode non invasive et atraumatique, tout en listant le stress de la pose de voie veineuse, l'irritation liée à l'intubation et le risque d'hypothermie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la structure du muscle squelettique ou du cœur, et conclut que les modèles canins restent "irremplaçables".

Objectifs

Les objectifs principaux de ce projet sont l'évaluation des méthodes non invasives pour caractériser structure et fonction des muscles dans des modèles pertinents de pathologies musculaires et établir des mesures fiables, voire des biomarqueurs qui décrivent le stade d'avancement de la maladie et son évolutivité. D'autre part, ces modalités seront utilisées pour evaluer un traitement innovant visant à rduire la fibrose musculaire

Bénéfices attendus

L’imagerie et la spectroscopie par résonnance magnétique représentent des techniques d’évaluation intrinsèquement non invasives et atraumatiques. L’utilisation d’un scanner à tunnel large et haute résolution permettent une évaluation corps entier ce qui permet donc d’avoir une bonne appréhension de la répartition des lésions musculaires. Le recours à diverses séquences permet d’obtenir divers contrastes ce qui traduit diverses propriétés des muscles. L'IRM devrait à terme aboutir à la définition de nouveaux biomarqueurs et d'établir des données de références permettant un diagnostic précoce par une méthode non invasive. Le développement de séquences entrelacées permet un raffinement supplémentaire de ces approches en raccourcsissant les durée d'examen. Le développement de nouveaux biomarqueurs devrait aider à l'évaluation de traitements innovants qui font encore défaut dans le contexte des maladies neuromusculaires.

Procédures

Une cohorte de chiens sera utilisée pour evaluer et valider de nouvelles méthodes d'imagerie médicale. Elle se décompose en chiens sains (M et F), de chiennes porteuses de la mutation et de chiens mâles atteints de la maladie. L’examen IRM (imagerie par résonnance magnétique), du fait de sa nature non invasive n’induit pas de douleur, mais une sédation est requise pour éviter les mouvements durant les acquisitions de données et améliorer le confort de l’animal. Les chiens seront donc endormis par médicament injectable, intubés et l'anesthésie entretenue par inhalation d’un anesthésique sous forme gazeuse. La durée de prépartion d'un chien est d'environ un quart d'heure. Un monitorage cardio-respiratoire continue ainsi que la surveillance de la température corporelle sont mis en place durant tout l'examen. Certaines séquences d'imagerie font appel à l'injection d'un produit de contraste. La durée d'un examen complet est limitée à 3 heures.

Impact sur les animaux

L’imagerie par résonnance magnétique (IRM) est certes non invasive et non douloureux, mais nécessite l’immobilité, d’où le besoin d’une anesthésie. L’induction de l’anesthésie par injection pourrait être source de stress et d’une douleur de courte durée au point de ponction de la voie intraveineuse. De même, la nécessité d’intuber pourrait causer une légère irritation. L’anesthésie nécessaire pour l’imagerie pourrait entrainer une hypothermie liée à l’immobilité et dans de rares cas de complications. Certaines séquences d’imagerie pourront nécessiter l’injection de produit de contraste pour l’IRM, ce qui ne devrait pas impacter l’animal (produit utilisé en pratique vétérinaire clinique).

Devenir

Tous les animaux retourneront à leur établissement d'origine qui gère la surveillance des chiens. La gestion des animaux en dehors de l'imagerie reste sous la responsabilité de l'équipe vétérinaire et n'implique pas le laboratoire de RMN. L'imagerie in vivo par une méthode non invasive comme l'IRM s'incrit dans ce contexte.

Remplacement

L’imagerie/spectroscopie par RMN répond au critère ‘remplacement’ de la règle des 3R en permettant de s’affranchir des prélèvements pour un grand nombre d’évaluations du tissu musculaire ; l’histologie tout comme la biochimie restent des méthodes invasives pouvant nécessiter l’euthanasie de l’animal pour le prélèvement. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro qui imite la structure complexe et le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. Le recours à des modèles animaux présentant un phénotype cliniquement patent est donc indispensable pour une meilleure compréhension de sa physiopathologie et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Les modèles canins gardent ainsi une place irremplaçable aussi bien pour la recherche fondamentale que pour les études précliniques en thérapeutique. car ils présentent des similitudes phénotypiques avec les pathologies humaines (fibrose, cycles de dégénérescence / régénérescence des fibres musculaires, atteinte cardiaque et respiratoire, …).

Réduction

La complémentarité des techniques d’imagerie et de spectroscopie permet d’acquérir des données multiparamétriques chez l’animal vivant, et représente une des caractéristiques singulières de la méthode RMN. Il est ainsi possible à partir d’un même examen, consistant en acquisitions de plusieurs séquences d’imagerie er de spectroscopie, d’extraire plusieurs caractéristiques du tissu musculaire. De plus, la nature non-invasive de l’examen par RMN autorise l’observation du tissu musculaire sans induire de modifications durables de ce dernier. Par son caractère atraumatique, la RMN offre la possibilité de répéter un examen sur un même animal sans effets nocifs pour celui-ci rendant possible le suivi longitudinal de l’évolution des pathologies et l’étude de l’efficacité dans le cadre d’essais thérapeutiques. Ces trois spécificités de la RMN permettent dans le cadre de l’expérimentation in vivo de ‘réduire’ le nombre d’individus nécessaires à une expérience comme le stipule la règle des 3R. Les nouvelles modalités d’imagerie/spectroscopie par RMN nécessiteront une validation chez des animaux sains (mâles et femelles (20 + 20), des femelles porteuses de la mutation (40) et des animaux malades mâles (49), soit un total de 129 chiens. De ce sous-groupe de chiens ayant la maladie génétique, une cohorte (9) sera incluse dans un essai thérapeutique basée sur une approche de thérapie cellulaire. Le nombre total d’individu est estimé de façon à avoir un nombre suffisant d’individus par groupe pour réaliser des tests statistiques.

Raffinement

L’inclusion des animaux se fera selon des critères d’inclusion qui sont clairement établis en amont des examen RMN par l’équipe promotrice. En résumé, le statut génétique est établi et un examen clinique doit permettre d’établir un phénotype clairement décrit. Les animaux prévus ici devraient ainsi présentés un phénotype modéré. Toutefois en cas de dégradation de l’état clinique lié à la pathologie ou de survenue d’une pathologie intercurrente, les animaux seront exclus de notre protocole. En soi l’imagerie/spectroscopie par RMN est un examen non invasif et atraumatique. La RMN répond donc au critère de ‘Raffinement’, grâce au développement constant des outils méthodologiques couplé aux progrès technologiques. Toutes les expérimentations RMN se feront sous anesthésie par inhalation afin de maintenir les animaux immobiles pendant les acquisitions et réduire ainsi tout stress lié à l’examen. L’anesthésie bénéficie d’un monitorage cardio-respiratoire continue jusqu’au réveil de l’animal. Certains examens peuvent nécessiter l’injection d’un produit de contraste. La température corporelle de l’animal est maintenue autour de 38 degrés à l’aide d’un tapis chauffant. Fréquence respiratoire et saturation périphérique en oxygène sont contrôlés en permanence pendant toute la durée de l’examen. La surveillance clinique est assurée jusqu’au réveil complet de l’animal et les animaux pourront retourner à leur lieu d’hébergement habituel. Les chiens restent donc sous la surveillance constante du vétérinaire qui aura toute liberté d’interrompre un examen s’il le juge nécessaire.

Choix des espèces

Le muscle est un ensemble organisé de fibres musculaires, cellules hautement différenciées et spécialisées, et de tissu interstitiel. La fonction musculaire est dépendante du fonctionnement des cellules musculaires, mais aussi d’une combinaison des fonctions vasculaire et nerveuse de l’individu. Cependant, à ce jour, il n’existe pas de modèle in vitro qui imite la structure complexe et le métabolisme énergétique du muscle, qu’il soit squelettique ou cardiaque. Le recours à des modèles animaux présentant un phénotype cliniquement patent est donc indispensable pour une meilleure compréhension de sa physiopathologie et découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. La règlementation sur le développement médicamenteux prescrit le recours à une expérimentation in vivo pertinente pour la pathologie humaine ciblée. Les modèles canins des maladies neuromusculaires, tels que le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), sont très utilisés dans la recherche sur les pathologies neuromusculaires. En effet, le phénotype sévère lié à l’absence de dystrophine, observé chez ces animaux, présente des similitudes importantes avec l’expression de la maladie chez l’homme. Afin de diagnostiquer le plus tôt possible la pathologie neuromusculaire, les examens qui vont être évaluer ont recours à des chiens peu symptomatiques, d'un âge adultes jeunes.

Injectées avec des vecteurs viraux dans les jours suivant leur naissance ou à quatre semaines, puis soumises à un régime spécifique et à deux gavages, 136 souris subissent la destruction chimique d'un muscle de la patte par injection de chlorure de baryum sous anesthésie. La régénération dure trente jours. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger à modéré, et le porteur indique que la lésion peut être douloureuse pendant cette phase. L'objectif déclaré est de valider une méthode qui permettrait ensuite de cibler n'importe quel gène sans créer une nouvelle lignée de souris, et toutes sont tuées pour prélever leurs cellules souches musculaires.

Objectifs

Le muscle possède une remarquable capacité de régénération, due en grande partie à la fonction des cellules souches musculaires, également connues sous le nom de cellules satellites. En réponse à une lésion musculaire ou à une maladie affectant le tissu musculaire, les cellules satellites s'activent et génèrent de nouvelles cellules musculaires pour réparer les dommages. Pour maintenir leur capacité de régénération, les cellules satellites doivent rester dans leur niche appropriée, qui leur fournit des éléments optimaux tels que des nutriments, des signaux chimiques et un soutien physique. Lorsqu'elles sont retirées de cette niche spécialisée, les cellules satellites perdent leur capacité de régénération. L'un des principaux défis de la recherche biomédicale est d'identifier les facteurs qui composent cette niche spécialisée, car cette connaissance pourrait aider à préserver les propriétés régénératrices des cellules satellites et éventuellement à les exploiter à des fins thérapeutiques. La matrice extracellulaire, un réseau complexe de protéines comme les collagènes, joue un rôle crucial dans la niche des cellules satellites. Nous avons identifié plusieurs facteurs candidats de la matrice extracellulaire et nous souhaitons étudier leurs fonctions à l'aide de modèles de souris génétiquement modifiées. Ce projet devrait nous permettre de développer une nouvelle méthode pour générer rapidement des souris génétiquement modifiées afin d'étudier le rôle de différents facteurs de la niche dans la fonction des cellules satellites.

Bénéfices attendus

Bénéfice à court terme (scientifique) : La matrice extracellulaire est un environnement riche et dense composé de nombreuses protéines différentes spécialisées en fonction du tissu. Ce projet nous permettra de cribler l'importance des différents composants de la matrice extracellulaire exprimés par les cellules souches musculaires pour leur activité lors de lésions musculaires. Bénéfice à long terme (scientifique + réduction du nombre d'animaux) : Ce projet nous permettra de confirmer la stratégie de ciblage de differentes gènes d’intérêt en utilisant une seul model. Par conséquent, dans une perspective à long terme, la validation de cette stratégie nous permettra, ainsi qu'à d'autres chercheurs-euses, d'utiliser ce protocole comme un modèle rapide et robuste pour cibler n'importe quel gène d'intérêt dans les cellules souches musculaires directement in vivo sans avoir besoin de développer de nouvelles model de souris pour chaque gène d'intérêt. Cela réduira considérablement le nombre de souris utilisées par projet.

Procédures

Les souris incluses dans ce projet recevront en une injection des vecteurs viraux, en un seul geste (rapide (moins d'une minute)) soit après la naissance, soit à l'âge de 4 semaines. Une fois adultes, les souris seront soumises à un régime alimentaire spécifique en granules pendant deux semaines suivi par deux gavages (pendant deux jours consictifs, un par jour, en un seul geste, ce qui prend moins d'une minute). Deux semaines après, un seul muscle d'une seule jambe sera blessé par injection intramusculaire (rapide (moins d'une minute)) sous anesthésie générale. Le processus de régénération musculaire dure 30 jours chez la souris.

Impact sur les animaux

Concernant l'injection des vecteurs viraux chez les souriceaux après la naissance ou chez les souris adultes, ils seront realisées rapidement et à l'aide d'une aiguille adaptée et fine afin de minimiser la douleur chez l'animal. La douleur est donc considérée comme faible. Le gavage est effectué par des chercheurs formés et expérimentés en un seul geste, rapidement, à l'aide de sondes adaptées. La douleur est minimale et l'inconfort pour l'animal est très faible. Enfin, concernant l'induction de lésions musculaires par injection de BaCl2 dans le muscle tibialis antérieur (TA), l'injection est réalisée rapidement, sous anesthésie, en un seul geste et à l'aide d'aiguilles fines adaptées pour minimiser la douleur. Cependant, étant donné que l'induction de la lésion elle-même peut être douloureuse pour les souris pendant la régénération musculaire, des analgésiques ainsi que des adaptations de l'environnement et de la nourriture des animaux dans la cage ont été envisagés et décrites dans les sections adaptées.

Devenir

Toutes les animaux inclut dans ce projet seront utilisées pour effectuer des prélèvements musculaire afin d'avoir accès aux cellules souches musculaire.

Remplacement

Dans ce projet, nous nous intéressons aux cellules souches musculaires et à la structure de leur matrix extra cellulaire in vivo. Bien que plusieurs systèmes de culture cellulaire se soient développés, le comportement de ces cellules change lors de leur mise en culture. Par conséquent, la simulation complète de la matrice extra cellulaire physiologique des cellules souches musculaire n’est pas encore possible in vitro, ce qui nous oblige à passer par des modèles in vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, tous les tests in vitro possibles ont été réalisés. Cependant, pour confirmer notre stratégie de travail nous aurions besoin de 36 souris avant de commencer les expériences principales. Ensuite, pour la phase expérimentale, nous avons décidé de réduire le nombre d'animaux en induisant une lésion musculaire dans un seul muscle d'une seule patte par souris, ce qui nous permettra de comparer le comportement des cellules souches musculaires au repos (muscle controlatéral non lésé = témoin) ou après régénération musculaire. Ainsi, 100 animaux (10 lots de 10 souris, pour avoir par lot, 5 souris controles et 5 souris expérimentales) sont prévus pour la phase expérimentale. Ces groupes représentent le minimum nécessaire pour pouvoir effectuer une analyse statistique et conclure les résultats expérimentaux.

Raffinement

Tout au long du projet, le comportement et le poids des souris seront surveillés par le même manipulateur afin de détecter tout signe de douleur ou d'inconfort chez les souris. Toutefois, l'induction de la blessure musculaire provoque des lésions musculaires et une régénération. De la nourriture et de l’hydrogel seront mis à disposition dans la cage les trois premiers jours au cas où les animaux ne parviendraient pas à atteindre la grille pour se nourrir. Également, des anti-douleurs sont prévus pour réduire la douleur des souris. Un tableau d'évaluation des animaux et des points limites a été préparé, adapté à chaque intervention, et sera consulté tout au long du projet pour évaluer l'état de chaque souris incluse dans chaque procédure

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples : 1. La souris est un mammifère et la structure de son muscle squelettique est très similaire à celle du muscle squelettique humain. 2. La courte durée de gestation et la maturité post natale chez la souris sont compatibles avec la durée de nos expériences. 3. La petite taille des souriceaux nous permet de cibler toutes les cellules avec une petite quantité des vecteurs viraux. 4. Des études similaires sur la délivrance de gènes par des vecteurs viraux chez la souris ont servi de base à la conception de l'expérience. 5. Notre laboratoire possède une expertise dans la manipulation des souris. pour l'injection des vecteurs viraux, les souris seront injectées soit après la naissance, soit à l'âge de 4 semaines. L'objectif est de cibler le plus grand nombre de cellules souches musculaire par l'intermédiaire des vecteurs viraux. Par la suite, les tests de régénération musculaire seront effectués chez des souris adultes, soit à 11-15 semaines d'âge, pour étudier le comportement et la capacité des cellules souches musculaires pendant la régénération des muscles squelettiques.